（食品科学专业论文）嗜烟碱节杆菌烟碱脱氢酶性质及其在烟草加工中的应用研究.pdf

摘要 烟碱( 尼古丁) 占烟草生物碱总量的9 5 以上。长期吸烟会导致对烟碱的依赖性而过量吸入 烟碱则会抑制中枢神经麻痹心脏，甚至有致命的危险；许多国家政府立法强制规定香烟盒上必 须标明烟碱含量以及警告消费者吸烟有害健康的宣传语。因此，在工业上利用微生物及其酶来降 解烟草烟碱，不仅对于维护人类健康有着深远的意义，而且可以改进烟气品质，提高烟e l 。资源的 利用率，有重大的经济效益。 ( 1 ) 降解烟碱菌株的筛选及鉴定：通过使用含烟碱的限制性培养基的方法，从土壤中筛选出 一株具有高效降解烟碱能力的卣抹z 3 ，根据该菌株的培养特征、生理生化特征及1 6 sr r n a 序列 分析将其命名为嗜烟碱节杆菌z 3 ( a r t h r o b a c t e r n i c o t i n o v o r a n s z 3 ) ，与嗜烟碱节杆菌( a r t h r o b a c t e r n i c o t i n o v o r a n s ) 有9 8 7 的同源性。 ( 2 ) 嗜烟碱节杆菌z 3 产烟碱脱氢酶条件优化：在摇瓶条件下，研究不同碳源和氮源对节杆菌 z 3 产酶的影响，以便优化培养基。实验结果表明，烟碱是最佳碳源，酵母提取物和( n h 4 h s 0 4 为 最佳氮源。其发酵产酶条件为：摇床转速2 2 0r m i n ，接种量5 ，初始p h7 0 ，温度3 0 ，发酵 时间4 8h 。 ( 3 ) 烟碱脱氢酶的纯化及酶学性质研究：嗜烟碱节杆菌z 3 粗酶液经硫酸铵分级沉淀、离子交 换柱层析和凝胶过滤层析等步骤分离纯化，得到电泳纯的烟碱脱氢酶。整个纯化过程其酶活回收 率为6 5 7 ，纯化倍数为“6 7 倍，酶分子最约为1 2 6k d a 。酶反虑最适p h 为7 o 最适温度为 4 0 。c 。该酶在5 0 ( 3 保温5h 后酶活力仍有6 0 以上。m n “、c o “能提高酶活力，分别是对照酶活 力的1 5 3 ： 11 2 7 。c u “对酶活力有抑制作用。酶对烟碱的k 。= 7 6 9 4 xl f f 4m o l l ，v 。= 9 9 5 1 0 。4m o l ( m i n m g ) 。 ( 4 ) 降解烟碱工程菌的构建：使用表达质粒载体p e t - 1 7 b 和表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s ，构建 降解烟碱工程菌并实现活性表达。在相同发酵时间内f 程菌产酶能力为z 3 菌的2 5 倍。并对重组 烟碱脱氢酶进行纯化，重组烟碱脱氢酶由a 、b 和c 三个砸基组成，其蛋白分子量分别为8 7k d a 、 3 0k d a 和1 5k d a 。 ( 5 ) 烟碱脱氢酶降解烟碱的条件及其降解产物的安全性评价：通过高效液相色谱法测定烟碱 含量变化，烟碱降解反应体系在n a d 、亚甲基蓝和2 , 6 二氯苯靛酚的参与下，划碱脱氢酶催化烟 碱发生了明显的降解反应，烟碱分别降解了4 8 9 2 、1 6 5 3 n1 5 6 8 。不加电子传递体烟碱不 变化，或仅有少量降解。通过动物实验和a m e s 实验证明烟碱降解产物的毒性小于划碱。 ( 6 ) 烟碱脱氢酶在烟草工业中的应用：探讨了烟碱脱氢酶在造纸法烟草薄片和白肋烟处理中 的应用方式。结果表明，在烟草薄片提取液中加入2 的烟碱脱氢酶酶液( v w ，酶浓度1 0 m g m 1 ) 及过量的n a d ，4 0 。c 下反应1 6h 后，烟碱降解率为5 0 5 8 。在加酶量1 0 m e c k g 和过量的n a d 及酶解1 2h 的条件f ，白肋烟烟叶的烟碱含量从5 8 2 降至2 8 5 。经过烟碱脱氢酶处理的烟草 薄片和白肋烟的划气品质均得到提高。 关键词：节杆菌，烟碱脱氢酶，酶学性质，烟碱，工程菌 a b s t r a ( 玎 n i c o t i n e ，a st h em a i na l k a l o i d ，i su pi o9 5p e r c e n ti nt o b a c c o s m o k i n gf o ral o n gt i m ew i l lm a k eo n e a d d i c t i v et on i c o t i n e a n di i l l l a l i l l gn i c o t i n ee x c e s s i v e l yw i l lp r e v e n tc e n t r a ln e u r o t r a n s m i t t e rf r o m t r a n s f e r r i n g ，b ep a r a l y t i ct oh e a r t ，a n de v e nb ed e a t h f u l _ s oe x a c tn i c o t i n ec o n t e n tm u s tb el a b e l e do n t o b a c c op a c k a g eb yl a wi nm a n yc o u n t r