（食品科学专业论文）小麦印度腥黑粉菌线粒体基因组制备与全序列分析.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 小麦印度腥黑粉菌i i l l e t i ai n d i c am i t r a 是小麦的一种重要真菌病 原物，同时也是一种世界范围内的检疫性有害生物。由于其冬孢子形 态特征和近似种非常相似，故仅依靠冬孢子形态特征难以准确鉴定。 尽管近年来分子生物学方法开始应用于小麦印度腥黑粉菌的鉴定，但 它和近似种黑麦草腥黑粉菌zw a l k e r i 在i t s 序列上也仅有一个碱基 的差异。而线粒体基因组作为细胞核外的遗传系统，具有完整性、多 态性、自主性和小型性等特点，其进化速率是核基因的5 1 0 倍，常 用于系统发生学和群体遗传学的研究。因此，对小麦印度腥黑粉菌线 粒体基因组全序列的研究，既可以分析其基因组成、基因排列和基因 结构特点及其进化特点，也可以通过腥黑粉菌不同种之问的系统分 析，进一步阐明小麦印度腥黑粉菌线粒体基因的遗传变异特征，从而 为小麦印度腥黑粉菌的检测鉴定提供分子生物学方面的依据。 本论文建立了简易快捷的真菌线粒体d n a ( m t d n a ) 的提取方 法，测定和分析y d , 麦印度腥黑粉菌线粒体基因组全序列，并对物种 间线粒体基因的进化特点和系统演化进行了分析。主要内容包括： 1 小麦印度腥黑粉菌m t d n a 的提取。利用两次氯化铯密度梯 度超速离心分离得到了小麦印度腥黑粉茵的m t d n a ；酶切结果证实 是m t d n a 。 2 小麦印度腥黑粉菌线粒体基因组的分析。 ( 1 ) 全序列及其结构分析：通过构建线粒体d n a 文库，测得 其基因组全长为6 51 4 7b p ( g e n b a n k 登录号：d q 9 9 3 8 1 4 ) ，衄含量为 江苏大学硕士学位论文 7 1 1 4 。包含1 4 个蛋白质编码基因，2 个r r n a 基因，2 4 个t r n a 基因。其组成和其它4 种担子菌线粒体基因组基本相同，但基因排列 差异很大。 ( 2 ) t r n a 的组成及二级结构分析：包含2 4 个t r n a 基因， t r n a - s e r 与t r n a - a r g 各有2 个，3 个t r n a - m e t ，其它1 7 种t r n a 都只有1 个，并绘制了各种t r n a 的二级结构。 ( 3 ) 蛋白质编码基因的分析：共编码1 4 种疏水性蛋白质多肽， 包括细胞色素b ( c y t b ) ，3 个a l p 酶的亚单位( a 印6 、a t p 8 、a t p 9 ) ，3 个 细胞色素c 氧化酶( c o x l 、c o x 2 、c o x 3 ) ，7 个n a d h 还原酶 复合体的亚单位( n a d l 、n a d2 、n a d3 、h a d 4 、n a d 4 l 、h a d 5 、n a d 6 ) 。 它们的起始子都是a t g ，终止子有1 1 个为t a a ，3 个为t a g 。其中 5 个( 即n a d l 、h a d 4 、n a d 5 、c o x l 、c y t b ) 有内含子，9 个为单一的基因 ( 即a t p 6 、a t p 8 、a t p 9 、c o x 2 、c o x 3 、n a d 2 、h a d 3 、n a d 4 l 、h a d 6 ) 。 3 小麦印度腥黑粉菌线粒体基因组进化分析。对zi n d i c a 的线粒 体基因a t p 6 和c y t b 以及g e n b a n k 中各真菌的对应基因进行同源性比 较，并构建了a t p 6 和c y t b 基因序列的系统进化树，为腥黑粉菌的分 类鉴定提供了参考。 关键词：小麦印度腥黑粉菌，线粒体基因组，m t d n a 提取，序列分析 江苏大学硕士学位论文 死l l e t i ai n d i c am i t r a ，a sa l li m p o r t a n tp e s ta r o u n dt h ew o r l dw h i c h c a u s e sk a m a lb u n to fw h e a t ，w a sv e r yc l o s e dt ozw a l k e r ii n p h y l o g e n e t i c r e l a t i o na n dm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s m o l e c u l a r b i o l o g ym e t h o d sa p p l i e dt oi d e n t i f i c a t i o no f zi n d c aw i t h i n1 0y e a r s w h i c hh a st h ed i f f e r e n c eo fo n l yo n eb a s ew i t ht h er e l a t e ds p e c i e s z w a l k e r ii nt h es e q u e n c eo fi