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浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 植物甾醇的改性研究 摘要 植物甾醇( p s ) 具有降低血液胆固醇的功能，但水相、油相中较低 的溶解度一直是限制其应用的瓶颈，改善其水中、油中溶解性是p s 应用研究中的重点。 植物甾醇酯( p e ) 比p s 具有更好的油溶性，它同样可以有效的降 低血液胆固醇与三酰甘油浓度，被广泛应用在食品，药品，化妆品行 业中。工业上合成p e 的方法很多，但都有其局限性，本文尝试以高 活性，可重复利用，比现在常用的均一化学催化剂腐蚀性更小，选择 性更高的碱性固体氧化锌( z n o ) 作为催化剂，以化学途径酯化合成 p e 。结果表明z n 0 不但可以催化p s 酯化反应合成p e ，且比其酯交 换反应条件更温和，选择性及转化率更高；对其反应产物顺反式脂肪 酸的研究表明产物中反式脂肪酸的比例很低，产品应用时完全可以满 足欧盟的质量标准，且p e 组分中反式脂肪酸含量( 3 2 6 ) 远低于游离 脂肪酸组分( 7 3 5 呦，显示p e 部分的脂肪酸更加稳定。本文所研究的 固定化z n 0 催化剂在酯化甾醇方面具有广泛的工业应用前景，可以 替代现在常用的均相腐蚀性催化剂。 现阶段国内外主要以乳化的方法来改善p s 水中分散性。文中首 先考察了不同乳化剂在所研究的三个体系( 纯水体系，蛋白溶液体系， 油水体系) 中对p s 的乳化效果，结果表明硬脂酰乳酸钠在三个体系中 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 对p s 都有良好的乳化效果，其喷雾干燥产品应用到牛奶饮料后( 1 p s 浓度) 有较好的稳定分散性，一个月后未出现任何沉淀。但是因其石 灰样的口感及混浊性，乳化产品无法成功应用到一些澄清的果汁饮料 及果酱中，为了得到在水中澄清的p s 改性产品，本文首次尝试以环 糊精包埋p s 的方法来改善其在水中的溶解性及稳定性并优化了反应 条件。d s c 结果显示p 环糊精( p c d ) 包合p s 确实可行；以正丁醇为 溶剂，p s 浓度2 ，p c d 与p s 的摩尔比为4 ：l ，温度为4 0 ，中等 速度搅拌条件下包合1 2 小时，p s 包合率可达9 0 ，p s 的水溶性得 到明显改善。但由于p c d 本身水溶性较低，本文同时选择了水溶性 更好，毒性更低的羟丙基p 环糊精( 唧p c d ) 作为包埋壁材；差热扫 描分析( d s c ) ；气相色谱( g c ) ；电子扫描电镜( s e m ) ；傅立叶红 外色谱( f t i r ) 等结果显示p s ( 动物体中胆固醇的结构类似物) 能 被h p p c d 包埋，p s 水中溶解性分散性得到显著提高；最后以相应 面法优化了h p p c d 包埋p s 的条件，以无水乙醇为溶剂，p s 浓度 1 ，h p p 。c d 与p s 的摩尔比为3 ：1 ，温度为5 0 ，中等速度搅拌条 件下包合1 2 小时，p s 包合率可达8 5 ，水中溶解度接近1 ，可以 很好的应用在水溶性食品中，对甾体的药物转化更是具有广阔的应用 1 l 目 刖景。 关键词：植物甾醇，1 植物甾醇酯，z n o ，酯化，g c ，唧p c d ，包合 物 i i 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 m o d i f i e dr es e a r c ho fp h y t o s t e r o l a b s t r a c t p l a n ts t e r o l sh a v eb e e ns h o 、nt h e 如n c t i o nt or e ( 1 u c et h e1 e v e l so f s e m m1 0 w d e n s 毋 1 i p o p r o t e i n( l d l ) c h 0 1 e s t e r 0 1i n h l m a n s ， b u t e 血c h m e n to ff o o dp r o d u c t sw i t h p l a n ts t e r o l s i sd i f ! f i c u l t 舶ma t e c h n 0 1 0 9 i c a la n df o o dq u a l 埘p o i n to fv i e ws i n c et h e ya r ei n s o l u b l ei n w a t e ra n dp o o r l ys 0 1 u b l ei nd i e t a r yf a t s i m p r o v i n gi t sw 砷e ra n do i l 一 s o l u b i l i t yw a sa l w a y st h ek e yp o i n ti np sr e s e a r c hs c o p e s p h o s t e r o le s t e r sw e r ee f e c t i v ei nr e d u c i n gb o