（食品科学专业论文）杨梅果汁的花色素苷稳定性和抗氧化功能的研究.pdf

浙江= = 商人学硕士研究生学位论文 杨梅果汁的花色素苷稳定性和抗氧化功能的研究 摘要 杨梅( m y r i c ar u b r as i e b ，e tz u c c ) 花色素苷作为一种天然的色素， 赋予杨梅果汁亮丽的色泽和一定的功能特性。但是，花色素苷极不稳 定，很容易发生降解。本论文以荸荠种杨梅花色素苷为研究对象，在 初步分离和纯化基础上，对其稳定性和抗氧化功能进行了研究，确定 了各种因素对花色素苷稳定性的影响以及抗氧化特性，为控制杨梅果 汁色泽的技术和天然色素的开发提供理论依据。 杨梅汁中存在大量的花色素苷。该花色素苷稳定性较差，不同 p h 值、温度和光照条件以及添加氧化还原物质、糖、山梨酸、苯甲 酸钠和金属离子均影响到其稳定性。p h 值是影响杨梅花色素苷最重 要的因素。随介质p h 值升高，花色素苷稳定性下降。光照、高温处 理促进了杨梅花色素苷的降解；其降解方式为裂解反应。低温、避光 能较好维持花色素苷稳定性。在4 。c 避光条件下，该花色素苷较稳定。 在该条件下贮放3 0d ，花色素苷保存率为7 9 6 7 。h 2 0 2 和0 2 一促进 了杨梅花色素苷的降解。经h 2 0 2 和0 2 - 处理3 0h ，花色素苷保留率 分别为1 5 3 和6 5 ，3 0 。同样，a s a 、d t t 、c y s 、g s h 和焦性没食 子酸处理也加速了该花色素苷的降解，其中a s a 效应最强，其次为 d t t 。两者处理3 0h ，其保留率分别为5 3 1 和2 9 0 6 。不同的金属 离子对杨梅花色素苷稳定性有不同的影响。添加1 0m m o l l 的c a 2 + 浙江工商人学硕_ 上研究生学位论文 或z n 2 + 可增加杨梅花色素苷的稳定性：而c u 2 + 或n a + 贝, j 无明显的影响。 f e 2 + 则导致杨梅花色素苷稳定性下降。1 0 及以上浓度的蔗糖、葡萄 糖增加了杨梅花色素苷的稳定性。另外，添加山梨酸和苯甲酸钠也可 增加该花色素苷的稳定性。 杨梅花色素苷具有强的抗氧化能力和对氧自由基( 0 2 - 和o h ) 和 对d p p h 的清除能力，其抗氧化能力和对0 2 、o h 乖w d p p h 的清除能力 高于抗坏血酸和二丁基羟基甲苯，但抗亚油酸氧化能力略低于b h t 。 花色素苷浓度与其抗氧化能力和对d p p h 自由基、超氧自由基及羟自 由基的清除能力之间明显存在正相关。其中，当使用浓度为1 0 0i t g m l 时，杨梅花色素苷对d p p h 自由基的清除率已达9 0 以上。 0 2 和n 2 处理对杨梅花色素苷的还原力和对清除d p p h 自由基的 能力影响不明显。6 0 。c 和8 0 。c 热处理增加了杨梅花色素苷的还原力 和对d p p h 自由基的清除能力，并且8 0 处理效果高于6 0 处理。 结论：荸荠种杨梅花色素苷具有较差的稳定性和较强的抗氧化能 力。影响花色素苷稳定性的因素很多。其中，p h 值是影响其稳定性 的最关键因素。酶、光、热、氧化还原物质、糖、食品添加剂以及金 属离子等因素都会对其稳定产生影响。同时，杨梅花色素苷对抗亚油 酸氧化能力、对氧自由基( 0 2 一和o h ) 和对d p p h 的清除能力都较强。 关键词：杨梅，花色素苷，稳定性，抗氧化能力 浙江丁商大学硕卜研究生学位论文 s t a b l l i t ya n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f a n t h o c y a n l n sf r o mj u i c eo f r e db a y b e r r y ( m y r i c ar u b r as i e b e tz u c c ) a b s t r a c t a n t h o c y a n i n se n d o ww i t hab r i g h tc o l o ra n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so f t h ej u i c eo fm y r i c ar u b r as i e b e tz u c c a san a t u r a lf o o dc o l o r b u t a n t h o c y a n i n sh a v ep o o rs t a b i l i t ya n dd e g r a d a t ee a s i l y t op r o v i d et h e t h e o r e t i c a li n s t r u c t i o n sf o rt h ec o n t r o lo nt e c h n o l o g yo ft h ej u i c ec o l o r a n dt h ed e v e l o p m e n to fn a t u r a lp i g m e n t s ，a n t h o c y a n i n sw e r ee x t r a c t e d a n dp u r i f i e df r o mb i j im y r