（食品科学专业论文）新型脱氮菌株的筛选、鉴定及其固定化研究.pdf

新型脱氮菌株的筛选、鉴定及其固定化研究 摘要 水体富营养化是我国目前水环境面临的重大问题，而氮素是主要的污染因 子。废水脱氮的方法有多种，生物脱氮被认为是目前最经济有效的方法之一。 传统生物脱氮理论认为脱氮主要由一群自养好氧型硝化菌和一群异养厌氧型反 硝化菌完成。然而在实践中人们发现这两种菌用在脱氮工艺中缺陷较多，所以 近年来对异养硝化菌和好氧反硝化菌的研究和应用成为热点，并有望克服传统 脱氮工艺的缺陷，丰富生物脱氮理论。因固定化微生物在废水脱氮上的优势， 许多脱氮菌株已被固定化。在固定化方法上，微胶囊固定化因其良好的稳定性、 生物相容性和传质性而备受关注，但目前对异养硝化菌和好氧反硝化菌的同步 微胶囊固定化还未见报道。 本文从合肥市内多家污水处理厂活性污泥、化肥厂土壤及市郊农田土壤中 取得2 6 个土样，通过一系列步骤，从中筛得一株高效的异养硝化菌和一株高效 的好氧反硝化菌，鉴定了它们的种属，考察了它们的脱氮条件和脱氮特征，将 它们优化组合，对组合菌株脱氮条件进行了优化，考察了组合菌株对实际污水 的脱氮效果，并将组合菌株进行了微胶囊同步固定化研究。 本研究所得结果如下： 1 采用污泥驯化、驯化过程中驯化液连续梯度稀释、平板划线分离及颜色 指示剂快速硝化、反硝化效果检测等步骤，筛得一株高效的异养硝化茵h n - s 和一株高效的好氧反硝化茵d n - s ，鉴定其种属分别属产碱菌属和鲁氏不动杆 菌，并命名为a l c a l i g e n e ss p h n - s 和a c i n e t o b a c t e rl w o f f i id n - s 。 2 h n - s 为专性异养硝化菌，无自养硝化能力。其在处理初始氨氮浓度为 1 8 2 3 0m g l 的废水时，3 0h 后氨氮去除率为9 9 8 ，指数期降解氨氮的平均 速率为9 6 1m g - n l h ，高于目前所筛得的大多数异养硝化菌株，且在降解氨 氮的过程中无亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累；最佳碳源为柠檬酸钠；高的溶氧 量和高的c i n 比有利于其降解氨氮，当c n 比为1 2 时即可达到最好的脱氮效果； 该菌株在温度为3 0 c 3 5 c ，p h 为5 0 , - 9 0 范围内均能较彻底地降解氨氮； 能利用亚硝酸盐氮作为氮源反硝化，但不能利用硝酸盐氮；能将氨氮直接转变 为以氮气为主的含氮气体。后两点与目前报道的大多数异养硝化菌不同。 3 好氧反硝化菌d n - s 在处理初始硝酸盐氮浓度为1 6 6 0 5m g l 的废水时， 7 2h 后硝酸盐氮去除率为9 9 8 ，总氮去除率为4 8 3 ，指数期降解硝酸盐氮 的平均速率为8 2m g - n l h ；其在反硝化过程中未出现亚硝酸盐氮的积累；高 的溶氧量有利于其反硝化作用，实验中最佳溶氧量为4 2m g l ；最佳c n 比为 9 1 2 ；能将硝酸盐氮转变为含氮气体，能利用氨氮，也能利用亚硝酸盐氮反硝 化，是一株同步硝化反硝化菌。 4 以总氮去除率为指标，通过正交试验确定了h n - s 和d n - s 混合培养时的最 佳脱氮条件：两菌接种量比例为l ：2 ，c n 比为1 2 5 ，温度为3 5 ，p h 为9 o ， 溶氧量为2 5m g l 。将组合菌株接种于实际污水中，与活性污泥相比，发现组 合菌株对不同的污水适应能力更强，其对不同来源的污水都有较好的脱氮效果， 尤其对氮素含量相对较低的生活污水脱氮效果更好。组合菌株在脱氮时对碳 源有一定的依赖性，柠檬酸钠的加入可以明显促进其脱氮能力。同时两菌的组 合使用也加强了其脱氮能力。 5 用微胶囊固定化组合菌株处理人工模拟废水结果显示，相比游离，固定 化菌株脱氮速率稍低，但脱氮持续时间长，产生的菌泥少，同化的氮量低，从 而提高了总氮去除率；固定化也提高了菌株抵抗不良环境的能力。 关键词：异养硝化；好氧反硝化；同步硝化反硝化；固定化技术；微胶囊 i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n di m m o b i l i z a t i o n lj 0 in 0 v e ic i e n i t r l i c a t l o ns t r a l l l s a b s t r a c t w a t e re u t r o p h i c a t i o ni so n eo fm a jo rp r o b l e m so fw a t e re n v i r o n m e n ti no u r c o u n t r y , a n dt h en i t r o g e ni st h em a i np o l l u t i o nf a c t o r t h e r ea r es e v e r a lw a y sf o r w a s t e w a t e rd e n i t r i f i c a t