n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s a sau n i q u e c y t o p l a s m i cg e n e t i cs y s t e m , m i t o c h o n d f i a ld n a ( m t d n a ) i sak i n do f c o m p l e t e ，s m a l l ，s e r f - r e p l i c a t i n ga n dd i v e r s eg e n o m e ，w h i c hh a sf a s t e r e v o l u t i o no f5t o1 0t i m e st h a nn u c l e a rg e n o m e ，o f t e nb eu s e dt oa n a l y s i s t h e p h y l o g e n e s i s a n d g e n e t i cr e l a t i o n s h i p t h es t u d y o nt h e m i t o c h o n d r i a lg e n o m ec o m p l e t es e q u e n c eo fzi n d i c aw i l lh e l pt o a n a l y s et h eg e n o m ec o m p o s i t i o n , g e n eo r d e r , s t r u c t u r ea n de v o l u t i o n c h a r a c t e r so fzi n d i c a ；m o r e o v e r , p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fd i f f e r e n t s p e c i e si ng e n u sl i l l e t i ac a nf u r t h e re x p l a i nt h eg e n e t i ca n de v o l u t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c sb e t w e e nzi n d i c aa n do t h e rs p e c i e s t h i sp a p e rc o n s t r u c t sam e t h o dw h i c hi s o l a t e sf u n g im t d n a s i m p l e a n d r a p i d t h ec o m p l e t e m i t o c h o n d r i a l g e n o m eo f zi n d i c aw a s s e q u e n c e dt oa n a l y s et h ee v o l u t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp b y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i po fzi n d i c a ，i n c l u d i n g ： 1 i s o l a t i o no ft h em t d n ao fz i n d i c a m t d n ao fzi n d i c aw a so b t a i n e d b y t h em e t h o do fc s c l b i s b e n z i m i d e d e n s i t yg r a d i e n t s 江苏大学硕士学位论文 u l t r a c e n t r i f u g a t i o n , a n dw a sp r o v e db yt h ed i g e s t i o no fr e s t r i c t i o n 2 a n a l y s i so ft h ec o m p l e t em i t o c h o n d r i a lg e n o m e f o rzi n d i c a ( 1 ) m i t o c h o n d r i a lg e n o m ea n di t ss t r u c t u r e ，t h em t d n a i s6 51 4 7b p w i t h7 1 1 4 a t ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o d q 9 9 3 1 8 4 ) b yc o n s t r u c t i n g t h ed n a l i b r a r y i tc o n t a i n s1 4k i n d so fp r o t e i n - c o d i n gg e n e s ，t w ok i n d s o fr i b o s o m a lr n a s , 2 4t r a n s f e rr n a s c o m p a