（食品科学专业论文）康宁木霉纤维素酶CBH2基因的克隆及序列分析.pdf

摘要 纤维素酶是天然纤维生物降解最主要的酶类，木霉是目前发现的产纤维素酶能力最 强的微生物，其高效的纤维素酶表达系统是研究丝状真菌表达调控的最好材料之一。本 研究以纤维素酶高产菌株康宁木霉( t r i c h o d e r m a k o n i n g i i ) a s 3 2 7 7 4 为对象，对其纤维 素酶c b h 2 基因进行克隆和分析。 研究比较了四种d n a 提取方法对康宁木霉d n a 提取效果，结果表明简化c t a b 法对 康宁木霉的d n a 提取效果最好。利用植物r n a 提取试剂盒提取康宁木霉的r n a ，结果 植物r n a 提取试剂盒可成功的提取康宁木霉r n a 。 依据g e n b a n k 中己公布的木霉c b h 2 基因序列设计合成了一对引物，采用p c r 和 r t p c r 法得到了c b h 2 基因及其c d n a 。将该基因及其c d n a 与p m d l 9 - t 载体连接， 转入大肠杆菌并进行序列测定。 测序结果表明康宁木霉a s 3 2 7 7 4 的c b h 2 基因全长1 5 8 3 b p ，g c 含量为5 5 5 9 。 通过同源性比较，其与g e n b a n k 中已公布的木霉其他菌株c b h 2 基因序列同源性达最高 可达8 7 4 9 。 康宁木霉a s 3 2 7 7 4 的曲h 2c d n a 全长1 4 1 3 b p ，g c 含量为5 6 4 1 。通过同源性 比较，其与o e n b a n k 中已公布的木霉序列同源性最高可达9 1 7 2 。 对康宁木霉c b h 2 基因结构进行分析，对比e b b 2 基因组d n a 序列与c d n a 序列， 证明该基因由4 个外显子组成，被3 个内含子间断隔开，其中内含子分别在9 3 1 4 3b d ， 5 2 8 5 8 3b p ，8 3 2 8 9 4b p 三处。可编码4 7 0 个氨基酸的多肽，其中前1 9 个氨基酸为信号 肽。 关键词：康宁木霉c b h 2 基因克隆序列分析 a b s t r a c t c e l l u l a s e sa r ev e r yi m p o r t a n tf o rt h ec e l l u l o s e h y d r o l y t i c t r i c h o d e r m ai so n eo ft h e m o s te f f i c i e n tp r o d u c e r sf o rc e l l u l a s e s ，a n di t se f f i c i e n tc e l l u l a s ee x p r e s s i o ns y s t e mi st h eb e s t m a l e r i a l st os t u d yo fg e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o n i nt h i ss t u d y ，t r i c h o d e r m ak o n i n g i i s t r a i n sa s 3 2 7 7 4 、：v i t hh i 曲e n z y m a t i ca c t i v i t yw a su s e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a lt oc l o n ea n d a n a l y s i st h ec b h 2g e n e f o u rd n ae x t r a c t i o nm e t h o d sw e r es t u d i e dt oe x t r a c tt h et r i c h o d e r m ak o n i n g i id n a ， t h er e s u l ts h o w e ds i m p l i f i e dc t a bm e t h o dw a st h eb e s te x t r a c t i o nm e t h o d t h et r i c h o d e r m a k o n i n g i ir n a c o u l db ee x t r a c t e dt h r o u g hp l a n tr n ae x t r a c t i o nk i ts u c c e s s f u l l y a c c o r d i n gt ot h ec b h 2s e q u e n c eo ft r i c h o d e r m ap u b l i s h e di ng e n b a n k ，ap a i ro f p r i m e r sw a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，t h ed n a a n de d n af r a g m e n t so fc b h 2 w e r eo b t a i n e d b yp c ra n dr t p c r ，a n dt h