i o n ，a n dt h eb i o l o g i c a ld e n i t r i f i c a t i o ni sc o n s i d e r e da so n eo f m o s tc o s t e f f e c t i v em e t h o d s t r a d i t i o n a lb i o l o g i c a ld e n i t r i f i e a t i o nt h e o r ys u g g e s t s t h a tt h ew a s t e w a t e rd e n i t r i f i c a t i o ni sm a i n l yc o m p l e t e db yag r o u po fa u t o t r o p h i c ， a e r o b i cn i t r i f y i n gb a c t e r i aa n dag r o u po fh e t e r o t r o p h i c ，a n a e r o b i cd e n i t r i f y i n g b a c t e r i a h o w e v e r ，i np r a c t i c e ，i ti sd i s c o v e r e dt h a tt h e r ea r em a n yd e f e c t sf o rt h e s e t w ok i n d so fb a c t e r i au s e di nt h ed e n i t r i l y i n gp r o c e s s s o ，i nr e c e n ty e a r st h e r e s e a r c ha n da p p l i c a t i o no fh e t e r o t r o p h i en i t r i f i e ra n da e r o b i cd e n i t r i f i e rb e i n ga h o ts p o t ，a n di ti se x p e c t e dt oo v e r c o m et h es h o r t c o m i n g so ft h et r a d i t i o n a ln i t r o g e n r e m o v a lp r o c e s sa n de n r i c ht h eb i o l o g i c a ld e n i t r i f i e a t i o nt h e o r y d u r i n gt h ea p p l i e d s t u d yo fb i o l o g yd e n i t r i l y i n gt e c h n o l o g y , i m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g yh a sb e e n a t t r a c t e da t t e n t i o nb e a c u s eo ft h es u p e r i o r i t yo fi t s e l f a so n eo fi m m o b i l i z a t i o n m e t h o d s ，m i c r o c a p s u l ei m m o b i l i z e dh a sb e e nc o n c e r n e db e c a u s eo fi t sg o o ds t a b i l i y ， b i o c o m p a t i b i l i t y a n dm a s st r a s f e r b u tt h e s y n c h r o n o u sm i c r o c a p s u l e i m m o b i l i z a t i o no ft h eh e t e r o t r o p h i en i t r i f i e ra n da e r o b i cd e n i t r i f i e rh a sn o tb e e n r e p o t e d w eo b t a i n e d2 6a c t i v a t e d s l u d g e ds a m p l e sf r o ms e w a g ep l a n t s ，c h e m i c a l f e r t i l i z e rp l a n t sa n df a r m l a n d a f t e rp e r f o r m i n gas e r i e so fs t e m p s ，f i n a l l ya h i g h - e f f i c i e n th e t e r o t r o p h i cn i t r i f i e ra n dah i g h - e f f i c i e n ta e