r e dw i t hf o u rk i n d so f b a s i d i o m y c e t e s ，i t sg e n o m e sc o m p o s r i o ni st h es a m e ，b u tt h eg e n eo r d e r i sg r e a t l yd i f f e r e n t ( 2 ) c o m p o s i t i o na n ds e c o n ds t r u c t u r eo ft r a n s f e rr n a s ，i tc o n t a i n s2 4 t r a n s f e rr n a s t r n a - s e ra n dt r n a - a r gh a v et w ok i n d se a c ho n e ， t r n a - m e th a st h r e ek i n d s ，a n dt h eo t h e r1 7k i n d so ft r n ah a v eo n l yo f l e k i n di n d i v i d u a l l y t h es e c o n ds t r u c t u r eo fr n ai sm a d eb yt h es o f t w a r e ( 3 ) p r o t e i n - c o d i n gg e n e s ，i tc o n t a i n s1 4k i n d so fh y d r o p h o b i cp r o t e i n a l t o g e t h e r , s u c h a sg e n e sc o d i n gf o rc y t o c h r o m e b ( c y t b ) ，a t ps y n t h a s e6 ，8 ， a n d9s u b u n i t s ( a t p 6 ，a t p 8 ，a t p 9 ) ，c y t o c h r o m eco x i d a s e1 ，2 ，a n d3 ( c o x l ， c o x 2 ，c o x 3 ) ，n a d hd e h y d r o g e n s s e1 ，2 ，3 ，4 ，4 l , 5 ，a n d6 ( n a d l ，n a d 2 ， n a d 3 ，n a d 4 ，n a d 4 l , n a d 5 ，n a d 6 ) a l lt h ei n i t i a t o ra r ea t g ；1 1k i n d so f t e r m i n a t o rw i t ht a aa n dt h r e ew i t h 劢g5k i n d so fg e n e sh a v e i n t r o n ( n a m e l yn a d l ，n a d 4 ，n a d 5 ，c o x l ，c y t b ) ，a n d9k i n d sa l es i n g l eg e n e ( n a m e l ya t p 6 ，a t p 8 ，a t p 9 ，c o x 2 ，c o x 3 ，h a d 2 ，n a d 3 ，n a d 4 l , n a d 6 ) i v 江苏大学硕士学位论文 3 e v o l u t i o no fm i t o c h o n d r i a lg e n o m ef o rz i n d c a b a s e do nt h e s i m i l a r i t yo fg e n e sa t p 6a n dc y t bo fzi n d c aw i t hr e l a t e ds e q u e n c eo f o t h e rf u n g ii ng e n b a n k , t h ep h y l o g e n e t i ct r e e so fg e n ea t p 6a n dc y t b w e r em a d et ob er e f e r e n c ef o rc l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr e l a t e d s p e c i e s k e yw o r d s ：t i l l e t i ai n d i c am i t r a ，m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ，e x t r a c t i o n o f m t d n a , s e q u e n c ea n a l y s i s v 江苏大学硕上学位论文 缩写释义 开放阅读框 随机扩增多态性d n a 限制性片段长度多态性 扩增片段长度多态性 内转录间隔区 聚合酶链式反应 碱基对 千碱基对 乙二胺四乙酸二钠 双蒸水 十二烷基硫酸钠 十六烷基三甲基溴化铵 溴化乙锭 光密度 马铃薯葡萄糖琼脂 r n a 酶 t r i s 醋酸电泳缓冲液 t i i s 缓冲液 三( 羟基甲基) 氨基甲烷 吣一一一璐嗽印勋一一哪一髓姒眦忸詈 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编本学位论文。 