i e s ，w a r n i n gt h a t c i g a r e t t es m o k i n gi sh a r m f u lt oo n e sh e a l t h ” i n t e r e s t i n g l y , m i c r o b ea n di t sm e t a b o l i z e de n z y m ec a nd e g r a d en i c o t i n e ，w h i c hi sh e l p f u lf o rh u m a n h e a l t h i m p r o v et l l eq u a l i t yo fs m o k ea n du t i l i t yo ft o b a c c ol e a v e sa n db r i n gal o to fe c o n o m i cb e n e f i t s ( 1 ) s e l e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fam i c r o o r g a n i s me f f e c t i v et od e g r a d en i c o t i n e ：s o m es t r a i n s p r o d u c i n gn i c o t i n ed e h y d r o g e n a s eo 奶田w e r ei s o l a t e df r o ms o i lb ys e l e c t i o nm e d i u mw i t hn i c o t i n ea s t h es o l ec a r b o ns o u r c e ，a n dah i g hn i c o t i n ed e g r a d a t i o ns t r a i n ( z 3 ) w a ss e l e c t e db ye x p e r i m e n t si ns h a k e f l a s k s t h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n ds e q u e n c eo f1 6 sr r n ao ft h es t r a i n s h o w e dt h a t i tw a sa r t h r o b a c t e rn i c o t i n o v o r a n s7 3 ，a n dt h e1 6 sr r n ao ft h es t r a i na n dt h a to f a r t h r o b a c t e rn i c o a n o v o r a n sw e r e9 7 8 h o m o g e n o u s ( 2 ) o p t i m i z a t i o no fn d hp r o d u c t i o nb ya n i c o t i n o v o r a n sz 3i ns h a k ef l a s k ：n i c o t i n ew a st h e o p t i m a lc a r b o ns o u r c e ，y e a s te x t r a c ta n d ( n h , ) 2 s 0 4w e l et h eo p t i m a ln i t r o g e ns o u r c e t h ea c t i v i t yo f n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s ew a su pt ot h eg r e a t e s ta f t e rc u l t u r i n g4 8 hi nr o t a r ys h a k e r ( 2 2 0 r m i n ) a t3 0 i n i t i a lp h7 0 5 i n o c u l u mc u l t u r e ( 3 ) p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f n d h ：n d h w a s p u r i f i e d f r o m t h e c u l t u r e f i l t r a t e o f a n i c o t m o v o r a n s7 _ 3b ya m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e l f i l t r a t i o n s d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i so ft h ep u r i f i e df r a c t i o nm i t i g a t e das i m p l eb a n d ，w h i c hr e v e a l e d t h a tt h i se n z y m ew a sp u r i f i e da n dt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h i se n z y m ew a s1 2 6k d a r e s u l t ss h o w e d t h a to p t i m a la c t i v i t yo fn d ha tp h7 0 ，t e m p e r a t u r e4 0 。