（食品科学专业论文）大豆蛋白ACE抑制肽的研究.pdf

摘要 摘要 酶法生产生物活性肽不仅有利于充分利用蛋白质资源，而且具有广阔的膳食或药物的应 用前景，其中利用大豆蛋白生产降血压肽因其安全、高效性而受到了广泛关注。考虑到疏水 性氨基酸对多肽的a c e 抑制活性的重要作用，论文研究利用大豆分离蛋白( s p i ) 的一次水解 沉淀，即高分子蛋白片段( h i g h m o l e c u l a r - w e i g h tf r a c t i o nh m f ) 制备a c e 抑制肽并对具有高 活性的组分进行了分离纯化和结构鉴定。 论文首先对酶解h m f 的条件进行优化研究。结果表明，微波预处理比加热辅助处理更 有助于促进h m f 水解，且确定最适微波功率为2 0 0 w ，时间为3 0 s 。选用p r o t e a s en 作为适 合水解h m f 的蛋白酶，其生产a c e 抑制肽的最佳水解条件是：底物浓度5 ( w v ) ，加酶量 2 ( w w ) ，温度5 5 ，p h 值7 0 ，水解时间1 2 0 m i n 。在以上的水解条件下h m f 的酶解液的 a c e 抑制活性最高，达到6 5 1 。同时，研究表明h m f 具有较s p i 更高含量的疏水性氨基 酸和疏水性值。 采用截留相对分子质量为5 0 0 0 的膜将粗水解液经过超滤分离，收集流出液，水解物的i c 5 0 降低了1 5 5 ，达到了初步纯化的目的。采用d a 2 0 1 c 型大孔吸附树脂能有效脱去h m f 水 解液中的盐分，同时使用不同浓度的乙醇分级分离，发现高浓度的乙醇对洗脱组分的疏水性 氨基酸有富集和分级作用，7 5 乙醇浓度洗脱下来的组分具有最高的降血压活性，i c 5 0 达到 0 0 9 3m g m l 一。经体外消化实验发现，消化道酶作用后a c e 抑制活性基本不变。说明经以上 步骤制得的a c e 抑制肽能较好地抵抗消化道酶作用。 采用s e p h a d e xg 1 5 分离7 5 乙醇洗脱下来的组分，酸性洗脱液：0 2 m o l l 、p h = 3 6 的 醋酸一醋酸钠缓冲液具有较好的分离效果，收集得到a c e 抑制活性最高的两个组分，i c 5 0 分 别为4 1l lg m l 以和4 3pg m l 以组分。其中一个组分经半制备r p h p l c 分离，得到具有最高 a c e 抑制活性的组分p 6 ，结合液质联用，分析其一级结构，其氨基酸序列可能是s e r - t r p ， i c 5 0 值为4 1 1hm o l l 。另一组分采用l c e s i m s 对它的成分进行鉴定，推测其中主要两个 组分为大豆异黄酮的化合物，可能分别是6 ”一丙二酰基异黄酮糖甙和6 ”一丙二酰基染料木甙 或它们的异构体。 关键词：大豆分离蛋白高分子蛋白片段a c e 抑制肽大孔吸附树脂凝胶过滤色谱反相高 效液相色谱 a b s t r a c t a b s t r a c t e n z y m a t i ch y d r o l y s i st op r o d u c eb i o a c t i v ep e p t i d e sn o to n l yc a nm a k et h em o s tu s eo fp r o t e i n s o u r c e s ，b u th a sb r o a da p p l i a n c eo u t l o o ki nd i e t a r ya n dp h a r m a c ya r e a s a m o n gt h ep l a n ts o u r c e s ， s o y b e a ni sw i d e l yu s e dt oo b t a i ns a f ea n de f f e c t u a la n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s i nt h i sp a p e r , h m f ( 1 l i g h - m o l e c u l a r - w e i g h tf r a c t i o n ) a f t e rh y d r o l y s i so fs p lw a su s e da ss u b s t r a t et op r o d u c ea c e i n h i b i t o r yp e p t i d e s i n i t i a l l y ，t h ec o n d i t i o n sf o rh m fh y d r o l y s i sw e r eo p t i m i z e d a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t m i c r o w a v ep r e t r e a t m e n tc o u l dp r o m o t ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o m p a r e dw i t hh e a tp r e t r e a t m e n t a n