保密口 本学位论文属于，在年我解密后适用本授权书。 不保密留 学位论文作者签名：周业琴 却7 年5 月f f 日 指导教师签名：专关 盆。o _ ) 年6 月f ，日 独创性申明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过得作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：凰业琴 日期：加7 年g 月7 日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1小麦印度腥黑粉菌简介及其研究概况 小麦印度腥黑粉菌f 死抛砌打l d m i t r a ( = n e o v o s s i ai n d i c a ( m i t r a ) m u n d k u 0 】 不仅是小麦上的一种重要病原菌，而且是一种世界范围内的检疫性有害生物。迄 今为止，已有多个国家包括我国已将该病菌列为检疫性有害生物 1 , 2 1 。1 9 3 0 年， 印度西北部h a r y a n a 邦k a m a l 地区首次发现印度腥黑穗病1 3 1 ，当时仅是一种不 为人注意的地方性病害，之后由于种植感病品种，改变栽培措施以及遇到适宜的 气候条件，该病于七十年代扩展到了印度北部的小麦主产区【4 】。1 9 7 2 年由于引种 的原因传入墨西哥【5 】。1 9 9 6 年3 月美国在亚利桑那州报道了该病的发生，立即引 起了至少2 8 个国家因此限制或禁止了从美国进口小麦，从而严重影响了年出口量 占世界1 3 ，价值高达5 0 亿美元的美国小麦的国际贸易 6 1 。2 0 0 1 年又扩展到了南非 7 1 。在近七十年的时间内，小麦印度腥黑粉菌从一个地方性病害逐渐扩展为世界 范围的检疫性有害生物，引起了世界主要小麦生产国家的高度重视。小麦印度腥 黑粉菌主要危害小麦( t n t c u ma e s t v u m ) ，不仅影响小麦的产量，使一些田块的损 失高达8 9 嘲；降低小麦种子的萌发率睁1 1 】，更重要的是影响了小麦的品质，小 麦中如含有3 的病粒，由此加工的面粉因有鱼腥味的三甲胺而不能食用。目前 该病在印度、巴基斯坦、伊朗、伊拉克、尼泊尔、阿富汗、墨西哥、美国和南非 等地均有报道1 6 , 1 2 1 。小麦印度腥黑粉菌可以种传、士传和气传n 3 1 ，主要以病粒或 附着于种子上的病菌冬孢子的方式作远距离传播，可随小麦种质资源交流和小麦 原粮贸易进行传播。该病菌冬孢子抗逆性极强，可在土壤中存活3 5 年【1 4 1 ，一 旦传入无病新区，极难根除。 小麦印度腥黑粉菌的冬孢子很容易与混入小麦中的水稻种子、黑麦草种子 和其它杂草种子上的腥黑粉菌冬孢子相混淆，这些冬孢子的形态特征相似，不易 区别。s m i t h 报道了美国南部港口出口小麦的一份抽样检查结果，显示有8 的小 麦船携带有水稻腥黑粉菌( z o 州砌) 【1 5 1 ；s m i l a n i c k 等报道美国在1 9 9 6 年对小麦 印度腥黑粉菌进行全国调查时发现在美国东南部的小麦样品中存在类似小麦印 度腥黑粉菌的冬孢子，这种后来被证明在黑麦草上的腥黑粉菌( zw a l k e r 0 在美国 江苏大学硕士学位论文 俄勒冈州发生十分普遍，在所检查的种子中有6 0 带有此病菌，并且这种腥黑粉 菌在澳大利亚也有分布报道【1 6 1 。由于小麦印度腥黑粉菌病菌与其近似种区别十 分困难，曾导致加拿大于1 9 8 8 年禁止所有来自美国华盛顿州的麦类和草种的进口 【 】，原因是加拿大从美国进口的雀麦草种子中发现一种和小麦印度腥黑粉菌十 分相近的腥黑粉菌，后来找到了该病菌的冬孢子并证明其为污染了雀麦的水稻腥 黑粉菌，才使得这一禁令得以解除。对带有小麦印度腥黑粉菌的贸易性小麦原粮 的检测与鉴定的关键点( 也是难点) 在于如何区别小麦印度腥黑粉菌与其形态学 上的近似种。这个问题的解决与否将直接影响检验结果的准确判定，进而也关系 到小麦印度腥黑粉菌疫区的划分，甚至影响到小麦原粮的贸易。为了寻求解决小 麦印度腥黑粉菌的检测和鉴定办法，避免因小麦印度腥黑粉菌的传入而影响小麦 生产和小麦贸易。自1 9 8 3 年以来，美国的一批科学家做了不少研究并取得了一些 进展。b o n d e 等报道了运用同功酶检测zi n d i c a 的研究结果，该方法需要相当丰 富的经验来解释酶的多态性，在常规检验中应用有限。p e t e r s o n 等根据腥黑粉菌 冬孢子的测量数据与其近似种的区别，初步建立了一种逻辑指数模型的形态学实 验方法，后来美国报道的黑麦草腥黑粉菌的孢子大小和小麦印度腥黑粉菌十分近 似，使该方法丧失了应用价值【l 钔。c a s t r o 等报道了从被zi n d i c a 污染的小麦中 提取zi n d i c a 冬孢子的技术，即：过筛和离心方法，提高了zi n d i c a 的检出率 1 9 1 。f e r r e i r a 等分离到一种专化性的线粒体d n a 片段 2 0 l 。