c d y n a m i cs t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a ti ti sa n e n z y m e w i t h k m o f 7 6 9 4 1 0 4 m o l l a n d v 99 5 1 0 一m o l ( m i n m g ) m n 2 + a n d c o “c a na c t i v a t e t h ee n z y m ea l t h o u g hc u “i n h i b i ti t ( 4 ) c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fn i c o t i n ed e h y d r o g e n a s eg e n eo f a n i c o t i n o v o r a n s ：e s c h e r i c h i ac o l i e n g i n e e r e d s t r a i nw i t h h i g hy i e l d o fn d hi so b t a i n e d n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s eg e n eo fa n i c o t i n o v o r a n sw a sc l o n e da n dc o n s t r u c t e di n t oe x p r e s sv e c t o rp e t - 1 7 b ，r e c o m b i n a n tp e t - 1 7 b n d h w a st r a n s f o r m e di n t oec o l ib l 2 1 f d e 3 ) p l y sa n dw a sh i g h l ye x p r e s s e d t h ee n g i n e e r e ds t r a i nc o u l d p r o d u c es o l u b l ea n da c t i v er e c o m b i n a n tn d h ，a n dt h ey i e l do fi t sn d h w a sa sm u c h2 5t i m e sa st h a to f 7 3s t r a i n r e c o m b i n a n tn d hw a sp u r i f i e d ，a n di ti sc o m p o s e do ft h r e es u b u n i t ( a ，ba n dc ) o f m r8 7 k d a ，3 0 k d a a n d l 5 k d a ( 5 ) c o n d i t i o no fn i c o t i n ed e g r a d a t i o nb yn d ha n ds a f e t ye v a l u a t i o no fd e g r a d i n gp r o d u c t i o n ： n i c o t i n ew a sd e g r a d e d b yn d hw i t hn a d m e t h y l e n eb l u e o r 2 , 6 d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l s u p p l e m e n t a t i o ni nr e a c t i o ns y s t e mw h i c hw a sa n a l y c e db yh p l c ，n i c o t i n ed e c r e a s i n g4 8 9 2 ，1 6 5 3 ， 1 5 6 8 ，r e s p e c t i v e l y b u tn i c o t i n ew a sn o tc o n v e n e di na b s e n c eo fe l e c t r o na c c e p t o r s a n i m a lt e s ta n d i i a m e sa s s a y i n d i c a t e t h a t t h e t o x i c i t yo f d e g r a d i n g p r o d u c t i o no f n i c o t i n e i s l e s s t h a n t h a t o f n i c o t i n e ( 6 ) a p p l i c a t i o