（食品科学专业论文）丹参糖蛋白的分离纯化与生物活性研究.pdf

丹参糖蛋白的分离纯化与生物活性研究王应强摘要丹参( s a l v i a m i l t i o r r h i z a b u n g e ) 系鼠尾草属植物，是一味常用中药，以其干燥根茎入药，可用于治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病。丹参中脂溶性有效成分为丹参酮类，具有抗菌作用；水溶性有效成分为酚酸类，具有抗氧化，改善心肌缺血等药理作用。目前对于丹参活性成分的研究仅限于以上两类小分子物质，而对于极具开发前景的活性多糖及糖蛋白类物质的研究报道较少。为了进一步开发利用丹参资源，本课题选取丹参为材料，采用现代分离分析技术对丹参糖蛋白组分进行了分离、纯化，并对纯化组分进行了组成及结构测定，采用现代功能评价方法对粗提物的体外抗氧化活性和对小鼠的免疫调节活性进行了初步研究，试验主要结论如下：1 采用热水浸提法提取丹参话蛋白，正交试验得出最佳提取条件为；科液比1 ：2 0 、浸提温度7 0 c 、浸提时间4 h 、n a c i 浓度0 1 m o u l ，糖蛋白得率为4 6 8 。2 采用超声辅助法提取丹参糖蛋白，正交试验得出最佳提取条件为：超声功率2 5 0 w 、超声处理2 0 m i n 、n a c i 浓度0 0 5 m o l l 、料液比为1 ：2 0 ，糖蛋白得率为6 8 9 。3 丹参糖蛋白精制的最佳条件为：s e v a g e 法去除游离蛋8 7 次，8 0 的乙醇沉淀，糖蛋白得率为5 0 3 。4 丹参糖蛋白精制品为( c s g p ) 糖含量5 1 2 4 ，蛋白质含量3 7 3 4 的不含淀粉、还原糖、多酚类物质的酸性物质，利用气相色谱法、氨基酸自动分析仪、紫外光谱法、红外光谱法对该提取物的单糖、氨基酸组成、光谱学特征进行了研究，结果表明该提取物含有1 7 种已测定的氨基酸和8 种单糖，存在大量的o 一糖肽键，初步获得了该提取物的光谱学特征图谱。5 丹参糖蛋白精制品( c s g p ) 经d e a e - 5 2 离子交换纤维素柱层析和s e p h a d e x g2 0 0 凝胶柱层析分离出c s g p 1 一a 、c s g p 1 - b 、c s g p 3 、c s g p - 4 四种组分，其纯度鉴定分别采用琼脂糖凝胶电泳和s e p h a r o s ec l - 6 b 凝胶柱层析法，结果表明四种组分均为均一组分。6 气相色谱、紫外光谱、红外光谱、理化特性分析结果表明，c s g p 1 一a 糖含量为9 5 4 ，a 、d 糖苷键同时存在，是主要由葡萄糖组成的硫酸化多糖，分子量8 7 6 k d ，比旋光度+ 5 2 3 0 ；c s g p 1 - b 、c s g p 3 、c s g p 4 均是酸性糖蛋白，糖含量分别为8 9 5 ，7 9 3 ，9 2 5 ，蛋白质含量分别为2 5 、1 9 6 ，7 9 ；分子量分别为6 5 4 k d 、5 5 8 k d 、4 2 3 k d ，比旋光度分别为+ 8 9 6 0 、+ 1 3 2 5 0 、+ 9 9 5 。在三种组分中葡萄糖、半乳糖含量均较高，且均存在o 糖肽键；其中c s g p 一3 、c s g p - 4 含有少量磺酸基和硫酸基。7 氨基酸分析结果表明，除c s g p 1 一a 未检测出氨基酸外，c s g p 一1 一b 、c s g p 3 、c s g p _ 4 均含有所测定的1 7 种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量均较高，构成植物糖蛋白o 糖肽键的丝氨酸、酪氨酸含量也较高。8 丹参糖蛋白( c s o p ) 对n a d h p m s 体系产生的超氧阴离子自由基，对f e n t o n反应体系产生的羟基自由基均有显著的清除作用，并呈一定的剂量效应关系，对d p p h 自由基具有一定的清除作用，无明显剂量效应关系；其中对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率与同浓度v c 相当。9 丹参糖蛋白( c s g p ) 的乙醇分级组分c s g p a 、c s g p b 、c s g p c 对超氧阴离子自由基，羟基自由基均有不同程度的清除作用，以半数清除率浓度0 c 5 0 ) 进行比较，对两种自由基的清除能力的强弱顺序均为：c s g p a c s g p c s g p - b c s g p c ，其中c s g p a 组分对自由基的清除效果最好，对0 h 和0 2 。的半数清除率浓度分别为0 0 9 7 0m g m l l 和o 0 7 1 6m g m u l ，是c s g p 中抗氧化的强效组分。l o 通过建立环磷酰胺所致免疫抑制小鼠模型来考察丹参糖蛋白( c s g p ) 的免疫调节功能，结果表明丹参糖蛋白能刺激免疫抑制小鼠免疫器官的增长( p 0 0 1 ) ，增强免疫抑n 4 , 鼠的巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力( p o 0 0 ：促进免疫抑制小鼠血清溶血素的生成( p o 0 5 ) ；显著提高脾淋巴细胞的增殖能力( p c s g p c s g p b c s g p c t h ei c 5 0f o r- o ha n d0 2 。