（食品科学专业论文）新型陶瓷载体固定化酵母细胞啤酒连续发酵工艺及动力学研究.pdf

摘要 本研究选用三种国产的新型陶瓷材料一一陶瓷拉西环、蜂窝陶瓷和泡沫陶瓷作 为酵母细胞的吸附固定化载体，进行了固定化酵母细胞啤酒连续发酵工艺及动力学 ， 的试验研究。毓望通过此研究为固定化细胞技术推广应用于我国啤酒的：r 业化生产， 提供理论和实践依据。经过长期大量的研究工作，取得了如下的研究结果。 ( 1 ) 三种陶瓷利料对酵母细胞的吸附能力有较人差异。i 在棚i 司条1 ，i ：_ 卜，三利t 陶瓷 材料中，泡沫陶瓷对酵母细胞的吸附能力最强，其次是蜂窝陶瓷，陶瓷拉西环最差； 三利t 陶瓷材料均存1 4 。c 的温度条件下，表现出最好的吸附效果；三种载体材料优化 的吸附 ：艺条什均为1 4 c 下，吸i j f 寸3 0 m i n 。同时还得到了不同温度条件下各载体 吸附量随吸附时间变化的9 个回归关系方程，这些回归方程能够定量描述刁i 同温度 条件下三种陶瓷载体对酵母细胞的i 吸附过程，可以作为动力学模型使用。) ， ( 2 ) 三种陶瓷载体固定化酵母细胞在三角瓶中经分批培养增殖后，所能达到的最 高细胞密度，泡沭陶瓷最高，蜂窝陶瓷次之，陶瓷拉西环最低。 ( 3 ) 三利t 陶瓷载体固定化酵母细胞在反应器中进行的连续培养试验，采用正交试 验设计的方法，对于不同的载体材料，分别考察培养温度和培养时间对载体装载细 胞量的影响。i 由试验结果的极差分析可知，对指标的影响程度，培养时间大于培养 温度。同时，对于- 1 1 陶瓷载体可获得连续培养较优的工艺条件分别为：陶瓷拉西 环载体和蜂窝陶瓷载体均为1 4 c 下2 小时；泡沫陶瓷载体1 4 c 下4 小时。而且比较 三种陶瓷载体连续培养与分批培养的试验结果可知，连续培养的效果要优于分批培 养。t ( 4 ) 采用均匀试验设计的方法，分别考察三种陶瓷载体固定化酵母细胞啤酒连续 后发酵过程中，发酵温度和酒液流量对双乙酰降低量的影响。趣过对试验数据进行 回归分析，得到发酵温度x 。和酒液流量x 2 与双乙酰的降低量y ( i 三l ，2 ，3 ，分别表示陶瓷拉 西环、蜂窝陶瓷和泡沫陶瓷) 之间的非线性回归关系方程分别为： 夕l = 一o 1 8 5 5 2 8 + o 0 3 1 0 2 4 x l + 0 0 1 8 0 8 3 x 2 0 0 0 1 1 5 5 x ? 一0 0 0 1 4 9 1 x ； 夕2 = 一0 2 0 1 7 4 6 + 0 0 1 9 9 7 4 x i + 0 0 4 0 3 7 0 x 2 0 0 0 0 7 5 0 x j 一0 0 0 2 6 8 7 x ； 多3 = 一o 1 4 3 7 2 5 + 0 0 1 3 0 4 6 x i + 0 0 4 1 5 0 2 x 2 0 0 0 0 5 5 7 x 一0 0 0 2 7 5 6 x ；。 ( 5 ) 采用改进f f j ) j | i 速单纯形法对回归方程进行非线性优化可得- i 1 陶瓷载体固 定化酵母啤酒连续后发酵优化的工艺条件分别为：陶瓷拉西环载体，发酵温度1 3 4 ，酒液流量6 1 l h 蜂窝陶瓷载体，发酵温度1 3 3 ，酒液流量7 5 l h ；泡沫陶 瓷载体，发酵温度1 1 7 ，酒液流量7 5 l h 。在优化的工艺条件下分别进行验证试 验，结果双乙酰的降低量分别可达：o 0 8 1 m g l 、0 0 8 8 m g l 和o 0 9 1 m g l 。，一， v f 6 ) x q 采川必定化酵母细胞连续后发酵工艺生产的啤 l ! ! 进行了主要理化指标的测 定，同时进行口味品评，= ：宝占果表明：其主要理化指标，与传统工艺生产的啤酒比较 接近，而且其1 2 1 味与传统工艺生产的啤酒也没有太大的差别。l ( 7 ) 在优化的工艺条件下，进行泡沫陶瓷载体固定化酵母啤酒的连续后发酵，、设 备持续运转1 5 天，结果表明该工艺具有较高的稳定性。 ( 8 ) 陶瓷载体固定化酵母细胞用于啤酒主发酵的研究中，首先采用正交试验设计 的方法，进行载体的优选试验，考察指标为浓度的降低量，对试验结果进行分析后， 确定将泡沫陶瓷和娇窝陶瓷用于固定化酵母细胞啤酒的连续主发酵，同时还得到较 优的工艺组合。 ( 9 ) 采用二次通用旋转中心组合设计的方法，增加考察指标一一双乙酰含量，对 较优的工艺条件作进一步的优化。；对试验结果进行合理的数学处理，最后得到泡沫 陶瓷载体固定化酵母啤酒连续主发酵优化的工艺条件一一发酵温度1 6 0 。c ，麦汁流 量2 0 l h ；蜂窝陶瓷载体固定化酵母啤酒连续主发酵优化的工艺条件一一发酵温度 1 7 6 c ，麦汁流量2 4 l h 。在优化的工艺条件下分别进行验证试验，对于泡沫陶瓷和 蜂窝陶瓷载体，结果测得浓度的降低量分别为7 0 9 0 b x 和6 9 1o b x ：嫩啤酒双乙酰含 量分别为0 1 4 4 m g l 和o 1 8 0 m g l 。： ( 1 0 ) 对采用固定化酵母细胞啤酒连续主发酵工艺发酵终了的嫩啤酒进行主要理化 指标的测定，结果表明：其主要理化指标，与传统工艺生产的啤酒比较接近口、 ( 1 1 ) 泡沫陶瓷载体固定化酵母细胞啤酒连续主发酵工艺的稳定性试验结果表明： 在1 5 天的连续生产中，酵母细胞始终保持着较高的发酵活性。该工艺具有较高的稳 定性。 ( 1 2 ) 通过对泡沫陶瓷载体固定化酵母啤酒连续主发酵过程动力学的研究，在1 6 的发酵温度条件下，建立了菌体生长、底物消耗和酒精生成的动力学模型，分别 为： 菌体生长的动力学模型： f l n ( x l i m + x 。w ) = 1 岳+ i n x 上， 式中，x “。一载体极限容量( g ，l ) ，x 。一反应器出口处细j 翅浓度( g f l ) ，u 一比生 长速率( 1 1 1 ) ，一持液率，d 一稀释率( 1 1 1 ) 。 底物消耗的动力学模型： 托。= 比( s l s 2 ) v i 式1 1 ，x 。一反应器n r 处细胞浓度( g l ) ，y 。一细胞对丛质的得率系数，s 。一 反应器进口处麦汁浓度( g l ) ，s 2 一反应器出口处麦汁浓度( g l ) 。 酒精生成的动力学模型： 只= c y 。 式中，p c 一酒精浓度( g l ) ，k 一酒精生成动力学常数，x 。一反应器出口处细胞 浓度( g l ) 。 ( 1 3 ) 根据试验数据对模型进行参数拟合，求得模型中各参数的估汁值分别为 酵母细胞的比生长速率j 1 = o 0 4 1 h ； 细胞刈丛质的得率系数y 。，。= 0 0 4 5 ； 酒精生成动力学常数k = 9 2 7 。 ( 14 ) 对泡沫陶瓷载体固定化酵母细胞啤酒连续主发酵系统中可能存在的内、外扩 ， 救效应的分析结架表f l j ：外扩散效应对发酵系统的影响微小町以忽略；内扩散效 应则埘发酵系统订较严巫的影l 呐。 关键词。陶瓷载体、i 固定化细n 斟啤酒；、。连续发酵；吸附；培养增殖；动力学 内、外扩散效应 致谢 本课题是在导师何国庆教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、试验方案的制定 到试验工作的完成以及论文的付梓元处不凝结着导师的心血。在三年攻读悼士学位 期间导师在生活上给我以无微不至的关怀掌业上严格要求，促我上进。导师渊博的 知识、敏锐的洞察力、富于开创性的思维、严谨的治掌态度，给学生留下了深刻的印象， 将使掌生终生受益。值此论文完成之际首先对导师的培养和教诲表示最诚挚的谢意! 博士生指导小组成员叶立扬教授、席与芳教授、郑晓冬副教授对课题的研究计划、 研究工作的具体实施提出了许多宝贵的意见，特此表示衷心的感谢! 感谢食品系曾超书记、应铁进教授、叶兴乾教授以及微生物袭酵教研组的尹源明 老师、王友永老师、胡政老师和冯澜老师三年来在掌习和生活上对我的关心和帮助。 本试验的大部分工作是在钱江啤酒厂完成的。感谢俞永飞副厂长、任开阳剐厂长等 几位厂领导在反应器的制作、原料的提供、试验工作的开展等方面给以的全力支持和合 作。特易q 要再次感谢9 1 年毕业于我系的校友俞剐厂长为试验工作提出了许多宝贵的 建议热心帮助解决试验中出现的困难和问题。同时对我的生活也关怀备至使我得以 顺利完成这部分试验工作。另外还要感谢钱啤集团研究所的陈_ 筻、刘辉、金招方、董 茂荣、陶从胜等人以及校友陈升岸的热心帮助。 陈启和、张颢同掌参加了啤酒厂的部分试验工作，对他们的帮助表示感谢；同时还 感谢孙涛、陈敏、郑铁松、阮辉、钱俊青、吴长青、汤兴俊、葛红娟等几位同门学友对 我在杭学习生活期间的关j 乜弄口帮助。 好友徐昌杰博士曾帮助上网检索资料：曹宝山博士、席磊硕士帮助扫描照片。在此 一并对三年来所有关，乜耳a 帮助过我的老师和同掌表示由衷的谢意! 三年求学期间我的妻子邱咏梅女士为我付出了许多，学业的顺利完成与她对我生 活上的关照和事业上的鼓励、帮助是密不可分的：还有我的父母，为了儿子的成长，不 辞艰辛奔波操劳毫无怨言。籍此论文完成之际，也向家人襄示深深的感谢! 程江簟 2 0 0 0 年5 月于杭州华家池 堑型堕堡塑堡型塞! ! 堕壁型堕! 壅垄璧垄壁三苎丝垫! ! 兰堕壅 第一章前言 1 固定化技术的发展概况 酶是一类由生物细胞产生的具有催化活性的特殊蛋白质。酶催化反应的专一性 强，催化效率高( 比一般催化剂的效率高山1 0 7 _ 1 0 ”倍) ，并且能在常温常压等温和的 条件下进行操作( i ? c ”i ，a 1 d e s 等，1 9 7 5 ) 。酶的这些优点人人促进了人 f l j x , j 酶技术的研究 和丌发。但是，l l l 予酶是生物体根据自身需要丽产生的，因而在实际的应用中，还 有很人的限制，主婴表现在以卜儿个万i 1 l ( h a , l m e i e rw 1 9 8 3 ) ：1 ) 宙些酶的提取纯化繁 琐，所以通常价格十分昂贵；2 ) 传统的酶反应采川分批方式操作，因此要从反应混合 物中回收有活性的酶以便重复使用，在技术上很困难。3 ) 酶的稳定性一般比较差，通 常不能在有机溶剂中或者高温条件下使用。 通常有两种方法能够克服酶在实际应用中所表现出的这些缺点。一种方法是应 用目前有机合成和聚合物化学的最新技术来合成具有酶活性的催化剂。这些合成的 催化剂有时被称为“人工合成酶”( s y n z y m e s ) 。另种方法是对生物体产生的酶进行 “修饰”，以满足实际应用的需要( b a i t e y 和o i l i s ，1 9 8 7 ) 。固定化酶就包括在第二种方 法之t | _ i 。 自从5 0 年代，首次尝试阎定化酶的实际应刚研究之后( l a f f e r t y ，1 9 8 2 ) ，6 0 年代 固定化酶在世界范围内成为研究的热点，在此期问，有大量的研究论文发表。