dt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o rp r o t e a s en h y d r o l y s i sw e r e ：m i c r o w a v ep o w e ro f2 0 0 w ， m i c r o w a v ep r e t r e a t m e n tt i m eo f3 0 s ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no f5 ( w v ) ，t h er a t i oo fe n z y m eo f 2 ( w w ) ，t e m p e r a t u r eo f5 5 ，p h7 0a n dh y d r o l y s i st i m eo f1 2 0 m i n n l eh y d r o l y t eu n d e rt h e h y d r o l y s i sc o n d i t i o n sb o a s t e dt h eh i g h e s ti n h i b i t o r ya c t i v i t yt oa c e ，w h i c hw a s6 5 1 m e a n w h i l e ， t h er e s e a r c hs h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fh y d r o p h o b i cp e p t i d e si nh m fw a sg r e a t e rc o m p a r e d 、航t l l s p i a f t e rp u r i f i c a t i o no ft h eh y d r o l y t ew i t hu l t r a f i l t r a t i o n t h ei c 5 0d e c r e a s e d15 5 c o m p a r e d 诵t l l t h eo r i g i n a lh y d r o l y t e a n dt h ef r a c t i o n sw e r ed e s a l t e db ya d s o r p t i o no nam a c r o p o r o u sr e s i na n d t h e ne l u t e dw i t he t h a n o la td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh i g h e s t a n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t yf r a c t i o n s 、析l 趾i c 5 0o f0 0 9 3m g m l 吖w e r ee l u t e d 、i t l l7 5 e t h a n 0 1 f r o md i g e s t i v ee x p e r i m e n ti nv i t r o i tc o u l db ef o u n dt h a ta c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h ee l u t e d f r a c t i o n sr e m m n e da l m o s tt h es a m ea f t e rb e i n gd i g e s t e db yd i g e s t i v ee n z y m e s t h ee l u t e df r a c t i o n s 、i m7 5 e t h a n o lw e r ef u r t h e rs e p a r a t e db yg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y w i t h0 2 m o l l 一、p h = 3 6h a c - n a a c 嬲ab u f f e r a n dt w of r a c t i o n sw i t ht h em o s ta c ei n h i b i t o r y a c t i v i t yw h i c hh a di c 5 0v a l u e so fo 0 4 11 1m o l l 1a n do 0 4 3l am o l l 1r e s p e c t i v e l yw e r ec o l l e c t e d o n ef r a c t i o nw a sf u r t h e rp u r i f i e db ys e m i - p r e p a r a t i v er e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( r p h p l c ) a n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y ( l c e s i m s ) s h o w e dt h a ta m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h ep u r i f i e df r a c t i o np 6 一i vw a s s e r - t r pp r o b a b l e l y ，w h i c hh a d t h em o s ta c e i n h i b i t o r ya c t i v i t y 谢血a ni c 5 0o f4 1 1 | lm o l 。