no f n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s ei nt o b a c c oi n d u s t r y ：t h em e t h o do fr e c o n s t i t u t e dt o b a c c o a n dh u r l e yt o b a c c ot r e a t e db yn d hw a sr e s e a r c h e d w i t ht h e2 p u r i f i e dn d h ( v w , e n z y m e c o n c e n t r a t i o n1 0m 咖1 ) a n do v e r d o s eo fn a d s u p p l e m e n t a t i o na t4 0 f o r l 6h ，t h ed e c r e a s i n gr a t e o fn i c o t i n eo fr e c o n s t i t u t e dt o b a c c oe x t r a c tw a s5 0 5 8 i na d d i t i o n o f p u r i f i e d n i c o t i n e d e h y d m g e n a s ea t1 0m a k g , a t4 0 ( 2f o r1 6h ，n i c o t i n ec o n t e n to fb u r l e yt o b a c c od e g r e a s e df r o m5 8 2 t o2 8 5 t h eq u a l i t yo fr e c o n s t i t u t e dt o b a c c oa n db u f l e yt o b a c c oc a nb ei m p r o v e db yn d h k e yw o r d s ：a r t h r o b a c t e rs p ；n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s e ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；n i c o t i n e ；e n g i n e e r e ds t r a i n l i t 英文略语与译名 6 - h n ，6 - h y d r o x y n l c o t i n e ；6 一羟基烟碱 6 - h - n m m ，6 - h y d r o x y n - m e t h y l m y o s m i n e ：6 - 羟基n 甲基麦斯明 6 - h p n 6 - h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e ；6 - 羟基假氧化烟碱 2 ，6 - d h p n ，2 , 6 - d i h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e ：2 ，6 - 二羟基假氧化烟碱 2 , 6 - d h p 2 , 6 - d i h y d r o x y p y r i d i n e ；2 , 6 - 二羟基吡啶 2 , 3 6 t h p ，2 , 3 6 - 三羟基吡啶 2 , 6 - d h n - m m ，2 ，6 - d i h y d r o x y - n - m e t h y l m y o s m i n e ：2 , 6 - 二羟基- n 一甲基麦斯明 6 - h m ，6 - h y d r o x y m y o s m i n e ：6 羟基麦斯明 6 - h 3 - s p ，6 - h y d r o x y 一3 - s u c c i n o y l p y r i d i n e ：6 - 羟基- 3 琥珀酰吡啶 2 , 5 d h p ，2 , 5 - d i h y d r o x y p y r i d i n e ：2 , 5 - 二羟基吡啶 3 一s p ，3 - s u c d n o y l p y r i d i n e ；3 ，琥珀酰吡啶 n d h ，n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s e ：烟碱脱氢酶 x d h ，x a n t h i n ed e h y d r o g e n a s e ：黄瞟呤脱氢酶 f a d ，f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e ：黄素腺瞟呤二核营酸 n a d ，n i c o t i n a m l d ea d e n i n ed i n u e l e o t i d e ：烟酰胺腺磲呤二核苷酸 6 - h l n o ，l - 6 - h y d r o x yn i c o t i n e o x i d a s e ；l - 6 一羟基烟碱氧化酶 6 - h d n