（食品科学专业论文）油茶籽壳活性物质的提取及抗氧化、抑制脂肪酸合酶机理初探.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 中国是世界上山茶科植物分布最广的国家，是世界上最大的茶油生产基地，油茶栽培 历史有2 3 0 0 年以上，是我国特有的油料树种。由于自然生长在山区，野生山茶果从开花结 果到采摘，历经1 2 个月，生长周期极长，素有“抱子怀胎，之称，营养价值很高。我国的油 荼资源十分丰富，据统计，全国有油茶3 6 6 7 万h m 2 ( 5 5 0 0 万亩) ，每年产油1 5 0 万吨，这 将带来1 0 0 0 多万吨的油茶轷壳。如此庞大的数量，若能加以有效利用，将能产生巨大的经 济效益。但长期以来，并没有把其中的活性物质单独分离出来作为研究对象。根据目前油 茶籽壳所呈现的抗氧化性，可预期油茶耔壳中必定含有一些特殊的天然活性成分，所以有 必要区分其主要活性物质，明确阐明其抗氧化功能及探讨对脂肪酸合酶的抑制作用。 本文首先对油茶耔壳中总黄酮类物质的测定及乙醇提取工艺进行了研究，探讨了影响 提取率的主要因素，最后通过正交试验确定了最佳提取工艺，结果表明：在3 0 倍于样重的 6 0 的乙醇浸泡3 0 r a i n 后，4 0 下超声波辅助萃取4 5 r a i n ，连续提取2 次，黄酮的总浸出率 可达9 7 3 4 ，油茶籽壳中的黄酮含量为1 7 1 。 为了考察油茶耔壳提取物的抗氧化性能，本研究通过d p p h 法，f r a p 法，清除t o h 能 力三个体系，以竹叶提取物、v c 为对照研究了油茶耔壳提取物体外清除自由基的能力及还 原能力。4 0 z , 醇提取物在清除d p p h 自由基的实验中显示出了良好的效果，其i c 值为 7 8 1 9 9 m l ，略低于对照物竹叶提取物8 5 9 9 9 m l 明显低于其他各相提取物；在f r a p 的测 试体系中，水提物的f r a p 值为1 7 9m m o l l ，还原能力与竹叶提取物相当，但低于v c ；在 清除o h 体系中，4 0 z - 醇提取物、纯乙醇提取物与竹叶提取物在浓度为5 0 0 p g m l 时对o h 清除率相当，分别为3 2 8 ，3 8 1 ，4 0 9 0 , 6 ，但低于对照品v c 。 通过h p l c 分析表明：油茶籽壳中含有黄酮类物质槲皮素与芦丁，含量分别为 4 2 5 m g k g ，1 4 7 8 5 m g k g 。此外，通过测定提取物对脂肪酸合酶( f a s ) 的快结合抑制作用 与慢结合抑制作用我们还发现，油茶籽壳提取物对f a s 具有很强的快结合可逆抑制作用， 油茶籽壳4 0 乙醇提取物对f a s 的快结台抑制的半抑制浓度为2 0 2 p g m l ：而油茶饼提取 物则具有慢结合不可逆抑制作用，在0 3 1 m i g m l 浓度下2 m i n 内失活超过8 5 。预计为新的 抑制剂，对研究f a s 的作用机理与防治肥胖症可能具有重要的研究价值。 关键词：油茶耔壳，黄酮类化含物提取工艺，抗氧化，h p l c ，脂肪酸合酶 浙江大学硕士学位论文a b s t r a ( j r a b s t r a e t c h i n ai st h el a r g e s tc a m e l l i ao i lp r o d u c t i o nc o u n t r y c a m e l l i ao l e i f e r aa b e li sas p e c i a lo i l s p e c i ew h i c hh a sah i s t o r yo f 2 3 0 0y e a r si no u rc o u n t r y i ti se s t i m a t e dt h a tt h e r ea 3 6 6 7 0 0h m 2 c a m e l l i ao l e i f e r aa b e lw h i c hp r o d u c e1 , 5 0 0 ，0 0 0 ，0 0 0 k gc a m e l l i ao i le v e r yy e a rb u ta l s ol e a v eu s 1 0 ，0 0 0 , 0 0 0 ，0 0 0 k gc a m e l l i as h e l la tt h es et i m e s oi f w ec a nm a k eg o o du s eo f i tw em a yg e t m u c hb e n e f i ta n dc r e a tm o r ee c o n o m i cp r o f i t s b u ti nal o n gt i m el i t t l ee f f o r ti sd e v o t e dt o i d e n t i f ya n di s o l a t et h em i n o rp o t e n t i a le h e m o p r e v e n t i v ea g e n t sp r e s e n ti nt h es h e l lo fc a m e l l i a o l e i f e r aa b e la n da s s e s