l 1 t h e p r o b a b l ec o m p o n e n t so ft h eo t h e rf r a c t i o no b t a i n e da f t e rs e p h a d e xg - 15w e r es o yi s o f l a v o n e s t h r o u g hb e i n ga n a l y z e db yl c e s i - m s k e yw o r d s ：s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s ，h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h tf r a c t i o n ，a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n g e n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e ，m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ，g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，r p - h p l c c h r o m a t o g r a p h y u 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 签名： 迸垒 日 期： 盘左：垒：丝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：牡；师签耋： 第一章绪论 第一章绪论 人们一直认为蛋白质是经过人体各种消化酶作用后以游离氨基酸形式吸收的，这种传统 观点正被近年来的研究成果所淡化【l 】。现代营养学研究发现：人类摄食蛋白质经消化道的酶 作用后，大多是以寡肽形式消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。肽作为分子结 构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是蛋白质的结构与功能片段，使蛋白质具有数以 千万计的生理功能。生理活性肽( b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e ) 是指对生物机体的生命活动有益 或具有生理作用的肽类化合物，又称功能肽( f u n c t i o n a lp e p t i d e ) 。目前已经从动、植物和微 生物中分离出多种多样的生物活性肽。生物活性肽的结构可以从简单的二肽到较大分子的多 肽( 数百个氨基酸) 。生物活性肽的生物学意义主要体现在其具有多种人体代谢和生理调节功 能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安 全性极高，因此是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。其中以食 物来源的生物活性肽研究最多，大豆蛋白作为一种重要的植物蛋白源，是优良的保健食品素 材。因此，利用大豆蛋白资源转化提取与开发活性多肽类制品的前景非常广阔。 1 1 大豆蛋白与其生理活性肽 1 1 1 大豆蛋白 在大豆中，蛋白质含量般不低于3 8 ，它是大豆中最主要、也是最重要的营养成分。 植物蛋白中，只有大豆蛋白最接近于动物蛋白和“全价蛋白，且没有动物蛋白的一些副作 用，同时单位质量中的大豆蛋白质含量明显高于动物蛋白，因此是取代动物蛋白的最好的植 物蛋白之一【2 j 。从大豆蛋白质氨基酸组成来看，大豆蛋白富含人体所必需的八种氨基酸，从 表1 2 1 3 1 可以看出，大豆蛋白的必需氨基酸组成与牛乳蛋白质接近，与美国科学院国家研究院 食品与营养局f n b ( f o o da n dn u t r i t i o nb o a r d ，n a t i o n a la c a d e m yo fs c i e n c e ，1 9 8 0 ) 所推荐的氨 基酸参考模式也十分接近，所以大豆蛋白是一种优质蛋白质。随着人们对大豆蛋白研究的深 入，不仅大豆蛋白作为食品配料的理化功能被逐渐改善，而且其卓越的生理活性也在被不断 发觉。因此，大豆制品不再被视为单纯的营养性食品，而是作为一种健康食品受到越来越多 的重视。 