o ，d - 6 - h y d r o x yn i c o t i n e o x i d a s e ：d 6 羟基烟碱氧化酶 k d h ，k e t o n ed e h y d r o g e n a s e ：酮脱氢酶 2 , 6 - d h p h ，2 , 6 一d i h y d m x y p y r i d i n e 一3 - h y d r o x y i a s e ：2 ，6 一二羟基吡啶一3 一羟化酶 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ；乙二胺四乙酸 k m ，m i c h a e l i sc o n s t a n t ：米氏常数 s t a ，s i l i c o nt u n g s t e na c i d 硅钨酸 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：跏j ，年f 月夕曰 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：乙刀，年，月尹日 辫嬲 中国农业大学博士学位论文第一章绪论 1 1 研究的目的及意义 第一章绪论 烟碱即尼占j 佃i c o t i n e ) 化学名称1 - 甲基2 ( 3 一吡啶基) 吡咯烷【l j 。 在烟草中天然存在的只有l 型烟碱印j ，合成的烟碱是d l - 型消旋体1 4 1 。纯净的烟碱基本是 无色或微带黄色液体，有辛辣感。其沸点为2 4 7 c ，比重1 0 0 9 ( 2 0 。c ) ，具有潮解性，6 0 以下 能与水以任何比例互溶。烟碱与水蒸气一起挥发蒸馏，因而可以片j 水蒸气蒸馏法从碱性溶液中蒸 出烟碱1 5 i 。 烟碱不仅易溶于水，还可以溶于许多有机溶剂，如四氯化碳、氯仿、乙醚、苯、煤油、三氯 乙烯和三氯乙烷等，都能很好地溶解烟碱。在阳光下易分解1 6 】，颜色变深，并有特殊的烟臭味。 烟碱是由两个氮杂环构成的化合物，其中一个是毗啶环，此环中的氮原子由于芳香化的结果， 与芳胺的碱性相近，它的碱性很弱。而烟碱分子中的另一氮杂环，属于吡咯环，此环中的氮原子 还连接着一个甲基，其属叔胺，由于此环没有芳香化，其碱性与脂肪族叔胺碱性相近。即烟碱中 含有两个碱性相差很大的碱性基团，不过与强无机碱相比它们都是弱碱，在强碱作用下很容易 被分离出来。烟碱可和酸反应生成盐 7 t ，如形成硫酸烟碱和硅钨酸盐等。 烟碱分子中，吡啶环由于芳香化的作用，比较稳定，反应活性比较低，而吡咯环由于没有芳 香化，比较不稳定易发生反应，当受紫外光照射或浓硝酸作_ h j 时，易被氧化。因此，烟碱的降 解在多数情况下先打开吡咯环。 烟碱是烟草生物碱中的主要成分，占烟草生物碱总量的9 5 以上。在烟草中，烟碱大部分是 以有机酸盐( 如柠檬酸和苹果酸盐) 的形式存在，也有少量的以自由状态存在。烟碱进入人体内， 9 0 被肺部吸收，进入血液后6 秒内即可到达大脑p 】。烟碱对人体最显著的作用是对交感神经产 生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制。烟碱的作用除了增加烟味和感到刺激外，土 要还在于它所产生的生理强度，通常称为“劲头”，所以人类长期保持着吸食烟草的习惯。一般 来讲，烟碱含量高的烟叶，烟气劲头大，反之则小。因此，烟气中含有一定量的烟碱对吸烟者来 说似乎是必需的，但烟碱的含量也不能过高，否则不但会增加烟气的刺激- 陛，而且会影响卷烟吸 味。 然而，长期吸烟会导致对烟碱的依赖性，而过量吸入烟碱则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚 至有致命的危险1 1 i ；在吸划过程中烟碱还会被砸硝化，生成烟草中特有的强烈的致癌剂亚硝胺 ( t s n a ) 7 】：烟碱也是一种环境有毒物质，烟气环境中就含有人量的烟碱，同时烟草加丁过程也会 产生许多含高浓度则碱等生物碱的废物，这种废物被认为是“有毒的危险废物”1 9 1 。 卷烟燃烧后产生的划气是一种气溶胶，分为气相部分和粒相部分【l ”1 。气相部分约占整个烟气 重量的9 2 ，其中包括有机物和无机物的蒸汽，过量的氮气( 约5 8 ) 、氧气( 约1 2 ) 、二氧化碳 f 约1 3 ) 、少量的碳氢化合物、含氧化合物以及其它成分，并且含有具有生物活性的物质。粒相 部分约占整个魁气重量的8 ，主要由划碱、焦油和水份组成。焦油是卷划中有机物质在缺氧条 件下不完全燃烧产生的，焦油是多种烃类及烃的氧化物、硫化物和氮化物的复杂混合物。 烟气中的有害成分约占总量的0 6 ，在这0 6 的有害成分中，其中0 2 为致癌和可能致癌 中国农业大学博士学位论文第一章绪论 的成分，o 4 为辅助致癌成分【”l 。卷烟烟气气相中的有害成分主要有一氧化碳、氢氰酸、挥发 性的醛类物质、挥发性的亚硝胺、氯乙烯、氮氧化物、氨、吡啶和气相自由基等1 1 ”。卷烟烟气粒 相中的有害成分除烟碱外，焦油中包含的有害成分最多，如烟草特有亚硝胺、异质环状胺、萘胺、 其他亚硝胺类、苯并f a l 芘等稠环芳烃类、单元酚及多元酚类( 如儿茶酚) 、固相自由基、* b 2 1 0 、铀、 镍、镉等1 1 “。 