而且 早在6 0 年代初期，就已经开始了将固定化酶应用于连续的工业化生产的研究( l e d e r 1 9 6 3 ) ，1 9 6 9 年成功地实现了将固定化氨基酰化酶用于d l 氨基酸连续光学拆分的工 业化生产( 千灿一郎，1 9 8 1 ) 。这被认为足世界上笫一个固定化酶的工业化应用。 目前固定化酶技术已经在化学( h e s l o p h a r r i s o n ，1 9 7 0 ) 、临床医学( h a r t m e i e r ，1 9 8 3 ) 、 药学( t a n a k a 等。1 9 8 4 ) 、食品) j l l t ( d r i e d o n k s 等，1 9 9 0 ) 等许多行业得到了广泛的应用。 虽然几乎所有的有机体，包括动物、植物和微生物，都能够产生酶，但是来源 于微生物细胞的酶，由于具有生产成本低、生产不受地域和季节的限制和生产周期 短等许多优点，最适于工业化应用的目郇j ( h u l s t 等，1 9 8 5 ) 。微生物细胞产生的酶可以 分为两类：胞外酶和胞内酶。为了利用胞内酶，必须从微生物细胞内提取，但是， 提取得到的酶通常是4 i 稳定的，囚此，将其固定化应用于实际的生产效果也不佳。 另外，i , - t ：多有用的化学物质必须利用微生物体内具有催化活性的多酶系统以发酵的 方式进行生产( d a i n o r e 等，1 9 8 7 ) 。 为了方便的利用微生物细胞的胞内酶，以及微生物细胞内的多酶系统，出现了 完整细胞的固定化技术( c h i b a t a 等，1 9 7 7 ) 。固定化微生物细胞的第一个工业应用是l 一 天冬氨酸的连续生产( f u k u i 等，1 9 8 2 ) 。 固定化细胞与同定化酶相比，有如下几方面的优点( d e r v a k o s 平w e b b ，1 9 9 1 ) ：它 不需进行破碎细胞而直接利用胞内酶，降低了制备成本；酶在细胞内的环境中比较 稳定，因此完整细胞固定化后，酶活力的损失较少：尤其在需要利用微生物细胞内 的多酶系统时，利用固定化细胞技术更容易实现。 固定化的微生物细胞，可以是死细胞或细胞处于休眠状态，而细胞内所要利用 的酶仍具有活性，而且相当稳定，这主要是应用于单酶催化反应( b u c h h o l z ，1 9 7 9 ) 。当 一些有用物质的生产需要利用发酵的方法，即由活细胞的许多种酶，同时还有a t p 和其他辅酶，如n a d ，n a d p 和辅酶a 等的共同参与，经多步催化反应才能生成时， 固定化的微生物细胞则必须是活细胞( b a i l l i e z 等1 9 8 5 ；b r i n g i 和d a l e ，t 9 s 5 ) 。传统的 发酵工业大多采用分批法进行生产，生产周期长，设备利用率低，而利用固定化细 胞技术变革传统的发酵工业，则可实现生产的连续进行，从而降低生产成本，提高 劳动生产率，能够获得良好的经济效益( h a g e r d a l 和m o s b a c h ，1 9 8 0 im a z i d 和l a i d l e r ，1 9 s o ) 。 固定化细胞的出现，表明固定化技术向前迈进了一步。如果说，固定化酶的应 用，是固定化技术的第一代。那么，完整细胞的固定化，便是它的第二代。如今， 又发展到固定化植物细胞、动物细胞( v a n 。1 9 8 8 ) ，甚至固定化亚细胞颗粒一一细胞器， 如线粒体、叶绿体等( m a t t i a s s o n 1 9 8 3 ) 。 固定化细胞技术自七十年代问世以来，虽然时间不长，但与固定化酶相比，其 应用范围已大大超过前者。目前，固定化细胞技术，在ix j k ( h i l g e r o t m a n n 和r e h m 1 9 9 1 ： h o l c b e r g 和m a r g a l i t h ，1 9 8 1 ) 、农业( d a n g l o 等1 9 9 4 ；l e e n e n 等1 9 9 7 ) 、医学( b a r b o t i n ， 1 9 9 4 ) 、化学分析( b e e f t i n k 等1 9 9 0 ；h o o i j m a n s 等，1 9 9 0 a ：m a t t i a s s o n 和d u r h o l t ，1 9 8 3 ) 、环 境保护( b a r n e s 等，1 9 8 3 ) 、能源开发( h e n r y 等，1 9 9 0 ) p j , 及理论研究( k e w e l o h 等。1 9 8 9 ：h e s l o t 和g a i l l a r d i n ，1 9 9 1 ) 等方面，都得到了广泛的应用，并取得了丰硕的成果。 2 酶和细胞的固定化方法 2 1 酶的固定化方法 酶的固定化方法主要有：吸附法、包埋法、交联法、化学共价法以及酶的逆胶 束包囊法等。常用的载体有活性炭、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚 丙烯酰胺凝胶、海藻酸盐、明胶以及一些合成的高分子化合物等( h a r t m e i e r ，1 9 8 3 ) 。 2 1 1 吸附法 吸附法是一种最古老的固定化方法。