r o b i cd e n i t r i f i e rw e r e o b t a i n e d w ei d e n t i f i e dt h es t r a i n sa n ds t u d i e dt h e i rd e n i t r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sa n d c h a r a c t e r i s t i c s t h e nw em i x e dt h et w ok i n d so fs t r a i n s ，a n do p t i m i z e dt h em i x e d s t r a i n sd e n i t r i f i e a t i o nc o n d i t i o n s ，i n v e s t g a t e dt h ed e n i t r i f i c a t i o ne f f e c t si n r e a l w a s r e w a t e r , s y n c h r o n o u si m m o b i l i z e dt h em i x e ds t r a i n sb ym i c r o c a p s u l e s t h er e s u l t so ft h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s 1 a f t e r s l u d g ed o m e s t i c a t i o n ，g r a d i e n t d i l u t i o no fd o m e s t i c a t i o nl i q u i d ， i s o l a t i o nf r o m s t r e a k i n gp l a t e ，u t i l i z a t i o n o fc o l o ri n d i c a t o ra s r a p i d d e n i t r i f i c a t i o nd e t e c t i o nm e t h o d ，f i n a l l yah i g h e f f i c i e n th e t e r o t r o p h i cn i t r i f i e r a n dah i g h e f f i c i e n ta e r o b i cd e n i t r i f i e rw e r eo b t a i n e d t h et w os t r a i n sw e r e i d e n t i f i e da sa l c a l i g r e n e ss p a n da c i n e t o b a c t e rl w o f f i ir e s p e c t i v e l y ，a n dn a m e d a sa l e a l i g e n e ss p h n sa n da c i n e t o b a c t e rl w o f f i id n - s 2 4 5 h n sw a sao b l i g a t eh e t e r o t r o p h i cn i t r i f y i n gb a c t e r i a ，n oa u t o t r o p h i c n i t r i f i c a t i o nc a p a c i t y i nt h ea r t i f i c i a lw a s t e w a t e rw i t h18 2 30m g la m m o n i a n i t r o g e na si n i t i a lc o n c e n t r a t i o n ，t h er e m o v a le f f i c i e n c yb yt h e s t r a i nw a s 9 9 8 a f t e r3 0hc u l t i v a t i o n t h ea v e r a g en i t r o g e nr e m o v a lr a t ew a s9 6 1 m g n l hi ni t se x p o n e n t i a lp h a s e ，f a s t e rt h a nt h em o s th e t e r o t r o p h i cn i t r i f i e r s t h a ts c r e e n e db e f o r e i tp r o d u c e da l m o s tn on 0 2 - - na n dn 0 3 - - ni nt h ee n t i r e n i t r i f i c a t i o np r o c e s s t h eo p t i m a lc a r b o ns o u r c ei ss o d i u mc