s m i t h 等根据线粒体d n a 的序列分析设计了对zi n d i c a 的专化性引物，并建立了zi n d i c a 的p c r 检测方 法1 1 3 】，该方法可以特异性地区分zi n d i c a 和zh o r r i d a ，但无法区分zi n d i c a 和黑麦草上的腥黑粉菌伍w a l k e r o 2 ”。p i m e n t e l 等根据r a p d ，p c r - r f l p 实验 报道了zw a l k e r i 与zi n d i c a 在分子生物学方面的区别情况【捌，得出不完全一 致的结果，r d n a 的p c r r f l p 分析表明：zw a l k e r i 和zi n d i c d 有9 0 的相 似性，它的酶切位点s c a l 是zi n d i c a 及其它近似种所没有的；而r a p d 的分 析则表明：它们仅具有2 5 的相似性。 在分类方面，小麦印度腥黑粉菌及其大多数近似种的分类地位一直都很混 乱，处于t d l e t i a 和n e o v o s s i a 之间摇摆不定。小麦印度腥黑粉菌在形态特征 和萌发特征方面除了与黑麦草腥黑粉菌和稻粒黑粉菌相近似外，还与狼尾草腥 黑粉菌( zb a r c l a y a n a ) 、狗尾草黑粉菌征s e t a r i a e ) 、zs u m a t i i ，zo p a c a 和z 2 江苏大学硕士学位论文 s a m l d 等十分相似，它们的冬孢子的表面纹饰均有疣状突起，孢子大小也有明 显交叉重叠，孢子萌发时也均产生担子，担子产生不交接的担孢子n , 2 3 - 2 9 。小麦 印度腥黑粉菌及其近似种的分类地位不稳的原因在于对t i l l e t i a 和n e o v o s s i a 的界定主要存在两种不同的观点，一种观点认为这两个属的主要区别在于： 矗l l e t m 冬孢子萌发时产生的担孢子少，担孢子能相互结合形成“h ”形结构， 而n e o v o s s i a 冬孢子具有无色长附属物，孢子萌发时形成的担子( 先茵丝) 产生大 量的初生担孢子，它们不相互结合。另一种观点，主要以凌立、俞大绂及d u r a n 和f i s h e r 为代表，认为担孢子产生的数量和是否相互结合成“h ”形结构这两 个特征并不可靠，不能用于区分t d l e t i a 和n e o v o s s i a 这两个属。v 五n k y 虽然 在1 9 8 7 年所撰写的 i l l u s t r a t e dg e n e r ao fs m u tf 咖西d o l 和在1 9 9 4 年撰写的 ( e u r o p e a ns m u tf u n g i ) 1 中认为乃l l e t i a 和n e o v o s s i a 主要区别在于豇l l e t i a 产生的初生担孢子数比n e o v o s s i a 少，h l l e t i a 为系统侵染，而n e o v o s s i a 则为 局部侵染，但他后来的研究发现一些介于这两属之间的近似属，故认为对t i l l e t i a 和n e o v o s s i a 这两个属的划分问题至今难以解决，他倾向于将除批m o l i n i a e 外 的所有腥黑粉菌置于t i l l e t i a 中，现阶段大部分学者都接受此分类观点。导致小 麦印度腥黑粉菌及其近似种的分类、检测和鉴定难于找到理想的方法的主要原 因在于这类菌用于分类的性状十分有限，而且其冬孢予大小也常常交叉重叠。 因而，要解决这一难题，必须寻求新的方法，包括借助分子生物学的最新研究 成果，全面、系统地研究这类真菌之间的亲缘关系。 1 2 核酸序列分析在真菌分类鉴定中的应用 真菌是一类种群数目庞大的微生物，传统分类鉴定主要依据形态学。但是 有些真菌形态极为相似，传统的形态学特征有时难以区分，这给真菌的鉴定和 分类带来了困难，有必要采用分子生物学手段来协助形态学特征进行分类鉴定， 使形态学鉴定更加准确和完善。其中，核酸序列分析由于其所具有的许多优点， 近些年来在真菌的系统发育研究中被广泛应用。 核酸序列分析能被广泛应用于真菌的系统发育研究，主要归因于核酸序列 分析有以下优点：分析的是其基因型，而不是表现型，更能反映其遗传本质； 对于一个要解决的问题，可以根据进化速率或遗传的方式，选择一个或多个 3 江苏大学硕士学位论文 适合的序列片段；在多数情况下采用的方法对各种d n a 都是适用的；可 以从很少量的组织中制备d n a 且d n a 性质稳定。这一点意味着对一些稀有的 或濒于灭绝的种类可以在不破坏样品的前提下，获得其遗传信息，甚至有时可 用来分析已灭绝的分类单元；进行核苷酸序列比较所使用的性状核苷酸数量 很大，这就大大增加了解决不同问题的能力；不同实验室的研究结果可以直 接比较，已发表的序列资料可存贮在电子数据库中，如g c n b a n k 等，当需要时 可以直接从互联网络中查到，可以不需要获得前人研究所用的菌株或进行克隆， 以及进行重复实验。由于以上这些优点，利用核酸序列分析进行真菌系统学研 究在近年得到了飞速发展。 分子性状与其他性状，特别是形态学性状是一种辨证关系，可以互为证据。 