目前认为烟气中的焦油和烟碱都是主要的有害成分，这就是为什么许多国家政府立法强制规 定香烟盒上必须标明焦油和烟碱含嚣以及警告消费者吸烟有害健康的宣传语的缘故。因此有效地 控制卷烟和环境中的烟碱的含量，对于维护人类健康有着深远的意义。 从2 0 世纪5 0 年代开始人们对“吸烟与健康”问题的认识也逐步加强，世界范围内的吸烟与健 康，研究发展很快【1 3 1 。1 9 7 0 年以前，关于吸烟与健康的论文有1 4 5 0 0 多篇 1 4 , 1 5 t 。而从1 9 7 0 年到2 0 0 0 年的3 0 年间，研究人员发表了超过1 0 万篇的论文，研究向更高水平发展。在大量的研究论文中， 美国科学家霍夫曼等发表的关于卷烟烟气中4 4 种有害成分的确定，即著名的霍夫曼清单对当今 降低卷烟有害成分的研究起到了较大推动作用。 世界卫生组织从开始的广+ 泛宣传“吸烟有害健康”，逐步发展到集中专门力量，开展全球范围 的控烟工作。烟草控制框架公约就是控烟工作的产物。2 0 0 3 年5 月，第5 6 届世界卫生大会通 过烟草控制框架公约，其主旨是要对全球划草的生产经营实行严格的控制，各国均表示支持。 中国是文明大国和烟草生产人国，政府已经签署了该烟草控制框架公约。但是在重视烟草对 公众健康造成危害的同时，比较多地关注控烟对经济和社会等多方面所产生的影响。 烟草产业在国民经济中r 与有重要的地位，经济效益每年以两位数的增长率增加。如2 0 0 4 年烟 草行业全年累计实现= 商税利2 1 0 0 亿元，比上年增女1 1 4 5 0 4 l 元，同比增长2 6 ，其中实现工商税 金1 4 1 4 亿元，比上年增) 1 1 2 2 5 亿元，创历史最好水平。但是，吸烟与健康是烟草行业在生存过程 中面临的主要挑战之一，以关注公众健康、促进和谐发展、维护消费者利益、实现可持续发展为 宗旨，把握“高香气、低焦油、低危害”原则，开展降低卷烟烟气主要有害成分技术及综合降焦技 术研究，在生物材料、生物技术开发干用等新材料、新工艺、新技术方面取得突破构筑降焦减 害综合配套集成技术平台，培育中式卷烟代表品牌，已成为我国烟草科技工作的主攻方向。尽管 近年米我国部分烟区的烟叶外观质量已接近国际水平，但就其内在质量而言还有一定著距，其中 一个较普遍且较突山的问题就是烟碱含量偏高。目前，我国烤烟烟碱含量偏高，尤其上部烤烟更 加明显，划碱达n 3 一4 ，白肋烟烟碱含鼙甚至高达6 1 1 6 1 ，而美国烤烟的烟碱含量在1 5 - - 3 5 之间其白肋烟的烟碱含量约2 9 1 7 1 。一般优质白肋烟的烟碱含量在1 5 一4 0 之间，以3 o 为 佳。国内卷烟企业目前贮存的上部烤烟较多，囚其烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中，这 个问题已引起有关方面的重视。如何降低这些烟叶中的烟碱含量是各卷烟企业所面临的现实问 题，而当前国内研究较多的是通过滤嘴过滤、打孔稀释及使用烟草薄片等物理措施降低烟碱含量 但是这些方法会造成烟香气的损失。 因此，在t ：业上开展利片j 微生物处理来降解烟碱，这种方法不会造成烟香的损失，还可以改 进划气品质，可以提高烟叶资源的利用率，有研究开发价值，会产生重大的经济效益和社会效益。 2 1 2 微生物降解烟碱的研究进展 1 2 1 降解烟碱微生物的种类 早在1 9 4 8 年f r a n k e n b u r g 1 s 首先在( s c i e n c e 上发表了他的重要研究成果，指出在雪茄烟 叶的自然发酵过程中有相当数量的烟碱降解了。他连续做了多年的实验研究b 9 - 2 q ，试验取不同年 份的宾夕法尼亚州雪茄烟分为4 个实验组，每组测定3 0 个样品，结果如表1 - 1 ，发现烟碱降解的 范围在6 9 4 ，平均降解了约5 0 。之后发现烟碱生成了3 取代吡啶化合物，如3 吡啶基烯酮、 2 , 3 二吡啶和烟酸，由此开创了烟碱生物降解的研究领域，得到许多生物学家的重视和积极参与， 至今仍有一批研究人员活跃在这个研究领域。现在已经分别从烟叶、烟草种子以及土壤中分离到 数种可代谢烟碱微生物。 表1 - 1 各组宾夕法尼亚州雪茄烟叶发酵后烟碱含量降低情况1 1 8 i t a b l e1 - 1d e c r e a s e o f n i c o t i n ec o n t e n t so f p e n n s y l v a n i a c i g a r t o b a c c o f o r v a r i o u s c r o p sa f t e r f e r m e n t a t i o n w a d a ”】最早用假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 研究烟碱降解的途径，烟碱吡咯环上的甲基氮被氧 化生成假氧化烟碱，随后将从土壤中分离出来的假单胞菌第4 1 小种对烟碱溶液进行了2 4h 处 理，结果烟碱含晕大幅度降低溶液的p h 值由6 4 降至4 6 。