w a s0 0 9 7 0 m g m l - a n do 0 7 1 6 m g 。m l lr e s p e c t i v e l y , t h i sr e s u l ts h o w e dc s g p ah a ss t o n g e rs c a v e n g i n gr a d i c a le f f i c i e n c ya n dw a sas t o n g e ra n t i o x i d a t i v ef r a c n o n 1 0 t h ei m m u n em o d u l a t i o na c t i v i t i e so ft h eg l y c o p r o t e i n s ，c s g p ，f r o ms a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g ew e l ei n v e s t i g a t e dv i ae s t a b l i s h i n gt h em i c em o d e li n h i b i t i d b yc y c l o p h o s p h a m i d e ( c y ) ，t h er e s u l t ss h o w e dt h eg l y c o p r o t e i ne x t r a c t sc o u l de f f e c t i v e l ys t i m u l a t et h eg r o w t ho fi m m u n eo r g a n s ，i m p r o v ep h a g o c y t o s i so fp e r i t o n e a lm a c r o p h a g e s ，a c c e l e r a t ed i s t i n c t l yt h el e v e lo f s e r u mh e r n o l y s ，e n h a n c et h ep f ca n di n c r e a s em a r k e d l yt h es p l e n i cl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o ni nm i c ei n h i b i t i db yc y , s ot h eg l y c o p r o t e i ne x t r a c t sp o s s e s s e dt h ei n l m u n cm o d u l a t i o na c t i v i t i e s t h er e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h e 出y c o p r o t e i n si ns a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g en o to n l yw e r eg r e a t l yh i g hi nc o n t e n tb u ta l s oh a dp r e f e r a b l eb i o a c t i v i t y , s oi ti sap l a n ta c t i v ec o m p o n e n tw i t ham a r k e d l yd e v e l o p e dp r o s p e c t k e yw o r d s ：s a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g ep u r i f i c a t i o nvg l y c o p r o t e i ni s o l a t i o nb i o a c t i v i t y学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名：王蟹量日期：2 垒晕互学位论文使用授权声明本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。作者签名：主朗 e ， o 。， 。一1 丹参研究进展第一章文献综述丹参( s a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g e ) ，别名紫丹参、赤参、血参、红根等，属唇形科( l a b i a t a e ) 鼠尾草属( s a l v i a ) 多年生草本植物，该属约包括7 0 0 1 0 5 0 种植物，遍布在全球的温暖地带，主要分布在地中海地区和西亚；在我国该属植物有8 3 种，2 5 个变种，9 个变型，主要分布在西南地区；由于该属是个大属，所以丹参有许多亲缘植物，如甘西鼠尾草( s a l v i a p r z e w a l s k i i m a x i m ) ，栗色鼠尾草( s a l v i a c a s t a n e ad i e l s ) ，云南鼠尾草( s a l v i a y u n n a n e n s i sc h w r i e s t ) 等，它们在许多地方被当作丹参的代用品。