i c ar u b r as i e b e tz u c c ，a n dt h e nt h e i rs t a b i l i t y a n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e d am o u n to fa n t h o c y a n i n sw a s p r e s e n ti nr e db a y b e r r yj u i c e v a r i o u s p hv a l u e sa n dt e m p e r a t u r e s ，l i g h te x p o s u r ea n da d d i t i o n so fo x i d eo r r e d u c i n ga g e n t s ，s u g a r ，s o r b i ca c i d ，s o d i u mb e n z o a t e a n dm e t a li o n s i n f l u e n c e da n t h o c y a n i ns t a b i l i t y t h ep hv a l u eh a dt h em o s ti m p o r t a n t e f f b c to nt h es t a b i l i t y t h es t a b i l i t yd e c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gp hv a l u e l i g h te x p o s u r ea n dh i g ht e m p e r a t u r er e s u l t e di na n t h o c y a n i nd e g r a d a t i o n ， w h i c he x h i b i t e dah y d r o p y r o l y s i sr e a c t i o nb a s e do nt h ek i n e t i c so ft h e d e g r a d a t i o n u n d e rd a r kl i g h t a n dl o wt e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s ，t h e i l 浙江工商大学硕一【研究生学位论文 a n t h o c y a n i n sc o u l db em a i n t a i n e dw e l l t h e r ew a s7 9 6 7 a n t h o c y a n i n s a f t e r3 0d a y so fs t o r a g ea t4 。cu n d e rd a r kl i g h t t r e a t m e n tw i t hh 2 0 2 a n d0 2 。，s i g n i f i c a n t l ya c c e l e r a t e da n t h o c y a n i nd e g r a d a t i o n ，w i t h1 5 3 a n d6 5 3 0 a f t e r3 0ho fs t o r a g e ，r e s p e c t i v e l y s i m i l a r l y ，a s a ，r r ，c y s a n dg s hs p e e d e du pt h ed e g r a d a t i o n d i f f e r e n tm e t a li o n sh a dd i f f e r e n t e f f e c t so na n t h o c y a n i ns t a b i l i t y a d d i t i o no fc a 2 + o rz n 2 + e n h a n c e dt h e s t a b i l i t y ，b u tf e ”r e s u l t e di nar e d u c e ds t a b i l i t y s u c r o s ea n dg l u c o s ea t h i g hc o n c e n t r a t i o n ( 10 ) i n c e a s e da n t h o c y a n i ns t a b i l i t y i na d d i t i o n ， u s eo f s o r b i ca c i da n ds o d i u mb e n z o a t ee n h a n c e dt h es t a b i l i t y a n t h o c y a n i n sf r o mr e db a y b e r r yj u i c ee x h i b i t e ds t r o n ga n t i o x i d a n t a b i l i t y a n df r e er a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t yi n c l u d i n gd i