st h e i rp r o p e r t i e s ，d u et oi t st r a c ea m o u n ta n dc o m p l e x i t y t h eo b j e c t i v eo f t h i ss t u d yw a st oi s o l a t ea n di d e n t i f yt h eb i o a c t i v ec o m p o u n d so f t h ee x t r a c to f c a m e l l i as h e l la n d t oc h a r a c t e r i z et h ea n t i o x i d a n tp r o p e r t i e sa n da s af a si n h i b i t o ro f t h e s ec o m p o u n d s t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so ft o t a lf l a v o n e sf r o mt h es h e l lo fc a m e l l i ao l e i f e r aa b e w e r es t u d i e d t h eb e s tc o n d i t i o n sw g r ec h o s e nt h r o u g ho r t h o g r a p h i ce x p e i i m e n t s t h er e s u l t s s h o w e dt h a t3 0 ：lo f6 0 e t h a n o lw a su s e dt od o u s et h ed r i e dt h es h e l lo fc a m e l l i ao l e i f e r aa b e w i t hu l t r a s o n i ct r e a t m e n tl a s tf o r4 5 r a i nt w i c e t h ea v e r a g ee x t r a c t i o nr a t ew a sa sl l i g ha s9 7 ，3 4 t h ec o n t e n to f f l a v o u e si nt h ee x t r a c t i o nl i q u i dw a sa sh i g ha s1 7 1 t oe v a l u a t et h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s ，w eu s e st h r e es y s t e m sl i k e d p p h ，f r a pa n d o h s c a v e n g i n gc a p a b i l i t y r e s u l t ss h o w st h a ti nd p p hs y s t e mt h e4 0 0 , 6e t h a n o le x t r a c th a v eag o o d a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ，i t si c s oi s7 8 1 t g m l ，l o w e rt h a nb a m b o oe x t r a c tw h i c hi c i s8 5 9 9 9 m la n d o b v i o u s l yl o w e rt h a nt h eo t h e re x t r a c t ；i nf r a ps y s t e m ，t h ef r a pv a l u eo f w a t e re x t r a c ti s1 7 9 m m o l lw h i c hi sv e r yc l o s et ob a m b o oe x t r a c tb u tl o w e rt h a nv e ；i n o hs c a v e n g i n gs y s t e m ， w h e na l lt h ee x t r a c tu n d e rt h e5 贼, m l , s c a v e n g i n gr a t ef o r4 0 e t h a n o le x t r a c le t h a n o le x t r a c t a n db a m b o oe x t r a c ti s3 2 8 ，3 8 1 ，4 0 r e s p e c t i v e l y ，b u tl o w e rt h a nv c h p l ca n a l y s i ss h o wt h a tc a m e l l i as h e l lm a yi n c l u d eq u e r c e t i na n dr u t i n , w h i c hh a sa c o n t e n to f4 2 5 m g k ga n d1 4 7 8 ，5 m g k gr e s p e c t i v e l y e x p e r i m e n t sa l s os