丹参作为传统中药，东汉神农本草经将其列为上品，e l ：“主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积累：破面除瘕，止烦渴，益气。”日华子本草对其论述更为全面：“养神定志，通利关脉，治冷热劳，骨节疼痛，四肢下逐，排脓止痛，生肌长肉止血崩带下，调妇人经脉不匀，血邪心烦，恶疮疥癣，肿毒、丹毒”。1 9 9 5 年版的中华人民共和国药典把丹参的药理功效归纳为“祛淤止痛，活血通经，清心除烦”，用于治疗“月经不调，经闭痛经，积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，肿瘤，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛” 2 1 。现代药理研究证明，丹参中脂溶性有效成分为丹参酮类，具有抗菌作用；而其水溶性有效成分则为酚酸类，具有抗氧化，改善心肌缺血等药理作用p l ，近年来其水溶性成分成为研究的热点，2 0 0 6年汪红首次从丹参中提取分离得到两个多糖组分并分析了结构，揭开了丹参大分子研究的序幕1 4 j 。目前，以丹参为原料生产的丹参口服液、丹参葛根六胡片、丹参丸、丹参膏、丹参片、复方丹参注射液、舒心冲剂、冠心片、复方甘草丹参片等中成药近百种，生产的剂型有蜜丸、水丸、片剂、酒剂、糖浆剂、注射剂等多种，临床应用疗效显著。1 1 植物学特征与生药学鉴别特征1 1 1 植物学特征丹参的形态如图1 所示。它为多年生草本植物，茎直立，高约3 5 8 0 厘米，密被柔毛，多分枝，根圆柱形，肉质，外面砖红色，内乳白色，长约5 1 5 厘米，直径4 1 6 毫米，疏生支根。奇数羽状复叶，叶柄长1 7 5 厘米，小叶3 5 ( 7 ) 片，长1 5 - 8 厘米，宽0 8 - 5 厘米，顶端小叶较大，小叶卵形或椭圆状卵形，先端渐尖，基部宽楔形或斜圆形，边缘具锯齿，两面疏被柔毛，下面密被灰白色绒毛，茎叶柄花萼外面均被长柔毛，后者的长柔毛具腺，有粘感。丹参的同属亲缘植物不但在形态上有自身的特点，而且在化学成分和药用性能上也有所差别，这些植物在许多地方作为丹参的代用品【1 1 1 5 1 。野生丹参植物学特征和栽培丹参基本一样，区别是：野生丹参根茎短粗，略有弯曲，须根细长、粗糙。图1丹参f i g 1s a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g e1 1 2 生药学鉴别特征野生丹参根茎短粗，顶端有时残留茎基。根数条，长圆l o 一2 0 厘米，直径柱形，略弯曲，有分枝和须状细根，长3 1 0 毫米。表面呈棕红色或暗棕红色，皮粗糙，具纵皱纹。老根外皮疏松，多显紫棕色，常呈鳞片状，易剥落。质硬而脆，断面疏松，有裂隙或略平整而致密，皮部棕红色，木部灰黄色或紫褐色，可见黄白色点状维管束，气弱，味微苦涩。栽培丹参根粗大肥实，直径0 ，5 1 5 厘米，圆柱形或长条形，偶尔有分枝，表面紫红色或黄红色，有纵皱纹，皮细而耦壮外皮紧贴不易剥落。质颦实，断面较平整，灰白色或黄棕色，无纤维。气弱，味甘微苦。以四川栽培的丹参最佳。其根粗长，分枝错综，无细根，皱皮有顺纹，折断面棕红色，无纤维，显粉性，紫红色，不糟朽，有香气而味带甘与其他丹参有显著不同。1 1 3 理化鉴别取粉末5 克，加水5 0 毫升，煮沸1 5 2 0 分钟，放冷，滤过，滤液置水浴上浓缩至黏稠状，放冷后，加乙醇3 5 毫升使其溶解，滤过，滤液做如下试验：( 1 ) 取滤液数滴，滴于滤纸条上，干后，置紫外光灯下观察，显亮蓝灰色荧光。将此纸条悬挂在氨水瓶中( 不接触液面) ，2 0 分钟后取出，置紫外光灯下观察，显淡亮蓝绿色荧光。( 2 ) 取滤液0 5 毫升，加三氯化铁试液1 2 滴，显污绿色。1 1 4 同属植物丹参有许多亲缘植物，可作丹参利用的同属植物主要有南丹参、甘肃丹参( 紫丹参) 、滇丹参、褐毛丹参等，它们在许多地方被当作丹参的代用品i5 1 。1 2 丹参的化学成分1 2 1 丹参酮类化合物丹参酮类化合物是丹参脂溶性的主要有效成分，均含有三元或四元碳环邻醌或对醌结构。1 9 3 4 年，日本学者中尾万三就从丹参的乙醇提取物中分离出丹参酮i ，丹参酮i i ，丹参酮1 1 1 ，但丹参酮i i i 在4 0 年代经我国化学家王序等证实是丹参酮i i a和丹参酮l i b 的混合物【6 】。由于各种条件的限制，直至u 1 9 7 1 年才先后从丹参中分离鉴定了1 1 种丹参酮类化合物。后来随着色谱与波谱技术的发展，至今己从丹参中分离出三十多种丹参酮类化合物，测定了结构式，并依次命名为丹参酮i( t a n s h i n o n ei ) ，丹参酮i i a ( t a n s h i n o n eh a ) ，丹参酮i m ( r a n s h i n o n ci m ) ，隐丹参酮( c r y p t o t a n s h i n o n e ) ，丹参新酮( m i l f i r o n e ) ，异丹参酮i ( i s o t a n s h i n o n ei ) ，异丹参酮a f i s o t a n s h i n o n eh a ) ，异丹参酮i i b ( i s o t a n s h i n o n eh a ) ，异隐丹参酮( i s o c r y p t o t a n s h i n o n e ) ，羟基丹参酮队饵y d r o x yt a n s h i n o n ei a ) ，丹参酸甲酯( m e t h y l t a n s h i n o n a t e ) ，二氢丹参酮i ( d i h y d r o t r t o t a n s h i n o n cd ，二氢异丹参酮( d i h y d r o i s o t a n s h i n o n e ) ，丹参新醌甲( d a n s h e x i n k u na ) 、乙( d a n s h e x i n k u nb ) 和丙( d a n s h e x i n k u nc ) ，次甲丹参醌( m e m y l e t 卸s h i q u i n o n e ) 等【 7 , 8 ，1 。