ed n a o re d n af r a g m e n t sw e r er e c o m b i n e dw i t hp m d i9 - t v e c t o ra n dt r a n s f e f e di n t oec o l ia n ds e q u e n c e d s e q u e n c ec o m p a r i s o n ss h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo fc b h 2g e n eo ft r i c h o d e r m ak o n i n g i i i s15 8 3 b p ，a n dg c i s5 5 5 9 t h eh i g h e s ts e q u e n c eh o m o l o g yb e t w e e nt h ec b h 2g e n eo f t r i c h o d e r m ak o n i n g i ia n dt h ec b h 2g e n eo f o t h e rt f i c h o d e n m ai s8 7 4 9 s e q u e n c ec o m p a r i s o n ss h o w e dt h a tt h ec b h 2c d n ao ft r i c h o d e r m ak o n i n g i iw a s i413 b p ，a n dg c w a s5 6 41 t h eh i 曲e s t s e q u e n c eh o m o l o g yb e t w e e nc b h 2e d n a f r a g m e n to f t r i c h o d e r m ak o n i n g i i a n d t h ec b h 2g e n eo f o t h e r t r i c h o d e r m a w a s9 1 7 2 t h er e s u l to ft h et h es t r u c t u r ea n a l y s i so fc b h 2g e n eo ft r i c h o d e r m a k o n i n g i i ，t h ec b h 2 g e n ei sc o m p o s eo f4e x t r o n s ，t h ee x t r o n s & r ei n t e r r u p t e db yt h r e es h o r ti n t r o n s ，t h es i t e so f i n t r o n sa r e9 3 - 1 4 3b p ，5 2 8 - 5 8 3b p ，8 3 2 8 9 4b p + t h ec b h 2e d n af r a g m e n to ft r i c h o d e r m a k o n i n g i ie n c o d e d4 7 0 a a ，a n dt h ef i r s t19 a ao fn e n di ss i g n a lp e p f i d e k e yw o r d s ：t r i c h o d e r m ak o n i n g i i c b h 2g e n e c l o n e s e q u e n c ea n a l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：主i 蔓趁 日期： i o o j 1 4 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：塑要丝 日期： 导师签名：墅兰 日期： o o 。o 如护6 ，、矽 康宁术霉纤维紊酶c b h 2 基因的克隆及序列分析 1 1 课题的目的和意义 第一章前言 随着世界人口的迅猛增长和人民生活水平的不断提高，能源危机，食物短缺，环境 污染等社会问题日益严重。寻找并开发新的能源、节省粮食、减少环境污染显得越来越 重要，并已引起世界许多国家的重视【l 】。 纤维索作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源。据 报道，全球每年通过光合作用可以获得新的纤维素约4 0 1 0 ”吨，约占地球生物资源 总量的4 0 ，相当于每人每天1 8 4 千克。如此丰富的纤维素资源怎样得到充分的利用， 将会成为在一定程度上解决上述社会问题的一种非常有效的办法。目前，利用纤维索酶 的水解作用是一种高效的，彻底的，无污染地分解纤维素的理想途径，它可使大量纤维 素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质，具有积极的深远意义。到目前为止， 纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医等领域中，并取得了初步成效。 我国对纤维素酶的研究虽然有几十年的历史，但由于纤维索酶的酶系组成相当复杂， 活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制。