p h e n o l - 一1 - p i c r y l h y d r a z y lr a d i c a l s ( d p p h ) ，s u p e r o x i d ea n i o n s a n d d y d r o x y l r a d i c a l s t h ef r e er a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t yo fa n t h o c y a n i n sw a sm u c h h i g h e rt h a nt h a to fe i t h e rv i t a m i nco rb u t y l a t e dh y d r o x y t o l u e n e ( b h t ) ， w h i l ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h ea n t h o c y a n i n sb a s e do nal i n o l e i cs y s t e m a s s a yw a sl o w e rt h a nt h a to f b h t p o s i t i v ec o r r e l a t i o n se x i s t e db e t w e e n a n t h o c y a n i n sc o n t e n ta n da n t i o x i d a n ta b i l i t yo rf r e er a d i c a ls c a v e n g i n g a c t l v l t v a p p l i c a t i o no f0 2o rn 2h a dn oo b v i o u se f f e c to nt h er e d u c i n g p o w e ra n dd p p hs c a v e n g i n ga b i l i t yo fa n t h o c y a n i n s h e a tt r e a t m e n ta t 6 0o r8 0 。ci n c r e a s e dt h er e d u c i n gp o w e ra n dd p p hs c a v e n g i n ga b i l i t y o fa n t h o c y a n i n s ，w i t hab e t t e re f f e c to f t h el m t e r v 浙扎丁商大学硕j 珊究生学位论文 c o n c l u s i o n ：a n t h o c y a n i n so fb i j ir e db a y b e r r yh a dp o o rs t a b i l i t ya n d e x h i b i t e ds t r o n ga n t i o x i d a n ta b i l i t y p hv a l u ew a st h em o s tc r i t i c a lf a c t o r e n z y m e ，l i g h te x p o s u r e ，t e m p e r a t u r e ，a d d i t i o n s o fo x i d eo rr e d u c i n g a g e n t s ，s u g a r ，f o o d a d d i t i v e sa n dm e t a li o n si n f l u e n c e da n t h o c y a n i n s s t a b i l i t y a n t h o c y a n i n sf r o mr e db a y b e r r yj u i c ee x h i b i t e ds t r o n ga b i l i t yo n al i n o l e i cs y s t e ma s s a y ，d p p hr a d i c a l s ，s u p e r o x i d ea n i o n sa n dd y d r o x y l r a d i c a l s k e y w o r d s ：r e db a y b e r r y ，a n t h o c y a n i n s ，s t a b i l i t y ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t y v 浙江丁商大学碰l 研究生学位论文 第一章前言 第一节杨梅概况 杨梅古称龙晴、马丽珠或君家果，属杨梅科( m 蜘c a c e a c ) 杨梅属( m y r i c a l i n n ) 。杨梅学名为m y r i c ar u b r as i e b e tz u c c ，其果实俗称r e db a yb e r r y 。杨梅 为常绿乔木，是原产于中国的亚热带果树，其野生种生长史己有7 0 0 0 多年，人 工栽培史也有2 0 0 0 多年。 世界各地杨梅属的植物共有6 0 多个种，中国有6 个种。