表1 - 1 大豆蛋白质、牛乳蛋白质等的氨基酸一般组成，g 1 0 0g1 蛋白质 t a b 1 - 1t h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fs o yp r o t e i na n dm i l kp r o t e i n g 1 0 0g - 1p r o t e i n 1 1 2 大豆多肽的生理活性 f 1 2 0 世纪7 0 年代以来，食用蛋白质的水解成为一门相对独立的研究领域，有关蛋白质水 解物性质的研究也得到了不断深入。低分子肽类作为一种功能性食品基料，在医药、宇航食 品、饮料及整个食品工业等许多方面获得了广泛的应用，其中由于大豆蛋白质资源丰富、价 江南大学硕士学位论文 格低廉和营养丰富，同时大豆多肽具有比大豆蛋白更丰富的加工特性、营养特性和生理功能， 所以成为大豆蛋白深加工的一个重要方向。 大豆多肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽混合物，以3 6 个 氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分，分 子质量在1 0 0 0 以下( 其组成、分子量范围与水解条件的控制有关) 。大豆肽的蛋白质含量为 8 5 左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。大豆肽与 大豆蛋白相比，具有消化吸收率高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的 生理功能以及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好等良 好的加工性能，因而越来越受到国内外学者的广泛关注。在大豆肽的多种生理功能中，主要 包括以下几方面： ( 1 ) 降血压作用 大豆多肽通过抑制血管紧张素转化酶( a c e ) 的活性，从而起到降低血压的作用。对原 发性高血压患者具有显著疗效1 4 ，而对于正常人不存在降血压的作用【5 j ，并且对肾功能没有任 何影响，无毒副作用，与降压药物相比，降压作用比较平稳，是降压首选的功能因子f 6 】，在 食品中加入大豆肽，人们在正常饮食的情况下即可达到维持正常血压的目的，其应用安全可 靠。 ( 2 ) 降低胆固醇作用 大豆多肽具有高疏水性，能阻止肠道中胆固醇的再吸收而将其排出体外，它还能刺激甲 状腺激素分泌增加，促进胆固醇的胆汁酸化，使粪便胆固醇排泄增加，从而降低血液胆固醇 水平。在总胆固醇中，大豆多肽所降低的胆固醇是对人体有害的低密度脂蛋白( l d l ) 和极 低密度脂蛋白( v l d l ) ，它不降低对人体有益的高密度脂蛋白( h d l ) 的数值1 7 1 。 ( 3 ) 抗氧化作用 大豆多肽能够清除羟基自由基，终止单线态氧的生成以及结合金属离子而起到抗氧化作 用，抑制机体内自由基的大量积累【8 j ，从而能在一定程度上消除机体内多种生理功能的障碍， 延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生。有学者用微生物蛋白酶水解大豆球蛋白，得 到分子量为7 0 0 一- - 1 4 0 0 的肽，试验证明具有抑制亚油酸自动氧化的作用 9 1 。 ( 4 ) 免疫调节作用 最早证实肽的免疫刺激作用是从人乳蛋白中获得的肽类，免疫刺激肽就是从人乳的酶解 产物中分离得到的一类具有刺激吞噬细胞功能的肽。有研究表明，大豆蛋白经酶解或微生物 水解法可以得至u l e u - l e u t y r 和t y r t y r - m e t - p r o l e u t y r , 只要极低剂量( o 1l lm ) 就可以通过 鼠腹膜巨噬细胞激活具有吞噬作用的绵羊红细胞，达到增强人体免疫功能的效果【l 们。大豆活 性肽还具有在组织水平上引发机体的生物学效应，调节植物神经系统，活化细胞免疫功能、 改善心血管功能和抗衰老等生理活性。 1 1 3 大豆多肽的国内外研究现状 对大豆多肽的研究，美国和日本无论在基础理论还是在应用研究方面，均处于世界领先 地位。美国于2 0 世纪7 0 年代初研究了新型大豆深加工产品一大豆多肽，之后d e l t o w ns p e c i a t i o n 公司建成了年产5 0 0 0 t 食用蛋白肽的加工厂。日本也于2 0 世纪8 0 年代开展此方面的研究，不二 2 第一章绪论 制油公司、雪印和森永等乳业公司均己成功地将大豆肽应用于食品工业领域【i 。目前，大豆 多肽已经工业化大规模生产，主要是根据所制得的大豆多肽不同的生理活性，将其制成药片、 口服液或作为功能因子添加到各种食品中，发挥其生理功能。 我国对大豆多肽的研究开发起步晚，研究单位少，基础和应用研究都很薄弱，目前处于 起步阶段。但近几年来研究逐步活跃起来，报道渐多，前景看好。当前生物活性肽研究开发 的方向是：肽的定向酶解技术开发，包括高效、专一性强的酶种选育、复合酶系共同作用机 理、机制的研究，脱苦微生物的分离、纯化和机理研究，酶解工艺改进技术等；功能性肽的 分离、分析技术开发，包括新型高效分离设备和分离工艺，灵敏度高、简单易行的目标肽活 性分析检测体系和分析技术及下游精制技术；肽的功能性生物学评价研究：生物活性肽功能 食品开发等。 在大豆多肽的众多生理活性中，降血压功能备受关注，成为当前研究的一个热点问题。 由于食源性的降血压肽的降压效果温和、专一、持久、安全性高，且对正常血压无影响和毒 副作用，特别适用于作为口服药剂或功能性食品基料添加制成各种保健食品。