但由于p h 值的降低和菌落数 的增大，烟碱的分解停止，约有3 5 的烟碱未发生降解； g i o v a n n o z z i m ”，3 “1 应用d e h a r y o m y c e s n i c o t i a n a e 、m i c r o c o c c u sn i c o t i a n a e 和a r t h r o b a c t e ro x i d a n s 三种菌株的培养液对烟草进行工业 发酵处理的试验结果表明，这三种菌液除了能够改善烟草的风味和香气外，烟草的烟碱含量降低 了；e n d e r s 【3 1 】发现酵母菌也能降解培养基中的烟碱。b r o w n & w i l l i a m s o n 烟草公司【3 2 i 开展了利 用纤维单胞菌来降低烟草中烟碱和硝酸盐含量的研究。m a e d a 等娜1 研究了利用米源丁烟叶表面 的细菌来降解烟碱一n 氧化物。u c h i d a 等p 4 还利用0 2 烟碱作为唯一碳源的培养基，从烟田土壤 和烟叶表面上分离出能够降解烟碱的细菌经过鉴定这些细菌为争论产碱菌臼l c a l i g e n e s p a r a d o x u s ) 和球形节杆菌( a r t h r o b a c t e r g l o b i f o r m i l s ) ，若培养基中有葡萄糖存在，它会具有较高 降解烟碱活性，但在烟碱浓度为0 5 条件下该菌的生艮会受剑抑制，把争论产碱菌液喷洒到潮湿 的烟叶上后，5d 内没有产生明显的降解，但若同时在培养基中加入葡萄糖，则在2d 之内就会 产生明显的降烟碱效果。g u t i e r r e z 等p 5j 从干烟叶表面分离出一种能够降解烟碱的菌株，经鉴定 为阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) e 1 5 0 。在含有烟碱( 小y - 5 9 l ) 的培养基中( 3 4 。c 、p h7 条件下) 进行发酵的过程中，该菌降解烟碱的能力得到诱导。另外，这种细菌还能代谢烟酸，但不 3 能降解去甲基烟碱和新烟碱。t a s h i r o 等i ”】从4 4 个含有烟碱的土壤和废水中获得5 7 种细菌，这些 菌都呈短棒状，用烟碱作为唯一碳氮源，在两周内能降解浓度为1 o x l 0 。g m l 的烟碱a 表1 - 2 从土壤和陈化烟叶中分离鉴定的能罅有效降解烟碱的微生物 4 f r a n c o i s 等在n i c o t i a n ap l u m b a g i n i f o l i a 细胞悬浮培养液中加入等量d - 烟碱和l - 烟碱， 中国农业大学博士学位论文第一章绪论 通过g c 和h p l c 分析发现前者比后者降解更迅速。r a t h b o n e 等【3 8 j 对烟碱微生物代谢迸行研 究，发现一些新化合物和中间产物，可以用作新药的合成或药物的改进。王革等【3 9 1 从烟叶上分离 获得了3 株降解烟碱和蛋白质能力较强的菌株，用于降解的微生物不同，烟碱的降解产物也不同。 f r a n k e n b u r g 等1 4 0 用3 种烟籽表面的微生物降解烟碱的研究均表明，烟碱降解生成了甲酰胺、氨、 草酸以及微量的丙二酸和琥珀酸。c a s i d a 等1 4 1 1 从烟叶中分离出可将烟碱氧化成y 氨基丁酸的细 菌，他们认为，这种菌先作用于烟碱的吡啶环，获得谷氨酸，然后使其脱羧。g i o v a n n o z z i l 4 2 j 从烟 叶仓库中分离出一种烟草节细菌，该菌可在烟碱一琼脂上大量繁殖并使烟碱降解，其降解产物为黄 色，随后又变成深的类似葡萄酒的红色。 1 2 2 微生物降解烟碱的机制 在早期的研究中，f r a n k e n b u r g , w v a i t e k u n a s t 6 l j 利用从烟草种子中分离的微生物降解烟碱的实 验发现，烟碱可以通过不同的途径被降解，包括吡啶环和吡咯环被进攻。这个发现被后来使用各 种不同的微生物降解烟碱的实验所证实。总之，可以降解烟碱的微生物多数能以烟碱作为唯一碳、 氮源进行生长，它们主要通过四种不同的途径代谢烟碱： 第一种为节杆菌属细菌中存在的吡啶途径( p y r i d i n e p a t h w a y ) ( 图1 - 1 ) 该途径从烟碱吡啶环的6 位羟基化开始，然后毗咯烷被氧化脱氢并自发水解打开，接着毗啶 环通过羟基化被打开； h o c h s t e i n , 和r i t t e n b e r g t 6 4 , 6 5 j 研究了菌种p 3 4 转化烟碱的情况，发现先生成6 羟基烟碱 ( 6 o h n ) ，进一步通过吡咯环脱氢形成6 羟基n 甲基麦斯明( 6 一h y d m x y - n m e t l l y l m y o s m i n e ) 。 l m o l 烟碱转化成6 一羟基烟碱需要0 5 m o l 氧，可是，产物中包括1m o l 氧，这表明氧来源于水而非 分子氧【6 6 1 。 m a e d a 等【6 ”报告另一种细菌j t s 0 0 0 6 代谢烟碱的方式与菌种p 3 4 类似，在培养基中先后 生成6 羟基烟碱、6 一羟基n 甲基麦斯明和6 羟基假氧化烟碱( 6 h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e ) 。 