t hb l o o dc h o l e s t e r o l 1 e v e l sa n dt r i g l y c 研d e sa n dc o u l db eu s e da sb i 0 1 0 9 i c a lc o n l p o u n d si n f o o d ， p h a m l a c e u t i c sa n d c o s m e t i c s m e t h o d so fp h y t o s t e r 姐e s t e r p r o d u c t i o nw e r ev 撕o u s ，b l u tm o s n yh a di t sl i m i t a t i o n t h es e l e c t i v e s y n t h e s i so fp h y t o s t e r 0 1e s t e r s 丘o mn a m r a ls t e r 0 1 sa n df r e ef i a t t ya c i d s 。w a si n v e s t i g a t e do nn e wg r o u n d sb yac h e m i c a lp r o c e s su s i n gab a s i c s 0 1 i dc a t a l y s t ( z n o ) t h a tw e r ea c t i v e ，r e u s a b l e ，1 e s sc o r r o s i v ea n dm o r e s e l e c t i v et h a nt h ec u n ? e n t l yu s e dh o m o g e n e o u s c a t a l y s t s i tw a sf o u n dt h a t e s t e r i f l c a c i o nr e a c t i o no fp h 妒o s t e r o lc o u l da l s ob ec a r 竹e do u tb yz n 0i n i i i 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 m o r em i l dr e a c t i o nc o n d i t i o n ss i m u l t a n e o u s l yh a dh i g h e rc o n v e r s i o nr a t e a n ds e l e c t i v i 够t h a nt r a n s e s t e r i f i c a t i o n ；i tw a sa l s of o u n dt b a t 勿馏咒s f a 戗y a c i df o m l e di ne s t 丽f i c a t i o nw a s1 0 wa n d加甩s - f a t t ya c i d ( ) i n p h y t o s t e r 0 10 1 e a t ee s t e r s 五阻c t i o n ( 3 2 6 ) w a sm u c h1 0 w e rm a ni n 矗r e e 0 1 e i co i l ( 7 3 5 ) s u g g e s t e dt h a t 蜘ya c i di ne s t e r sa r em o r es t a b l et h a n 丘e e f a 竹ya c i d i m m o b i l i z e dz n 0c o u l db eap r o m i s i n gc a t a l y s tf o r r e p l a c i n gh o m o g e n e o u s 撕dc o r r o s i y ec a t a l y s t sf o re s t 耐f i c a t i o nr e a c t i o n o fs t e r 0 1 e m u l s i f i c a t i o nm e t h o dw a st h em o s tu s e di nt h ew a t e r s o l u b i l i t y a s p e c t o fp l a n t s t e r o l ， f i r s tw eu s e dt h i sm e t h o dt o i m p r o v e w a t e r - d i s p e r s i o na n ds t a b i h t y f o rt h em r e es y s t e m sr e s e a r c h e d ( p u r e w a t e r ，p r o t e i n w a t e r ，o i l 一w a t e r ) ，s o d i u ms t e a r y l1 a c 够l a t eh a dag o o d e 髓c t i t ss p r a yd 巧e rp r o d u c t sh a dap r e f e r a b l es t a b i l i t yi nm i l k 嘶n kt h a t n od e p o s