因此选育高活性的纤维素酶是我国 酶制剂研究的一项重要任务【2 。尽快采用各种行之有效的高新技术，发展具有中国自己 知识产权的新酶种、新产品、新剂型，满足市场的需求，是当务之急。 2 1 世纪是知识经济时代，随着人们对纤维素酶研究工作的深入，纤维素酶必将在食 品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。 纤维素酶产酶菌株中木霉产纤维素酶的活性最高、转化纤维素的效率最好。纤维素 酶是纤维素诱导型酶类，具有多个酶组分，其基因的表达调控是一个非常复杂的过程， 其中c b h 2 具有重要的作用。要想提高木霉的纤维素酶的产酶能力就必须了解c b h 2 基因 及其调控机制。在国际上有关里氏木霉纤维素酶的分子生物学方面研究较多，而有关康 宁木霉纤维素酶基因研究较少【34 1 ，康宁木霉是一种纤维索酶高产菌，其c b h 2 基因在 g e n b a n k 中报道较少，开展相关研究具有重要理论意义。 纤维素酶产酶菌株普遍受到其酶解产物如葡萄糖等反馈抑制影响，采用常规诱变选 育的办法也能获得一些抗阻遏菌株i s ，但由于总体产酶能力较低未能得到广泛应用。通 过康宁本霉c b h 2 基因克隆，可将其构建在一些不受葡萄糖抑制的真核启动子下游，如 p k i ，c d n a l 等启动子【6 j ，使c b h 2 不再受到培养基中葡萄糖影响而得到高效表达，从而诱 导其他纤维素酶基因的协同表达，较大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能 河南工业大学硕士学位论文 3 。 本研究拟采用基因工程的方法，通过对可利用纤维素的丝状真菌康宁木霉的纤维素 酶基因的克隆，为咀后进行基因改造打下良好基础。 1 2 纤维素酶概述 1 2 1 纤维素的特性 纤维素是一种由d 吡喃式葡萄耱基通过争l ，4 一糖苷键连接而成的线性不分支的同 聚多糖。它所连成的线性长链是“硬而直的”。纤维素分子的聚合度变化很大，而一般 在g o o q 1 0 0 0 0 个葡萄糖残基左右。值得注意的是占重要比重的植物纤维索的聚台度高 达1 4 0 0 0 左右。它的高聚合度、毛细管结构，木质素( 1 i g i n ) 和半纤维素( h e m i c e l l u l a s e ) 形成的保护层，再加上其超分子结构中的结晶区( c r y s t a l l i n e ) 存在大量氢键，从而使纤 维素很难被很好的利用。 1 , 2 2 能降解纤维素的微生物群落7 1 伴随着漫长的进化历程，自然界中出现了众多能降解纤维素的微生物，包括真菌、 细菌和放线菌。目前，已发现的具有降解纤维素能力的微生物接近2 0 0 种。其中，丝状 真菌是研究最多的微生物降解类群。真菌与细菌降解纤维素的途径不同：真菌在降解纤 维素时，菌丝穿过次生壁进入胞腔，由内向外降解纤维素，使纤维逐步被破坏：而细菌 则是粘附在纤维上，从纤维的表面向内生长，在接触点处纤维素被降解，使纤维表而呈 锯齿蚀痕。术霉属( t r i c h o d e r m a s p p j 真菌是目前研究最多的纤维索降解菌，如：z r e e s e i ， t _ v i r i d e 。t k o n i n g i i 和t p s e u d o k o n i n g i i 等，本课题所研究的菌种为其中的zk o n i n g i 32 7 7 4 。 1 2 3 纤维素酶酶系的组成和理化性质【8 , 9 1 纤维素酶是指所有参与降解纤维素、最终将其转化为葡萄糖的各种酶的总称。它是 一类复杂的酶复合物，故而又称为纤维素酶系( c e l l u l a s es y s t e m ) 。人们通常将纤维素酶 分为三个组分：内切葡聚糖酶( e n d o - l ，4 一b d - g l u c a n a s e ，e c 3 ，2 1 4 ，e g ) ，外切葡萄糖酶 ( e x o 一1 ，4 一p d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ) 和p - 葡萄糖昔酶( d - g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 12 1 ，b o ) 。 其中，外切葡萄糖酶又称纤维二糖水解酶( e e l l o b i o h y d r o l a s e ，简称c b h ) 。e g 和c b t 2 康宁木霉纤维素酶c b h 2 基因的克隆及序列分析 分别有两种异构酶，即e gi ( e g i i 同e gi ) 和e o i i i ，c b hi 和c b h i i 1 0 1 。 纤维素酶的理化性质主要是它的多重性( 也称“多态性”) 。e v c l e i g h 分析了酶多重 性的原因：( 1 ) 微观不均一性( m i c r o h c t c r o g e n c i t y ) ：这是基于纤溶酶组分与其他糖蛋白 或多糖之间结合的复杂性。( 2 ) 。宏观不均一性( m a c r o h e t e r o g e n e i t y ) ：这是基于复合酶聚 合体形式多样性的多重性。( 3 ) 翻译的不守性( i n f i d e l i t y ) ：由于蛋白酶解或糖苷化及培养 液中不同组分酶间的作用导致由一个原始基因形成的变种而合成的多种酶。