由于醌类成分易被还原为二酚类衍生物，后者再被氧化又易转变为醌，在转变过程中起电子传递作用，这也是该类化合物生物活性的结构基础1 9 1 。至今为止，关于丹参脂溶性成分的研究已相当透彻和深入。1 2 2 丹酚酸类化合物丹参的水溶性有效成分多具有酚酸结构，最早发现的丹参素化学名为b 一3 ，4 二羟苯乳酸( 3 ，4 - h y d t r o x y b i e n y ll a c t i ca c i d ) ，是各种丹酚酸的基本化学结构，如丹酚酸a ( s a l v i a n o l i ca c i da ，s a l a ) 是一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成，丹酚酸b ( s a l v i a n o l i ca c i db ，s a l b ) 为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，丹酚酸c ( s a l v i a n o l i ca c i dc ，s a i c 、；呗0 为二分子丹参素缩合而成，其它丹酚酸亦有类似结构，丹参水溶性成分中的迷迭香酸( r o s m a r i n i c a c i d a r o s ) 也是由一分子丹参素和一分子咖啡酸缩合而成【8 t i 。周长新用国产大孔树脂和s c p h a d e x l h 一2 0 对丹参注射剂及丹参饮片的温水浸提液的化学成分进行了研究，从中共分离得到丹参素及九个寡聚咖啡酸类化合物j 。在众多的酚酸类物质中含量最高活性最强的成分为丹酚酸a 和b 1 1 2 , 1 3 j 。1 2 3 丹参多糖汪红首次从丹参中经过水提醇沉，以d e a e - s e p h m o s ef a s tf l o w 纯化，用h 2 0 2脱色，流水透析，冷冻干燥得到两个浅黄色均一多糖s m p l 和s m p 0 5 ，经。3 c n m r ，d e p t ，i r 谱，单糖组分分析及部分酸水解等方法鉴定其结构。s m p l 相对分子质量约为1 3 9 x 1 0 8 d ，s m p l 主要以a ( 1 - - 6 ) d g l c 聚合而成，有少量的a r l - - - - ，2 ) d g l c聚合；s m p 0 5 相对分子质量约为4 0 3 x 1 05d ，主要由a ( 1 6 ) d g i c 聚合而成i4 1 。1 2 4 其他成分丹参还含有b 谷甾醇( 3 - s i t o s t e m l ) ，黄芩甙( b a i c a l i n ) ，胡萝h 甙( d a u c o s t e r 0 1 )和谷氨酸、丙氨酸、天冬氮酸、组氨酸和精氨酸等1 5 种游离氨基酸和水解氨基酸，钙、镁、钡、铝、镍、硒、铁等无机元素等【1 0 1 。总之，丹参的成分多种多样，近年来水溶性成分成为研究的热点，但还有待于做深入细致的研究【1 4 1 。1 3 丹参的药理研究1 3 1 保护心血管系统的作用丹参对心血管系统的作用主要体现在保护心肌、扩张血管、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成等方面。丹参及复方丹参注射液能有效清除心肌再灌注所产生的具有细胞毒性的氧自由基，从而对缺血再灌注损伤的心肌起保护作用，另外丹参对急性心肌缺血引起的心肌损伤也有保护作用【1 5 1 。丹参素可防止大鼠心肌线粒体h + a t p酶水解活性下降，对心肌具有明显的保护作用【l “。丹参酮能抑制中性白细胞的溶酶体酶释放，吞噬及粘附，从而对梗塞起到防治作用，丹参酮i i a 的磺酸钠( d s 一2 0 1 )能够影响血管平滑肌细胞增殖相关基因c m y c 的表达，从而抑制了平滑肌细胞的增殖，达到了抗动脉粥样硬化的作用7 】。另外丹参对血小板聚集和凝血有抑制作用，在血浆中加入丹参素，可使复钙时间和加胶原复钙时间延长，加大剂量可抑制血浆的凝固【1 8 】。丹参能增加心肌的血流量和提高心肌组织缺氧耐受力，因而起到治疗冠心病、心绞痛的作用。1 3 2 消炎、抑菌作用丹参酮具有明显的抗炎作用，对炎症的第一、第二期以及急性和亚急性炎症均有良好的治疗作用，如对菌液引起的大鼠脚掌关节感染性肿胀、渗出性甲醛腹膜炎、巴豆油致小鼠耳肿等均有良好的抑制作用1 9 2 0 1 。对于丹参酮的抗炎机制尚不甚清楚，可能与丹参酮降低血液中的p g f 和p g e 水平、抑制中性粒细胞的趋化性及趋化移动距离等因素有关【2 ”。