i t i o nw a so b s e r v e da r e ro n em o n t h b u tt h e i rc h a l k yt a s t e 狮d 劬勘d i 够m a k e di tc a n ts u c c e e da p p l i e di nc l e a ra d ea n dj 锄i no r d e rt o o b t a i n aw a t e r - s 0 1 u b i l i t ym o d i f i e dp h y t o s t 9 r 0 1p r o d u c t ，i nt h i s s t u d y ， c y c l o d e x t r i nw a su s e dt oi n l p r o v et h ew a t e r - s o l u b i l i t yo fp h 舛o s t e r o la n d t h er e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t so fd s cs h o w e dt h e i n c l u s i o nc o n l p l e xo fp h 舛o s t e r o li np - c y c l o d e x t r i nc a nb ef o m e d r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d i tw a sd e t e r m i n e dt h a tp h 吵o s t e r 0 1 i n c l u s i o nr a t i oo f9 0 c a nb er e a c h e d ，w h e nr e a c t i o nw a l sc a 而e do u ta t t e 1 p e r a t u r eo f4 0 f o r12 h ，w i t ham o l a rr a t i oo fp c dt op h y t 9 s t e r o lo f 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 4 ：1 i nn - b u t a n o l s y s t e m w r a t e r - s o l u b i l i t y o fp h y t o s t e r o l s i m p r o v e s i g n i f i c a n t l y p c y c l o d e x t r i nw h i c hi s m o s tc o m m o n l yu s e di nm e p h a m a c e i u t i c a la n df o o d f i e l di s1 i 血t e db yi t sr a t h e rl o wa ( 1 u e o u s s o h l b i l i 妙h y d r o x y p r o p y lp - c y c l o d e x t r i n ( h p p - c d ) ，t h eh y d r o x y p r o p y l d 嘶v a t i v e s o fc y c l o d e x t r i n sw h i c h h a st h ea d v a n t a g e so fe n h a n c e d s 0 1 u b i l i t y ，a sw e l la sl o w e rh e m 0 1 y t i ca c t i v i t ya n dr e d u c e dn 印h r o t o x i c i 够 w a s 邳 p l i e di nt 1 1 i ss t u d y d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t 巧( ds c ) ，g a s c h r o m a t o 聊h y ( g c ) ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n df i o 嘶e r 胁1 s f o r mi n 行a r e ds p e c t r o s c o p y ( f t i r ) r e s u l t ss h o w e dp l a n ts t e r o l s ( p s ) w h i c hw e r es t m c t u r a l l ys i m i l a rt oc h o l e s t e r o li na n i m a l sc o u l df o 衄 i n c l u s i o nc o m p l e x e sw 仙h p - p c d a ( 1 u e o u ss o l u b i l 埘a n dd i s s o l u t i o n i m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y t h er e s p o n s es u 血c em e t h o d 