一方面利用分子信息可以促进对形态性状进化过程的理解，证实形态学进化方 面如趋同进化、平行进化的一些假说。并不能简单的认为分子性状比其它性状， 如形态学性状、生理学性状及生态学性状等更优越。另一方面，如果分子信息 与用形态学性状建立并认为较完善的理论相矛盾，分子信息可能就有问题。分 子系统学并不能解决所有与生物系统发育有关的问题，这是因为分子本身也存 在一定的局限性：尽管不断发现新的分子特征的潜力是巨大的，但是某一特 定的分子信息可能缺乏解决真菌某一类群系统发育历史所必需的一些形状。 某一分子的系统发育历史可能和这种生物的系统发育历史是不同的 3 2 , 3 3 。其它 一些因素也可能导致某种系统发育方法不能揭示正确的系统关系。例如，分子 信息可能被饱和，因而缺乏充分的信息；选择样品的错误，包括分类单位选择 和资料的数量等。建立自然的生物进化的系统发育关系一直是系统学家追求的 目标，这个目标可能只有在更多的分子性状、形态学性状、生理学性状、生物 化学性状的不断发掘及对这些性状的综合比较才能达到。 1 3 线粒体基因组概述 1 3 1 线粒体基因组的特点 线粒体d n a ( m t d n a ) 结构与细菌质粒d n a 有些相似，为闭环双链的螺旋环 状分子( 少数原生动物和高等植物为双链线型分子) 洲。线粒体d n a 的含量相当于 核d n a 的1 2 嗍。一般说来，动物的m t d n a 较d ，约1 5 1 8 曲【3 4 1 。线粒体 4 江苏大学硕士学位论文 基因组的大小在真核生物中差别很大( 表1 - 1 ) ，从迄今检查过的物种可看出动物 界除原虫外是比较恒定的，多数为1 5 曲左右。在真菌中，线粒体基因组大小在 不同种内存在较大差异，从1 8 9 1 0 9 0k b 。植物的m t d n a 变化较大，从1 2 7 妨洲，高等植物变异幅度更大，同一科( 葫芦科，c u c u r b i t a c e a e ) 不同种的线粒体 基因组大小可相差7 倍3 6 1 。 从1 9 8 1 年测定了人类线粒体基因组的全序列至今 3 7 1 ，已有多种动物及植物 的线粒体基因组全序列被测定。例如，h e x a p o dt e t r o d o n t o p h o r ab i e l a n e n s i s ， c e p h a l o p o dm o l l u s kn a u t i l u sm a c r o m p h a l u s ， a r t i c u l a t eb r a c h i o p o dt e r e b r a t a l i a t r a n s v e r s a ，s p o t t e da s p a r a g u sb e e t l ec d 瑚啦d u o d e c i m p u n c t a t a ，f u n # c r y p t o c o c c u a b e o f o r t n a b $ v a r g r u b u ，s c h i z o p h y l l u mc o n l m u n f ，c r i n i p e l l i s p e r n i c i o s a 和u s t i l a g o m a y d s 等。从已发表的序列来看，以人为代表的哺乳动物线粒饲q ) n a 的利用率较 高，除了与d n a 复制起始有关的区域d 环( i ) l o o p ) 外，整个线粒体d n a 基因组 上的基因之间无间隔区，基因组中也无内含子，甚至有基因重叠现象。 表1 1 线粒体基因组的大小d 6 1 t a b l el - 1t h es i z eo f m i t o c h o n d r i a lg e n o m e 此外，研究测序结果表明脊椎动物线粒体基因组的长度多在1 6 曲左右，环 状双链，根据线粒体d n a 在氯化铯密度梯度离心中双链密度不同分为重链( h - 链) 和轻链( l 链) ，它由1 3 个蛋白质基因、2 个r 鼢4 a 基因、2 2 个t r n a 基因、控制区p 环区) 和轻链复制起始区组成，除一个蛋白质基因d 6 ) 和8 个t r n a 基因由l 链编 码外，其余大部分基因都由h - 链编码【3 舯。 5 江苏大学硕士学位论文 植物线粒体d n a 中由其编码的少数基因是其它线粒体d n a 所没有的，如线 粒体的5 sr r n a 、a t p 酶的d 亚基等。植物的线粒体基因中，基因的排列变化很 大，甚至在相近的属之间，基因的排列顺序也各不相同，人们用限制性酶谱证实 了在植物线粒体基因组中的这种易变性。这种现象的出现是由于植物线粒体中有 一个非常活跃的重组系统【3 9 1 。植物线粒体基因组的同源重组所导致的结构重排， 往往是由线粒体d n a 上双向或反向重复序列的参与而引起的 4 0 i 。 真菌线粒体基因组的大小介于动物与植物的线粒体基因组之间，变化较大， 甚至在关系较近的类群中，都可有相当大的变化范围，从w i n ey e a s t h a n s e n i a s p o r ai l p a r u l f l 的1 8 9k b 到c r i n i p e l l i s p e r n i c i o s a 的1 0 9 妨。