h o wt h a tt h ee x t r a c lo f c a m e l l i as e e ds h e l l ( c s s ) i n h i b i t e df a sa c t i v i t yw i t hs t r o n gr e v e r s i b l ef a s t - b i n d i n gi n h i b i t i o n ， 4 0 烈h a n o lw a st h eo p t i m a ls o l v e n tf o re x t r a c t i o n ，h a l f i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n ( 1 c 如) o f c s st o f a so v e r a l lr e a c t i o nw a s2 0 2 i _ t g m l ，w ea l s of o u n dt h ee x t r a c to fc a m e l l i as e e dr e s i d u e ( c s r ) i n h i b i t e df a sa c t i v i t yw i t hi r r e v e r s i b l es l o w b i n d i n gi n h i b i t i o n i nt h ep r e s e n c eo f o 3 1 m g m lo f s c rt h ei n h i b i t i o nl e dt oo v e r8 5 a c t i v i t yl o s s t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tf a si n h i b i t o ri n n 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t c a m e l l i as e e dh a das t r o n g e ri n h i b i t i o na b i l i t yt h a nt h ek n o w ni n h i b i t o r s i ti se x p e c t e dt ob ea n e we f f e c t i v ef a si n h i b i t o r , a n dm a yb eo fg r e a tv a l u ef o rt h es t u d yo ff a sm e t h a n i s ma n dt h e c o n t r o lo f o b e s i t y , k e y w o r d g ：c a m e l l i as e e ds h e l l ；f l a v o n e s ；e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ；a n t i o x i d a n t ；h p l c ；f a s i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎姿盘茎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期： 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘鎏盘茎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权迸鎏盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：年月日签字日期： 年月日 浙江大学硕士学位论文第一章引言 第一章引言 中国是世界上山茶科植物分布最广的国家，是世界上最大的茶油生产基地，除此之外 只有东南亚，日本等国有极少量的分布”j 。油茶的中心产地则分布在我国的西南及湘、赣南 部的山地丘陵，其栽培历史有2 3 0 0 年以上，是我国特有的油料树种。我国栽培的油茶主要 有以下几种，普通油茶，约占油茶总面积的9 8 ，其次为分布于浙江省的浙江红花油茶、 广东省的南山茶、云南省腾冲的红花油茶等由于自然生长在山区，野生山茶果从开花结 果到采摘，历经1 2 个月，生长周期极长，索有“抱子怀胎”之称，营养价值很高由油茶 耔加工成的山茶油，其所含单不饱和脂肪酸为天然植物油之首，被盛赞为东方的“橄榄油”。 国际粮农组织已经将其列为重点推广的健康食用油。西方国家近年来也选用山茶油来替代 橄榄油。 油茶果实称为“茶果”，它由茶蒲和种子( 1 4 粒) 两部分组成。种子即油茶籽，它包 含在茶蒲中，其重量约占茶果的3 8 7 - - 4 0 0 。油茶籽为双子叶无胚乳种子，外形呈椭圆 形或圆球形，背圆腹扁，长约2 5 c m ，含有丰富的皂素，它由种仁( 即茶仁) 和种皮( 即茶 壳) 两部分组成。茶仁为淡黄色，仁中含有脂肪、粗蛋白、租纤维、皂素、无氮浸出物等。 油茶壳占茶果重的3 0 6 - 3 4 o ，含较多色素，呈棕黑色，极其坚硬，主要由半纤维素( 多 缩戊糖) 、纤维索和木质素组成，此外还含有一定量的多酚类抗氧化活性物质。