因此，大豆源 降血压肽的开发和利用已经引起了研究学者的高度重视，必将有着广阔的应用前景。 1 2 高血压 高血压是一种以动脉血管收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，它发病率高，常伴 有心脏、血管、肺以及肾脏等功能性或器质性病变，易引发心脏、脑、肾和眼等多种并发症 和导致中风、动脉硬化、冠心病等疾病。近年来，高血压在世界范围内呈日趋严重的态势， 已经成为生命“第一杀手”，因此防治高血压成为全球医务界面临的一项艰巨任务。 1 2 1 高血压的危害 高血压是心血管病的决定因素，与心血管病发生的危险性呈正相关，脑、心、肾等重要 器官是高血压的主要损害对象，医学上称为高血压的靶器官。高血压可以引起心肌肥厚及心 力衰竭，还可以引起心绞痛及心肌梗死，长期的高血压还会使心室扩张，形成高血压心脏病； 引起脑动脉硬化，最后引起中风，包括脑梗塞和脑溢血；引起肾动脉硬化，影响肾功能，甚 至会导致尿毒症。以上这些疾病，在早期可能没有任何症状。高血压患者一旦出现这些靶器 官的损害，就标志着高血压病正在发展。高血压之所以会引起这些器官损害，主要是由于高 血压使动脉产生了一系列变化，尤其是全身小动脉的长期痉挛，可能使血管壁发生营养不良 性变化，内膜下蛋白性物质沉积，纤维组织增多，中膜肌层肥厚，动脉弹性减低，以致管腔 变窄。由于小动脉内的变化，管腔内的沉积增厚变窄，医学上称此为“玻璃样改变”。全身 各器官组织内的小动脉都会受到影响，其中尤以肾细小动脉最明显。因为小动脉痉挛，血管 外周阻力增加，心脏为了维持畅通的血液循环，必须加倍努力地收缩，才能使血液达到各处， 其结果是心脏过于劳累，左心室肥厚以至扩张。肾脏则因肾小动脉硬化，形成肾缺血，最后 产生高血压素，促使全身小动脉痉挛，这样又加重了高血压，形成“恶性循环”。肾脏长期 缺血，发生营养不良变化，肾功能也会受到影响i l 引。 虽然高血压病的发展是缓慢的，在相当长的时间内，机体可以适应，没有症状。但当高 血压对心血管的损害达到一定程度时，将并发严重的心脑血管疾病，此外由于某些诱发因素 3 江南大学硕士学位论文 或高血压本身的发展，可导致一些高血压患者血压显著或急骤升高，严重危及生命，缩短病 人寿命，所以称为“隐形杀手”【1 3 1 。因此治疗和防治高血压病是当今社会研究的一个热门课 题。 1 1 2 高血压病的治疗 高血压病的治疗原则提倡对于任何一位高血压患者都应该进行采用非药物治疗预防措 施，但重度高血压病，一开始就应同时给予药物治疗，治疗高血压的药物很多，但是对于患 有并发症的高血压病人，应针对特定病人选择合适的药物。例如糖尿病或高血脂的病人，就 不宜使用可能升高血糖或血脂的降压药。心律缓慢或有传导阻滞的病人就不宜使用减慢心律 的药物【1 4 1 。目前临床用于降压的药物多达1 2 0 余种，而且在不断更新发展，但是选择何种药 物治疗以及如何合理使用一直是专家学者寻求解决的课题。 w h o i s h 于1 9 9 3 年达成的最新治疗原则已把抗高血压的一线药物由利尿剂和p 受体阻 断剂扩大到五类，增加三类：血管紧张素转换酶抑制剂( a c e i ) 、钙通道阻滞剂( c a a ) 、 仅受体阻断剂等【1 5 1 。特别是a c e 抑制剂( a c e i ) 是当今降血压药物发展最快的一种。a c e i 是一类有效降压药物，长期用药不产生耐药性，降压的同时仍能保持重要脏器血流供应。其 扩张肾出球小动脉大于入球小动脉，因而对肾脏有保护作用【1 6 1 。在改善心室收缩和舒张功能， 保护缺血心肌，逆转左室肥厚等方面十分有益，对减少患者心血管并发症以及代谢紊乱有重 要价值【1 5 】，对改善脂代谢和糖代谢方面也有良好影响。目前主要的a c e i 药物有卡托普利、 依那普利、赖诺普利等。但由于a c e i 抑制了激肽酶，使缓激肽增多因而易引起干咳，偶见 血管神经性水肿。近年来，血管紧张素i i 受体拮抗剂越来越受到重视，其疗效同a c e 抑制剂， 但不致干咳( 不干扰缓激肽系统) 1 1 6 。同时还有人认为a n gi i 抑制具有双重作用而远非“没 有咳嗽的a c e i ”【1 7 】。在已经上市的a n g i i 抑制剂中，有研究表明洛沙坦能明显减少伴有糖 尿病或不正常的高血压白蛋白尿，并有促进尿酸尿钠排泄的肾脏保护作用，不良反应低于目 前一线药物【1 8 】。但总体来说，药物治疗临床仍有许多不良反应，如降压过度，泌尿系统发生 病变，味觉失真和血管神经性水肿等【1 9 1 。 随着我国经济的不断发展，人民生活水平不断提高，人们的自我保健意识和安全意识的 加强，如何通过非药物疗法达到防治高血压的目的，已为越来越多的人所关注。我国自古就 有“药食同源”的说法，即通过改善饮食状况来预防和治疗疾病，源于食品蛋白的降压肽安 全高效，如将降压肽开发为保健食品，长期服用来预防，缓解和辅助治疗高血压的方式，必 将为人们所接受。 1 3a c e 对血压的调节作用 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是一种含锌的膜结合二肽羧肽酶 ( d i p e p t i d l yc a r b o n o x y p e p t i d a s e ) 2 0 1 ，存在于肺、肾、脑、眼球、小肠、胎盘等组织的血管内 皮细胞或上皮细胞【2 1 2 2 】及血浆、尿等体液中，正常情况下在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰 富【2 3 1 。