( 4 ) 复合基 因的出现：不同基因形成的酶在纤维素水解中起不同作用。 微生物中能够分泌纤维素酶“完全”酶系的一般为真菌。个完整的纤维素酶系中 的三类酶作用方式不同，但能相互协同催化水解纤维素。在每一类纤维素酶中，不同酶 系往往会有多个在结构、功能和活性上不同的组分，每一组分又可能由不同的弧组分组 成。即使是同一微生物也可能因不同的地区来源和不同的培养条件而使得纤维素酶的成 分、分子大小和p h 值有很大的差别。 1 2 4 纤维素酶分子生物学 1 2 4 1 纤维素酶分子结构 近年来，人们针对纤维素酶分予结构的研究已开展了广泛的工作，借助现代化分析 技术和方法( 如重组d n a 、电镜和x 射线扫描等) ，对纤维素酶的分子结构进行了大量 研究。 迄今为止，一级结构已经被分析确定的纤维素酶至少有2 0 种，通过比较分析，可以 发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性( h o m o l o g y ) 。其中，木霉属产生的c b hi 和e gi 之间总的同源性约占4 5 ，但内含子的位置没有被保存下来。在t r e e s e i e gi 和c b hi 的c 末端与e g i i i 和c b h i i 的n 末端均含一段约3 5 个氨基酸残基的保守区域， 它们之间同源性达7 0 。位于保守区域前面的是富含羟基氨基酸和脯氨酸的序列。c b h i i 和e g i i i 互同源性不高，与另外两种蛋白质也不相象。然而，木霉属的e g i i i 与裂褶菌 属( s c h f ：z o p h y l l u ms p p ) 中s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e 的e gi 却有很大同源性。除c b hi 和 e gi 之间外，尽管其它的纤维素酶在总体上缺少相似性，但所有木霉纤维素酶都有一 个短的保守序列，分别处在c b h i i 和e g i i i 的氨基末端以及c b hi 和e gi 的羧基末端 i n 。 c b h 是木霉分泌的主要纤维素酶，包括两种异构酶：c b hi 和c b hi i 。c b hi 的 p i 值( 等电点) 约为4 2 ，分子量约为6 6 k d ，n 端有一个由1 7 个氨基酸残基构成的引 导肽，成熟的c b hi 由4 9 6 个氨基酸残基组成。c b hi 的产量很高，约占外分泌蛋白 河南工业大学硕士学位论文 总量的6 0 ，它和底物的亲和性较高，但活性较低。c b h i i 的p i 值约为5 9 ，分子量约 为5 3 k d ，n 端有一个由2 4 个氨基酸残基构成的引导肽，成熟的c b h i i 由4 4 7 个氨基 酸残基组成。c b h i i 所占比例比c b hi 少，但特异性强，活力高。c b h i i 降解微晶纤 维素产生还原糖的能力比c b hi 高2 倍1 2 1 。有研究表明c b hi i 对整个纤维素酶系的表 达起着重要作用( s e i b o t he ta l 。，1 9 9 7 ) 【l 。 由g t - a g 规则( 内含子与外显子连接处的序列特异： 内含子5 端为g t ，3 端 为a g ) 和e d n a ( 互补d n a ：通过逆转录酶由m r n a 模板合成的双链d n a ) 序列已 经得出绿色木霉c b h i i 基因由4 个外显子和3 个内含予组成，全长1 6 1 3 b p ，5 端存在 与一般真核基因类似的两个特征性调控序列，3 端存在功能未明的短重复序列和嘧啶 富集区。 大多数纤维素酶都由一个或多个催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 和纤维素结合区 ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 组成，中间由一段可辨认的连接肽( 1 i n k e rp e p t i d e ) 所连接， 只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域，如t r e e s e i e g 的e g i i i 就没有c b d 结构域。通常认为c b d 对高效降解纤维素起到关键的作用，但t r e e s e i 的 c b hi 在没有c b d 的情况下仍具有水解纤维素的活性，同样的现象也在t r e e s e i 的e g i 中被观察到，此外，腐殖菌属( h u m i c o l as p p ) 中h u m i c o l ai n s o l e n s 的e g v 和纤维 单胞菌属( c e l l u l o m o ? l a ss p p ) 中c e l t u l o m o r l t 2 s 触i 的c e r t e g 都并未发现具有c b d 结 构，但仍然具有水解酶活性，这些实验证明，在有些外切和内切酶中c b d 的结构可能 不是必需的【l “。 