0 1 0 9 y ( r s m ) w a s u s e dt o o p t i m i z e t h er e a c t i o n c o n d i t i o n s ， t h er e s u l t ss h o w e dt h a t p b 矿o s t e r 0 1i n c l u s i o nr a t i oo f85 c a nb er e a c h e d ，w h e nr e a c t i o nw a s c a 币e do u ta tt e m p e r a m r eo f5 0 f o rl2 h ，w i t ham o l a u fr a t i oo fh p p c d t op h y t o s t e r 0 1o f3 ：1 勰dp h y t o s t e r o lc o n c e n t r a t i o na t1 i na b s 0 1 u t e a l c o h o l s y s t e m a q u e o u ss 0 1 u b i l i t yo fp h y t o s t e r 0 1r e a c h e da l m o s t1 w 1 1 i c hc o u l dw e ua p p l i e di nw a t e r s 0 1 u b i l i t yf o o ds y s t e m sa n da l s oh a d i 瑚【p o n a n ti n f l u e n c eo ns t e r o i dd m gt r a n s l a t i o n l ( e y w o r d ：p h y t o s t e r o l ，p h y t o s t e r 0 1e s t e r ，z n o ，e s t 嘶f i c a t i o n ，g c ， h p p - c d ，i n c l u s i o nc o m p l e x v 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：砌易 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 、 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：购孵 导师签名： 日期：泐年二月五旷日 日期：年月日 b 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 1 1 来源 第一章文献综述 植物甾醇( p s ) 主要以自由的醇结构和酯化形式存在于自然界中，在富含 油脂的植物中含量较高，比如坚果，豆类，植物种子等】( 如表1 1 所示) 。在植 物油的提取过程中产生的副产物脱臭馏出物是p s 的一个主要来源；p s 另一个重 要来源是工业生产的下脚料浮油。浮油是造纸等工业的副产物，主要由脂肪醇， 脂肪酸酯，p s ，植物甾醇酯等组成】。另外，研究人员发现酿酒行业中的发酵 废弃物也含有一定量的p s 【6 】。 表l ：1 高油脂食品中主要植物甾醇的含量( i l 拶1 0 0 9 ) t a b l e1 1m a m l yp h y c o s t e r o l sc o n c e n 廿嘶o n so ff a t t yf o o d s ( m 1 0 0 曲 种类 b 谷甾醇菜油甾醇豆甾醇总甾醇 橄榄油 花生油 大豆油 芝麻油 胡桃 花生 杏仁 芝麻 1 1 7 1 5 3 2 2 1 3 6 7 1 1 4 4 7 1 3 3 1 4 3 2 3 l 未检测出 1 3 6 7 2 8 2 7 1 0 5 2 2 1 2 功能 p s 是一种三萜烯，结构与胆固醇类似，都有四环类固醇晶核( 如图1 1 所示) ， 它们已经被广泛应用在医药品( a d ，a d d 的前体【刀) ，保健品( 作为降胆固醇， 抗癌物质添加在食品中【8 】) ，化妆品( 手霜，口红) 等领域，具有抗炎，退热， 降胆固醇，美容，抗癌，促进动物生长等作用 9 】。其中p s 的降胆固醇特性在近半 个多世纪以来一直都是人们关注的焦点，目前为止大量研究表明p s 可以有效的 降低人体内血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇( l d l ) ，人体摄入o 5 3 d a y 的 p s 可以抑制肠道内3 0 8 0 的胆固醇吸收从而降低1 0 1 5 的l d l 【1 0 - 1 2 1 。到目前为 止还，人们还不了解p s 降胆固醇的确切机理，e 1 k ea t r a u 似e i n 等人总结了近年 1 6 5 9 6 3 1 - 3 6 m 鸺 弘 钉 心 舛 ：2 8 5 为 鼹 丌 5 引 5 弱 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 来p s 降胆固醇作用的研究指出的可能机制主要有：1 ) 在消化道与胆固醇形成混合 结晶，使其沉淀，呈不溶解状态而排出体外，2 ) 竞争溶解于小肠内腔的胆汁酸 微胶束，减少微胶束中胆固醇的含量，使之不能运送到达小肠微绒毛的吸收部位， 3 ) 在小肠微绒毛膜吸收胆固醇时和胆固醇相互竞争吸收位点，阻碍其吸收，4 ) 抑 制催化胆固醇代谢转化酶的活性，5 ) 竞争结合胆固醇受体。