到目前为止， 已认为许多疾病的发生与转归都与自由基有关，尤其是非病毒性和非细菌性的疾病，特别 是退化性的疾病。即使是病毒性和细菌性疾病，虽然病原不是自由基，但自由基也在其中 起着推波助澜的作用。 植物多酚( p l a n tp o l y p h e n 0 1 ) 又名植物单宁( v e g e t a b l et a n n i n ) ，为植物体内的复杂酚 类次生代谢物，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶、果中，在植物中的含量 仅次于纤维素、半纤维素和木质素。植物多酚是天然的抗氧化活性物质。多酚类化合物的 抗氧化作用是向脂质过氧化自由基( l o o ) 提供一个电子( 氢) 而使之成为较稳定的过氧 化脂质( l o o h ) ，而自身则成为酚氧化自由基或其同系物质。 黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布的多酚类天然产物。泛指两个具有酚羟基的苯 环( a 与b 环) 通过中央三碳原子( c 环) 相互连接构成的一系列化合物，用c 6 - c 3 6 表示。在植 物体内多以磷离态或与糖结合成瞢的形式存在，从合成途径分析，这类物质是植物在长期 自然选择过程中产生的二级代谢产物，是许多药用植物的主要活性成分。研究表明，黄酮 浙江大学硕士学位论文第一章引言 类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病、抗炎，抗病毒、免疫调节等多种生理功能 及药理作用。虽然现在开发了许多人工合成的抗氧化剂，像b h a ，b h t ，t b h q 等，但许多天 然的植物中含有多量的酚类抗氧化剂且抗氧化效果甚至比人工合成的还要好。未来的发展 应该是寻求较佳的萃取方法获得这些天然抗氧化剂，以期符合食品自然健康的形象。 本研究以油茶耔壳为试验材料，主要探讨下面几个问题：( 1 ) 油茶籽壳中总黄酮提取 的工艺优化；( 2 ) 油茶耔壳提取物的抗氧化活性；( 3 ) 油茶籽壳中提取物的活性成分( 化 合物提取及其鉴定) ；( 4 ) 油茶耔壳提取物对f a s ( 脂肪酸合酶) 的抑制作用。 2 浙江大学硕士学位论文第二章文献综述 第二章文献综述 2 1 天然抗氧化剂的研究概况 2 1 1 自由基概述 自由基又称游离基，系外层轨道含有未配对电子的原子、原子团或特殊状态的分子的 总称，是携有单电子的、活性极高的化学质点。自由基是机体正常代谢的产物，人体组织 中许多生化反应的中间代谢物都伴随有自由基，自由基极易引起化学反应。自由基中以氧 自由基( o x y g e nf r e e r a d i c a l s ，o f r ) 对机体的危害最大。o f r 包括超氧阴离子自由基( 0 2 - ) ， 羟基自由基( o h ) 。过氧化氢( h 2 0 2 ) 及单线态氧( ( 1 0 2 ) 等。 自由基是引起机体损伤的化学物质，脂质过氧化一度被定义为一定的氧化压下形成的 自由基所引起的生物伤害。自由基对生物机体的损伤主要有：( 1 ) 对生物组织和代谢的直 接伤害；( 2 ) 引起生物机体的衰老加快；( 3 ) 导致食品发生质变。生物体内存在着清除 自由基的物质，主要包括两大类，一是抗氧化酶类，主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过 氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o x ) 及谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 等：二是非酶类抗氧 化剂，主要有维生素e 、维生素c 、谷胱甘肽( o s h ) 、b 一胡萝 素等。另外还可通过食用具 有清除自由基功能的保健食品和清除剂来清除人体多余的自由基。它们的主要功能性成分 即为人体各种营养索如维生素c 、b 一胡萝h 素、以及与抗氧化防衰老有关的黄酮、花色素及 抗氧化酶类。耳前临床应用机率最大的自由基清除剂是甘露酵、超氧化物歧化酶、过氧化 氢酶，某些自由基清除剂对再灌注心律失常有一定防治作用。 2 1 2 抗氧化作用的生物学意义 抗氧化活性物质通过抑制自由基的产生、清除、熄灭自由基来抑制自由基参与的过氧 化反应即为抗氧化作用( a n t i o x i d a t i o n ) 。抗氧化物质主要抑制活性氧的产生，抑制过氧化氢 的生成，减少d n a 的氧化损伤，抑制脂质过氧化。其主要的作用机理为：熄灭自由基通过提 供活性基团，作为供氢体与自由基反应，使之形成相应的离子或分子，熄灭自由基，终止 自由基的链式反应：促进抗氧化酶活性的提高，如大豆异黄铜对小鼠抗氧化酶活性有较强 促进作用；降低膜的流动性，从而降低自由基在脂质双层中的流动性，阻止自由基的渗入， 减慢自由基反应，达到抑制脂质过氧化作用”1 ；增加抗氧化蛋白如金属硫蛋白( m t ) 的表 浙江大学硕士学位论文 第二章文献综述 达“1 ；螯合金属的作用，如异黄酮类化合物抗金属离子诱导的过氧化作用，很可能就是由于 它们与金属离子的螯合作用所致”。 抗氧化作用主要应用于医学上某些疾病的治疗、营养保健、食品保鲜等领域。j a c o b ”1 报道了生物体内抗氧化保护系统。