i t r a t e h i g h e r d i s s o l v e do x y g e na n dc nr a t i of a v o r e di t sn i t r i f i c a t i o n w h e nt e m p e r a t u r ei s r a n g e df r o m3 0 0t o3 5 a n dp hi sr a n g e df r o m5 0t o9 0 ，i tc a nc o m p l e t e l y r e m o v ea m m o n i an i t r o g e n i tw a sa b l et od e n i t r i f yw h e nn i t r i t en i t r o g e nw a s u s e da sn i t r o g e ns o u r c e ，b u ti tc o u l dn o tu t i l i z e dn i t r a t en i t r o g e n t h em o s t r e m o v e da m m o n i an i t r o g e nw a sc o n v e r t e dt on 2 t h i sw a sd i f f e r e n tf r o mm o s t c u r r e n tc o v e r a g e dh e t e r o t r o p h i en i t r i f i e r i nt h ea r t i f i c i a lw a s t e w a t e rw i t h16 6 0 5m g ln i t r a t en i t r o g e na si n i t i a l c o n c e n t r a t i o n ，t h er e m o v a le f f i c i e n c yb yt h ed n - sw a s9 9 8 a f t e r7 2h c u l t i v a t i o n t h ea v e r a g en i t r o g e nr e m o v a lr a t ew a s8 2m g n l h i ni t s e x p o n e n t i a lp h a s e i tp r o d u c e da l m o s tn on 0 2 - 一ni nt h ee n t i r ed e n i t r i f i c a t i o n p r o c e s s h i g h e rd i s s o l v e do x y g e nf a v o r e di t sd e n i t r i f i c a t i o n t h eo p t i m a lc n r a t i ow a sr a n g e df r o m9t o12 t h em o s tr e m o v e dn i t r a t en i t r o g e nw a s c o n v e r t e dt on 2 d n sw a sss i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o na n dd e n i t r i f i c a t i o n b a c t e r i a ，i ta l s oc o u l du t i l i z ea m m o n i an i t r o g e na n dn i t r i t en i t r o g e n a si t s n i t r o g e ns o u r c e w em i x e dt h eh n sa n dd n s ，a n do p t i m i z e dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n so ft h e m i x e ds t r a i n sb yo r t h o g o n a lt e s t t h em o s to p t i m a ln i t r o g e nr e m o v a lc o n d i t i o n w a sa sf o l l o w s ：t h ei n o c u l u mc o n c e n t r a t i o np r o p o r t i o no f h n sa n dd n sw a s 1 ：2 ，c n = 1 2 5 ，t e m p e r a t u r ew a s3 5 c ，p h = 9 0 ，d i s s o l v e do x y g e nw a s2 5 m g l n i t r o g e nr e m o v a la b i l i t yo fm i x e ds t r a i n sw a se v a l u a t e di nr e a lw a s t