p s 的降胆固醇功能正 是由于上述一种或几种机制的综合作用 9 1 。 s t i g m as t e r o l b r a s s i c a s t e r o l 图1 1 常见植物甾醇的结构 f i g u r e1 1t h es 恤l c t u r eo fs o m er e p r e s e n 枷v ep h ”o s t e r o l 1 3 提取分离 自从发现p s 具有降胆固醇作用以来，人们便开始大规模提取p s ，直至目前 已经发展了多种分离提纯方法。在含p s 的原材料中，p s 主要以酯化形式存在， 因此必须首先对它进行水解使之转化成不能皂化的自由甾醇，目前主要有高温高 压水解和碱水解，由于碱水解条件温和，且水解皂化一起进行，近年来被人们普 遍采用【1 3 】。根据不同组分在所选溶剂中的溶解度差异或在高真空蒸馏时挥发性 的差异，可以对未皂化部分进行有效分离浓缩。针对不同原料，提取分离p s 的 方法有所不同，下面将给出p s 提取分离的几个有代表性的例子。 1 3 1 植物油脱臭馏出物 早期从脱臭馏出物中提取p s 主要面临两大难题；1 ) 高温长时间蒸馏时p s 容 易降解，2 ) p s 与生育酚的熔点非常接近，对它们直接分离非常困难 1 4 1 。随着科 2 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 技的发展，分子蒸馏技术的运用，有效的解决了这两大难题；研究人员对植物甾 醇进行酯化后，根据植物甾醇酯( p e ) 与生育酚自由度的差异运用分子蒸馏技术， 使p s 与生育酚得到有效分离。c z u p p o n 等对低甾醇高酸价原料的分离工艺如图 1 2 a 1 5 1 所示；c h a r l e m a g n e 等人对高甾醇低酸价脱臭馏出物的分离工艺如图 1 2 b 【1 6 】所示。同时近年来，c 0 2 超临界萃取【1 刀以及根据脂肪酶的特异性来分离 植物甾醇的方法因其条件温和、分离过程中涉及的有毒有害物质少也越来越受到 人们的重视 1 8 ，19 1 。 蒸馏游离 脂口e熨 “ 肋 j 真空蒸馏 甾醇 部分 馏出物乙醇 集 溶剂蒸发 田 j r 忑篙酐 皂化的脂肪酸 富集部分 b o h 图1 2 脱臭馏出物中甾醇的提取工艺 f i g l l r e1 2p r o c e s s e s 矗n l er e c o v e 巧o fp h ”o s t e r o l s 五md e o d o r i z e rd i s t i l l a o e s 3 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 1 3 2 浮油 随着科技的进步，人们环保意识的加强，对浮油的综合利用正越来越受到人 们的重视，其中浮油中的p s 的分离一直是人们关注的焦点。早期国外主要以溶 剂萃取的方法对p s 进行分离，此方法不但效率不高且所用溶剂大都为有毒有害 物质，因此后来研究人员用蒸馏技术来分离浮油中的p s ，近年来人们结合两者 可以得到纯度为9 7 以上的p s ，h 锄u i l e n 等人研究的分离工艺如图1 3 捌所示。 为了克服溶剂萃取的弊端，r o l l r 等人研究用金属萃取结合蒸馏的方法来分离浮油 中的p s 【2 ，但由于蒸馏时金属有机酸容易融化形成粘度很大的液体，且此过程 中需要比较长时间的高温环境，应用前景还需进一步研究。 醇晶体 图1 3 浮油中甾醇的提取工艺 f i g u 他1 3p r o c e s s 毒”l l l er e c o v e r yo f p h y t o s t e r 0 1 s 五mc n l d et a l lo i l 1 4 改性研究， 天然的植物甾醇熔点高，在水中不溶，油溶性也非常低且有白垩味，这些一 直是限制植物甾醇应用的瓶颈，近年来国内外研究人员尝试各类方法试图克服这 个局限性。 4 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 1 4 1 植物甾醇的改性研究现状 由于天然的p s 熔点高( 1 3 0 1 8 0 ) ，它们很容易在食品体系中的油相中结 晶出来，而这种结晶将导致食品体系不可接受的质感，特别是在p s 含量高的体系 中，严重影响食品品质。在工业应用上国内外主要以p e 与乳化形式添加到食品 体系中，a k a s h e 等人研究了p s 与乳化剂的共熔结晶物，结果表明共熔结晶物的 熔点比p s 有很大程度的降低( 降低约3 0 ) 产品可以比较好的应用在奶酪等食 品中【2 2 】；水油体系中添加乳化剂对甾醇的稳定分散性研究，通常应用复合乳化 剂，u sp a t e n t ：60 6 37 7 6 报道了单一不同乳化剂对p s 在模拟胆汁酸中稳定性的 影响【2 副；也有研究人员以p e 的形式添加一些别的辅料乳化形成水分散性较好的 产品【2 4 1 ；另外u sp a t e i l t ：o0 3 32 0 2 指出纳米技术在p s 乳化方面的应用可以得到 分散稳定性更好的产品 2 5 】。