包括内源性抗氧化剂、食用抗氧化剂、金属蛋白和自由 基屏蔽酶。内生抗氧化剂有n a d p h 及n a d h ，谷胱甘肽、辅酶q 、尿酸、金属酶等。其中 谷胱甘肽在自由基、抗氧化剂与营养素及其代谢平衡关系中起到很重要的作用。 2 1 3 天然抗氧化剂的研究与开发 抗氧化剂是一类能有效阻止或延缓自动氧化的物质。h a l l i w d l 定义为：在相对可氧化底 物( 糖类、脂质、d n a 或蛋白质) 更低的浓度下能有效地延缓或阻止底物发生氧化反应的物 质旧。抗氧化剂既有化学合成的也有天然生物物质的提取物，前者有叔丁对甲氧酚制剂( b h a ) 和丁基羟基甲荤( b h t ) 。随着食品安全意识的增强，越来越多的人认识到化学合成抗氧化 剂的危害。据2 0 世纪9 0 年代美国市场的调查表明。1 ，2 6 的美国人认为化学合成添加剂有害； 来自英国的报告称，5 8 的英国人认为这种食品添加剂是健康的一个主要威胁；在中国， 越来越多的人认为。化学合成添加剂危害人体健康。而天然抗氧化剂由于具有天然、高效、 低毒的特点而逐渐为人们所利用并取代人工合成抗氧化剂。 天然抗氧化剂是直接从天然生物中提取而得到的抗氧化剂。天然抗氧化剂常用于添加 到食品材料里来减缓脂质过氧化“”“，被广泛应用于油脂及含油食品的加工中。目前，生命 有机体内的不饱和脂肪酸过氧化作用。在脂质氧化反应，和许多疾病包括衰老、癌、糖尿 病、心血管病等领域已经逐渐引起人们更多的关注。医学上，氧自由基和脂质过氧化关系 到衰老“2 1 和许多疾病包括癌1 、多发性硬化、帕金森氏症、老年痴呆、自身免疫性疾病和 石棉沉滞症等的病因学“。2 z , 基一3 羟基- 6 一苯硫基- 4 ( i h ) 一吡啶酮( h p p ) 和3 一羟基- 4 ( 1 h ) 一 吡啶酮类化合物作为抗肿瘤药物，其在抗肿瘤、抗氧化、清除自由基和抗炎等方面的药理 活性，国外已有文献报道“”，它们均具有较强的抗氧化作用。因此抗氧化剂不仅仅在食 品保护上，更是在生命细胞抵抗氧化破坏的防御机制中成为了脂质过氧化重要的抑制剂。 抗氧化剂包括抗氧化酶类和非酶抗氧化剂。目前开发利用的主要是后者。 植物是天然抗氧化剂的潜在资源，它们吸收太阳辐射，产生高能态氧，作为光合作用 的第二代谢产物。植物中的氧易被紫外线辐射激活，并从太阳光中获取热量，产生有毒的 反应性氧( r o s ) 。植物产生各种具有抗氧化活性的化合物，来阻碍这些活性氧的毒性作用进 而生存下去。这些具有抗氧化活性的化合物即为天然植物抗氧化剂的来源。天然产物的抗 4 浙江大学硕士学位论文第二章文献综述 氧化活性决定于植物里面的活性化合物。据p r a t t 和h u d s o n 报导。大多数天然抗氧化剂可以 在木材，树皮、植物茎杆、叶、果实、根、花和种子中发现。这些化合物大多是自然界中 的普通酚类或多酚化合物，例如，生育酚、类黄酮类化合物以及肉桂酸、磷脂，绿原酸、 咖啡酸和其他有机酸的衍生物，越来越多的研究发现天然多酚类化合物对人体有着重要的 保健功能，由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性；更为 丰富的非酶类抗氧化剂如黄酮类化合物，广泛存在于植物界，是目前倍受关注的天然活性 产物之一。长期以来在其对活性氧自由基的清除和对老年病的防治功效上已有较多研究， 已被证实有很强的清除氧自由基的能力；植酸类物质，如柠檬酸、多聚磷酸等，具有极强 的螫合金属的能力，可减少金属离子所催化的氧化反应。另外含氮化合物，如咖啡碱、咖 啡因以及其他分子中含有- - s h 基的蛋白质及其衍生物类、多肽、氨基酸等等也已经发现具 有较高的抗氧化活性，是潜在的抗氧化物质资源。 目前开发利用的抗氧化物植物资源主要是药用植物、果蔬、香料植物。植物来源的天 然抗氧化物分类见表2 1 。 表2 一l主要天然抗氧化荆的种类及来源 t a b l e 2 一1 t h er e s o u r c e sa n ds p e c i e so f m a i na n t l o x i d a n t s 抗氧化物来源 黄酮类化合物 酚类化合物 各种木质素的衍生物 生育酚、芝麻酚及相关成分、橄榄油和磷脂 抗坏血酸、羟基羧酸、类黄酮、类胡萝h 素 药用植物 药用植物、饮料植物、调味香料植物 燕麦和稻壳等 植物油 水果、蔬菜、茶叶( 几茶索属类黄酮) 氧基酸、二羟基n 比啶蛋白质和蛋白水解物 目前对于海洋生物抗氧化性质的研究尚处于起步阶段，现今已经发现鼠尾藻 ( s a r g a s s u m t h u n b e ) 和海黍子( s a r g a s s u mk j e l l m a n i a n u my e n d o ) 两种褐藻中含有具抗氧化活 性的多酚，海黍子提取物对不饱和脂质也具有较好的抗氧化作用，另外，扇贝多肽、虾红 紊的抗氧化和抗肿瘤作用为人们发现并得以证明。 其它类型的抗氧化剂还包括： ( 1 ) 复合抗氧化剂 抗氧化剂的潜在价值，已经促使许多研究人员开始探索具有高抗氧化活性及低细胞毒 性的复合抗氧化剂。