1 2 4 1 1 催化结构域的结构 迄今为止，所有已知的纤维素酶的催化结构域根裾其氨基酸序列的相似性可分为7 0 个家族，在同一个家族内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点，因此在同一家族 内，其反应机制和对底物的特异性都可能相同，这已通过比较1 5 种来自3 个家族的酶 解实验中得到支持。最先被阐明的催化结构域是t r e e s e i 的c b h i i 的催化域结构，它是 由a 邝组成的筒状结构：由5 个a 螺旋和7 条b 链组成，活性部位由两个延伸至表面的 环( 1 0 0 p ) 形成一个隧道状( t u n n e l ) 结构，长度大约2 r i m ，包含4 个结合位点，水解糖苷键 发生在第2 和第3 结合位点之间；嗜温单胞菌属( t h e r m o m o n o s p o r as 阳) 中 t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a 的e g i i 尽管和t r e e s e i 的c b h i i 属于同一家族，但在活性部位 的组织结构上却有一点显著的不同，它的活性位点表面没有一个由环覆盖的结构，因此 它更像是个沟槽( g r o o v e ) 而不是一个“隧道”。所有属于e g 家族的环结构都缺失，而 属于c b h 家族的正好相反，都有个环结构。普遍认为，正是由于c b h 拥有这样一个 环结构形成的“隧道”，因此它能连续地催化几个糖苷键的断裂。 4 康宁木霉纤维素酶c b h 2 基因的克隆及序列分析 1 2 4 1 2 连接肽 在有着催化结构域和结合结构域的内切或外切纤维索酶中，催化结构域和纤维素结 合区是通过连接肽连接而成的，这一段肽链对蛋白酶非常敏感，这是因为它易暴露于水 相，所以为了防止被蛋白酶水解，这一段肽链常常被糖基化( 与s e t 、t h r 和h y p 的o h 连接，连接的糖为半乳糖或n 乙酰半乳糖胺，在高尔基体上进行糖基化) 真菌纤维 素酶的连接肽富含p r o 、t h r 和s e r ，并且总的来说比细菌的小，大概只有3 0 4 0 个氨 基酸残基组成，而细菌的连接肽则由约1 0 0 个氨基酸残基组成。 1 2 4 1 3 纤维素结合区( c b d ) 结构域 c b d 通常位于纤维素酶序列的n 末端或c 末端，细菌的c b d 大概有6 3 2 4 0 氨基 酸残基，而真菌的c b d 只有3 0 4 0 个氨基酸残基，根据c b d 氨基酸序列的相似性， c b d 主要可分为5 个家族，c b d 家族1 由3 3 3 6 个氨基酸组成，其三维结构以t r e e s e i 的c b hi 为代表，其结构已经用核磁共振技术( n m r 技术) 测定，是一个锲形不规则的 b 折叠结构，疏水面上有3 个保守的t y r 残基，这个面主要与纤维素分子的结合有关， c b d 家族2 大概含有1 1 0 个氨基酸残基，属于这类家族的有纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s s p p ) 中c e l l u l o m o n a s f i m i 和嗜温单胞菌属( t h e r m o m o n o s p o r as p p ，) 的c b d 。c b d 的 作用机制目前仍未完全清楚，一种观点认为它有助于增加催化结构域在固体纤维素表面 的浓度，另一种观点认为它能促使单链纤维素分子从结晶纤维素中释放，以便催化结构 域能接近它，如b o r a s t o n 等通过实验证实家族2 的c b d 能够促使微纤维中内部氢键的 断裂，从而释放单根纤维素分子链，但却未发现家族1 的c b d 有这种作用。 1 2 4 2 纤维素酶作用机理 在纤维素酶水解纤维素的过程中，目前普遍认为是纤维素酶三种组分协同作用的结 果。一般来说，内切葡聚糖酶负责进攻纤维素的非结晶区，随机水解1 3 1 ，4 糖苷键， 将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素，它对结晶纤维素无 活性，但能够水解非结晶的纤维素和可溶性底物( 如羧甲基纤维素钠) 。纤维低聚糖也 是其底物，其水解速率随链的延长而加快。外切葡萄糖水解酶( c b h ) 负责从纤维素线 状分子的非还原性末端水解切下纤维二糖单位，其活力随链长度的减少而减少。水解晶 体纤维素时外切葡萄糖水解酶并不同内切葡聚糖酶起协同作用。对于e g 和c b h 的作 用先后顺序还有争论。b 葡萄糖苷酶( b g ) 通过水解纤维二糖和从短链的非还原性末端 切下葡萄糖而终止纤维素的水解过程。但是它的活力随着聚合度的下降而增加。三种主 要纤维素水解酶在酶解过程中并不具有明显的专一性，同一种酶的不同异构体，也有不 同的水解效果。这些都会导致人们关于纤维素酶作用机制假说的相异性，这种相异性主 河南工业大学硕士学位论文 要体现在对各组分间作用顺序和部位及协同作用的分子学机理等方面。 s i n n o t t 则从化学机制的角度在分子水平上阐述了纤维素酶催化糖基转移的机制，认 为糖苷配基的离去是涉及到两氨基酸残基的酸碱催化反应。负责催化的氨基酸通过底物 异头碳原子位构型的保留( 双置换) 或转化( 单置换) 完成催化反应。但是，由于纤维素底 物的高度复杂性以及底物的多样性，纤维素水解过程的具体细节并没有完全研究清楚。 