对p s 的乳化研究虽然可以得到水中稳定分散的产品， 但是其石灰样的口感及在水中的浑浊性使其不能应用在澄清饮料中，例如果汁， 果酱等。p e 比游离甾醇具有更好的油溶性，为此研究人员用不饱和脂肪酸对p s 进行酯化【2 6 。o 】，使其油溶性增加的同时也改善了天然p s 的不良气味，该产品已 广泛应用在油性食品中，下面我们主要介绍p e 的合成方法及可能的副产物，重 点强调工业上广泛应用的化学合成法。 1 4 2 植物甾醇油溶性改性研究 对植物甾醇的油溶性研究国内外已经有很多的报道，主要是以酯化或酯交换 的方法来合成p e 进而提高它的油溶性并消除其白垩味。早期人们普遍采用化学 法对植物甾醇酯化( 甲醇钠催化) ，但是化学法容易生成一些副产物( 氧化甾醇 和脱水甾醇) ，得到p e 的纯度不高，严重影响产品品质j 因此近年来人们用脂 肪酶合成p e ，但由于酶法合成p e 现阶段存在着一些固有的缺陷( 反应时间长， 产量低，脂肪酶价格昂贵) ，不能满足现今大规模的工业生产需要，化学法合成 p e 仍是当今工业生产的主流，寻找催化效率高，副产物少的化学催化剂显得尤 其重要。x m e n g 等人研究寻找替代甲醇钠的化学催化剂，结果表明以硅钨酸作 为催化齐u 时可以获得高产量高纯度的p e ，将其固定化后，经过六次连续使用， 硅钨酸仍然有较强的催化活力符合大规模的工业大生产的要求【2 7 】；以金属氧化 物( z n o ，m g o 等) 为催化剂酯交换法合成p e ，同样也得到较为满意的结果 3 1 。3 2 1 。 化学催化容易引起副反应，甾醇的副反应产物氧化甾醇与脱水甾醇的种类及鉴定 5 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 方法将在下文中重点介绍；同时在工业应用上人们更希望以不饱和脂肪酸为原料 合成p e 以发挥不饱和脂肪酸与p s 在降血脂血压方面的协同作用，当以不饱和 脂肪酸为反应原料时，由于化学催化反应温度较高( 1 2 0 以上) ，不饱和脂肪酸 的顺反异构化同样需要被考虑。 1 4 2 1 氧化甾醇、脱水甾醇、反式脂肪酸的种类及鉴定方法 以化学法合成p e 时甾醇的副产物主要有脱水甾醇和氧化甾醇，关于脱水甾 醇的安全性问题国内外鲜为报道，它主要用来评价植物油的掺假问题 3 3 。4 1 。脱水 甾醇是植物油在精炼过程中产生的，主要是在漂白与脱臭两步，对它含量的检测 可以有效的区分压榨油与精炼油，欧洲对压榨橄榄油的标准是总脱水甾醇低于 0 1 5 m 眺g ，高于此值的压榨油很有可能是掺入了精炼油。图1 4 分别列出了谷甾 醇、菜油甾醇、豆甾醇、胆固醇的脱水产物；虽然脱水甾醇可能不会带来安全性 的问题，但是由于甾醇的3 位羟基脱除，若其含量直接影响酯化过程中p s 的转 化率，最终影响p e 产品的品质。脱水甾醇在国内鲜见分析报道，国外主要以 g c m a s s 分析 3 5 - 3 6 1 ，虽然也有研究人员以h p l c 分析，但是其对p s 分离效果不 好，特别是对于多种脱水产物更加的不适合 3 7 1 。图1 5 及表1 2 侧分别列出了几 种主要甾醇氧化产物的产生途径及谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇的氧化产物在b d 一5 毛细管柱上的分离情况 3 8 删，甾醇的氧化产物主要有7 位羟基类、7 位酮类、环 氧化物等，由于工业上合成p e 所用原料都为混合甾醇( 主要包括谷甾醇、豆甾 醇、菜油甾醇) ，其氧化产物接近三十种，其在气相分析时存在着重叠现象造成 分析困难。由于氧化甾醇潜在的类似于氧化胆固醇的副作用，其含量希望越低越 好，具体鉴定过程中以g c m a s s 分析。 当反应原料含有不饱和脂肪酸时( 油酸、亚油酸) ，化学催化的高温环境下 不饱和脂肪酸的顺反异构化需要被考虑。反式脂肪酸能增加人体血液胆固醇的浓 度与心血管疾病的风险，在富含油脂的食品体系中它的含量必需低于一定值；食 品体系中反式脂肪酸的分析方法主要有g c 、a g - h p l c 【4 5 彻；g c 以其准确性高， 分离效果好被人们广泛使用，g c 分析中气相柱的选择是关键，目前对油酸、亚 油酸各种顺反异构体分析效果较好的主要有c p s i l8 8 ，s p 2 3 4 0 ，b p x 7 0 等专门 的脂肪酸毛细管柱【4 8 】。g c 分析脂肪酸常用的样品准备方法有两种：( 1 ) t l c 富 集待测样品组分，然后皂化甲酯化；( 2 ) 先将样品皂化甲酯化后以t l c 分离待 6 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 测的脂肪酸甲酯组分。对于甾醇酯化样品中不同组分中反式脂肪酸的比例宜采用 第一种方法，而对总脂肪酸中反式脂肪酸的比例测定侧应采用第二种。 