a c e 也是一种血管内膜细胞核膜糖蛋白【2 4 1 ，相对分子质量为1 2 0 ，0 0 0 1 5 0 ，0 0 0 2 5 1 。a c e 对血压调节起着重要的作用，其一是将血管紧张素i ( a n gi ) 转换为血管紧张素i i ( a n gi i ) ； 其二是同时降解激肽，使之失活。a c e 在人体肾素血管紧张素系统( r e n i na n g i o t e n s i ns y s t e m ， 4 第一章绪论 r a s ) 和激肽释放酶激肽系统( k a l l i k r e i n - k i n i ns y s t e m ，k k s ) 中的调节作用见图1 1 i 2 6 1 。 在人的生理过程中，血压的调节主要是受到r a s 和k k s 一对拮抗体系相互作用控制的。 r a s 是升压系统，由血管紧张素原( a g t ) 、肾素、a c e 及血管紧张素酶原( a t r ) 组成。首先 在肾素的作用下，血管紧张素原c 端失去l e u ，转化为血管紧张素i ，接着a c e 作用于血管紧 张素i ，生成血管紧张素i i 【2 砚7 1 。因此，血管紧张素i 本身没有升高血压的作用，但在a c e 的作用下生成的血管紧张素i i 是肾素一血管紧张素系统中已知的最强的血管收缩剂【2 引，作用 于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效应；同时血管紧张素i i 通过刺激醛固酮分泌 和直接对肾脏作用( 减少肾血流量及促进n a + 、k + 的重吸收) ，引起钠贮量和血容量的增加，也 能使血压升高。与此相反，k k s 是降压系统，又称抗高压因子，其中激肽是降压物质，主要 作用是扩张毛细血管和增加其通透性，达到舒张血管的目的，使血压下降。a c e 具有催化激 肽酶的作用，作用于舒缓激肽使其失去c 末端的p h e a r g 或s e r p r o ，从而使激肽降解为失活 片段，引起血压升高【2 9 】。 r a s 和k k s 在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压有重要 作用，这两者的平衡失调被认为是高血压发病的重要因素之一【3 0 】。a c e 在这两者系统中起重 要作用，a c e 活力升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡，使得血管紧张素i i 生成过 多，而体系中扩张血管物质舒缓激肽和前列腺素合成减少，此三种因素共同存在使血压升高。 抑制a c e 活性对降低血压有积极的影响，因而研究开发有效的a c e 抑制剂引起人们极大的关 注【3 1 1 。 至至 血管紧张素原激肽原 l 一一肾素激肽释放酶一l 血管紧张素i 激肽 血压升高 图1 - 1a c e 对血压的调节作用 f i g 1 - 1t h er e g u l a t i o na c t i o no fa c e o nt h eb l o o dp r e s s u r e 1 4a c e 抑制肽 a c e 抑制肽指的是一类对a c e 有抑制作用的多肽类物质，这些多肽对a c e 的亲和度比血 管紧张素i 或舒缓激肽还要强，而且也较不易从a c e 结合区释放，从而阻碍a c e 催化血管紧 张素i 水解成血管紧张素i i 以及催化舒缓激肽水解成为失活片段的两个过程，起到降 压作用1 3 2 1 。 c u s h m a n 实验室根据竞争性抑制剂与a c e 活性的结合位点提出了模型假说旧，该模型后 来一直被许多研究者用来解释降压肽的作用机理。图l 一2 所示就是该假设模型。 江南大学硕士学位论文 l 靳：i | l 州越奏艇。黼 l l 伊- j 乙i ，象塞_ o 静翻刖 i ； ； 一一 蠢霉洲点i 上糍橱 j 巍强点岛细翻捌 莹a b 童。建，哪。皇。薯。 乏聱譬拿t 擎c h 卜a 争 舭h 4 0 模型中的六角缺口是羧肽酶的活性点，表示酶的疏水袋。a c e 的环形缺1 2 i 表示底物和竞争 性抑制剂的取代基r l 和r 2 与a c e 作用的活性点，x h 表示a c e 活性点的氢键。 该模型认为a c e 与羧肽酶a 的结构相似。a c e 活性点有一个正电荷( 类似于羧肽酶a 的 a r g 1 4 5 ) 可能与底物肽的c 端羧基结合。与正电荷相距一个二肽残基的距离处有一个z n 2 + ( 与 羧肽酶中相距一个氨基酸残基的距离相对) ，可能对肽键的断裂有作用。a c e 对c 端的疏水性 氨基酸没有专一性，因此在活性点不像羧肽酶有一个疏水袋。但是它有2 个环形缺口，可能对 肽底物的两端氨基酸残基( r l 和r 2 ) 有亲和力。另外，a c e 还可能以氢键与底物末端不断裂的 肽键结合。 但严格上区分，a c e 抑制肽和降血压肽并不完全一样，a c e 抑制肽只是在体外对a c e 具 有抑制作用的肽类物质，它不能保证经口服后一定具有降血压的作用；而降血压肽则更强调 经人体或动物实验证实具有抗高血压作用。