因此，纤维素酶系的降解机理还有待进一步研究和探讨【j “。 1 2 4 2 1 纤维素结合区( c b d ) 的作用 虽然对纤维素酶的水解机制已经有了初步的阐明，但至今仍未阐明酶和纤维素分子 的吸附作用机制，高温梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 的c b d 由1 5 0 个氨基 酸残基组成，折叠成紧密的3 3 4 5 r i m 棱形结构，该c b d ( c f i m i 的c b d 和z r e e s e i 的c b d 情况也是如此) 结合于3 条连续的纤维素分子链上，这样通过c b d 和纤维素分 子的作用，能够导致纤维素内部氢键的断裂，并有助于催化结构域对糖苷键的水解，并 使得酶或c b d 重新吸附纤维素，尽管c b d 是一种锲形结构，并且c b h 作用有连续性， 迄今为止还没有实验表明是否c b d 将不会脱吸附而沿着这3 条纤维素链一直作用下去。 也许c b h 作用是如此，但对于e g 来说，却并未这样，因为已有实验表明c b h 和e g 对结晶纤维素的水解程度是完全不同的。 1 2 4 2 2 催化域的作用 t r e e s e i 的c b hi 和c b hi i 的催化结构域直径长度大约是3 r i m ，接头( 1 i n k e r ) 大约是 9 r i m ，分子量分别是5 2 k d 和4 7 2 k d ；褐色高温单孢菌( t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a ) 的e g i i 的催化结构域是5 3 3 8 3 6 n m ，分子量是4 3 k d ，而在微纤维中单根纤维素分子链 的直径是o 6 r i m 到l n m 。尽管纤维素酶催化结构域和接头的大小将因酶的不同而不同( 特 别是当分子量不同时) ，但这些事实表明一旦纤维素酶被c b d 结合到纤维索分子链上， 它将有许多机会接触纤维素链并且在一条链上将有许多的作用位点。当然，总的催化机 会还依赖于接头的柔韧性。总之，一旦底物被纤维素酶的c b d 结合，它将能在一个限 定的范围内水解许多的糖苷键，基于上述对催化结构域大小的事实，可以得知催化结构 域对纤维索的水解主要在微纤维水平上，对无定形纤维来说，很难界定它的攻击水平； 但是可以想象，无定形区将更少有结构上的限制，导致纤维素酶更容易对其攻击，因而 表现出酶活性较高。 1 2 4 ，3 纤维紊酶的基因结构 迄今为止，人们己经从4 0 多种细菌和数种真菌中克隆到了纤维索酶基因，其中大多 数的核昔酸序列已被测定。比较各类纤维素酶基因，发现有共同的特征性结构。但就整 6 康宁本霉纤维素酶c b h 2 基因的克隆及序列分析 体而言，不同纤维素酶基因的同源性甚低。真菌的同一类型的纤维素醉基因有较高的同 源性，但同一菌种不同类型的纤维索酶基因的同源性相对较低。真菌的纤维素酶基因中， 内含子的数目一般为2 - - 3 个，所处的位置保守性较低，长度一般在4 0 8 0 b p ，比高等真 核基因的内含子要短得多【l ”。对于真核纤维素醉的基因的了解目前主要来源于里氏木 霉的分子生物学研究。己经克隆了 c b h i 1 7 18 1 ，c b h i i 【1 2 19 1 、e g i 叫，e g i i i t 2 和b g e 2 1 1 5 个 基因并己全部测序。其中c b h i 与e g i 同源性为5 2 ，局部序列同源性达7 4 c b h i 与e g i i 基因整体同源性很小，而且它们与c b h l 年i e g i 两个基因基本上不存在整体同源性。 绿色木霉的c b h i t 2 2 2 3 和c b h i i 1 4 t2 4 1 基因也已被克隆并测序。绿色木霉c b h i 与里氏木 霉c b h i 基因序列同源性达9 5 暇】。绿色木霉c b h i 基因的外显子和内含子其数量、长度和 相对位置与里氏木霉c b h i i 基因极为相似：有4 个外显子，外显子总长相同( 1 4 1 3 b p ) ，核 苷酸序列同源性高达9 1 ：有3 个内含予，总长( 1 9 6 6 p ) 较里氏木霉c b h i 基因的内含子总长 多2 6 b p ，两者核苛酸序列同源性仅为5 7 。绿色木霉c b h i 基因的结构与绿色木霉c b h i 基 因的结构差别较大，后者只包括3 个外显子和2 个内含子，因而这两个基因缺乏整体同源 性。 里氏木霉c b h i 和c b h i i 基因分别与绿色木霉c b h i 和c b h i i 基因序列同源性很高。 也发现里氏木霉e g i 与裂褶菌e g i 基因的同源性也较高，这些结果提示我们，不同类型 的纤维素酶基因的进化是各自独立的，在进化之初可能只存在一个纤维索酶基因，它编 码纤维素酶的前体，但由于进化选择的压力，这一基因发生了突变，通过这种歧异进化， 形成一个复杂的纤维素酶基因家族。 1 2 4 4 纤维紊酶的转基因表达 已有多种细菌和少数真菌的纤维素酶基因在大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) 中表达出 可检测的e g 年h c b h 及b g 活力，这种表达不需用载体的启动子，但如基因同高效表达基因 的启动子和染色体起始位点融合。