弧g m a 熊a - 3 ，5 击e n ec 御n | p i e s 饶- 3 5 一d 撼柏e s 畦雕3 j ，2 2 由溉ec h o 把g 3 5 碰翰e 图1 4 植物甾醇与胆固醇脱水产物的结构 f i g l l r e1 4t h es 觚l c l ：i 】r 懿o fn l es t 蝴l ea n dc h o l 鹤t a d i e l l e h o 差嬲蚓柏阳 图1 5 甾醇主要氧化产物的形成过程及结构 f i g u r e1 5r e a c t i o np 椭a y sf b rs t i 目n a s t e r o lo x i d ef o n n a t i o na n di t ss t n l c t u r e 7 二 糍 升 脚 浙江工业大学硕士学位论文 植物甾醇的改性研究 表1 2 豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇氧化产物的种类及其在d b 一5 上的出峰时间 t a b l e1 2p h y t o s t e r o lo x i d a t i o np r o d u c t sa n dt h c i rr e t e n t i o nt i m e si 1 1d b 一5g cc o l u r l l i l 1 4 2 2 反应溶剂的影响 不管是化学法还是酶法合成p e 都必需注意反应溶剂，反应溶剂可以是单一 的有机相，也可以是水和有机溶剂的混合相，甚至不用反应溶剂p s 和脂肪酸都 能成功的合成p e 。移走p s 与脂肪酸反应生产的水根据化学平衡理论可以提高 p e 的产率，但是近年来的小规模生产实验表明不移走反应生成的水仍能获得非 8 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 常高的p e 产率且工艺也简单是目前工业生产的主要方法【lj 。不加反应溶剂酶法 合成p e 时，反应前脂肪酶必须在水中活化，且由于p s 在油中溶解度较低，一 般反应温度比较高 2 5 1 ，b y u n gh e e 磁m 与s a t o s b in e 西s k 就分别研究了加正己烷 到反应体系和未加反应溶剂的酶法合成甾醇酯的工艺，从结果对比中不难发现加 正己烷的反应体系条件温和很多且仍能获得高的p e 产率2 5 ，2 6 1 。对于化学法合成 p e ，由于本身反应温度较高( 1 0 0 ) ，因此基本上都是在无溶剂状态下合成 的。 1 4 3 植物甾醇水溶性改性研究 以乳化形式将植物甾醇添加到水溶性食品体系中只是提高了甾醇在体系中 的稳定分散性，其水中的溶解性并没有实质性的提高。国内外关于植物甾醇的水 溶性改性研究鲜见报道，在医药行业中一些水中不溶、容易氧化的甾体，黄酮类 药物通常以糊精包埋的方式来提高药物的稳定性及在水中的溶解性进而增加其 生物活性 4 9 5 0 】：在食品行业中更有以糊精包埋的方式来脱除蛋黄体系中的胆固 醇，以此提高蛋黄的营养价值，预防冠心病及动脉硬化【5 1 5 6 】；r a m 姗锄y 【轫等 更是通过实验证实了包合物的存在，并从理论上解释了b c d 包合胆固醇的机理。 目前，工业上d c d 已成功应用于脱除奶油中胆固醇。 d c d 是由7 个葡萄糖组成的大环低聚糖，空间结构呈桶形，内部疏水，外 部亲水，是典型的客体分子，可以包埋许多小分子物质，在改善主体的水溶性、 稳定性及掩盖不良气味方面应用广泛；而且b c d 安全性高，因此越来越受到研 究人员的关注。 植物甾醇作为胆固醇的结构类似物，虽然目前为止关于糊精包埋植物甾醇来 改善其水溶性的文章未见报道，但是已有研究人员以b c d 为辅助材料来增加其 在人体细胞膜上的通透性及甾体药物转化时提高甾醇的生物转化率 5 8 】。这些说 明p c d 与植物甾醇存在一定的相互作用力，且其能被p c d 包埋的可能性非常 大。 。 。 1 4 3 1 糊精包合物的验证 糊精客体与包合主体之间是否存在着相互作用力，形成包合物的验证方法目 前主要以色谱法为主；其中包括热差扫描分析( d s c ) 、扫描电境( s e m ) 、傅立 叶红外色谱( f t m ) 、核磁共振( n m r ) 、x 射线衍射( x i ) 掣5 9 6 3 1 。 9 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 d s c 是测定物质热性质非常有效的手段，可以用来测定蛋白质的变性温度、 待测物质的熔沸点、失结晶水温度等，在验证主客体分子之间的相互作用力时， d s c 是最常用的一种手段。当主体分子被客体分子包合形成包合物时，主体的 特征吸热峰( 主要是主体分子失结晶水、熔点峰) 通常会消失或强度大大降低， 而在物理混合的样品中侧有出现，说明主体分子进入了客体分子( 通常为p - c d ) 的空腔。 s e m 根据测定待测物质被电子源激发的电子来观测样品的表面形态，通常 在物理混合样品中主客体分子的表面形态特征都有出现，而在包合样品中主客体 分子各自的形态将会消失，出现的是一种新的形态进而论证主客体分子之间存在 作用力。 f t r 在验证糊精包合物时通常不是一种非常有效的手段，因为糊精强的吸 收峰容易掩盖了主体分子的特征峰，而f t - m 验证包合作用时最直观的是主体特 征峰在包合样品中消失，在相应的物理混合样中侧有出现；不过实验中仍能通过 观察对于物理混合样与包合样中主要吸收峰的峰形、强度的改变间接说明相互作 用力的存在。 