h o c h s t e n 和d a l t o n l 6 7 分离的氧化节杆菌( a r t h r o b a c t e r o x i d a n s ) 能将水分子中的氧结合到烟 碱中生成6 羟基烟碱。这是有水合功能的氧化酶起的作用。6 - 羟基假氧化烟碱已经在6 羟基烟 碱被进步氧化之后分离得到【6 5 j 。6 - 羟基假氧化烟碱进一步氧化后生成2 , 6 二羟基假氧化烟碱 ( 2 ，6 一d i h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e ) 1 6 8 , 6 9 1 。2 ，6 - 二羟基假氧化烟碱转化成2 , 6 二羟基吡啶( 2 , 6 d h p ) 和y 甲氨基j 酸( y m e t hy 】a m j o b u t y r i c ) 4 9 1 。一个单一酶催化2 ，6 二羟基吡啶生成2 ，3 ，6 三羟基 比啶 t q 。在氧存在和没有催化酶的情况下，这个三羟基吡啶迅速自动氧化形成蓝色素。在氧化1 ， 杆菌粗酶存在下，蓝色素不能形成而2 ，3 ，6 三羟基吡啶被裂解酶转化成琥珀酸“。2 , 6 二羟基吡 啶生成琥珀酸至少需要两个酶，即氧化酶和裂解芳香环的酶( 图1 - 1 ) 。 2 , 6 二羟基假氧化烟碱作为6 羟基假氧化烟碱的不稳定的中问产物，在缺少适当酶组分情况 卜- 形成2 , 6 二羟基n 甲基麦斯明( 2 , 6 d i h y d r o x y n m e t h y l m y o s m i n e ) 6 s , 6 9 , 4 9 1 。2 , 6 二羟基一n 甲 基麦斯明不再进一步代谢，它好象是烟碱降解过程中由于不完全的酶体系而产生的新陈代谢人造 品1 6 8 , 6 9 。 w a d a 7 1 , 7 2 发现假单胞菌既能代谢烟碱也能代谢降烟碱( n o m i c o t i n e ) 。降烟碱与烟碱的区别在 于1 何上的结构不同( 降烟碱为h ，烟碱为c h 3 ) 。在降烟碱的降解途径中，从培养基中已经鉴 5 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 定山6 - 羟基麦斯明( 6 一h y d r o x y m y o s m i n e ) 和6 - 羟基- 3 - 琥珀酰吡( 6 - h y d r o x y - 3 - s u c c i n o y l p y r i d i n e ) 。 6 - 羟基麦斯明的形成表明假单胞菌的代谢途径包含了芳香环的羟基化作用优先于生成假氧化烟 碱。这也说明同一种细菌以不同的途径来降解烟碱。 6 骂。卿 。d q 6 一羟摹娴碱 6 乎至基假氧化炳碱6 一羟基一n 一甲基麦斯明 。，i ：。h i 来知酶l 。：肿h o o c ( c h , ) , n 酸h c h _ 。9 “ 2 ，6 一二羟摹毗啶 3 , 6 一d h p hi 2 , 3 ，6 一二羟基吡啶 非酶反心 2 , 5 一二羟基毗啶 s t r a l np 3 4 s t r a i n j t s - 0 0 任 马米酸蓝色素 4 o x y d a n s 图1 - 1a t h r o b a c t o ro x y d a n s 降解烟碱的途径【4 9 1 1 f i g 1 - 1p r o p o s e dp a t h w a yf o rt h em e t a b o l i s mo f n i c o t i n eb y a t h r o b a c t o ro d d n d h ，烟碱脱氢酶：6 h n o ，6 - 羟基烟碱氧化酶： k d h ，酮脱氢酶：2 , 6 一d h p h ，2 6 - - 二羟基- 3 羟基化酶。 一一嚆 烟碱 n 一甲基麦斯明 假氧化烟碱 p 小。 。八。 6 羟基3 琥珀酰吡啶3 - 琥珀酰吡啶 j 图1 - 2 p s e u d o m o n a s p u t i d a 降解烟碱途径6 2 , 6 3 f i g 1 - 2p r o p o s e dp a t h w a yf o rt h em e t a b o l i s mo fn i c o t i n eb yp s e u d o m o n a ss p a n dj t s - 0 0 0 6 第二种为以假单胞菌属细菌为代表的吡咯途径( p y r r o l i d i n e p a t h w a y ) 该途径从烟碱的吡咯烷被脱氢而打开开始，然后通过羟基化打开吡啶环( 图1 - 2 ) ； 有儿种微生物通过首先修饰吡咯环来转化烟碱( 图1 - 2 ) 。g h e m a u r i t t e n b e r g 6 3 , 7 3 】报道假单 胞菌能够氧化烟碱、n 甲基麦斯明、假氧化烟碱、3 一琥珀酰吡啶及3 琥珀酰6 羟基吡啶。假单 胞菌细胞适应烟碱也同时适合2 ，5 二羟基吡啶( 2 , 5 一d i h y d