例如，t b n g 等“”研究了从中草药中提取的各种类黄酮、木质素类， 生物碱、双苄基、香豆素和萜类化合物对于小鼠大脑脂质过氧化、肾脏匀浆以及小鼠红细 5 浙江大学硕士学位论文 第二章文献综述 胞溶血的抑制作用，并通过影响博莱霉素引诱d n a 损伤来评定上述各物质的不同复合体的过 氧化活性，发现植物天然成分中的黄铜类黄芩甙、芦丁和毛地黄酮一7 一葡萄糖醛酸化合物一6 一 木精酯，生物碱四氢巴马汀，木脂素类4 一去甲去氧鬼臼脂素和香豆素花椒毒酚等表现出潜 在的抗氧化活性。 ( 2 ) 微量元素 硒是动物必需的营养元素，主要起清除活性氧的作用，是谷胱甘肽过氧化物酶的辅基， 通过调控谷胱甘肽过氧化物酶的活性而调控生物体内的抗氧化系统。中国科学院薛泰麟等 系统研究了硒对高等植物的抗氧化作用。1 9 8 7 年p a r n h a m 研制出e b s l e n 有机硒化合物。此外， 铜、锌是维持s o d 活性的微量元素 ( 3 ) 铁螯合剂 体内羟自由基主要经f c n l o n s 反应和h a b e r - w e i s s 反应生成，这两个反应都需要铁的参 与，故铁能起到促进自由基生成的作用。铁螯合剂则可以阻断自由基反应。动物实验证明， 铁螯合剂去铁敏能阻止o h 破坏透明质酸，抑制抗原一抗体复合物诱导的大鼠血管内皮损 伤及过敏性实验脑炎。 2 1 4 天然抗氧化剂的应用现状与前景 目前，天然抗氧化剂已广泛应用于以下几个方面。”：( 一) 用作食品添加剂，主要的功 能是防止或减慢食品发生氧化作用，提高食品的稳定性，延长货架期。( 二) 用于保健食品， 主要功能是消除自由基或阻抑自由基的活动，从而起到防老抗褒、抑制肿瘤的发生、防止 心脑血管疾病、增强免疫功能的作用。( 三) 用于化妆品，有防止皮肤衰老，美容养颜的作 用。( 四) 用于新药品，治疗心脑血管病、抗癌等。 过去由于天然抗氧化剂生产成本高，受价格低廉的合成抗氧化剂冲击，一直没有商品 化。随着时代的发展，人们感觉到化学合成物对食品的污染，因而对天然产物的渴望越来 越强烈。近十多年来，人们对茶多酚、迷迭香醚等提取工艺进行了深入的研究。相继开发 出比合成抗氧化剂活性更强的天然产品。目前能够实现工业化生产的天然抗氧化剂有天然 v e 、迷迭香提取物、茶多酚、甘草抗氧化物、竹叶抗氧化物、磷脂等。在“崇尚绿色、回 归自然”的二十一世纪，随着工业的快速发展。人们安全意识的增强，天然抗氧化剂的使 用会日趋普遍。随着天然抗氧化剂的品种增多以及生产成本的迸一步降低，天然抗氧化剂 将逐步取代合成抗氧化剂。 6 浙江大学硕士学位论文第二章文献综述 2 1 s 有待解决的问题 很多天然产物都具有抗氧化活性，且大部分在食品中已经应用了数百年。没有发现毒 性和有害的副作用，为什么它们尚不能在加工食品中更广泛到应用，代替合成的抗氧化剂? 原因主要有三点： ( 1 ) 可能性一种天然的抗氧化剂要想得到广泛的应用，首要条件是容易得到，这包括它 在自然界是否有丰富的资源原料。是否很容易地从原料中提取制得，或是否容易仿照天然 结构而合成出来。目前已经被注意到的化合物有栎精和迷迭香酸等。对它们做了大量的研 究，并提出来应用的可能性，但是尚不能达到“易得”的要求。 ( 2 ) 作用性能抗氧化剂必须有足够的溶解度。特别是油溶性，对于热和光的稳定性，不 易退色以及具有柔和的香味和味道，才可以在食品中应用。黄酮、黄烷酮以及它们的苷、 酚酸等，油溶性都特别低。有的有退色作用，例如，在b 环上的3 ，4 - - - 羟基苯基结构，对 于含有微量重金属或用金属容器包装的化合物产生严重的退色。没食子酸就是一个例子。 另外，从草本植物和香料中提取出来的物质，其气味和味道有些是不受人喜欢的。 ( 3 ) 毒性虽然实际上我们已经摄入了大量的这些化合物，并未发现毒害作用，而且某些 黄酮类化合物在医学上对某些疾病有疗效，但是要将这些化合物添加到食品中去，仍然要 进行急性和慢性毒理实验。这些实验工作也需要一个过程。 2 2 油茶籽的研究概况 2 2 1 国内外研究动态 由于资源的分布特点，国外对油茶耔壳的研究很少，对山茶油的研究主要有以下几个 方面：比较过山茶油和其它植物油如橄榄油、葵花子油等理化特征，脂肪酸组成和食用品 质；还有从油茶籽油不皂化物中分离出三萜醇的研究以及从茶耔饼中分离黄酮和黄酮醇苷 的极少量报导【”i 抗氧化方面的研究有直接把山茶油添加到其它植物油中从而显著提高了 产品的保质期和稳定性【2 3 l 。还有以山茶油为对照，研究了檄榄油在防治紫外辐射引起的老 鼠皮肤癌的作用的报导1 2 4 l ，这些为油茶籽的研究提供了方向与依据。而国内的相关研究主 要集中在从油茶耔饼中分离提取茶皂素”，还有少量从油茶果壳叶等副产品中提取抗氧化 物质的研究报导，但其中提取黄酮和多酚类的文献较少据报道，油茶饼中的黄酮主 要为山奈酚糖苷类黄酮，从油茶饼正丁醇提取物中可分离出两个黄酮苷，经u v ，1 h n m r ， 7 浙江大学硕士学位论文第二章文献综述 1 3 c - n m r ，e l m s ，f a b m s 等分析，鉴定为山奈酚一3 - 0 - 葡萄毗喃糖基( 6 一1 ) 鼠李毗 喃糖苷( 1 ) 和山奈酚3 口葡萄吡喃糖基一 ( 2 一1 ) 葡萄吡喃糖基 ( 1 ) 鼠李毗喃糖苷 ( i i ) 。曾韬【2 。1 等采用酯化一蒸馏和溶剂萃取等工艺从茶油脚中提取天然维生素e ，并确 定了提取工艺条件；林生深口q 等进行了从油茶果壳中提取天然抗氧化剂的研究，通过提取 工艺的正交试验，确定了最佳提取条件；采用b - 胡萝h 素共氧化法初步确定有效抗氧化组 分，并测定其含量，对有效抗氧化组分进行了详细的薄层色谱分析和 玎，l c _ u v 分析。