它们分别为：毛杨 梅( m y r i c ae s c u l e n t a b u c h ) 、青杨梅( m y r i c a a d e n o p h e r a h a m e ) 、矮杨梅( m y r i e a n a n a c h e v e a l ) 、金缘叶杨梅( m y r i c a i n r e g r i f o l i a r o x b ) 和大杨梅( m y r i c a a r b o r e c e n s s r 1 i e tx l h u s p n o r ) 1 2 。 杨梅原产于中国，属于特产果树。在国外除了日本将其作为观赏植物而有少 量栽培外，其它国家种植很少。杨梅在中国大致分布在北纬1 8 。一3 3 。之问，东 起台湾东岸，西至云南瑞丽，北至陕西汉中，南至海南三亚，地跨北、中热带和 北、中、南亚热带。杨梅的经济栽培主要集中在我国东南沿海的浙江、江苏、福 建、广东和江西、安徽、湖南、贵州等省”，其中浙江省的栽培面积、产量、品 种、品质均为全国之首。目前浙江种植杨梅已超过4 6 6 6 7 公顷，约占全国总栽培 面积的2 1 8 3 】。2 0 0 4 年浙江省年产量已达2 4 万吨。 杨梅果实为核果球形，食用部分为外果皮外层细胞发育而成的囊状体【4 3 。因 品种不同，囊状体有长短、粗细、尖钝、硬软之分。肉柱充分发育而先端圆钝的 果实，汁多味美；反之，风味较差 ”。杨梅内果皮( 果核壳) 坚硬，种仁无胚乳， 只有子叶二枚。 杨梅果实酸甜多汁、风味浓郁、营养价值高，可食率达9 0 以上；果实富含 糖、有机酸和多种维生素，其中维生素c 含量平均为1 0 8m g g ( 鲜重) 。同时杨 梅还含有硫胺素、核黄素、胡萝h 素以及钙、磷、铁、钾等矿物质 6 】，其中钾的 含量是所有水果中最高的。杨梅果实中的各种营养成分如下表1 1 所示【7 l 。 浙江丁商大学硕上研究生学位论文 表1 1 每1 0 0 克鲜重杨梅中营养成分的含量【7 j t a b l e l1t h en u t r i t i o nc o n t e n t so f l 0 0 9f r e s hw e i g h to f r e db a y b e r r y 杨梅具有消食、御寒、消暑、止泻、治疗痢疾以及生津止咳、清肠胃、除烦 愤恶气等多种药用价值 3 , 8 1 0 】。杨梅果实及其制品可治疗牙龈出血等维生素c 缺 乏症、腹泻等症状【3 ，5 1 。杨梅果汁能显著抑制亚硝酸钠和n 一甲基苄胺的致突变作 用，具有潜在的抗肿瘤作用 。杨梅酱能消肿止痛，可治疗扁桃体炎、牙痛等挖】； 杨梅果仁可榨油，同时含维生素b 1 7 ，对胃癌细胞有杀伤抑制作用【1 2 i 。根为收敛 剂，可以治下痢出血、跌打损伤及烫伤等。杨梅叶子含黄酮类物质，可提取芳香 油，作焙烤食品、化妆品及皂化香精的原料t g , t 0 1 。 杨梅果实采后呼吸强、衰老快；同时又极易受到微生物侵染，故极不耐贮藏 和运输。为了更好利用杨梅资源，需进一步改进杨梅保鲜技术，延长化货贺期； 同时对杨梅制品进行开发将是一种重要的手段。杨梅果实通过糖渍、酒浸等传统 方法可加以保存。目前，主要产品主要有果脯、罐头等。近年来又逐渐开发出一 浙江工商大学硕l 研究生学位论文 系列的杨梅加工产品，如粒粒杨梅汁、发酵酒、杨梅干、杨梅果酱、话杨梅、赫 渍、蜜饯、杨梅糕等1 4 。”。 第二节杨梅果汁概况 杨梅果汁酸甜可口，富含多种营养物质，具有一定的食用和药用价值；同时， 可保持杨梅中原有营养物质，还具有货架期长，耐运输和储藏等特点，可为冰激 淋、果冻、混合果汁饮料、杨梅酒等生产提供原辅料。因此，杨梅果汁具有较大 的发展空间。 杨梅果汁在贮放过程中容易发生色泽变化，影响了果汁的外观及风味。引起 杨梅果汁色泽变化主要是由于色素物质不稳定，易发生降解和聚合反应。 杨梅果汁存在大量花色素苷。花色素苷是一种天然的色素，赋予杨梅亮丽的 紫红色；但是花色素苷极不稳定，易受到各种因素的影响而发生降解。花色素苷 在杨梅果汁贮藏过程中的降解是引起色泽变化的主要因素；因此，对杨梅花色素 苷的研究就显得重要。 第三节杨梅花色素苷的研究概况 一、花色素苷的理化性质 花色素苷( a n t h o c y a n i n s ) 是红、蓝、紫花色的母体色素。花色素苷所呈现 的不同颜色取决于它的羟基、甲氧基的数量和糖苷化作用。花色素苷的种类很多， 天然存在的花色素苷有2 5 0 多种。当前已鉴定的花色素苷约1 4 0 种。花色素苷非 糖苷化的部分成为花色素( a n t h o c y a n i d i n ) ，其糖苷化可发生在3 , 5 ，7 ，3 一羟基的 位置，但多见于3 ，5 ，7 一位羟基。因糖与羟基结合的位置、数量和种类的不同，使 得花色素苷的种类繁多。 花色苷是属于类黄酮的天然色素，以黄酮核为基础，以花色素为糖苷配基， 基本结构为2 一苯基苯并吡喃样( 花色样) 上连有不同的羟基和甲氧基。常见的花 色苷均在3 位或3 ，5 位上连有糖苷键。常见的糖基为葡萄糖、鼠李糖、木糖、半 乳糖、阿拉伯糖和果糖。