影响基因 组大小的有以下一些因素：基因问隔的长度、基因编码部分的长度多态性、内 含子的存在与否、重复序列的存在及其数量、基因组片段的倍增、一些新的可 读框( o r f ) 的存在等。不同种类的真菌基因排列顺序有很大的变化f 4 ”。较小的 真菌基因组f 如& p o m b e 和zg l a b r a t a ) 的基因排列也是较紧密的。与动物不同 的是：随着基因组变小，内含子的数量减少，最小的基因组中，也有个别基因 具有内含子【4 1 4 2 】。内含予在真菌线粒体基因组中是普遍存在的，其含量变化很 大，以至连物种特异性都没有，即一个株系中某个基因的内含子在同种的另一 个株系中就不存在了f 4 3 】。在基因间隔较大的种类中，可以在其间隔区域找到一 些较短的重复序列，并在整个基因组中都有分布。 真菌线粒体基因组通常是母性遗传【4 5 】，多为双链、环状或线性d n a 分子， 环状居多。例如，h y a l o r a p h i d i w nc 扪砸加行拥有线性的m t d n a ，p e n i c i l l i u m m a r n e f f e i 的m t d n a 则是环状分子。g e n b a n k 中已公布的4 2 个真菌线粒体基因 组中，5 个为线性，3 7 个为环状。 线粒体基因组通常编码的基因有呼吸链上的疏水亚基、核糖体心姨大亚基 基因、核糖体r n a - b 亚基基因以及t r n a s 4 6 i 。动物线粒体基因组编码的全部多肽 通常包括：细胞色素b 基因( c y t b ) 、细胞色素c 氧化酶三个亚基的基因f c o x l 、c o x 2 、 e o x 3 ) ，n a d h 氧化还原酶七个亚基的基l 习( n a d l 、h a d 2 、n a d 3 、n a d 4 、n a d 4 l 、 h a d 5 和n a d 6 ) 和a t p 酶两个亚基的基因( a t p 6 和a t p 8 ) 。绝大多数的真菌除了含有以上 同样的基因组成外，还含有编码a t p 酶第9 亚基的基因( a t i 9 ) 。a t p 9 租v e u r o s p o r a c r a s s a 和a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 的核基因组以及线粒体基因组中都有发现【4 7 ，船】， 6 江苏大学硕士学位论文 但在最大的线粒体( p o d o s p o r a 口船p 砌西基因组中却没有发现。 真菌线粒体基因组中，含有普通的开放阅读框( o r f ) 和编码含有少f 5 0 个氨 基酸的多肽的潜在的开放阅读框o r f s ( u r f s ) 。许多真菌线粒体基因组还编码核 糖体r n a t j 、亚基的蛋白质基因嗍。最初襁c e r e v i s i a e 中确认的基因v a t l ，以其 第二种形式存在于mc r o 噶$ a 中。在a l l o m y c e sm a c r o g y n u s 中也发现了存在于细菌 中的糖体r n a 4 , 亚基蛋白质基因( i p s 3 ) 。 线粒体基因组中一个显著的差异就是t r n a 基因的数量不同。根据一个不确 定的假说怿o l ，高等真菌的线粒体基因组编码全部的t r n a 基因，这些基因足够阅 读所有的密码子。相反，一些壶菌，像融枷锄驰栅刖蝴觚或h y a l o r a p h i d i u m u r v a t u m 仅有七到八个t i t n _ a 基因。这有可能是因为其他的t r n a 基因是由核基因 组编码，然后再转移到线粒体中的缘故【5 ”。 真菌线粒体基因组的大部分基因是由同一条链所编码的，并且基因排列的顺 序变化很大，这可能是由m t d n a 较高的重组率所引起的。一个共同的特征是 t r n a 基因经常聚集在一起，这些报n 姘分散在整个基因组中。真菌线粒体基因 组中，密码子的第三位点偏向于a 或t 的现象普遍存在【铋，但是也有许多物种偏 离这一通用密码子 5 3 , 5 4 。终止密码子t g a ，在许多子囊菌中被翻译成色氨酸，然 而在许多低等真菌中，t g a 被翻译成亮氨耐5 5 】。在许多c a n d i d a 中，通用的编码 亮氨酸的密码子c r g 被翻译成丝氨酸【5 6 1 。 1 3 2 线粒体基因组与核基因组的相互关系 线粒体基因组( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 与细胞核基因组( n u c l e a rd n a ， n d n a ) 之间存在着非常密切的关系。两者不但在其生物发生、生物合成方面需 要相互协调，更重要的是通过相互协调作用，来调节呼吸链亚基的表达，从而介 导线粒体呼吸链功能的改变。在细胞内，线粒体遗传系统与细胞核遗传系统相互 协作进行生物合成。线粒体是细胞中具有独特结构和功能的细胞器，这些功能的 精细调节有赖于细胞核基因组与线粒体基因组之间的相互调控，称之为“交叉对 话( c r o s s - t a l k ) ”，尽管两基因组在“地理位置”上是独立的，但它们可以通过各 种转录因子进行? 