结 果表明，抗氧化主要成分为天然没食子酸和儿茶素类物质；杨辉荣i 划等报道了从野生油茶 叶中提取抗氧化剂的研究，并对该抗氧化剂的成分进行了初步鉴定，初步证明该主成分中 含有黄酮类化合物的槲皮素。 2 2 2 油茶籽的研究与开发前景 我国的油茶资源十分丰富。据统计，全国有油茶3 6 6 7 万h m 2 ( 5 5 0 0 万亩) ，每年产油 1 5 0 万吨，这将带来1 0 0 0 多万吨的油茶籽壳。如此庞大的数量若能加以有效利用，将能 产生巨大的经济效益。此外，还可综合利用山茶油加工副产品如油茶籽饼，皂脚等，从中 提取相应的抗氧化成分。油茶耔饼，又称茶桕。别名茶枯、茶籽饼、茶籽饼粕等。呈紫褐 颗粒，是野山油茶树果实榨油后剩下的渣滓。油茶耔饼含有脂肪、蛋白质、粗纤维、山茶 甙、山茶皂甙、糖类等物质，当然同时还含有一定量的抗氧化活性物质。故可以从中提取 残油，山茶甙、山茶皂甙、茶多酚等物质，并进行综合利用。我国是世界上油茶籽产量最 大，品种最多的国家，每年都有成千上万吨榨油剩下的油茶耔饼，但由于其味苦辛辣且对 冷血动物有毒，故一般是提取皂甙后当肥料或饲料用或直接当燃料焚烧，经济效价不高。 所以，对油茶籽饼的化学活性成分的提取分离和综合利用的研究，具有显著的经济效益和 社会意义。 中国食品工业协会c h i n a n a t i o n a lf o o di n d u s t r y a s s o c i a t i o n ( c n f i a ) 已经发布了( 2 0 0 6 年2 0 1 6 年全国食品行业科技发展纲要建议。纲要在油脂加工业中特种油脂这方面指出要 实施油茶籽和茶叶耔高效增值全价开发及产业化工程。并对油茶耔和茶叶籽的功能成分进 行研究等。可以看出对油茶籽中的活性物质进行研究的作用与意义。浙江是我国著名茶油 主产区，西部山区拥有良好的油茶生长环境，常山县是油茶的天然分布区，是中国油茶之 乡。因此通过种植原料树，到租加工( 山茶油毛油、油茶耔饼) ，再到高科技的深加工( 精 炼山茶油、蛋白饲料) 和相关产品的开发( 茶皂素、山茶油酸丸、抗氧化剂和保健品等) ， 不断推出新产品。尽快形成产业化，可以提升产品的价值，带动当地经济的发展。 8 浙江大学硕士学位论文第二章文献综述 2 3 课题来源及选题意义 本项目来源于2 0 0 5 年浙江省自然科学基金的重点项目一山茶油活性物质的抗氧化防 辐射机理的研究( 项目编号z a 0 2 1 8 ) 。本研究拟在确定油茶耔壳活性物质的最佳提取工艺 的基础上，采用先进的植物有效成分的提取分离手段，进一步研究油茶籽壳提取物的抗氧 化能力及对f a s ( 脂肪酸合酶) 的抑制能力，为深入开发和综合利用天然的油茶籽原料提 供科学的佐证，并为改进油茶籽壳中活性物质的利用和开发具有抗氧化与减肥功能的具有 自主知识产权的保健产品提供有效的数据参考和实践依据。本项目的研究成果，不仅为油 茶耔的开发利用开辟新的途径，而且进一步推进天然植物有效成分研究和功能性产品开发 的进程，因此，具有十分重要的理论和现实意义。 9 浙江大学硕士学位论文 第三章油茶籽壳中总黄酮的最佳提取工艺研究 第三章油茶籽壳中总黄酮的最佳提取工艺研究 3 1 引言 黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布的多酚类天然产物。泛指两个具有酚羟基的苯 环( a 与b 环) 透过中央三碳原子( c 环) 相互连接构成的一系列化合物，用c 6 - c 3 - c 6 表示。 研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫调节 等多种生理功能及药理作用，其提取物已用于食品、药品、化妆品等产品中”“ 据报道油茶总皂苷有抗氧化及清除自由基的能力。”1 ，茶耔毛油中存在极性抗氧化物质 ，但从油茶耔壳中提取黄酮的研究还未见报道。油茶是我国特有的木本食用油料树种， 资源十分丰富，据统计，全国有油茶3 6 6 7 万h m 2 ( 5 5 0 0 万亩) ，每年产油1 5 0 万吨，这将 带来 0 0 0 多万吨的油茶果壳。如此庞大的数量，若能加以有效利用，将能产生巨大的经济效 益。因此充分开发利用油茶耔壳中的黄酮类化合物具有十分重要的现实意义。为了利用油 茶籽壳中的黄酮类物质，本文利用溶剂浸提，借助了超声波辅助萃取，通过单因素试验和 正交试验对油茶籽壳总黄酮的提取工艺进行了探讨，为油茶籽壳中有效成分的提取提供了 理论基础。 3 2 材料与仪器 3 2 1 实验材料 油茶耔，2 0 0 5 年1 1 月份购于浙江常山芳村镇。将油茶耔敲碎，分离的油茶籽壳晒干， 用粉碎机粉碎后过4 0 目筛。 3 2 2 试剂与仪器 芦丁( 中国医药上海化学试剂公司，分析纯，纯度) ； 7 5 3 0 g 分光光度计( 惠普上海分析仪器公司生产) ； k q - 2 5 0 b 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司生产) ； 电动粉碎机( 温岭市大德中药机械有限公司生产) 。 