主要的花色素苷元有六种：矢车菊花色苷元( c y a n i d i n ， c y ) 、天竺花色苷元( p e l r g o n i d i n ，p g ) 、飞燕草花色苷元( d e l p h i n i d i n ，d p ) 、 牵牛花色苷元( p e t u n i d i n ，p t ) 、锦葵色素苷元( m a l v i d i n ，m v ) 、芍药花色苷元 ( p e o n i d i n ，p n ) 【2 3 】。天然花色苷结构如图1 1 ： 浙江工商大学硕：k - 珥f 究生学位论文 h o o h r 1 图1 1 花色营的结构 f i g 1 1t h es t 兀1 c t m eo f a n t h o e y a n i d i n s o h r 2 表1 2 花色茁基团及位置 t a b l e l 2g r o u p sa n dt h e i r p o s i t i o n so f a n t h o c y a n i d i n s 基团g r o u p 位置p o s i t i o n 糖苷配基 3 573 7 4 5 7 a g l y c o m e 飞燕草色素 o ho ho ho ho h o h d e l p h i n i d i n 矢车菊色素 c v a n i d i n o ho ho ho ho hh 天竺葵色素 o h0 ho hho hh p e l a r g o n i d i n 锦葵色素 m a l v i d i n o h o ho ho c h 3o ho c h 3 芍药色素 p e o n i d i n o h0 h0 ho c h 3o h h 牵牛花色素 p e t u n i d i n o h o ho hho ho c h 3 杨梅果实中含丰富的花色素苷。目前“荸荠”杨梅主要花色素苷组分是为矢 车菊花色苷元一3 一葡萄糖苷，以及少量的天竺葵花色苷元一3 一单糖苷和飞燕草花色 苷元一3 一单糖等 2 4 】。 q 页旷 参芯川 f o + 二 ，蓼 8(a币一嫩 浙江工商人学颅l 研究生学位论义 二、花色素苷稳定性 花色素苷由于糖苷配基部分的高度反应活性而极易受到亲核电子的攻击。在 常温条件下，花色素苷性质极不稳定，易受酶、温度、氧气、光【2 8 】、p h 2 9 1 、 糖及其降解产物【2 6 、金属离子【2 9 】和次生代谢产物以及辅助色素等因素的影响。 不过，不同因素对花色素苷稳定性的影响常因花色素苷种类、来源、性质等不同 而有明显的差异。 ( 一) 酶对花色素苷稳定性的影响 影响花色素苷的酶主要为多酚氧化酶( p p o ) 、过氧化物酶( p o d ) 和糖苷 酶。j o l y n n e l 3 ”、h u a n g t 3 2 】和z h a n g 等盼3 4 认为糖营酶、多酚氧化酶和过氧化物酶 促进花色素昔降解生成花色营元和耱；而花色素昔元比花色素营更不稳定，易于 分解。w e s c h e 等人发现，草莓p p o 对花色素苷不表现活性，但对花色素却表现 非常高的活力 ”1 。j i a n g 推测荔枝果实花色素苷不能被p p o 直接催化氧化，可能 是糖配基构成空问阻碍而导致p p o 对花色素苷亲和力低i ”) 。z a p a t a 等发现葡萄 p o d 对花色素苷亲和力很低，只有当花色素苷的糖苷配基去掉后才能被p o d 催 化氧化m 】。目前，对杨梅果汁花色素苷的酶促降解还缺乏了解，需要加以研究 阐明。 ( 二) 温度对花色素苷的稳定性的影响 温度对花色素苷稳定性具有显著的影响。花色素苷在溶液中存在酸碱平衡、 水解平衡和结构互变平衡。一般说来，高温会促进花色素苷水解。花色素苷的二 苯基苯并吡喃阳离子的失电子过程是一放热反应，而水解反应和开环反应都是吸 热反应并且都随着熵的增大而增大。因此在温度增加时，不管是否有利于二苯基 苯并吡喃阳离子的形式，都将会有利于查耳酮的产生m 1 。不过，杨梅红色素在 温度低于6 0 ( 2 下变化不大，但加热到8 0 4 c 以上，则迅速降解o ：娉“1 。因此，研究 在不同温度下杨梅花色素苷降解的动力学特性，可了解花色素苷降解对温度的响 应模式。 ( 三) 氧气对花色素苷稳定性的影响 氧气可导致色素苷发生氧化作用，从而影响到其稳定性。一般认为，氧气通 过直接氧化花色苷或者使介质过氧化，然后通过介质间接和花色素苷反应促使花 浙江r t 商大学硕。i 研究生学位论义 色素苷降解。励建荣等4 2 峙旨出氮气处理可保持杨梅花色苷的热稳定性。目前， 不同氧气浓度对杨梅果汁花色素苷醉解及其作用机理还缺乏专门研究。 ( 四) 光对花色素苷稳定性的影响 光对花色素苷稳定性影响较大。研究表明杨梅红色素置于紫外光下照光0 5 h ，红色素开始降解，到】0h 后则完全降解 3 9 , 4 1 。p i f f a u t 4 3 1 认为在光照条件下花 色素苷热降解速率增大。光照还引起花色素苷降解为c 。羟基的中间产物，该中 问产物在c ：位上水解然后开环最后生成查耳酮，查耳酮则快速降解成苯酸等产 物。不过，光对杨梅花色素苷稳定性的影响常因在不同条件下而有所变化。 ( 五) p h 对花色素苷稳定性的影响 p h 对花色素苷稳定性具有明显的影响。花色素苷分子中吡喃环上的o 为四 价，呈碱性，而苯基上的酚羟基具有酸性，从而使花色素苷分子具有两性，在不 同p h 介质中呈现不同的颜色。