由于a c e 抑制肽经过人体消化道时会被体内的蛋 白酶水解，一些具有明显较高a c e 抑制活性的肽经水解后，抑制活性降低或完全失活【3 4 1 ；相 反，一些肽段经消化道作用后抑制活性升高【3 5 1 。所以，要想使a c e 抑制肽在体内发挥作用， 必须要保证在其到达作用靶点时，能够保持它的完整形式或被酶解成有活性的片段。除非特 别指明，在本论文中降血压肽和a c e 抑制肽代表同一意思。 1 4 1a c e 抑制肽的结构与功能关系 降血压肽对a c e 抑制活性主要取决于以下2 个因素：多肽的氨基酸组成和结构以及多肽 的分子质量。c h e u n g 等人经研究认为a c e 抑制肽的活性主要取决于c 端氨基酸，c 端氨基 酸为芳香族氨基酸( 包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 和脯氨酸时其抑制活性较高。另外，n 端 为疏水性的撷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸的肽与a c e 的亲和力较强，抑制活性较 高，但是脯氨酸则例外【3 3 1 。最初人们从蛇毒液中分离提取的a c e 抑制肽大多数c 端为脯氨 酸，经动物实验证明降血压效果较好1 3 7 1 。目前从食品蛋白质中分离的多数降血压肽结构上与 6 第一章绪论 上述模型相符，如s a i t o 3 8 1 等人从酒糟中分离了9 种c 端含有t r p 或t y r 的含5 个或更少氨基 酸残基的a c e 抑制肽，分析了i l e - t y r p r o - a r g - t y r 和t y r - g l y g l y - t y r 两种肽段，认为a c e 抑制肽序列中的疏水性氨基酸和肽段的c 端氨基酸对其抑制活性有着重要的作用。但也有不 少抑制活性较强的降血压肽的结构不符合c h e u n g 等降血压肽结构模式，如m a t s u i t 3 9 】等用碱 性蛋白酶酶解沙丁鱼获得的a c e i 主要由酸性氨基酸组成，疏水性氨基酸含量很低。另外， s u e t s u n l 4 0 1 分析了来源于1 5 种鱼贝类a c e i 的氨基酸组成，发现来源于鱼类的a c e 抑制肽含 有丰富的a s p ，g l u ，a r g ，p r o ，i l e 和l y s ，来源于贝类的则富含a s p ，g l y 和l y s 。不同的 氨基酸结构和组成对a c e 的抑制活性差别也很大。另外随着研究进一步深入，越来越多的三 肽、二肽被分离并证实有a c e 抑制作用，这符合a c e 抑制肽主要集中在相对分子质量较小 的部分( 1 5 0 0 以下) 的说法，即除肽的氨基酸序列外，肽的分子大小对其活性也会产生影响。 但是，a c e i 的氨基酸组成和结构与其抑制活性的具体关系尚未研究透彻，有关机理尚不清楚， 可能是不同氨基酸结构的a c e i 与a c e 的活性中心有着不同亲和力的缘故。 1 4 2a c e 抑制肽的评价方法 目前a c e 抑制肽活力主要采用体内( 动物实验) 和体外两种方法进行评价。使用比较广 泛的是1 9 7 1 年，c u s h m 觚和c h e 岫g 建立的紫外分光光度、法【4 。根据a c e 在体内特异性切下肽 c 末端的两个氨基酸的作用原理，选择含有马尿酸( h i p ) 的三肽作为底物，通过测定加入抑 制剂前后所生成马尿酸紫外吸收的差别即可算出抑制活性的大小。但该方法对实验操作要求 甚高，实验易产生误差；第二种是色谱法，此法是通过测定a c e 抑制剂加入前后，马尿酸的 出峰面积的变化来计算抑制率的，该方法具有准确度高，检测时间较短的优点，适合于降血 压肽的快速筛选。但是测定成本高，不适于推广；第三种是可见分光光度法，将a c e 作用的 底物由含有马尿酸的三肽换为蓝色的f a p g g ，在a c e 作用后光吸收减弱，通过光吸收减弱的 程度来评价a c e 抑制肽的活性，相较前两种方法此法更加方便实用【4 2 1 。此外有研究学者提出 了用酶偶联法测定a c e 抑制肽活性，此法以h i p g l y g l y 为底物，生成h i p 和双甘肽，再加入 l y 谷氨酰3 羧基- 4 硝基苯胺( g g c n ) 和y 谷氨酰基转移酶( g g t ) ，催化生成3 羧基4 硝基 苯胺，于4 1 0 n m 检测光吸收，此法操作简便，重复性好【4 3 1 。 1 4 3 源于大豆的a c e 抑制肽 1 4 3 1 降血压大豆肽的研究现状 关于大豆来源的a c e 抑制剂国内外已有很多报道郴】，d z i u b a 等研究发现大豆蛋白酶解 物能抑制a c e 活性，因而具有良好的降血压作用。1 9 9 8 年，吴建平从大豆水解物中分离出 a s p l e u p r o ( a l p ) 和a s p g l y ( a g ) 两种a c e 抑制肽，并证实此二种肽对s h r 鼠有显著降 压效果，但对正常鼠无显著影响。2 0 0 4 年，张国胜等人以大豆分离蛋白为原料，选用4 种商业 蛋白酶水解获得大豆蛋白a c e 抑制肽，并以水解度为指标设计正交实验得出，在p h 值为8 o ， 温度为4 5 ，酶与底物浓度比6 时，水解4 8 0 m i n 得到的a c e 抑制肽活性最强。