无水乙酵，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝均为分析纯； 1 0 浙江大学硕士学位论文第三章油茶耔壳中总黄酮的最佳提取工艺研究 3 3 实验方法 3 3 1 油茶籽壳总黄酮的分级提取 油茶籽壳一晒干一粉碎一溶剂浸泡一超声波辅助萃取一抽滤一定容一 定量分析 选用极性由弱到强的四种溶剂石油醚、乙醇、4 0 乙醇、水对油茶耔壳中的黄酮进行提 取。准确称取8 0 9 油茶籽壳粉于5 0 0 m l 三角瓶中，按物料比l ：3 0 加入石油醚，在5 0 c 下 超声波提取4 5 r a i n ，趁熟减压抽滤用相应浓度石油醚的溶液容至3 0 0 m l 到容量瓶中，作 为待测液。抽滤后的样品再依次以乙醇、4 0 7 醇、水为溶剂以同样的方法提取、定容。 3 3 2 油茶籽壳总黄酮的乙醇提取 准确称取1 o g 油茶耔壳粉于5 0 m l 三角烧瓶中，加入一定量的乙醇，在一定温度下超 声波提取一定时间，趁热减压抽滤，用相应浓度的乙醇溶液定容至5 0 m l 容量瓶中，作为待 测液。 3 3 3 标准溶液的制各和标准曲线的绘制 准确称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥( 6 0 c ，0 0 9 m p a ) 至恒重的芦丁标准品 0 0 7 7 0 9 ，用6 溅乙醇溶解，定容至2 5 0 m l ，摇匀，得浓度为0 2 9 2 6 m g m l 的标准应用液， 放置低温暗箱内，及时检测。分别吸取标准应用液1 0 m l ，2 0 m l ，3 0 m l ，4 0 m l ，5 0 m l ， 6 , 0 m l 于2 5 m l 容量瓶中，分别用6 0 9 6 乙醇添至1 0 m l ，加入5 n a n 0 2 溶液1 0 m l 摇匀， 放置6 r a i n ，再加入1 傩a | ( n o d 3 溶液1 0 m l ，6 r a i n 后加入4 n a o h 溶液1 0 m l ，混匀，再 用3 0 的乙醇定容至刻度，摇匀，放置1 5 m i n 后在波长5 1 0 n m 处测定吸光度a ，得芦丁含 量y ( m g m l ) 与吸光度a 间的回归方程。 3 3 4 油茶籽壳总黄酮的测定 取待测液i m l 于2 5 m l 容量瓶中，以下操作同3 2 2 项，测定其在5 1 0 n m 处的吸光度a ， 由回归方程计算黄酮含量。 总黄酮含量( ) = ( 黄酮类化合物质量原料质量) x1 0 0 得率( ) = ( 提取物质量原料质量) x1 0 0 提取物干基黄酮含量( ) = ( 黄酮类化合物质量提取物质量) 1 0 0 浙江大学硕士学位论文第三章油茶耔壳中总黄酮的最佳提取工艺研究 3 3 s 单因素及正交试验设计 加热提取有一定的水解产物的存在，本试验利用超声波辅助萃取，通过对提取工艺中 乙醇浓度、料液比、超声波辅助萃取温度和萃取时间等影响油茶籽壳总黄酮提取率的因素 进行单因素试验及正交试验，确定最佳的工艺参数。 表3 - 1 正交试验因素水平表k ( 3 ) t a b l e3 - 1 f a c t o r s a n d l e v e l s o f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 3 4 结果与分析 3 4 1 标准曲线及回归方程 按照3 2 2 中总黄酮含量测定方法配制不同的芦丁浓度梯度于5 1 0 h m s 定吸光值，制作总 黄酮标准曲线，并计算回归方程。 3 目 v 魁 蛏 卜 札 0 6 0 4 0 2 0 0020 4 0 6 吸光值( o d 5 1 0 ) 图3 - 1 芦丁的总黄酮标准曲线 f i g3 - 1s p e c i f i e m i o nc u r v eo f r u t i n 3 4 2 油茶籽壳各相提取物中的总黄酮含量 2 o8 浙江大学硕士学位论文第三章油茶耔壳中总黄酮的最佳提取工艺研究 表3 2 油茶籽壳各相提取物中的黄酮含量 t a b l e3 - 2 t o t a lf l a v o n e si nt h es h e l lo f c a m e l l i ao l e i f e r aa b e 不同溶剂提取的总黄酮含量差异很大，对于油茶耔壳，4 0 7 醇提取液的黄酮含量为 1 0 9 * 0 最高，其次为水提取液、乙醇提取液和石油醚提取液，石油醚提取液的黄酮含量仅为 0 2 3 * , ，约为4 0 乙醇提取液的l 5 。此外，水提取物与4 0 7 , 醇提取物干基黄酮含量为 4 0 * 一5 0 ，显著高于石油醚与乙醇的提取物。 3 4 3 单因素实验 3 4 3 1 不同乙醇浓度对油茶籽壳黄酮提取效果的影响 毋 v 钮 蕊 枢 确 图3 - 2 不同乙醇浓度对提取效果的影响 f i g 3 - 2 r e s u l to f d i f f e r e n te t h a n o lc o n c e n t r a t i o no l ie x t r a c t i o ne f f e c t 在1 o o g 油茶耔壳粉样品中，分别入2 0 m l 不同浓度的乙醇，浸泡3 0 r a i n 后超声波萃取 2 0 r a i n ，抽滤，定容，测其吸光度a 值，得总黄酮含量与乙醇浓度关系