e w a t e r c o m p a r e dw i t ha c t i v a t e ds l u d g e ，t h em i x e ds t r a i n sh a das t r o n g e ra b i l i t y t o a d a p t t od i f f e r e n tw a s t e w a t e r b ya d d i n gs o d i u mc i t r a t e c a ns i g n i f i c a n t l y p r o m o t et h e i rd e n i t r i f i c a t i o nc a p a c i t y w ei m m o b i l i z e dt h em i x e ds t r a i n sb ym i c r o c a p s u l e sa n du s e dt h e y t o t r e a t m e n ta r t i f i c i a lw a s t e w a t e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e n i t r i f i c a t i o n s p e e do fi m m o b i l i z e db a c t e r i aw a sl o w e rt h a nt h em o b i l i z e db a c t e r i a ，b u ti t s d e n i t r i f i c a t i o nl a s t i n gl o n g e r ，t h ep r o d u c t i o no fb a c t e r i am u dw a ss m a l l e r ，a n d t h en i t r o g e na s s i m i l a t i o nw a sl o w e r ，t h u si m p r o v e dt h et o t a ln i t r o g e nr e m o v a l r a t e i m m o b i l i z a t i o na l s oi m p r o v e dt h ec a p a c i t yo fs t r a i n st or e s i s tt h eb a d e n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n ；a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n ；s i m u l t a n e o u s n i t r i f i c a t i o na n dd e n i t r i f i c a t i o n ；i m m o b i l i z a t i o n ；m i c r o c a p s u l e s 插图清单 图3 1 氨氮定量测定标准曲线1 2 图3 2 菌株h n s 扫描电镜照片16 图3 3 基于菌株h n s 和其它相关菌株的1 6 sr d n a 序列同源性构 建的系统发育树1 7 图3 4 亚硝酸盐氮定量测定标准曲线2 0 图3 5 硝酸盐氮定量测定标准曲线2 0 图3 - 6 总氮定量测定标准曲线2 1 图3 7 菌株h n s 的生长曲线及培养过程中p h 的变化2 2 图3 8 菌株h n - s 的脱氮速率特征曲线2 2 图3 - 9 菌株h n - s 在自养硝化培养基中的生长曲线2 3 图3 1 0 血清瓶中接入h n s 菌后的气体质谱图2 5 图3 1 l 血清瓶中未接h n - s 菌的气体质谱图2 5 图3 1 2 空白组与加菌组的气体中氮气相对含量的比较2 6 图3 1 3 空白组与加菌组的气体中一氧化氮相对含量的比较2 6 图3 1 4 空白组与加菌组的气体中氧化亚氮和或二氧化氮相对含量 的比较2 6 图3 1 5 不同碳源对h n - s 脱氮效果的影响3 0 图3 1 6 不同溶氧量对h n - s 脱氮效果的影响j 3 0 图3 1 7 不同c n 对h n - s 脱氮效果的影响3 1 图4 1 菌株d n s 扫描电镜照片3 6 图4 2 菌株d n - s 的生长曲线3 9 图4 3 菌株d n - s 的脱氮速率特征曲线4 0 图4 4 血清瓶中接入d n s 菌后的气体质谱图4 1 图4 5 血清瓶中未接d n s 菌的气体质谱图4 2 图4 - 6 空白组与加菌组的气体中氮气相对含量的比较4 2 图4 7 空白组与加菌组的气体中一氧化氮相对含量的比较4 3 图4 8 空白组与加菌组的气体中氧化亚氮和或二氧化氮相对含量 的比较4 3 图4 - 9 不同溶氧量对d n - s 脱氮效果的影响4 4 图4 1 0 不同c n 对d n - s 脱氮效果的影响4 5 图6 1 培养基中添加空微胶囊对组合菌株生长的影响5 7 图6 2 固定化菌株和游离菌株的脱氮效果的比较5 