丹参总酮对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌作用，抑菌效果比小檗碱还要好，其中，隐丹参酮、丹参酸甲酯、二氢丹参酮i 、羟基丹参酮i i a 、丹参酮i i b 等有较好的抑菌效果，而丹参酮i i a ，丹参酮i ，丹参新醌甲、乙、丙无明显的抑制作用【2 2 2 3 1 。丹参酮的结构与抑菌活性关系表明：丹参酮的醌式结构是抑菌的必须基团，邻醌的抑菌活性高于对醌的抑菌活性，a 环的羟基化或环内脱氢，或在母核上引入极性基团均会导致抑菌活性下降，另外丹参酮呋喃环4的0 【一h 的不同取代也可明显影响其抑菌活性【2 4 1 。另外丹参酮对人型结合杆菌、铁锈色毛发癣菌、红色毛发癣菌、霍乱弧菌等都有抑制作用1 2 鄄。1 3 2 清除自由基与抗氧化作用丹参有效成分丹参酮、丹参素和丹酚酸对f e 2 + h 2 0 ：系统产生的o h 、黄嘌呤黄嘌呤氧化酶系统产生的0 2 、以及佛波豆寇乙酸( p m a ) n 激白细胞产生的0 2 等均具有极为明显的清除作用【2 引。例如丹参酮能清除f e 2 + 启动的心肌线粒体膜脂质过氧化过程中产生的脂类自由基，使线粒体呼吸功能不受影响【3 0 l 。丹参酮可以通过清除自由基从而阻断过氧化链式反应，抑制细胞内脂质过氧化产物与d n a 加合物的形成，从而达到抗氧化，减少细胞毒性的目的l3 1 1 。丹参清除自由基的功能在生理上具有重要意义，它可以通过清除自由基而有效的防止有机体的氧化损伤。1 3 3 抗肿瘤活性丹参酮对小鼠e h r i c h 腹水癌，对人鼻咽癌细胞株( k b ) ，人宫颈癌细胞株( h e l a ) 、人结肠癌细胞株( c o l o 一2 0 5 ) 和人喉癌细胞株( h e r , 2 2 ) 等均有不同程度的杀伤作用，对喜树碱、环磷酞胺的抗肿瘤活性有增效作用【3 2 】。用3 h t d r 掺入法证明丹参可以抑制肉瘤细胞d n a 合成，表明丹参酮对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用【3 l 】。袁淑兰等在体外细胞培养的基础上，通过细胞形态学、细胞增殖动力学和裸鼠成瘤性的研究，观察了丹参酮i l a 对人宫颈癌细胞株( m e1 8 0 ) 的体外诱导分化作用，结果表明，细胞株经无毒剂量的丹参酮i i a 处理后，细胞形态趋向良性分化，生长减慢，集落形成率和3 h t d r 掺入率明显降低，在裸鼠上的成瘤时间延长，成瘤能力明显降低；经统计学处理表明：丹参酮i n 对m e1 8 0 细胞均具有较好的诱导分化作用【3 3 】。用无毒剂量丹参酮i i a 作用于人肺癌细胞株( s p c a n ，发现它可以诱导肿瘤细胞凋亡的发生，其作用机制可能是丹参酮i l a 可以促进凋亡基i 园p 5 3 、f a s 、b a x 表达水平的升高，而使凋亡抑制基因b c l 2 的表达水平显著降低【3 4 1 。普遍认为，丹参酮是丹参抗肿瘤的活性成分，主要通过直接杀伤肿瘤细胞、诱导分化作用、诱导肿瘤细胞凋亡三种途径发挥抗肿瘤作用。1 3 4 对中枢神经系统的抑制作用实验证明，丹参对小兔有明显的镇静效果，表现出对中枢神经系统的抑制作用 3 5 1 丹参对大脑皮层的抑制作用，可能是通过抑制环腺苷酸磷酸二酯酶的活力，增加环腺苷酸水平而实现的p “。1 3 5 调节组织的修复与再生丹参能促进组织的修复和再生，改善局部血液循环，使骨折局部淤血减轻，愈合时间缩短。动物实验证明，丹参能使肝部分切除后的大鼠肝再生度增加，并能提高核分裂相指数和甲胎蛋白检出率，说明丹参具有促进肝再生的作用。病理组织学也观察到，丹参可以明显减轻肝坏死和炎症反应，对于肝硬变具有防治作用。另据报道，丹参注射液对平阳霉素引起的小鼠肺纤维化具有保护作用，可明显抑制肺纤维化病变【3 7 。3 9 1 。1 3 6 丹参的其它药理作用丹参除了具有以上各种药理作用外，还有抗休克、抗血栓形成、抗结核、性激素样活性等作用【4 0 - 4 2 1 。总之，丹参的药理作用十分广泛，目前认为主要是脂溶性成分丹参酮和水溶性成分酚酸类是其功效成分，其他功效成分还有待于发现。1 4 丹参的临床应用中医认为丹参性寒味苦，入心、肝经，具有活血祛淤、消肿止痛、镇静安神、凉血消痛、养血等功效。长期以来在治疗心、脑血管系统疾病，呼吸消化系统疾病，泌尿系统疾病，眼科皮肤科等方面十分有效。目前，以丹参为原料生产的丹参口服液、丹参葛根六胡片、丹参丸、丹参膏、丹参片、复方丹参注射液、舒心冲剂、冠心片、复方甘草丹参片等中成药近百种，生产的剂型有蜜丸、水丸、片剂、酒剂、糖浆剂、注射剂等多种，临床应用，疗效很好【1 _ 2 1 。1 5 丹参的膳食应用以丹参作原料形成的多种膳食具有保健作用。丹参粳米粥长期服用，能起到活血化淤的作用；丹参三七鸡可起到补虚化淤、活血止痛的作用，用于治疗血淤胃痛、胁痛、腰痛等病症【1 l ；丹参黄豆汁长期服用可通血脉，破瘀血，健脾胃，补心血，是动脉硬化症的食疗佳方；参乌茶代茶饮有补精血，益肝肾的作用，是抗衰老推荐食疗秘方。在当今人类要“回归大自然”的潮流中，丹参己广泛应用于医疗、保健、养生、防病，成为科技时代开发、利用的重点。2 糖蛋白的研究进展2 1 糖蛋白研究的现状糖蛋白是一类十分重要的糖复合物，作为名词是在1 9 7 3 年首次被m o n t r e u i l在其著作中提出的，他将糖复合物划分为糖蛋白和糖脂2 大类1 4 3 a 4 1 。