也是一种最简便、最经济的方法。只要将 酶溶液与吸附载体接触就能达到吸附结合，但此法获得的酶与载体之间的结合力较 弱。 酶可以非专一性地吸附于矿物材料、离子交换树脂、金属材料以及天然高分子 载体材料上。矿物材料和类似的无机载体对酶的吸附能力通常很低，一般小于l m g 酶叠载体。直径1 0 0 2 0 0 1 tm 的不锈钢粒子用氧化钛处理后，对b 半乳糖营酶具有 2 新型陶瓷载体同定化酵母细胞啤酒连续发酵t 艺及动力学研究 较强的吸附可达1 7 r o b 酶儋载体( 俞俊棠等，1 9 9 4 ) 。 目前最常用的吸附剂是离子交换剂，例如，羧甲基纤维素，d e a e 一纤维素，d e a e 葡萄糖以及人工合成的阴离子和阳离子交换剂。多糖类离予交换剂与酶的结合量很 高，可达5 0 1 5 0 m g 酶g 载体( g o d b o l e 等，1 9 9 0 ) 。 离子交换剂对酶的吸附主要靠静电吸引，当离子强度增加或者介质的p h 、温度 改变时，会发生解离。通过化学方法增加酶蛋白上的电荷则可使这些影响得到改善 ( h a r t m e i e r ，1 9 8 3 ) 。 2 1 2 包埋法 将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法称为包埋法( l a f f e r t y ，1 9 8 2 ) 。 包埋法的优点在于它的普适性。除了包埋过程中的化学反应可能对酶有不利影响或 者作为包埋材料的聚合物会引起酶的变性外，基本上大多数酶都能用包埋法固定。 用包埋法固定酶的条件较温和、酶活力也较高。但是，包埋法对底物分子和产物分 子的火小有所限制( t a n a k a 等，1 9 8 4 ) 。常用的格子型包埋载体有：海藻酸盐、卡拉胶、 琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等( c a n t a r e l l a 等，1 9 8 8 ) 。 近年来，有人通过在疏水性有机溶剂中的悬浮聚合，将聚丙烯酰胺凝胶剂制成 具有一定大小的珠体固定化酶。珠体固定化酶机械强度较高，而且在装柱使用时， 流体流动速度也高。珠体固定化酶可以作为模型系统用于固定化酶反应的动力学研 究( c a n l a r e l l a 等1 9 9 2 ) 。但是化学法悬浮聚合必须在隔绝氧气的情况下作用一段较长 的时间，这将引起酶的失活。在这一方面，采用冷冻光辐照聚合法可使该问题得到 明显改善( m a e d a 等，1 9 7 5 ) 。 常用的微胶囊包埋材料有火棉、尼龙、聚脲等半透性界面聚合物膜( m a z i d 和l a i d l e r 1 9 8 0 ) 。例如，将含有1 ，6 - 二氨基己烷的酶的水溶液分散到与水互不相溶的含有己二 酰二氯的有机溶剂中去，水相与有机相界面上的二胺和二酰氯发生聚合，形成包围 在水相酶溶液珠滴外面的聚酰胺薄膜( 也即尼龙6 ，6 薄膜) 。 另外，利用界面沉淀法也可使酶液包埋在微胶囊r - ) ( b u c h h o l z 1 9 7 9 ) 。例如，三醋 酸纤维素能溶于二氯甲烷中，但在甲苯溶液中则沉淀析出。将酶的水溶液与含有三 醋酸纤维素的二氯甲烷溶液混合形成乳浊液，然后将此乳浊液在搅拌的情况下混入 甲苯溶液中，这样三醋酸纤维素便在水相界面沉淀，形成薄膜。结果酶被包埋在里 面成为微胶囊。 2 1 3 交联法 交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶发生分子间交联因而得到 固定的方法。常用的试剂有戊二醛、己撑二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯马来酸 酐共聚物等( l a f f e r t y 。1 9 8 2 ) 。 笙= 里萱皇一 戊二醛可直接参与酶蛋白的交联或者酶蛋白分子与其它惰性蛋白分子的交联， 形成酶的蛋白质聚结态。双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级 结构的改变，使酶失活。为了避免或减少酶在交联过程中因化学修饰造成的失活， 常在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白。例如牛血清蛋白和明胶等蛋白 质的) j 1 j 入往往能够提高阎定化酶的稳定性( 俞俊棠利h 孝矗1 9 9 1 ) 。 2 1 4 化学共价法 化学共价法就是使：怍水溶性载体与酶以共价键的形式结合。用共价法固定酶， 载体与酶的结合牢固、半衰期较长。但由于化学共价法结合时反应剧烈，常会引起 酶蛋白高级结构发生变化，囚此一般情况下酶活性的回收较低。能够用于共价法固 定的酶蛋白上的功能基团有：1 ) 氨基赖氨酸上的氨基以及多肽链n 末端的a 一氨基； 2 ) 羧基双羧基氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸上的游离羧基，以及多肽链c 末端的q 一羧 基：3 ) 酪氨酸上的苯酚环；4 ) 半胱氨酸上的巯基；5 ) 羟基丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸 上的羟基；6 ) 组氨酸上的咪唑基：7 ) 色氨酸上的吲哚基等。