8 图6 3 温度对固定化菌株和游离菌株脱氮效果的影响5 8 图6 - 4p h 对固定化菌株和游离菌株脱氮效果的影响5 9 图6 5 初始氮浓度对固定化菌株和游离菌株脱氮效果的影响“6 0 表格清单 表3 - 1 不同菌株降解氨氮效果比较1 3 表3 - 2h n - s 在自养硝化培养基中硝化能力考查7 2 3 表3 - 3 亚硝酸盐培养基中主要含氮化合物的量的变化2 3 表3 - 4 硝酸盐培养基中主要含氮化合物的量的变化2 4 表3 - 5 不同温度对h n s 脱氮效果的影响3 1 表3 - 6 不同p h 对h n - s 脱氮效果的影响：3 2 表4 - 1 不同菌株降解硝酸盐氮效果比较3 6 表4 - 2 异养硝化培养基中主要含氮化合物的量的变化：4 0 表4 - 3 亚硝酸盐培养基中主要含氮化合物的量的变化4 1 表5 - 1 正交实验因素水平表4 8 表5 - 2 正交实验结果表4 8 表5 - 3 正交实验结果极差分析表：。4 9 表5 - 4 正交实验结果方差分析4 9 表5 - 5h n - s 和d n - s 降解污水总氮实验分组5 0 表5 - 6 实验水样中t n 和p h 指标检测：5 1 表5 - 7 组合菌株对王小郢污水厂污水的脱氮效果5 1 表5 - 8 组合菌株对朱砖井污水厂污水的脱氮效果5 2 表5 - 9 组合菌株对斛兵塘污水的脱氮效果5 2 表5 - 1 0 组合菌株对化肥厂污水的脱氮效果5 3 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得金月曼工业太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：司又玖 签字日期钐d 冈年产月2 9 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金月曼工些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权金月曼王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位粼墩欲适用本授权书学位论文作者签名：豸j 又i 入 签字日期汐口闷年牛月三留日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 致谢 衷心感谢导师曾庆梅教授。本研究是在曾老师的悉心指导下完成的，从论 文的选题、实验方案的设计到论文的成稿，每一步都凝聚着曾老师的心血。曾 老师渊博的学识、严谨的科研作风和亲切、豁达的情怀，是我做人和治学的楷 模。曾老师在生活上和思想上给我的帮助和指导更让我铭记在心，不敢忘怀。 在近三年的学习生活中，潘见教授严谨的治学态度、广博的学问和犀利的 见解使我在研究中得到很多启发。谢慧明老师、袁传勋老师、张文成老师、陈 彦老师、杨毅老师、甘昌胜老师、惠爱玲老师、王武老师等也同样给予我很多 指导，在此向这些老师表示衷心的感激和崇高的敬意! 感谢张冬冬、韩抒、李志强、魏春燕、靳靖、吴聪、宗凯及资环学院的刘 海波、李金虎等同学在实验过程中给予我无私的帮助，与他们愉快的合作与交 流使我受益匪浅。 感谢我的室友蒋磊、马凌云同学在生活中给予我的关怀，怀念我们在一起 度过的美好时光。 感谢母校合肥工业大学给我提供的优良的科研条件和良好的学习氛围，让 我度过了三年繁忙而充实的学习生活。 感谢我的父亲和母亲，他们的养育之恩和殷切期望，是我前进的力量之源。 作者：司文攻 2 0 1 0 年4 月9 日 1 1 问题的提出 第一章前言 氮素是水体的一种重要污染物，它在水体中通常以无机氮和有机氮的形式 存在，前者包括蛋白质、多肽、氨基酸和尿素等，后者包括氨氮、亚硝酸盐氮 和硝酸盐氮。有机氮可在氨化微生物的作用下转变为无机氮。 据2 0 0 7 年公布的中国环境状况公报，全国地表水污染依然严重。七大 水系总体中度污染，湖泊富营养化问题突出。其中七大水系中包括长江水系、 黄河水系、珠江水系、淮河水系、海河水系及辽河水系中，氨氮均为主要污染 指标之一；在2 8 个的国控重点湖( 库) 中，满足i i 类水质占7 1 ，i 类水质 占2 1 4 ，类占1 4 3 ，v 类的占1 7 9 ，劣v 类的占3 9 3 ，主要污染指标 为总氮和总磷；在检测的2 6 个湖( 库) ，重度富营养的占7 7 ，中度富营养的 占1 1 5 ，轻度富营养的占3 4 6 。2 0 0 7 年，全国废水排放总量为5 5 6 7 亿吨， 其中氨氮排放量达1 3 2 3 万吨。由此可见氨氮和总氮的去除是污水治理的一个 关键问题。 氮素在水体中大量存在的危害主要包括如下几个方面：( 1 ) 造成水体的 富营养化现象，使水生植物旺盛生长，导致水体变臭，透明度降低；( 2 ) 增加 给水的困难，进而严重影响饮用水水质；( 3 ) 消耗水体中的氧气使水中溶氧量 急剧下降，进而导致鱼类等水生生物因缺氧而窒息死亡，使水体因处于厌氧状 态而产生h ：s 等臭气；( 4 ) 对人及生物具有毒害作用，如饮用n o 。