则表达量增加。大多数克隆的纤维素酶基因能产生信 号肽，从而使表达产物部分或全部转移至大肠杆菌的周质间隙。但n 一末端的疏水信号 肽并不是纤维素酶转移至周质间隙必不可少的，黄化瘤胃球菌( r u m ：一 n o c o c c u s ， a v e f a c i e n s ) 的c e l a 基因编码的纤维糊精酶虽然没有常规的信号肽，但也能 分泌到大肠杆菌的周质间隙。少数几种在大肠杆菌中克隆的纤维素酶基因的表达产物能 分泌至培养物中，导致这种分泌的原因还不清楚。如枯草杆菌 ( 肋c j l “s s u j j 由p a r l l 5 ，e f 0 1 0 3 4 ，d l g 株的纤维素酶基因在大肠杆菌中表达的e g 分泌至 胞外的能力相差很大，胞外表达的量分别为7 0 ，2 4 和小于1 。但这三种酶的序列包括 信号肽非常相似，差异主要在一般认为对胞外分泌并不必需的羟基端【2 5 】 河南工业大学硕士学位论文 在e c o l i 中表达纤维素酶基因，存在着两个主要问题，一是提取有很大困难，二是 表达水平低，一般在1 0 以下。所以在纤维素酶基因的表达方面人们将目光转向了真核 表达系统，目前应用较多的是酵母表达系统。酵母作为一种传统工业微生物，不产生毒 素，用其表达纤维素酶基因，其产物高度糖基化，经正确加工修饰后可直接分泌至培养 基，表达水平高如酵母表达的里氏木霉c b h i ，e g i 的产量可达1 0 0 m g l 以上，并具有正 常的生物学活性。也有人报道构建了能表达长梗木霉( zt o n y b r a c h i a t u m ) 纤维素酶中e g 基因的重组啤酒酵母【2 州 已有利用纤维素酶基因转化构建纤维素酶高产工程菌的报道。里氏木霉的c b h 和e g 酶活力很高，但b g 酶的活力不高，b a r n e t t c c 等【2 7 】将克隆的里氏木霉的b g 基因进一步转 化里氏木霉，获得了具有增加t b g 基因拷贝数的稳定的转化株，纤维素酶活提高了5 倍。 木霉菌中c b h l 基因表达活力最强，所以其纤维素酶系中c b h i 当主导地位。有研究 表明c b h 2 的催化活力高于c b h l ，但c b h 2 基因表达能力弱，总体含量较低。因此本研究 首先克隆木霉c b h 2 基因，拟构建表达载体并将其置于e b h l 基因启动子下游，以期实现该 基因的超量表达。 1 3 国内外研究进展 早在2 0 世纪初，人们已经发现了纤维素酶。1 9 0 6 年，s e i u i e r e 在蜗牛的消化液中发 现有纤维素酶，能分解天然纤维素。1 9 3 3 年g r a s s m a n 等研究了一种真菌的纤维素酶系， 分辨出2 个组分。2 0 世纪4 0 5 0 年代对产纤维素酶的微生物进行了大量的分离筛选工 作，建立起较为完整的分离筛选方法。2 0 世纪6 0 年代后，由于分离技术的发展，推动 了纤维索酶的分离纯化工作，加快了纤维素酶的组分、作用方式以及诱导作用等方面的 研究进展，并且实现了纤维素酶制剂的工业生产，在应用上取得了一定成绩。2 0 世纪 7 0 年代有些学者就提出纤维素酶的作用必须多种酶协同作用，才能表现出很强的活性， 还提取了这种协同作用的3 种酶2 8 2 9 1 。同时，由于利用纤维素酶的降解作用进行纤维素 的生物转化有着广阔的前景，自7 0 年代末就开始了纤维素酶基因的克隆 3 0 】。8 0 年代中 期，纤维素酶开始应用于洗涤剂行业。2 0 世纪末，几个国家的学者通过对里氏木霉产纤 维素酶的特性研究发现，通过酶的协同作用，葡萄糖的产率比单独的纤维素酶的作用有 明显提高。目前，世界上酶制剂工业发展很快，丹麦的n o v on o r d i s h 公司和美国的 g e n e n c o r 公司成为世界上最大的酶制剂生产商和供应商【3 ”。 我国对纤维素酶的研究开始于2 0 世纪6 0 年代初，开始初期，就有北京，上海，山 东等地的多所院校以及科研院所进行了纤维素酶菌种的选育工作。1 9 7 0 年以后中国科学 康宁木霉纤维素酶c b h 2 基因的克隆及序列分析 院t 海植物生理研究所等单位利用诱变方法获得了产酶能力较高的变异株，并进行了生 产试验；2 0 世纪8 0 年代中期，上海生产出纤维素酶：2 0 世纪9 0 年代，黑龙江首条年 产2 0 0 0 t 纤维素酶的生产线投产，我国成为继美国，日本，丹麦之后第四个能生产纤维 素酶的国家：2 0 世纪9 0 年代，上海市农业科学院畜牧兽医研究所的王建荣等克降了绿 色木霉纤维素酶c b h1 1 基因，并对其结构进行了研究i 2 4 】。祝令香等( 2 0 0 1 ) 通过聚合 酶链式反应( p c r ) 技术扩增得到了康宁木霉k 8 0 1 纤维素酶c b h i i 基因的全序列p “。 目前的研究主要集中于有关纤维素酶特性，作用机理，培养条件和应用方面。迄今为止， 我国规模生产纤维素酶仍未解决，形成不了大批量生产，满足不了市场的需要p ”。 1 4 纤维素酶的应用 目前，在国外纤维素酶主要用于食品工业、医药工业与环境保护。在国内纤维素酶 主要用于酿造工业、饲料工业和轻化工业等。 1 4 1 纤维素酶在饲料中的应用 随着养殖业突飞猛进的发展，饲料行业面临资源短缺的状况愈来愈突出。