其中以氨基和羧基为最常 用。 对于共价偶联反应的选择一般应考虑到酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不 影响酶的催化活性：反应条件必须尽可能温和；而且最好能在水溶液中进行反应。 偶联反应应该对酶蛋白上某一类功能基团有很强的专一性，而对其它功能基团或水 溶液儿乎无副反应。 化学共价法的主要方法有酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰法、重氮化反 应以及硅烷基化法等( h a r t m e i e r ，1 9 8 3 ) 。 2 1 5 逆胶柬酶反应系统 除了用固体作载体将酶固定外，近来利用逆胶束酶反应系统进行有机相合成反 应，生产具有工业意义的有机化合物已成为一种重要的酶技术。在这种系统中，酶 以逆胶束( r e v e r s e dm i c e l l e s ) 的形式被固定，并在有机溶剂中参与反应。因此与过去认 为酶只能在水溶液中进行反应的传统观点相反，逆胶束酶作为有机相反应的催化剂 大大扩大了酶的工业应用。 所谓逆胶束就是表面活性剂等两性分子在有机溶剂中自发形成的聚集体。表面 活性剂的亲水性一端连结成逆胶束的极性核，而其疏水性一端向外仲展进入主体有 机溶剂中。水分子可以进入( 即溶解到) 这种逆胶束的极性核中，结果形成热力学上稳 定的“汕包水”型微观乳状液。如果逆胶束中还溶有酶分子，那么这种微观乳状液 就成为逆胶束酶系统。 用于逆胶束酶系统的表面活性剂有琥珀酸二辛酯磺酸钠( a o t ) ，溴代十六烷基三 甲铵( c t a b ) ，氯化三辛4 , t - q l 铵( t c m a c ) ，磷脂酰胆碱( p t c ) ，磷脂酰乙醇胺( p t e a ) ， 新型陶瓷载体【两定化酵母细胞啤酒连续发酵工艺及动力学研究 以及磷脂酸等，其中以a o t 为最常用。作为逆胶束系统的主体有机相可以用环己烷、 庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油等有机溶剂。 在逆胶束极性核t h7 卜一部分水起着使农i f | f 活性剂亲水性址【j i 】水化的作川，这 部分水被牢固地束缚着，其流动性较差。例如，在以烷烃溶剂作主体有机相的a o t 逆胶水t t ，水化一个表i ( 1 i 。r , - i q - 荆分予人约需业七个水分予，i 町c 余水分。r ，i ：1 i 受到 约束，它们与主体水相一样可以自由流动。凶此逆胶束系统的水含量与表面活性剂 的量有关，两者之摩尔比。，可以用术表示逆胶束的大小。大多数逆胶束酶系统中 的水含量为l 5 ，其( 0 。为5 4 0 。 制备逆胶束酶系统一般有三种方法： ( 1 ) 最常用的方法是将含酶的水溶液注入到含表面活性剂的有机溶剂中去，然后 进行搅拌直到形成透明的溶液为止。用此法可以很好地控制逆胶束中水核的大小和 含量。 ( 2 ) 第二种方法是相转移法。将酶从主体水溶液中转移到含表面活性剂的有机溶 剂中形成逆胶柬酶溶液。用此法可以得到较高的酶浓度。 ( 3 ) 逆胶束溶液与i 同体酶直接搅拌，使酶进入逆胶束内。j 1 1 ：法所需时i 刈长，酶变 性失活较严重。 逆胶束酶反应系统在有机合成中应用很广，例如，氨基酸对映体的拆分：多肽 合成；甾体的氧化或还原：甘油三酯或二酯的酯键选择性修饰：以及芳香族异构体 混合物的选择性氧化等。对于某些酶反应，如果系统中有有机溶剂的存在，将会对 反应有利。例如： ( 】) 如果合成反应的产物在水中溶解度很小而易溶于有机溶剂，那么有机溶剂的 存在会改变原来的反应平衡，使合成反应趋于完成。 ( 2 ) 女1 1 果水枷酶反应的底物在有机溶剂小可j 溶，则有机溶剂的存在将会使酶反应 方向发生逆转。如：在通常情况下，木瓜蛋臼酶、胃蛋白酶和o 【肤凝乳蛋白酶等能 有效地催化蛋白质, 1 1 j j 太键的水解。系统中有机溶剂的存在不利于水解反应的进行， 相反却有利于推动合成反应趋于完成。另外，对于胰凝乳蛋白酶( 一种酰基形式的 酶) i 丕k r 以用氨基酸酯作底物在有机介质中催化多肽的合成。 ( 3 ) 产物如有抑制作用，其抑制程度与产物的浓度有关，因此产物在有机溶剂中 的溶解将会减轻产物的抑制程度。 ( 4 ) 如果水能与反应底物、产物或其它物质起反应形成副产物，那么在有机相中 进行反应可以减少副产物并提高反应收得率。 ( 5 ) 一般来说，酶的热稳定性与水化程度有关，不完全水化的酶其热稳定性往往 较高，因此，有机溶剂的存在将改善酶的热稳定性。 ，于l ：述讨沦，夼机介质一i ，的酶反应引起丁人们的很人兴趣。存逆胶求酶反应 5 系统中，酶因表面活性剂的存在而与有机溶剂分隔，因而它既能在有机介质中发挥 催化作j f j ，又能不受溶剂影响而保持活性。l 捌此，逆胶束酶反应技术将成为有机合 成工业中一项很有前途的技术( 俞俊棠利”孝宜，1 9 9 1 ) 。 2 2 完整细胞的固定化方法 完整细胞的固定化，基本上仍沿用固定化酶的一套方法，即吸附法、包埋法、 交联法和共价法。固定的微生物细胞，可以是处于生长状态的活细胞、休眠状态的 活细胞和死亡的细胞( 但胞内的酶仍具有活力) 。当固定的细胞是处于生长状态时，往 往很难与发酵过程州区别，但它与常规的游离菌发酵相比，菌体细胞的密度要大得 多，故可提高发酵速率，节省反应器容积。