一含量超过1 0 m g l 的水时，会致婴儿出现高铁血红蛋白症，严重可致死亡；当水中游离氨超 过3m g l 时，可致部分种类的鱼类死亡。此外水体中亚硝酸可和胺作用生成亚 硝胺，该化合物有致癌致畸作用等。 水体氮素污染的危害性迫使国家制订越来越严格的污水排放标准。2 0 0 2 原 国家环保总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布的城镇污水处理厂污染 物排放标准( g b l 8 9 1 8 - 2 0 0 2 ) 中规定：氨氮最高允许排放浓度( 日均值) 为： 一级标准：a 标准5 ( 8 ) m g l ，b 标准8 ( 1 5 ) m g l ，二级标准2 5 ( 3 0 ) m g l 。 2 0 0 7 年卫生部和国家标准化委员会发布的生活饮用水卫生标准规定生活饮用 水中硝酸盐氮限值为1 0m g l ( 地下水源则为2 0m g l ) ，氨氮限值为o 5m g l ， 亚硝酸盐氮限值为1m g l 。这意味着绝大多数城市污水和工业废水都要经过脱 氮处理。 污水脱氮一般有物理、化学、生物方法，实践证明，相较前两种方法而言， 生物脱氮是最经济有效的方法之一n 1 ，其工艺简单，处理成本低、效果好，且无 二次污染，在国内外得到广泛应用。 传统的生物脱氮的基本原理是，氨氮通过硝化作用氧化为硝酸盐，再通过 反硝化作用将硝酸盐还原成气态氮从水中逸出，从而达到脱氮的目的。硝化作 用是通过自养型硝化细菌完成的，包括两个类群，第一类群为亚硝酸菌，它们 把铵盐氧化为亚硝酸盐：第二类群为硝酸细菌，它们把亚硝酸盐氧化为硝酸盐。 反硝化菌一般为兼性细菌，在有氧条件下以氧气为电子受体，在缺氧条件下以 硝酸根为电子受体，所以必须在缺氧环境中进行反硝化作用i 传统的生物脱氮工艺因将上述两种脱氮微生物作为脱氮“主力军”而存在 许多缺点，如( 1 ) 硝化过程是在好氧环境中完成的，而反硝化过程是在缺氧环 境中进行的，这使得整个脱氮过程必须经过好氧和缺氧两个反应器，从而增加 了基建面积和成本；( 2 ) 自养型的硝化菌增殖速度慢，代时长( 平均1 0h 以上) ， 特别是在低温冬季，难以维持较高的生物浓度，造成系统总水力停留时间较长。 此外在有大量有机物存在条件下，其对氧气和营养物的竞争不如好氧异养菌， 从而导致其难以在系统中成为优势菌1 ；( 3 ) 硝化过程会产酸，反硝化过程会 产碱，到一定程度会抑制脱氮反应的进行，所以需要定时往硝化池投碱、反硝 化池投酸来中和，增加了处理成本和二次污染的风险。因此，近年来新型脱氮 微生物的选育成为研究热点，一些新型脱氮微生物如异养硝化菌、好氧反硝化 菌等也相继被发现。 1 2 研究现状 1 2 1 异养硝化菌 自1 9 4 9 年q u a s t e l 和s c h o l e f i e l d 1 首次以丙酮酸肟作为选择性培养基筛选得 到产n 0 。一的异养硝化菌株以来，人们发现异养硝化现象广泛存在于不同的环境 中啼曲1 。1 9 8 5 年r o b e r t s o n 等n 们从污水处理厂的反硝化单元分离出既有异养硝化、 又有好氧反硝化能力的泛养硫球菌( t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a ) 。在实际应用中， 异养硝化菌的硝化能力无疑是最关键的因素，所以许多研究者对筛得的菌株的 硝化能力进行了考察。k i m 等1 筛得2 4 株具异养硝化功能的蜡样芽孢杆菌 ( b a c i l l u sc e r e u s ) ，在最佳培养条件下，对1 0 0m g l 的氨氮去除率达9 0 以上； s u 等n 2 1 从猪舍污水中筛得一株为产碱假单胞菌( p s e u d o n d n a sa l c a l i g e n e sa s - 1 ) 的异养硝化菌，5 8h 内能降解掉2 5 0 2m m o l l 的n h 。+ ；j o o 等n 3 1 筛得一株 为粪产碱菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i sn o 4 ) 的异养硝化菌，在高的n h 。+ 一n 浓度( 约 1 2 0 0m g - n l ) 下，达到其最大n 乩+ 一n 去除速率为2 8 9m g n l h ，显示出优异 的异养硝化能力。国内方面也有研究者筛出了一些异养硝化菌，如林燕等1 筛 出的芽孢杆菌( b a c i l l u ss p l y ) 及短芽孢杆菌( b r e v i b a c i l l u ss p l y ) ；苏俊峰 等n 5 1 筛出6 株异养硝化菌：胡宝兰等n 印筛出一株既有自养硝化作用又有异养硝 化作用的链霉菌；孔庆鑫等n 筛得一株为不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p y y 5 ) 的异养硝化菌，其处理起始氨氮浓度为9 5 2 3m g l 的废水，3d 后降解率达 9 8 6 ，效果相对比较优越；陈赵芳等n 胡筛出一株名为y y 4 的异养硝化菌，处 理起始氨氮浓度为1 0 4 1 2m g l 的废水时，1 2h 的降解率为9 5 ，最大硝化速 2 率为7 4 2m g - n l h ，速度相对较高。 