1 9 0 8 年美国生物化学家协会的蛋白质命名协会将糖蛋白定义为：由蛋白质分子和包含有碳水化台物基团的物质共同组成的非核酸类复合物( c o m p o u n d so ft h ep r o t e i nm o l e c u l e sw i t has u b s t a n c eo rs u b s t a n c e sc o n t a i n i n gac a r b o h y d r a t eg r o u p ，o t h e rt h a nn u c l e i ca c i d ) ，同时将与蛋白质通过共价键一糖苷键( g l y c o s i d i c l i n k a g e ) 相连的糖部分称作聚糖( g l y c a n s ) 【4 5 1 。糖与蛋白形成的复合物在早期都统称为糖蛋白，但随着这一领域研究的开展和深入，现已将蛋白聚糖从糖蛋白中划分出来【4 “。糖蛋白是生物体内重要的生物大分子之一，它广泛存在于动物、植物和某些6微生物中，甚至还存在于单细胞有机体和病毒中：糖蛋白可分别以可溶性和不溶性形式存在干细胞外液和细胞间质中；几乎所有合成蛋白质的细胞都会合成糖蛋白，并且8 0 以上的蛋白质都是糖蛋白，包括许多酶、激素、毒素、免疫球蛋白、载体蛋白、凝集素、结构蛋白、受体、粘液组分等，甚至过去人们一直认为是“纯”的多糖，如糖原和纤维素，亦含有少量的共价结合的蛋白质。糖蛋白对于细胞增殖的调控、受精、发育、分化以及免疫等生命现象起着十分重要的作用【4 7 1 。动物性糖蛋白的研究相对较多，并且已确定了不少糖蛋白的一级结构，如人血浆球蛋白、a 1 _ 酸性蛋白、干扰素等】。植物性糖蛋白的研究起步较晚，l i sh 等( 1 9 6 4 ) 从大豆凝激素( s o y b e a n a g g l u t i n i n ，s b 中分离出一种天门冬酰胺低聚糖【4 8 l ；m u r a c h i 等( 1 9 6 7 ) 从波萝蛋白酶( b r o m e l a i n ) 中分离出一种糖蛋白【4 9 j ，此后，植物性糖蛋白的研究有了较大进展。现已发现的植物性糖蛋白除了具有凝集素( 1 e c t i n ) 、结构蛋白( s t r u c t u r a l p r o t e i n ) ，酶( e n z y m e ) ，贮藏蛋白( s p o r a n i n ) 和毒素等方面的作用外，还具有多种保健功能，如抗菌、抗糖尿病、降血脂、抗氧化、调节免疫、抗肿瘤、抗炎、防衰老等1 5 0 5 7 1 。国内外对多种天然糖蛋白的研究成为继多糖之后生物活性成分研究的又一热点，随着糖生物学研究的迅速发展，使长期被忽视的糖蛋白已成为生物化学研究的中心，它吸引着许多学科，包括化学、生物学、生物化学、兔疫学、细胞生物学、医药学以及食品科学的工作者从事这一领域的研究。2 2 糖蛋白的结构2 2 1 糖蛋白的组成糖蛋白含有几乎所有的氨基酸，其中苏氨酸( r h r ) 、丝氨酸( s e r ) ，羟脯氨酸( h y p ) 、天门冬酰胺( a s h ) 、羟赖氨酸( h y l ) 的含量常常较高。在自然界中已发现的单糖虽有2 0 0 种左右，但通常在糖蛋白中出现的单糖只有1 1 种( 见表1 ) 【5 8 】，然而在植物糖蛋白中，糖基的成分主要是阿拉伯糖、半乳糖和n 一乙酰葡萄糖胺，其次是甘露糖、木糖、葡萄糖以及糖醛酸等1 5 9 , 6 0 1 。糖蛋白中的糖有时可以和其他基团结合，例如硫酸基团( 在小肠粘蛋白和病毒的糖蛋白中) 和磷酸基团( 在溶酶体水解酶和酵母甘露聚糖中) 。糖蛋白中糖的含量变化很大，含量较少者如猪肠二肽酶含糖量为0 3 ，而血型糖蛋白和人胃糖蛋白中糖的含量高达8 0 以上【4 7 1 ，糖蛋白中所含的氨基酸种类似乎与糖的含量有一定的关系：糖含量高的糖蛋白，如血型物质，往往含有较多的脂肪族氨基酸，而芳香族氨基酸、碱性氨基酸和含硫氨基酸含量则较低【4 7 】。7表1已知糖蛋白中单糖组成t a b 1t h em o n o s a c h a r i d ec o m p o s i t i o no f k n o w ng l y c o p r o t e i n类别单糖己糖( h e x o s e s )脱羟己糖( d e o x y h e x o s e )己糖胺( h e x o s a m i n e s )戊糖( p e n t o s e s )唾液酸( s i a l i c a c i d )己糖醛酸( h e x u r o n i c a c i d )d 一葡萄糖( d g l u c o s e )d 一甘露糖( d m a n n o s e )d 一半乳糖( d g a l a c t o s e )l 岩藻糖f l f u c o s e )n 一乙酰一d 葡萄糖胺一a c e t y l d g l u c o s a m i n en _ 乙酰d 半乳糖胺一a c e t y l d g a l a c t o s a m i n ed 一木糖( d x y l o s e )l 阿拉伯糖( l a r a b i n o s e )唾液酸( s i a l i c a c i d )d 葡萄糖醛酸( d g l u c u r o n i c a c i d )l 艾杜糖醛酸( d l d u r o n i c a c i d )2 2 2 糖蛋白的糖肽键特征糖肽键( g l y c o p e p t i d el i n k a g e ) 是糖链和肽链的连接键，是指糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水形成的糖苷键。