然而，地 球上最为丰富的可更新资源纤维素却没有得到充分利用。因此，如何成功地丌辟这 一资源作为饲料原料，已显得尤为迫切。纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含 的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维素降解为可被畜禽机 体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。 不同来源的纤维素酶结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故 在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。目前，利用纤维素酶降解 纤维素达到其有效利用的方法，己成为国内外营养学家极为关注的课题【h j 。饲用纤维素 酶对于反刍动物来说，可以补充体内微生物形成纤维素酶的不足，促进胃肠道有益微生 物生长，提高饲料币用率。对于单胃动物来说，可以降低可溶性非淀粉多糖在食糜中产 生的黏性，促进内源酶扩散，改善消化道环境，上述纤维素酶功能已为国内外许多研究 所证明。 1 4 2 纤维素酶在造纸工业中的应用 制浆造纸工业是国民经济的重要支柱产业之一，但目前制浆造纸工业所面临的原料 短缺，能源紧张，污染严重的三大问题束缚着它的发展。近年来，人们相继研究并应用 河南t 业大学硕上学位论文 了一系列新方法和新技术，期望通过技术进步和创新来解决困扰制浆造纸工、发展的这 些不利因素，纤维素酶的研究与应用无疑是实现这一目标的一条有效途径l j ”。 在全世界范围内，包括欧美很多发达国家，生产和生活垃圾造成的大气污染以及水 污染问题f 1 益严重1 3 6 1 。其中，废纸造成的“白色污染”是非常主要的因素。信息技术的 高速发展并没有减少纸的用量，纸的消耗仍然成线性增长。在发达国家2 0 0 0 年有5 5 的 纸被回收，而其中只有5 4 的被真正重新利用，暴露出人们对纸的再利用的愿望远远超 过当今技术利用废纸材料的能力的现状。余下的未被回收利用的纸材料必须通过燃烧或 掩埋来处理。但是，因为环境的限制，缺乏合适的新的场所，以及温室效应的影n 眺燃 烧或者地下掩埋在不久的将来都将成为不可能。寻找新的可以再循环利用废纸材料的方 法变得非常迫切【j “。生物产品和废弃物产生的生物能在更多领域的利用，不仅会减少坏 境污染，还能帮助很多国家和城市来处理日益增长的废水问题。 尽管对废纸的再循环利用已经获得很大的成功，纸墨的残留和纤维强度的丢失都会 影响处理效果。生物方法可将多糖转化为可消化的单糖。真菌和细菌能够产生纤维素酶 酶系，它表现出对纤维素相对特别高的酶活。通过水解可以得到单糖如葡萄糖和纤维二 糖。废纸的有效利用，依赖于纤维素降解为可消化单糖的程度。通过废纸的预 b _ t 9 9 ( v a n w y k ，1 9 9 9 ) 以及不同纤维索酶酶系的组合使用可以增强废纸材料的生物转化程度。 1 4 3 纤维素酶在食品工、业中的应用 纤维素酶在食品工业应用极为广泛。如将纤维素酶应用于豆腐生产工艺中，结果表 明，在大豆浸渍时添加o 0 5 0 5 纤维素酶，可提高4 0 0 1 1 0 1 豆腐出品率，且 所产豆腐色质和风味无明显变化，同时不改变原有生产工艺路线，其经济效益比较明显。 另外用纤维素酶处理茶叶制各速溶茶，可有效提高速溶茶提取率，并且具有一定稳定性， 制成的速溶茶不仅保持茶叶天然的色、香、昧和营养成分，且无不溶性渣滓，饮用方便 3 8 1 。纤维素酶还应用于果蔬榨汁、花粉饮料中，有利于细胞内物质渗出、增加出汁串约 1 0 、减少压榨压力、促进汁液榨取和澄清作用。纤维素酶处理植物可使细胞壁发生不 同程度改变，如软化、膨胀和崩溃等，从而可提高细胞内含物的提取率。例如用纤维素 酶处理大豆，不仅可促使其脱皮、增加从豆类中提取优质水溶性蛋白质得率，且还可回 收豆渣中蛋白质和油脂。纤维素酶用于淀粉制造，可缩短时间，增加得率【3 9 l 。 纤维素酶在酿造中应用前景十分光明。白酒酿造所用原料中纤维含量较大，使用纤 维索酶后，可同时将淀粉和纤维素转化为糖，再经酵母分解全部转化为酒精，提高3 5 的出酒率，且酒体质量纯正，淀粉和纤维利用率高达9 0 。纤维素酶用于崮态无黼 l o 康宁木霉纤维索酶c b h 2 基w 的克隆及序列分析 酱油发酵，能将包裹蛋白质的纤维素分解，使蛋白质呈裸露状态，便于蛋f 1 酶分解蛋白 质，提高酱油得率，加快发酵速度，改善酱油风味和质量，酶制剂用量仅为o o 】2 5 ， 酱油中还原糖增加1 0 7 ，色度提高4 2 ，全氮和原料利用率分别比不加纤维素酶提高 8 6 和8 1 。在食醋酿造过程中，将纤维素酶与糖化酶混合使用，可明显提高原料利 用率和出品率：应用于啤酒工业麦芽生产上，可增加麦粒溶解性、加快发芽、减少糖化 液中p 一葡萄糖含量，改进过滤性能。 我们知道，在酿酒工业中，由于原料品种不一，所含纤维素不同，传统发酵对酒酪 的酸度、粘度要求比较高，原料要适当粉碎，不宜太细也不宣太粗，并适当添加稻糠等 疏松辅料，这势必造成许多颗粒原料外衣包藏淀粉，不能彻底进行糖化发酵，使残糖偏 高。纤维素酶却可以将高粱、小麦等原料淀粉中3 左右的纤维索和半纤维素转化为可 发