目前的研究成果表明，异养硝化菌相比自养硝化菌具有生长速率快、细菌 产量高、要求的溶解氧浓度低、能够在偏酸性的环境中生长、代谢活动范围大、 可利用的基质多、分布广泛等优点 1 9 - 2 1 ，但也存在异养硝化菌在单位生物量的 氨氧化速率较自养硝化茵慢的问题口引。此外，目前筛出的大多数异养硝化菌在 处理高浓度氨氮废水( n h 4 + - n 浓度大于1 0 0m g l ) 时，往往有较高浓度的氨氮 残留，达不到饮用水质标准。而在异养硝化作用机理上目前学术界还未取得统 一乜。因此我们认为有必要进一步加强高效异养硝化菌的筛选，以期能在较短 时间内处理较高浓度的氨氮废水，处理后氨氮残留量低于国家生活饮用水水质 限量标准；同时丰富异养硝化菌种资源，为早日揭开其硝化作用机理打下基础。 1 2 2 好氧反硝化菌 1 9 8 4 年，r o b e r t s o n 和k u e n e n 【2 2 1 首先在实验室观察到在氧气存在条件下发 生了反硝化现象：p o c h a n a 等也证实了好氧反硝化现象的存在。此后一些好 氧反硝化菌陆续被分离出来。首先是r o b e r t s o n n 们在反硝化和除硫系统中分离出 t h i o s h a e r ap a n t o t r o p h a 、p s e u d o m a n a ss p 和a l c a l i g e n e sf a e c a l i s 等好氧反硝化 菌。l o n ef r e t t e 等堙5 1 从间歇式厌氧好氧运行污水处理池活性污泥中分离出1 6 株反硝化菌，它们在好氧和厌氧条件下都具有反硝化作用。h u a n g 心印从硝化反 硝化污泥中分离出好氧反硝化菌c i t r o b a c t e rd i v e r s u s ，当维持d o ( 溶解氧) 浓 度在3 1 3 8m g l 时，经4 0h 的培养，总氮去除率为9 0 8 。t a k a y a 等犯 分 离得到两株好氧反硝化菌t r 2 和k 5 0 ，在d o 浓度分别为3 9l x m o l l 和3 8l x m o l l 的情况下，其还原硝态氮为氮气的速率为0 9 u n o l m i n 和0 0 3 “m o l m i n 。 国内方面，周丹丹等心引采用污泥驯化手段富集好氧反硝化菌，并分离纯化 得到1 0 5 株茵，当起始硝酸盐氮为约1 2 0m g l 时，有2 5 株对t n ( 总氮) 去除 率为5 0 以上；马放等强们研究了一株为假单胞菌属( p s e u d o m a n a s c 办z d ，豇f d 捃m “f 口玎s ) 菌株x 3 1 ，发现当培养液中初始氧化态氮质量浓度为1 5 0m g l l 左右时，溶解氧值对x 3 1 的反硝化效果没有显著影响。其对1 5 1 3 9m g l 的 n 0 a - - n 去除率为8 9 6 2 ，对1 4 8 4 0m g l 的n o 。一一n 去除率为9 6 4 9 ，显示出 良好的好氧反硝化性能。王宏宇等n 0 1 则研究了不同碳源和碳氮比对x 3 1 脱氮性 能的影响，发现x 3 1 对碳源有较严格的选择性，以乙酸盐为最佳，当c n 大于 5 时，脱氮率能达到9 0 。 总的来说，国外对好氧反硝化菌分离的报道并不多，国内则更少。因此我 们认为，进一步加强对高效好氧反硝化菌的筛选，并配合异养硝化菌用于脱氮 的生产实践，无疑有着重大的实际意义。 1 2 3 生物微胶囊固定化 固定化酶在工业生产上成功应用后，引发了人们对细胞直接固定化的热 情。与传统活性污泥法相比，固定化微生物处理废水技术有明显的优点口，如 可使系统维持较高的微生物浓度、缩短水力停留时间、使生物反应器小型化、 固液分离容易、抗毒性及耐冲击负荷能力强、可使剩余污泥大大减少等，所以 近年来，许多研究者对传统自养硝化菌和厌氧反硝化菌进行了固定化研究口卜3 钔。 如曹国民等n 钔用海藻酸钠和聚乙烯醇混合固定硝化菌和反硝化菌，并考察了 p h 、碱度、温度等对固定化菌的脱氮效果的影响。安立超等【3 刚也以海藻酸钠和 聚乙烯醇混合固定硝化菌和反硝化菌，发现当n h 。c 1 浓度为5 0 - - 1 0 0m g l 时， n h 。+ 一n 去除率达9 0 以上。因硝化菌好氧，反硝化菌厌氧，d o ss a n t o s 等人 以海藻酸钠和k 角叉菜胶为载体分层包埋硝化菌和反硝化菌，成功使反硝化菌 固定在内层，硝化菌固定在外层。 菌株被固定化后最关键的问题是保证其中活菌的数量，微胶囊固定化在延 长菌株的保存期上被认为优于其它方法m 1 。 作为最重要的固定化方法之一，生物微胶囊是将细胞、酶等大分子物质通 过一层半透的囊膜阻隔在囊内的液态环境中，允许细胞所必需的碳源、氮源、 氧、无机盐等小分子营养物质自由进入及代谢产物自由