可分为n 一糖苷键和o 糖苷键2 大类。参与糖肽键的氨基酸残基主要有：天冬酰胺( a s n ) 、丝氨酸( s e r ) 、苏氨酸( t h r ) 、羟赖氨酸( h y l ) 和羟脯氨酸( h y p ) 。它们可以与n 乙酰葡萄糖胺、n 乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形成5 种主要的糖肽键，分别是：b n 乙酰葡萄糖胺一天冬酰胺( g i c n a c a s n ) 、a n - 乙酰半乳糖胺丝氨酸苏氨酸( g a l n a e s e r t h r ) 、3 - 木糖丝氨酸( x y l s 盯) 、p 半乳糖一羟赖氨酸( g a l h y l ) 、a l 广阿拉伯糖一( a l a h y p ) 蚓。此外，还发现罕见的以n 末端氨基酸残基为连接点的糖肽键，存在于小鼠血红蛋白a l c 中。在n 糖肽键中，只有一种糖残基( n 一乙酰p - d 葡萄糖胺) 与天门冬酰胺相连接，其a s h 经常处于a s n - x t h r s e rf x 为除p r o 外的任一氨基酸) 的顺序子( s e g u o n ，称为天冬酰胺顺序子) 中，处于顺序子中的a s n 更容易发生糖基化，这可能是因为顺序子中t h r 和s e r 的羟基与a s n 侧链的羰基形成氢键，从而产生有利于糖基化的构象，很多糖蛋白都存在此连接键，如血清类粘蛋白、免疫球蛋白、激素类糖蛋白、甲状腺球蛋白等。以丝氨酸或苏氨酸残基为连接点的0 一糖肽键在碱性溶液中易发生消去反应，丝氨酸和苏氨酸生成的消去产物分别是a 一氨基丙烯酸和a 氨基一a 丁烯酸，可用以区别糖蛋白中的n 一糖肽键【“4 7 1 。在一个糖蛋白分子中，通常可以同时存在许多条糖链，既可以通过n 糖肽键与肽链相连，也可以是0 糖肽键与肽链相连，但对植物糖蛋白而言，尚未发现两种类型的糖肽键同时存在于同一糖蛋白中【4 7 1 。2 2 3 糖蛋白中糖链部分的结构2 2 3 1 糖链结构的微观不均一性糖蛋白中糖链结构具有十分普遍的微观不均一性，如从鸡卵清蛋白中分离出5种糖肽，每种糖肽中的糖单位虽都连接在同一个天门冬酰胺残基上，但彼此的组成不同；各种糖蛋白中糖链的长短不同，有的糖链由一个或二个单糖组成，有的是由数十个单糖组成没有支链的长的寡糖链；各种糖蛋白所含的糖链数也十分不同，可以从每个分子中仅含一条糖链到多达几百条糖链，如核糖核酸酶b ，每个分子中只有一条糖链，而羊的颌下腺粘蛋白，每个分子中有8 0 0 条寡糖链f 4 6 1 。2 2 3 2n 糖肽键型糖链的结构n 一糖肽键型糖蛋白由天冬酰氨的一n h 2 和一相同的五糖糖核相连，糖核的结构是：m a n 2 ( 1 - 6 ) - m a n 3 ( 1 - 4 ) - g i c n a c 3 ( 1 - 4 ) - g i c n a c 3 ( 1 - n l基本上可分为3 种类型( 4 ”：仅含甘露糖( m a n ) 和n 乙酰葡萄糖胺( g i c n a c )糖基，称为简单性糖链或甘露糖型糖链，其分子量在1 2 0 0 至2 0 0 0 之间；除含上述两种糖( m a n 和g i c n a c ) 夕 ，还含有唾液酸( s i a l i ca c i d ，s i a ) 、半乳糖( f u c ) 、岩藻糖( g a l ) 、木糖( x y l ) 等，称为复杂型糖链，其分子量在2 0 0 0 3 0 0 0 之间。a 1 - 酸性糖蛋白、转铁蛋白、i g g 免疫球蛋白、啦一巨球蛋白、红细胞膜糖蛋白、胎球蛋白等含此糖单位；糖链的结构介于简单型和复杂型之间，称为混和型( 或杂种型) 糖链。2 2 3 3o 糖肽键型糖链的结构o 糖肽键型糖链的结构十分多样，没有n 糖肽键型糖链那么明显的规律性，仅在动物糖蛋白的0 型糖链中就发现有四种核心结构】。两个单糖通过糖苷键形成双糖时，糖苷键可以是1 2 ，1 3 ，l 4 或1 6 ，糖苷键连接还可以有不同的异头构型，如a 或6 构型，3 个以上的单糖形成寡糖时，情况更复杂，糖不仅有直链形式，还可以有分支结构。由此可见，糖链结构比蛋白质和核酸的结构复杂得多。因此阐明一个蛋白质的一级结构，只要弄清它的氨基酸组成和顺序就行，但要阐明一个寡糖结构，不仅要弄清它的组成成分、糖的连接顺序，还必须清楚连接每个糖基的糖苷键的性质以及糖链和肽链的连接方式。2 2 4 糖蛋白的立体结构糖蛋白分子中肽链的立体结构与一般蛋白质相似，借氢键、疏水键、离子键、9二硫键等构成螺旋结构、b 一折叠结构、不规则的卷曲结构等二级结构，再由这些肽链进一步相互作用，形成分子特有的三级结构：这些肽链作为亚基再形成四级结构。糖蛋白分子中糖链的立体结构与一般寡糖或多糖相似，也具有二、三、四级结构，多糖的结构形态是各单糖残基在空间相对定位的综合。糖蛋白的立体结构则由糖蛋白中肽链和糖链立体结构的综合而决定，具体可归纳为以下三种【4 6 ，6 1 1 ：( 】) 糖蛋白的蛋白质分子( 肽链) 呈自由卷曲的链状，形成分子的二级结构，该链相互缠绕在一起，进一步卷曲、折叠，形成球状分子等三级结构，在这种结构中，糖链、游离的氨基、羧基等亲水性基团，都位于分子的外侧，疏水性基团则位于分子的内，如卵白蛋白、糖蛋白酶等的立体结构。