在低p h 时( p h 1 5 ) 杨梅花色素苷显示鲜艳的 红色，但随着p h 增大，红色逐渐变淡至无色；当p h 7 时花色素昔转变为蓝色。 另外，当p h 处于3 o 一7 0 时，杨梅花色素苷的最大吸收峰波长有右移趋势；而 当p h 处于7 o 一1 2 0 ，则表现出向左移动。这样，了解杨梅花色素苷最佳稳定性 的p h 值，可为保持杨梅果汁色泽提供重要的理沦依据。 ( 六) 金属离子对花色素苷稳定性的影响 金属离子多为花色素苷的组成成分，对花色素苷的稳定性有较大的影响。有 研究表明添加金属离子可增加杨梅色素的稳定性“，3 ”。s e g a l 等认为添加铝盐 可使酸樱桃、葡萄和草莓汁色泽稳定性增强。阑定运等也认为铝离子和铁离子可 增强红米色素的稳定性1 。不过，陈健初等4 6 l _ q 2 作表明铝、铁离子对杨梅花色 素苷稳定性无显著的影响。因此，金属离子在杨梅花色素苷稳定性中的作用需要 进一步了解。 ( 七) 辅助色素对花色素苷稳定性的影响 辅助色素可使花色素苷吸收波长蓝移，并导致吸光度值增加，这与辅助色素 与花色素苷相互作用有关。辅助色素主要有蛋白、单宁酸、类黄酮、有机酸、核 酸、多糖等。励建荣等报道单宁可显著增加杨梅花色素苷的稳定性m 1 。方忠祥 等工作表明十二烷基硫酸钠、乙醛和桑椹红色素对贮藏杨梅汁的色泽有明显的保 6 浙江t 商大学碘j j j 】f 究生学位论文 护作用 4 引。目前，有关辅助色素对杨梅花色素苷稳定性的影响了解还不多，尚 待进一步研究。 三、花色素苷的抗氧化特性 近来的研究表明花色素苷是一种抗氧化荆，具有抗辐射、抗炎、抗癌等许多 重要的生理和生物学功能，因而在食品添加剂、保健品和医药工业方面有着广阔 的应用前景。 葡萄果皮中含有多种锦葵配基花色素苷类，其中m a t v i d i n - 3 0 5 g l u c o s i d e 的抗氧化能力是儿茶素和生育酚的两倍，可同时作为抗氧化剂和着色剂。 黑米含有特殊的抗氧化成分，经分离纯化，主要的抗氧化性色素为 c y a n i d i n e - 3 一o b d g l u c o p y r a n o s i d e ，其抗氧化活性极强，该成分也存在于黑豆中。 w a n g 等采用氧自由基清除能力测定方法研究比较了1 4 种花色素苷类物质 清除脂质过氧化能力，结果提示这类化合物的脂质过氧基清除能力均为t r o l o x 强。 杨梅果汁富含多种营养物质，除具有一定的食用价值外，还具有抗氧化等多 种功能特性。杨梅果汁中富含花色素菅，而花色素苷具有较强的抗氧化性。因此， 研究杨梅花色素苷的抗氧化特性，可了解杨梅果汁的抗氧化功能，为开发杨梅保 健食品提供理论依据。 第四节本研究的意义 杨梅果汁因其丰富的营养价值、独特的口味和亮丽的色泽而深受消费者欢 迎。杨梅果汁在贮藏过程中常出现色泽变化，影响到杨梅果汁质量。杨梅果汁色 泽变化与花色素苷降解密切相关。同时杨梅果汁富含多种营养物质，具有抗氧化 等多种功能特性，其中花色素苷在杨梅果汁抗氧化方面起着重要的作用。因此， 研究杨梅花色素苷的稳定性和抗氧化特性具有重要的理论意义。 本研究在初步纯化花色素苷基础上，重点研究热、酸、碱、光、气体组分、 抗氧化和还原剂等对杨梅花色素苷稳定性的影响以及抗氧化能力，初步确定影响 花色素苷稳定性的关键因素，为控制杨梅果汁色泽的技术和杨梅保健食品的开发 提出理论依据。同时杨梅花色素苷作为一种天然色素，具有无毒无害等优点，通 过对其进行研究也可为天然色素的丌发提供一定的理论依据。 浙江1 = 商人学坝1 ：6 0 t 究生学位论文 第二章杨梅花色素苷的提取和初步纯化 一、试验材料 第一节材料与设备 杨梅品种荸荠，采自浙江省兰溪市柏社乡。果实红熟后采收并立即运回实验 室。挑选烂果、虫果后，于一1 8 c 冰柜中冷藏备用。 二、主要试剂 表2 1 主要试剂 三、主要试验仪器与设备 表2 2 主要试验仪器与设备 仪器生产商 旋转蒸发仪 s l 系列( 高精度) 电子天平 p h s 一3 c 精密p h 计 t g l 一16 g a 型高速冷冻离心机 u v 一2 8 0 2 型紫外可见分光光度计 上海青浦沪西仪器厂 上海民桥精科科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 浙江丁商人学硕研究生学位论文 第二节实验方法 一、杨梅果实花色素苷的提取和初步纯化 参照b a u b l i s 等4 9 1 的方法并作一定改进。取一定量的冷冻杨梅果实，解冻后， 去核后匀浆，用l ( v v ) 的盐酸多次浸提，直至果实无红色，然后用w h a t m a n n o1 滤纸过滤提取液，得花色素苷粗提取液。该粗提取液上a m b e r l i t ex a d 一7 树脂( s i g m a ) 层析柱( 1 5 4 0c m ) 。用3 0 0m l 蒸馏水洗柱以除杂质，接着用 o 1 h c i - 甲醇洗脱，分管( 每管3m l ) 收集洗脱液，最后用0 4m o l l ( p h3 0 ) 柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液稀释沈脱液后测定5 1 0n l n 处的光吸收值。合并光吸收 值较大且相近的几管收集液，用减压旋转蒸发仪在低于4 0 。c 下浓缩。