z a e l k 等利用 高效液相色谱分析得到了a c e 抑制活性最强的片段，其氨基酸序列为h i s h i s l e u ( h h l ) ，注 射5 m g l ( g b w 能显著降低心脏收缩血压6 1m m h g ( p o 0 1 ) ，表明大豆蛋白中获得的a c e 抑制 肽h h l 在体内具有抗高血压活性。 7 江南大学硕士学位论文 1 4 3 2 降血压大豆肽的酶解制备 利用食品蛋白质制取活性多肽的方法中：( 1 ) 酸碱水解：工艺简单、成本低廉，但因在 生产过程中酸水解会生成有毒物质，碱水解产物有异味，并且水解程度难于控制，氨基酸受 损严重因而较少应用；( 2 ) 化学合成活性肽：采用液相或固相化学合成法可制取任意需要的 活性肽，但因成本高、副反应物及残留化合物多等因素而制约其发展；( 3 ) 基因重组法制取 活性肽：采用d n a 重组技术制取活性肽也存在宿主的特异性，表达产物的分离纯化困难等诸 多限制条件；( 4 ) 酶法生产活性肽：相比之下酶水解具有条件温和，对蛋白质的营养价值破 坏小，水解过程容易控制，最重要的一点是能对蛋白质进行定位水解而产生特定生理活性的 肽类，因而已成为最主要的生产方法。 具有a c e 抑制作用的大豆肽可以通过酶解大豆蛋白质而获得。酶法生产降血压大豆肽工 艺一般流程为：选择原料蛋白_ 预处理_ 酶解_ 精制_ 成品。其中酶的选择是a c e 抑制肽生 产的关键。由于不同的蛋白酶对蛋白质的水解方式不同，水解产物中的多肽也有区别，获取 的a c e 抑制肽的数量与活性有较大的不同。应根据酶的专一性从众多的蛋白酶中进行筛选。 随着酶工程技术和生物技术的发展，已有大量的蛋白酶问世，植物蛋白酶( 如木瓜蛋白酶、菠 萝蛋白酶) 、微生物蛋白酶( 如枯草杆菌蛋白酶) 、动物蛋白酶( 如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶) 均已能工业化生产。这为酶的筛选提供了广阔的空间。酶法生产降血压肽的下游技术主要包 括分离、精制和分析试验。由于目标活性肽在生产反应体系中含量甚微，传统分离技术往往 无能为力，必须采用吸附分离、色谱分离、超滤膜分离、反渗透等现代分离技术和脱色、脱 臭、脱苦等提纯精制技术1 4 9 1 。目前国内外已经出现数家大豆肽制品加工企业，在大豆肽的研 究与开发方面也取得了一定的进展。 1 4 3 3 存在的问题与难点 ( 1 ) 虽然目前对大豆蛋白的酶解机理已有一定研究，但在生产中往往与实验结果不一致。 这就要求对蛋白质酶解机理与过程控制能进行系统深入研究，为制备降血压多肽的水解工艺 控制提供科学理论指导。 ( 2 ) 肽的分离纯化是a c e i p 产品产业化的主要难题。要得到高活性、高疗效的a c e i p 产品， 就要对蛋白质酶解产物进行反复的分离提取，工业上采用层析分离等手段对多肽进行提取纯 化成本较高。 ( 3 ) 多肽的结构与抑制a c e 活性的机理仍有待深入研究。多肽对a c e 活性的抑制作用与 多肽的结构有关，因而对高活性的a c e i p 结构模型的研究极为重要。 ( 4 ) 多肽抑铝j j a c e 的活性与其实际降血压功能的关系仍有待深入研究。由于测定速度快， 目前对a c e i p 的开发是以其抑铝t j a c e 的活性( i c 5 0 ) 大小作为筛选指标的，但也发现i c 5 0 的大小 与动物实验降压功能的强弱结果不一致的现象，说明多肽的a c e 抑制活性与实际降血压功能 有时仍有出入。一个重要的原因是口服后肽在动物消化道被进一步分解，使多肽的结构发生 了变化，多肽抑铝t j a c e 的活性与其实际降血压功能的关系仍有待深入研究。 1 5 立题背景及意义 近年来，大豆的保健功能作用越来越受到世人关注，大豆多肽亦是其中的佼佼者。美国、 8 第一章绪论 日本等国相继开展了大豆多肽的生产和应用研究。大豆多肽作为一种生物活性肽拥有特殊的 生理功能：降胆固醇、降血压、促进脂肪代谢和抗肥胖、增强运动员肌肉及恢复疲劳、促进 矿物质吸收、抗氧化、促进抗双歧杆菌和乳酸菌增殖等。其中具有降血压作用大豆血管紧张 素转化酶( a c e ) 抑制肽备受关注，成为当前研究的一个热点问题。据世界卫生组织估计， 全球患高血压的人数已愈5 亿，同时，它又是冠心病、心及肾功能衰竭的最主要的发病因素。 因此，防治高血压成为全球医务界面临的一项艰巨任务。在高血压人群中有占9 5 以上的患 者是原发性高血压，通过抑制a c e 酶活性可有效地降低原发性高血压，目前合成的a c e 抑制 剂虽能有效地降低高血压，但临床表现有许多不良反应。 随着人们对自身保健意识的不断增强，人们已不仅仅满足于药物的治疗效果，对其安全 性也越加关注了。食物蛋白源的降血压肽安全性很高，只对高血压患者起到降压效果，而对 血压正常者无降压作用，降压作用平稳而温和。同时还具有多功能生理活性和易吸收的特点， 所以开发具有降血压功能的大豆功能性食品具有非常广阔的前景。 有报道表明具有生物活性的大豆肽尤其是a c e 抑制肽的n 端的疏水性氨基酸对于肽正确 地进入a c e 酶的活性中心是必要的，因而亲水性的肽段的a c e 的抑制活性就