( 2 ) 糖蛋白的蛋白质分子( 肽链) 呈螺旋或直链状等伸展的二级结构，短的糖链结合在这条肽链上，整个分子的立体结构为棒状等特定的形状，如胶原蛋白的立体结构。( 3 ) 糖蛋白的多肽链上结合很多的糖链，形成星状的立体结构，多见于蛋白聚糖中。2 3 糖蛋白的生物活性糖蛋白具有增强免疫调节、抑制肿瘤、降低血糖、血脂、抗氧化、防衰老等作用，在新型特种药物及功能性食品开发方面具有广阔的运用i i i 景，多年来许多科研工作者对糖蛋白的药理作用及保健功能进行了深入的研究，取得了一系列重要的成果。2 3 1 免疫调节活性免疫系统对保持机体内环境的稳定和结构的完整性，抵抗病原微生物对机体的损害以及对机体内突变细胞的监视等均有重要作用，因此，保持机体免疫功能的正常是保持机体健康的重要条件之一，到目前为止，已经发现不少糖蛋白都具有调节免疫功能。阐建全【5 6 1 发现甘薯糖蛋白s p g 一1 能促进p h a 人外周血淋巴细胞转化起作用，可促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，可显著提高小鼠脾指数，y o s h i k o 6 2 l 等发现白皮甘薯( w s s p ) 的抗糖尿病活性成分c a f 具有增强人体嗜中性粒细胞和单核细胞的噬菌和溶酶活性，提示c a f 有明显的增强免疫调节的作用。h a m e t t 等从寄生的线虫中提取出一种糖蛋白具有很高的增强免疫的效果，其机制可能是刺激t - 淋巴细胞的增殖【6 3 1 。汪东风【删研究表明，茶叶中稀土结合糖蛋白( r e e t g p ) 对正常大鼠和佐剂性关节炎( a a ) 免疫功能紊乱大鼠脾淋巴细胞增值反应均有恢复趋势，对a a 大鼠脾淋巴产生过低的i l 2 ( 白细胞介素一2 ) 有提高作用，而对过高的i l q ( f l 细胞介素1 ) 有抑制作用，提示r e e t g p 对a a 大鼠引起的免疫功能紊乱具有双向调节作用。戴玲等 6 5 1 报道白头翁糖蛋白能在体外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用，并可诱生巨噬细胞产生一氧化氮，对巨噬细胞i o分泌白介素1 亦有一定的提高作用。糖蛋白增强免疫功能的机理被认为是糖蛋白中特定的寡糖具有作为专一信息载体的能力而影响淋巴细胞的许多功能，包括有机体中细胞有丝分裂原的激活作用，细胞对毒素的反应和淋巴细胞对靶器官的作用等【矧。糖蛋白的免疫调节活性是糖蛋白诸多生物活性中研究最多的一类，并已有糖蛋白类免疫调节剂上市，国外已将肺炎克雷菌荚膜糖蛋白开发为免疫调节药必思添( b i o s t i o m ) ，云芝糖蛋白作为免疫增强剂在国内外己应用于临床，但价格昂贵。因此开发高效廉价的具有免疫活性糖蛋白资源是该活性研究的重要方面。2 3 2 抗氧化活性自由基是人体生命活动中生物化学反应的中间产物，许多疾病的发生、发展与自由基对组织的损伤有密切关系，自由基可加快机体的衰老过程，可诱发癌症、心血管疾病等，因此，寻找无毒高效的自由基清除剂是生物活性成分开发研究的活跃领域。越来越多的研究发现，糖蛋白具有抗氧化活性。魏文志【6 7 】从小球藻糖蛋白中分离出分子量分别为6 3 7 ，2 1 0 k d a 的c g pi 和c g p i i 两种组分，利用m脱氧核糖法，连苯三酚自氧化法进行抗氧化实验，结果表明c g pi 和c g pi i 均有一定抗氧化能力，且c g p i i 高于c g pi ；高居易【6 8 】等从建宁莲子中提取出两种糖蛋白，对超氧阴离子自由基的清除率分别为4 5 9 和8 7 ，8 1 ；l i m ，s e i j u n gl e e等相继从u d n ( u l m u sd a v i d i a n an a k a y ) 中提取一种糖蛋白，其对自由基的清除率达7 0 【6 9 j 【7 卅；高荫榆从乌桕叶分离出一种分子量为5 3 0 0 0 的糖含量极高的糖蛋白，具有极强清除羟自由基的活性，5 6 6 x 1 0 。6 m o l l 糖蛋白溶液的活性相当于2 4 1 0 4 m o l l 硫脲液的活性，清除羟自由基活性在0 o 7 5 5 6 m o l l 浓度范围内呈现出剂量效应关系1 7 lj 。聂少平等发现茶叶糖蛋白对超氧自由基有一定的清除作用，对d p p h 有机自由基有很好的清除作用，对口胡萝b 素亚油酸氧化体系也有较好的抑制作用，这提示了该糖蛋白可能在抗衰老、抗炎症等方面有一定作用【7 2 l 。f l i u等研究了8 种具有抗肿瘤活性的蘑菇多糖的抗氧化及清除自由基作用1 7 3 1 ，结果表明，有6 种蘑菇多糖具有上述功效，并且发现与多糖相连的蛋白质与该活性之间有着直接的联系。郭素芬【7 4 】的研究发现甘薯糖蛋白具有明显降低血中丙二醛含量，升高s o d 活力和n o 活性的作用，s o d 活力增高，可对自由基清除增加，从而减轻对组织的损伤和抑制l d l 的氧化。糖蛋白在动物体内的抗氧化途径可能有两种：一是直接清除体内过多的自由基；二是通过提高动物抗氧化酶活力的间接作用来清除过多自由基f 7 ”。2 3 3 降血脂、降血糖作用高血脂症是指血液中一种或多种脂质成分的含量异常增高的病症，大量的研究表明，糖蛋白有很好的降血糖和降血脂功效。李亚娜【7 6 , 7 7 1 研究发现，甘薯糖蛋白能显著降低高血脂症大鼠中血清胆固醇( t c ) 和甘油三脂