而且，菌体细胞可以重复使用，酶活力 稳定性大为提高( c a b e c a s i l v a 等，1 9 8 2 ) 。 按照细胞固定化的方式，又可分为：无载体固定化、有载体固定化及细胞在生 长情况下的固定化等三种。 2 2 1 无载体固定化 这意味着细胞的固定化，是靠细胞自身的絮凝作用而实现：有时，亦可添加少 量助凝剂促进细胞的絮凝。此法的优点是能获得高细胞密度，茹且絮凝条件温和， 不会损害细胞的生存( l i b i c k i 等，1 9 8 8 ) ：其缺点是机械强度极差，不能承受压缩或强 的剪切作用。此外，若是细胞活力很高，那么密集填充的细胞，必将导致严重的传 递阻力( c a u n t 等，1 9 8 8 ) 。例如，对需氧微生物来说，处在颗粒中心的细胞很可能会因 此而缺氧并造成死亡。 2 2 2 有载体固定化 用于细胞固定化的载体可以是预先制备的，也可在固定的同时制成( d i n c b a s 等。 1 9 9 3 ) 。前者主要用于吸附固定化，后者用于包埋及微胶囊包埋技术( n o r t o n 等，1 9 9 5 ) 。 为了避免细胞在固定化时被化学试剂毒害，保证固定化后的细胞仍具有较高的活力， 交联法和共价法一般在固定化细胞技术中很少使用。 ( 1 ) 吸附法固定化 细胞的吸附固定化，既可用无机载体，包括陶瓷、金属氢氧化物以及有特定结 构的多孔性玻璃等。也可用有机载体，包括木片、无烟煤及天然高聚物，如胶原蛋 白、海藻酸盐凝胶、纤维素、卡拉胶和清蛋白等( d o r a n 和b a i l e y ，1 9 8 6 ) ，此外，合成 高聚物，如聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、离子交换树脂和聚氨酯等也可使用( d r o r 等，1 9 8 8 ：t a m p i o n 和t a m p i o n ，1 9 8 7 ) 。 吸附法具有两大优点，简单及合乎细胞的生理条件。当载体与细胞悬浮液混合 后，细胞便吸附在载体的表面。因为载体是惰性的，并且没有化学试剂的参与，所 以被固定的细j j 乜处在与悬浮细胞相同的生理条什下，这样就不会影响细胞的生长， - 6 - 堑型堕堡塾堡塑室些壁堡型塑哩塑垄丝丝壁! 兰丝垫! ! 塑巫! ! 也不会影响细胞的特性和活力( k a n a y a m a 等，1 9 8 8 ) 。例如把活的酵母细胞经吸附固定 化后生产乙醇，便可证实这一方法在生理条件方面的优越性( b a r b o t i n 等1 9 9 0 ) 。吸附 法的一个致命弊端，就是它的吸附容量小。为了有足够多的细胞能被吸附，载体材 料应该是多孔性的，并且它的孔径应比细胞的直径大。在吸附细菌和酵母的场合下， 孔径一般应比菌休入4 5 倍( c l a r k ，1 9 9 0 ) ，但孔径增人，比表面积就减少，因而有一 最适宜的孔径或最适宜的比表面积这些最宜值随菌体种类及载体材料的不同而异 ( w h e e l e r ，1 9 5 i ) 。 吸附法的第二个弱点即结合强度低。不难想像，像完整细胞这么大的一个实体， 在吸附于载体表面时，显然不能建立彼此之间强大的作用力。研究已经表明：p h 值、 离子强度以及无机载体的组成等，均对此有影1 1 1 自( c h i b a t a 等，1 9 8 3 ) 。 另外，还需说明两点：其一，细胞的附着除物理吸附作用之外，往往还可施以 共价连接。如二氧化硅或纤维素等载体的表面，常用有机功能团进行修饰。这是吸 附法中经常使用的一利，加强措施( j i r k i j 1 9 9 1 ) 。其二，前面述及的载体一般都是单纯 的无机材料或有机材料，而近年来又提出了“杂交结构”的概念。所谓杂交结构， 就是把有机、无机材料结合在一起，使其成为更理想的载体。如有机凝胶可用无机 填充物进行加强，以提高其机械性能。又如，二氧化硅用有机分子进行修饰，可增 加它的吸附性或极性。这方面的第三个例子就是把螯合金属阳离子掺入到多糖载体 中去，以增强吸附作用。很显然，各种杂交型的载体均有其优越的性能，因而极有 发展丽途0 0 s h i 和y a m a z a k i ，1 9 8 7 ：l n a m a 等，1 9 9 3 ) 。 ( 2 ) 在聚合物载体内的包埋 在多孔性聚含物拽体内包埋宽憋细胞，足最常j f j 的固定化细胞技术( d c t a x i s d u p o e t 等，1 9 8 7 ：g a l a z z o 和a i l e y ，1 9 8 9 ) 。由于细胞体积较大，所以要制备既能保留细胞，同 时对底物和产物的传递又具有较大孔隙率的多孔性网状材料，并不是一件难事。但 在制备这种生物催化剂时，还需注意如下几点( b a r b o t i n 等，1 9 8 9 ：l e e n e n 等，1 9 9 4 ) ： 网络要有化学稳定性；网络要有机械稳定性；便于加工和控制催化剂的几何形 状；网络的多孔性；细胞的装载容量；固定化后的活力回收：固定化细胞 的存活等。 