偶侧主要是对比物理混合样与包合样中不同位置1 h 或1 3 c 化学位移的变 化来说明主客体分子之间的相互作用力，因为这种相互作用力主要是氢键或疏水 ，作用，会造成相应韵1 h 或1 3 c 化学位移的改变。 x 。i m 是测定晶体衍射角的一种有效方法，当主体分子被客体包埋后其特征 衍射角通常会消失进而说明主客体分子之间存在作用力。 1 。5 植物甾醇分析检测 p s 独特的生理学特性，特别是其能有效降低人体胆固醇的功能吸引了越来 越多的人对它们进行研究；对食品中p s 的分析检测也引起了人们极大的关注。 植物甾醇主要以四种形式存在于食品中，分别为自由甾醇，甾醇酯，甾醇糖， 甾醇糖酯，此为还有植物甾烷醇；因此理想的分析方法应该能上面所提到的所有 形式。但是当前的分析方法都是把所有甾醇形式当作自由甾醇来分析，这样便于 标明特定食品中自由甾醇的含量。 对食品中植物甾醇的分析国内外主要采用色谱的方法，其中毛细管气相色谱 ( g c ) 【6 4 击6 1 是最常用也是国际上公认的当今对植物甾醇分析效果最好的方法， 1 0 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 但是g c 柱温高，对毛细管柱要求较高，且对样品需要衍生化( 主要有硅烷化和 乙酸化) ；因此高效液相色谱( h p l c ) 【6 7 。7 1 】也逐渐被应用在p s 的分析上，特别 是h p l c m s ，它可以对食品体系中的p s 进行比较有效的分析，关于这方面的 研究主要集中在国外，国内对这方面的报道很少或只是以h p l c 对组分进行分 析，准确度较低。 1 5 1 样品处理 一般情况下，色谱分析食品体系中植物甾醇主要的步骤有：萃取油脂成分， 皂化，提取未皂化部分，分离或部分净化甾醇( 主要方法有固相萃取和薄层色谱) ， 对于毛细管g c 还应对净化组分进行衍生化。 植物甾醇是种不稳定的成分，因此在分析之前必须考虑样品的储存条件，研 究表明未冻干的储存在一2 0 下的样品比冻干后储存在4 下的样品更稳定；此 外为了阻止植物甾醇的氧化，在样品处理时通常需加氧化剂并通氮气 7 2 1 。 提取分析体系中的油脂成分以往主要用有机溶剂萃取，它涉及到氯仿，甲醇 等有毒有害物质的应用；随着分离技术的成熟，此方法正被固相萃取和超临界流 体萃取所逐步替代。 对未皂化组分进行分离富集p s 通常是必须的，特别是以h p l c m s 方法分 析体系中植物甾醇时，它可以有效的提高检测的准确性，消除一些干扰组分对分 析的影响。b c a n a b a t e d l a z 等人对橄榄油中p s 的研究时就以薄层色谱( t l c ) 对未皂化组分分离富集【6 9 】；r a o u lr o z 曲e 玛等人研究小麦中的p s 时也以固相萃 取对未皂化组分进行分离富梨6 8 1 。 对p s 的色谱定量分析中通常还需加入一种内标物，它可以有效的消除由于 仪器波动对分析结果带来的误差，这一点外标法定量是无法做到的。内标物在样 品处理之前直接加到分析原料中，这样某种程度上还可以补偿样品处理时所这样 某种程度上还可以补偿样品处理时所带来的误差，选择内标物的原则是分析体系 中本不含的物质，实验中首选的内标物为胆甾烷。 1 6 可能危害 p s 对水生动物具有潜在的内分泌干扰作用，实验研究表明p s 可以影响成年 金鱼类固醇荷尔蒙的分泌【7 3 1 ，j o h o n k a l l 等人研究也表明p s 能影响河鳟的 孵化时间，因此有研究人员提出p s 可以干扰人体类固醇物质( 类胡萝卜素，激素) 浙江工业大学硕士学位论文植物甾醇的改性研究 的代谢 7 4 1 。由于当今植物甾醇主要以酯化形式应用在食品行业中，评价p e 对人 体的安全性就显得非常重要，l j l e a 等人对欧洲国家中p e 的应用安全性所做的 调查研究表明：在前2 6 个星期平均镊入相当于1 8 d a y 的p s 对人体中类胡萝卜 素的含量几乎不影响，但在第5 2 个星期时，人体中0 【一胡萝卜素，b 一胡萝卜素 有明显的下降。由于这些物质的吸收是和l d l 胆固醇联系在一起的，综合分析 该情况下对人体基本无害，尽管如此，到目前为止关于p s 的儿童和孕妇的研究 还鲜见报道，有待进一步研究【7 5 】。 1 7 结论 p s 作为一种有效的降胆固醇营养素被广泛应用在食品医药行业中。随着人 们环保意识的增强，p s 提取分离中分子蒸馏技术，酶催化技术正逐步替代传统 的有机溶剂萃取；一些富含p s 的工业下脚料也被人们综合的利用，以提高其附 加值。由于p s 不溶于水，油溶性也非常低，工业上应用必需对它改性；目前对 p s 的改性研究主要其中在油溶性方面，方法是以酶法或化学法对植物甾醇进行 酯化，生成的p e 具有较好的溶解性已广泛应用在油溶性食品体系中；而关于它 的水溶性研究鲜见报道，主要也就集中在添加乳化剂以乳化分散的方法应用在水 溶性食品体系中。目前p s 的分析检测主要以g c f i d m s 为主，可以达到良好 的分离效果和较低的检测限；也有以h p l c m s 方法对原料体系p s 进行检测的， 但是效果不如g c f i d m s ，虽然它不需要对样品进行衍生化，且不需要高温环 境。关于p s 的安全性问题目前的研究表明正常剂量下对人体基本无害，