浓缩液通 过s e p p a kc 1 8 柱以除去不溶性杂质，得到初步纯化的杨梅花色素苷浓缩液。 二、p h 差示法测定花色素苷含量 ( 一) 果汁花色素苷含量测定 参照w r o l s t a d 等的方法。取一定量冷冻的杨梅果实，解冻后去核榨汁。 果汁先用四层纱却过滤，后用滤纸过滤，收集过滤液，得杨梅果汁。取o 1m l 过滤液，分别用0 4m o l lk c l - h c l 的缓冲液( p h1 o ) 和0 4m o l l 柠檬酸磷 酸氢二钠缓冲液( p h5 o ) 稀释至3m l ，混匀后以蒸馏水作对照，在5 1 0n l n 下 测定光吸收值( a ) 。 杨梅果汁花色素苷的含量按下述公式计算：c l ( m m o l l ) = a x3 0 x1 0 0 0 2 9 6 0 0 ，c 2 ( u g m l ) = a 3 0 x 4 4 5 2 x1 0 0 0 2 9 6 0 0 ：其中a a = a ( p h1 o ) 一a ( p h5 0 ) ，3 0 为稀释倍数，4 4 5 2 为矢车菊素一3 一葡萄糖苷的分子量( g m 0 1 ) ， 2 9 6 0 0 为矢车菊素3 一葡萄糖菅的摩尔比吸收系数( t o o l c m ) 。 c t 和c 2 分别为花色素苷的摩尔浓度和质量浓度。 ( 二) 部分纯化的花色素昔含量测定 取部分纯化的花色素苷浓缩液o 1m l ，分别用0 4m o l lk c l 一h c l 的缓冲液 ( p h1 o ) 和0 4m o l l 柠檬耐磷酸氢二钠缓冲液( p h5 o ) 稀释至3m l ，以蒸 馏水作对照，在5 1 0n m 下测定光吸收值( a ) ，花色素苷含量计算方法同上。 9 浙江工商人学硕：研究生学位论史 三、花色素苷保存率的计算 杨梅花色素苷的保存率按下述公式计算：花色素苷保存率( ) = ( c t c o ) 1 0 0 = ( a t a o ) 1 0 0 ；其中，c o 和c t 分别为花色素苷开始放置时和经过 时间t 后的花色素苷的浓度。参照陈健初和苏平5 3 1 的方法以花色素苷保存率的负 对数 l g ( a o a t ) 】为纵坐标，贮藏时间为t 为横坐标作图，确定反应性质。 第三节结果与讨论 一、花色素苷的分离和纯化 色素的提取方法一般有压榨法、溶剂浸提法、热煮法、酶反应法、培养法和 粉碎法等。本试验根据杨梅花色素苷的性质，选择了溶剂浸提法。色素的纯化方 法一般有溶剂分离、两相萃取、酶纯化、c 0 2 超临界萃取、吸附树脂分离、超滤 等。由于杨梅花色素苷易溶于甲醇，且在酸性条件下比较稳定；因此，本研究采 用0 1 盐酸一甲醇洗脱的吸附树脂分离法。 杨梅花色素昔浸提液通过a m b e r l i t e x a d 一7 树脂柱进行分离。图2 1 为分管 收集得到的杨梅花色素苷沈脱液在5 1 0n r n 处的吸光度值情况。由图2 1 可以看 出，杨梅花色索营分布比较集中，主要在扯1 0 号管，合并浓缩后进行下一步实 验。浓缩液的p h 为2 2 2 。杨梅果汁的p h 约为2 8 4 。 浙江t 商大学颅，i 研究生学位论文 1 2 0 1 0 0 测8 0 世 米 督6 0 重 。4 0 2 0 o 1 92 22 52 83 l3 43 7 收集管数 图2 1 杨梅花色素苷在a m b e r l i t ex a i ) _ 7 上不同收集管数的吸光值 f i g 2 1a b s o r b a n c eo f f r a c t i o n so f r e d b a y b a r ya n t h o e y a n i n s p u r i f i e db y a m b e r l i t e x a d 一7 二、杨梅果汁花色素苷的含量 本试验采用p h 差示法测定花色素苷的含量，可消除一些非花色素苷物质对 测定结果的干扰。该方法优于盐酸甲醇直接测定法。 ( 一) 杨梅果汁中花色素苷的含量 c l = ( o 3 0 9 0 0 3 0 ) 3 0 1 0 0 0 2 9 6 0 0 = 0 2 8 3 m m o l l c 2 3 ( o 3 0 9 0 0 3 0 ) 3 0 x1 0 0 0 4 4 5 2 2 9 6 0 0 = 1 2 6 0ug m l 杨梅果汁中的花色素苷含量随杨梅品种而不同。一般来说荸荠种杨梅花色素 苷含量较高。在本试验中，荸荠杨梅花色素苷含量达到1 2 6 0ug m l 。 ( 二) 杨梅花色素苷浓缩液中花色素苷的含量 c l = f o 9 9 2 0 1 7 5 ) 3 0 1 0 0 0 2 9 6 0 0 = o 8 2 8 m m o l l c 2 3 ( 0 9 9 2 _ 0 1 7 5 ) 3 0 x 1 0 0 0 x 4 4 5 2 2 9 6 0 0 = 3 6 8 6ug m l 浙江丁商大学硕：研究生学位论文 第四节本章小结 本章根据前人提取、分离、纯化花色素苷方法，结合杨梅花色素苷特性， 确定了杨梅花色素苷初步纯化方法；同时利用p h 差示法测定了花色素苷的含量， 为研究杨梅花色素苷的稳定性和抗氧化特性做好准备。 浙江t 商大学硕l 研究生学位论文 第三章杨梅花色素苷稳定性 第一节试验材料与设备 一、试验材料 供试材料为杨梅花色素苷浓缩液( 由第二章方法制备) 。 