包埋法的材料主要是有机高聚物，在包埋技术发展的初期，以使用聚丙烯酰胺 等合成高聚物为主( a u d e t 和l a c r o i x ，1 9 8 9 ) ，但如今已逐渐转向使用海藻酸盐、卡拉胶 及琼脂等天然聚合物，这是因为它们的毒性小，不会损害细胞f a m a u d 和l a c r o i x ，1 9 9 1 ； c a n t a r e l l a 等，1 9 9 2 ) 。 目f j l ，在完整细胞的包埋技术中，主要采用卡拉胶( h o o i j m a n s 等1 9 9 0 b ；h u n i k 等。 1 9 9 4 ) ，这是一种从海藻中分离得到的无毒多糖物质，十分适合用于微生物细胞的包 埋固定化。可以蜕，卡拉胶的使用，足包埋技术的一大进步。一g - 拉胶在4 0 6 0 ( 2 之间 - 了- 第一章前肯 i q 溶j ：水，但冷上至室温，便发_ ! 凝胶化作川。此外， 拉胶水溶液与禽仃k + 、n i i ，+ 、 c a ”、c u “、m g ”等离予的水溶液以及水溶1 t - ：4 i 1 机溶剂等凝胶化诱发剂接触时，也能 甘j 波掀胶化；们对它如会发乍凝胶化f i j j l i ： i ! ，| | 附还4 9 i f 楚。卜 洲受的j 、v 川，【! ! i l - r 川j 二雕聃f f l 化反心的场合，三呵川1 ：川定i - , r , - f l l l 胞。 川湘濒般胁c a “受l l 、天( o o s m a n n _ lr e h m 1 9 8 8 ：i ) o ss ；l l l | o s 讨1 9 9 6 ) ，也琏允恺 j 也他j ! i h 史术i i n 0 利t 占j i j 力泓i 。如i 果把怂浮f j a l | 胞f 1 03 ：_ f 襄n q “9 溶i 陂 ；| j i 商地；商 入到c a c i ，溶液”去，则在不到一小州的时n u 内，便凝成具 r 一定人小的小殊 本。 这就是我们需要的包埋细胞生物催化剂。 c a ”海藻酸胁系统的包埋法，具有一个重要特点，这就是小珠体可通过部分t 燥法术减小它的直径。干燥后的颗粒即使再与水溶液接触，也不会再溶胀。部分干 燥法的优点是，可以显著地增加催化剂的机械强度而不失基质的多孔性。而且，细 胞的裟载密度可以提高( c o o n e y 羽il t u n l p h l e y ，1 9 8 5 ) 。l _ i | j i ，刘海藻酸钙凝胶n 州月箭法 又有新的发展，例盘可把磁性铁粉与细胞起j 同圃定，以制符磁一陆珠体。于是， 改变j 术层j 嗣i i ；| 磁场的条什便町控制反应( 舡1 1 ；j ：e 化j 术反成器) l i 小珠运动f 。j 况以 改善操f j ! ( h i l g e r o t m a n n 和r e h m ，1 9 9 0 ) 。 2 2 3 生长细胞的固定化 制衙生【毛状态卜的完整f i l l 胞固定化生物雠化剖，可增加催化剂表i f i i 细胞的密度， 制成“蛋壳形”生物催化剂，这有利于减小i j 扩散阻： j ( g a l a z z o 和a l l e y ，1 9 8 9 ) 。敞达 此l i 的，一般l j j 也刚制备好的新鲜生物催化剂，在合适的生长条什下进行培f 而获 得( d eg o o i j e r 等，1 9 9 1 ) 。使用这种具有生长状态的固定化细胞，与使用普通的游离细 胞，两疗t i 苻年i l 的实质。 制衙生长细胞的固定化生物催化剂，最常用的方法是在网络基质中物理包埋细 i l l - ( 1 ) c i h x i sd up o e t 等1 9 8 8 ：c a l d w e l l 等1 9 9 i ) 。筇肜，把预先j 哥芥的自 川( ! i j 壤合介 质泄俞，然后把此池合物一滴一滴地加入到凝液t t 太，j ：轻轻揽动，j ：足便f i ： 剑 均匀分厕j t j 少哦细胞的凝胶颗粒。筇二步，把也坪前少殴活细胞的凝胶颊粒，了1 ： 定的营养介质- l ，培育，于是被包埋的细胞就发生生长，最终所得的吲定化生物催化 荆，j l l f l l l 胞密度可比培育前增加1 2 个数量级，j 且多数密集于载体表面。 叫定生长情况下i 1 9 垒l l 胞，还有一个优点，这就足在连续生产商浓度乙醇时，由 酵母细胞的生长，可起到自然选优的作用( a q u i l e r a 和b e n i t e z ，1 9 8 9 ：l e e 等，1 9 8 1 ) ，也 即在生产过程中，那些受底物和产物抑制作用小的酵母将被保留下来，而那些受抑 制作用大的酵母则被淘汰，从而有利于生产率的提商。 3 固定化技术应用的工程学问题 3 i 固定化细胞生物反应器 新型陶瓷载体i 舌i 定化酵母细胞啤酒连续发酵t 岂及动力学研究 固定化细胞生物反应器以固定化细胞( i m c ) n 生物催化剂，常见的主要有间歇反 应器、连续搅拌釜式反应器、填充床反应器及流化床反应器等类型，除此之外，还 有一些特殊形式的反应器：如连续搅拌与超滤膜棚结合的反应器、中空纤维反应器 以及螺旋卷绕膜式反应器等( f o n s e c a 等，1 9 8 6 ) 。一些反应器的类型如图1 1 所示。下 i j l 将坩这些不刷缶i 构的反应器作简j 丫j 的描述。 