交流( c o m m u n i c a t i o n ) ”【5 7 l 。 线粒体是一个半自主性的细胞器，它有自己的基因组，能进行d n a 的复 制、转录和翻译。线粒体基因组除编码自身的r r n a 、t r n a 外，还合成约2 0 7 江苏大学硕士学位论文 多种蛋白质。这些蛋白质主要包括：细胞色素b 、a t p 酶亚单位、细胞色素c 氧 化酶亚单位和n a d h 还原酶复合体亚单位。这些蛋白质虽然数量不多，但对线 粒体的结构和功能都有重要作用。线粒体虽然有自己的d n a 及核糖体等遗传 装置，但由于它所含的遗传信息不足以支持它的生命活动，仍然要受核基因的 控制。因此，线粒体的生长和增值是受核基因组及其自身基因组两套遗传系统 的控制。一方面，线粒体内存在着一套完整的m t d n a 复制、转录和翻译的自 主性遗传系统。但是由线粒体核糖体合成的线粒体自身蛋白质只占少数，其中 绝大多数线粒体蛋白质都是由核d n a 编码并在细胞质核糖体合成后再运送到 线粒体各自的功能位点上。如细胞色素氧化酶的3 个亚基由线粒体核糖体合成， 4 个亚基由胞质核糖体合成；细胞色素b - c i 复合物的1 个亚基由线粒体核糖体 合成，6 个亚基由胞质核糖体合成。线粒体基因表达所必需的一些蛋白质，如 r n a 聚合酶、核糖体大亚单位以及许多调控因子都是由核基因编码，在细胞质 的核糖体上合成后，运输进线粒体后再起作用。线粒体功能的正常发挥需要线 粒体基因组和核基因组的互作。组成呼吸链的一系列结构蛋白是由线粒体和细 胞核共同编码的，这些蛋白质的正确组装，受核基因的控制。另一方面，线粒 体基因组受核基因组的调节作用，核基因组对线粒体基因表达的调控反映在三 个水平上：转录、r n a 加工和翻译，其中转录水平上的调控占主要作用，而且 对线粒体基因组的稳定也有作用。如在对人类的m t d n a 缺失综合症及m n g i e 症等疾病的研究中，发现核基因的变异会影响线粒体基因的拷贝数和完整性1 5 柳。 对酵母的研究发现，核基因与线粒体基因两套遗传系统具有密切配合的协 调性。如酵母在有放线菌酮存在的情况下，细胞质蛋白合成受到特异性抑制， 即细胞核中控制蛋白质合成的基因受到抑制，当培养1 小时左右，线粒体的生 物合成活性也显著下降，这说明控制线粒体生物合成的基因由于核基因受到抑 制，也受到了影响。在对链孢霉的实验中，还发现另一现象，即在氯霉素( 专一 抑制细菌的蛋白质合成，不抑制细胞蛋白质合成1 存在的条件下，链孢霉线粒 体r n a 合成和蛋白质合成都受到抑制，但是却刺激了细胞中与线粒体基因表 达和复制有关的r n a 聚合酶、d n a 聚合酶的活性。根据这个现象，人们假设 在正常情况下线粒体基因可能编码一种阻遏物，具有阻遏细胞核d n a 转录和 合成与线粒体有关的蛋白质和酶的作用，在氯霉素作用下抑制了线粒体蛋白质 8 江苏大学硕士学位论文 的合成，同时使得这种阻遏物不能形成，从而导致了由核基因编码的r n a 聚 合酶活性的升高【5 9 】。 在对哺乳动物内细胞色素氧化酶的研究中，研究人员发现无论是抑制或是促 进哺乳动物体内的酶活性，都需要1 3 种基因的协同作用，而这1 3 种基因有3 种分 布在线粒体基因组上，另外1 0 种则分布在核基因组中p s l 。 同时，越来越多的实验发现，线粒体也可以以不同形式对核基因的表达起调 节作用，这主要集中在对酵母的研究上。受线粒体反馈调节的核基因可以分为两 种类型：第一类只受线粒体呼吸表型的调节，与线粒体的基因组无关联，这类核 基因在线粒体呼吸功能缺陷时表达量提高，呈增量调节：第二类基因的表达与线 粒体基因组的质和量有关，与呼吸表型无关。在完全丧失线粒体d n a 的酵母小 菌落( r h o o ) 和部分缺乏线粒体d n a 的小菌落( r h o ) 中，这类基因的表达量与含完整 线粒体d n a 的酵母菌落( f h n 相比，有的提高，有的下降，呈增量或减量调节。 另外，核基因产物表达的紊乱与m t d n a 突变、线粒体蛋白质的生物合成等受到 抑制均有关系。 综上所述，线粒体基因表达是建立在核基因表达基础之上的，并且在生物 体内所进行的生命活动需要线粒体基因组与核基因组共同配合、协调作用才能 正常进行。这充分说明了线粒体基因组与核基因组相互关系的重要性。 1 3 3 线粒体d n a 的遗传机制 由于线粒体是一种半自主性细胞器，它含有蛋白质合成所需的核糖体及各 种合成因子，因此它有能力一代一代地遗传下去。 线粒体的遗传是线粒体的增殖和线粒体d n a 的复制。线粒体的增殖是由 原线粒体分裂或出芽来实现的。在细胞分裂过程中，线粒体往往通过间壁分裂、 收缩后分离或出芽这几种分裂方式而分离到子代细胞中，经过h 胆碱同位素标 记实验已证实了在子代细胞中所出现的子代线粒体确实由亲代线粒体分裂而 来。为了使予代线粒体中的遗传信息与亲代线粒体中的保持一致，这就需要亲 代线粒体的d n a 精确复制并传递给下一代。 线粒体d n a 的复制是半保留复制，其中最常见的复制方式是所谓的d 环 复制。前已述及，线粒体d n a 的双链根据其在氯化铯中离心分离时密度不同 而被分为h 链( 重) 与l 链( 轻链) ，d 环复制即d n a 的