二、主要试剂 试剂 表3 1 主要试剂 等级 生产商 邻苯三酚 愈创木酚 核黄素 甲硫氨酸 抗坏血酸 半胱氨酸 二硫苏糖醇 焦弧硫酸钠 还原型谷胱甘肽 焦性没食子酸 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市化学试剂研究所 上海化学试剂厂 上海伯奥生物科技有限公司 上海伯奥生物科技有限公司 中国科学院生物化学研究所 s e r v a 公司 汕头市光华化学厂 上海酵母厂 贵州遵义市第二化工厂 三、主要仪器与设备 表3 2 主要试验仪器与设备 仪器 生产商 s l 系列( 高精度) 电子天平 p h s 一3 c 精密p h 计 u v 一2 8 0 2 型紫外可见分光光度计 上海民桥精科科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 浙江丁商大学硕j 。研究生学位论文 h h 6 数显恒温水浴锅金坛市富华仪器有限公司 第二节试验方法 一、酶对花色素苷稳定性的影响 ( 一) 多酚氧化酶( p p o ) 活性测定 参照j i a n g 3 6 的方法，略有修改。冷冻杨梅解冻、去核后榨汁，四层纱布过 滤后，经离心得到上清夜为杨梅原汁。取杨梅原汁作为酶液进行酶活性测定。3 m l 反应液中含有2 7 0m l1 0m l o l l 邻苯三酚( 用0 2m o l lp h6 8 的磷酸缓冲 液配制) 和o 3 0m l 的酶液。测定3 9 8n l n 处的光吸收值的变化，以每分钟光吸 收值变化o 0 0 1 表示一个酶活性单位。 ( 二) 过氧化物酶( p o d ) 活性测定 参照陈贻竹和王以柔【5 1 1 的方法，略有修改。同上方法得到杨梅原汁。以杨 梅原汁作为酶液进行酶活性测定。3m l 反应液中含有o 1m l4 o 愈创木酚( 以 5 0 7 , 醇配制) 、o 1 m l0 4 6 h 2 0 2 、2 5 m l 0 1 5 m o l l 磷酸缓冲液( p h7 o ) 和o 3 m l 酶液。测定4 7 0r l l n 处光吸收值的变化，以每分钟光吸收值变化o 0 1 表示一 个酶活力单位。 ( 三) p p o 、p o d 对杨梅花色素苷稳定性的影响 按照上述方法得到的杨梅原汁在室温( 约3 0 。c ) 下放置不同时问，定期测 定花色素苷含量和p p o 、p o d 的活力。 二、不同p h 对花色素苷稳定性的影响 选用0 3m o l l i 拘h c i k c l 缓冲液和广范围缓冲液分别配制p h 为1 0 、2 0 、3 0 、 4 0 、5 0 、6 0 的溶液。取一定量杨梅花色素苷浓缩液，用上述缓冲液稀释至2 0 u 曲 1 l ，于4 和2 5 下分别放置0 、6 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 h 后，测定5 l o 衄处的光吸 收值。每个处理设3 个重复，以相对处理前的百分数表示。以0 1 盐酸一甲醇稀释 相同倍数的花色素苷溶液在5 1 0 砌下的光吸收值1 0 0 。 三、不同温度对花色素苷稳定性的影响 耿一定量杨梅花色素营浓缩液，用o 4 m o l l 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液( p h 浙江工商大学琐_ l 研究生学位论文 3 o ) 稀释至2 0 “g m l ，分别置于4 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、4 0 、6 0 、8 0 ，9 0 和1 0 0 。c 下，定期测定5 1 0n m 处的光吸收值。每个处理设3 个重复，以相对处理前的百 分数表示。 四、不同光照对花色素苷稳定性的影响 取一定量杨梅花色素苷浓缩液，用0 4m o l l 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液 ( i o h3 o ) 稀释至2 0u g m l 。稀释后的溶液室温( 约3 0 。c ) 分别于避光、自然 光和白炽灯( 光强度为4 0 0 0l u x ) 条件下，每隔5h 测定5 1 0n m 处的光吸收值。 每个处理设3 个重复，以相对处理前的百分数表示。 五、不同金属离子对花色素苷稳定性的影响 用0 4m o l l 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液( p h4 0 ) 分别配制lm m o l l 和1 0 m m o l l 的n a c 、c a c i 。、c u s o 、f e c l 。、f e c l 。和z n s o 。溶液。取一定量的杨梅花 色素苷浓缩液用上述溶液稀释至2 0g m l ，于室温( 约3 0 。c ) 下避光放置，定 期观察溶液颜色的变化，并测定5 1 0i 2 m 处的光吸收值，以相对处理前的百分数 表示。每个处理设3 个重复。 六、氧化物质对花色素苷稳定性的影响 取一定量花色素苷浓缩液，分别稀释于含1 0m m o l l 过氧化氢( h ：0 2 ) 和2 0 p