o 晰日噶- f l o s t i r r e d - t t n i , tr a c t o r l c s r r l ，5 h 眦山 f u x m 疆= or e a c t o r o 目n e dc s t r u fr e a c t ( 图1 - 1 固定化细胞生物反应器的类型 f i g 1 - 1 t h e t y p e so ft h ei m m o b i l i z e dc e l l sb i o r e a c t o r s 3 1 1 间歇式反应器 根据加料和排料方式的不同，固定化细胞生物反应器可分为问歇式与连续式两 大类。阳j 歇式反应器可用于游离细胞的反应，并将细胞与底物起加入反应器内， 待达到规定的转化率后随即放料。间歇反应器常用于食品工业和饮料工业f f 。a k i 等，1 9 8 3 ) 。 如果把固定化细胞用于间歇反应器，在下一步操作中需把流出液中的固定化细 胞和产物分离，这可采用过滤或超滤法实现。但细胞经反复的循环回收使用，活性 会降低，故含同定化细胞的间歇反应器，在工业上应用很少。 9 第一章前言 3 1 2 连续搅拌釜式反应器( e o n t i n o u s s t i r r e dt a n kr e a c t o r , c s t r ) 这种反应器在运转过程中，以恒定的流速流加新的底物溶液，与此同u 寸，反应 液则以i 刊样的流速流山反应器( n o r t o n 等，1 9 9 3 ) 。在理想的c s t r 中，反应液混合良 好，各部位的成分棚，j ：与流小液的t l tj & u 三一致。缺点足，l l j 揽拌浆产q i v , j 蓟 切力较人，常会引起必定化细胞的破坏( a r n a u d 等，1 9 9 2 ) 。近来有一种改良的c s q r ， 将载有固定化细胞的圆片聚合物，固定在搅拌轴上或者放置在与搅拌轴一起转动的 金属网筐内( h u n i k 等，1 9 9 2 ) 。这样，既能保证反应液搅拌均匀，同时又不致损坏固定 化细胞。c s t r 适合用于有底物抑制的场合。 3 1 3 填充床反应器( p a c k e db e dr e a c t o hp b r ) 这种反应器使用最普遍。迄今已发表的固定化细胞反应器的研究工作，主要也 集i | 在填充床反应器( k a n a y a m a 等，1 9 8 8 ) 。固定化细胞通常可以各种形状，如球形、 碎片、碟形、薄片、小珠、丸粒等填充于床层内。它所使用的载体有多孔性玻璃珠、 殊状离予交换树脂，如d e a e 葡聚糖凝胶、圆l 状聚丙烯酰胺凝胶、薄片形聚合物、 胶原蛋白薄膜片等( c h i b a t a 等，1 9 8 3 ) 。近年来，球形微囊体办用于填充床( c h e n 等，1 9 9 0 ) 。 填充床反应器内流体的流动型态，接近于平推流( 又称活塞流) 流型，所以填充床 反应器可近似认为是一种平推流反应器( p l u gf l o wr e a c t o r ，p f r ) 。此反应器的缺点是， 传质系数和传热系数相对较低，如加上循环装置后，可适当改善。固定化细胞颗粒 的大小，会影响压力降和内扩散阻力( r u g g e r i 等，1 9 9 2 ) ；一般言之，固定化细胞颗粒 的大小，应尽可能均匀。当反应液内含有固体物质时，不宜采用p b r ，因为固体物 质会引起床层的堵塞。当有底物抑制时，不适宜用p b r ；但当有产物抑制时，则采 用p b r 可获得较好的效果。近年来，填充床反应器也有了一些新的发展，例如水平 填充床反应器、气相填充床反应器和多柱串联填充床反应器等( 俞俊棠等，1 9 9 4 ) 。 3 1 4 流化床反应器( f l u i d i z e db e dr e a c t o r ，f b r ) 在流化床反应器内，底物溶液以足够大的流速向上通过固定化细胞床层，使固 体颗粒处于流化状态。这种流动方式，使反应液的混合程度介于c s t r 的全混型和p b r 的平推流型之间。在f b r 中，由于混合程度高，故传热、传质情况良好( t a i t e l 等，1 9 8 0 ) 。 f b r 可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，也可以用于需要供应气体或排放气 体的反应，对于停留时间较短的反应，也可用f b r 。但f b r 中混合均匀，故不适合 于有产物抑制的反应。为了减轻产物抑制引起的不良影响，一般可采用多个f b r 串 联或将f b r 分成几个不同区域，在不同进口处加入反应液的结构。近年来，为了提 高固棚和液柚之n u 的密度差，以利于提商传质，义发展了在阎定化细胞内添加微小 的砂粒、不锈钢粒等惰性物质或加入磁性物质，以使床层在磁场操纵下运行的新技 术( c h u n g 平w e n ，1 9 6 8 ) 。 一1 0 堑型堕窒垫堡型塞! ! 壁苎塑些竺塑垄壁丝堕! 兰丝垫尘堂型兰- 一 3 1 5 其它类型的反应器 ( 1 ) 循环反应器 当反应底物是不溶性物质时，可以采川循环反应器。这种反应器是把部分流出 物与加利流混合，然后再令其进入反应器。其特点是可以提高液体的流速和减少底 物阳i 酗定化细胞表面传递的阻力，尽管该时商流速将减少每次底物通过反应器的停 刚时州，但总的米泌，循环操作仍能为底物与细胞提供足够的接触机会，以达到所 需的转化率( f u r u s a k i 筲，1 9 8 5 ) 。 ( 2 ) 连续搅拌釜一一超滤膜反应器