（食品科学专业论文）中华蜜蜂王浆抗菌肽Accroyalisin原核表达及抑菌活性研究.pdf

浙江大学硕上学位论文 摘要 摘要 中华蜜蜂( a p i sc e r a n ac e r a n a ) 是我国土生土长的蜂种，其抗病性明显优于西方蜜蜂( a p i s m e l l i f e r a ) 。蜂王浆是哺育工蜂的咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体分泌的乳状、具有生物活性的活 性物质。近期的研究表明，中华蜜蜂抗病性优于西方蜜蜂以及蜂王浆不易变质的特性都与中华蜜 蜂王浆抗菌肽a p i sc e r a n ac e r a n a - r o y a l i s i n ( a c e r o y a l i s i n ) 有关。p r e p r o - a c c r o y a l i s n ( p p a r ) 是 a c e - r o y a l i s i n 前体，m a t u r e a c c r o y a l i s i n ( m a r ) 为a c c r o y a l i s i n 的成熟肽部分。 1 p r e p r o - a c e - r o y a l i s n 原核表达及多克隆抗体的制备 以含蜂王浆抗菌肽p r e p r o a c c r o y a l i s n ( p p a r ) 基因的中华蜜蜂头部c d n a 文库质粒为模 板，用p c r 方法扩增出其前体片段，将该片段克隆入表达载体p g e x - 4 t - 2 ，其c 端与g s t 连接。 在大肠杆菌b l 2 1 中与g s t 进行融合表达。利用割胶回收获得目的蛋白注射兔子，制备多克隆 抗体。s d s p a g e 和薄层扫描分析结果表明：该基因得到高效表达，表达产物大小约为4 6k d a ， 占细胞总蛋白的1 6 3 。利用所获抗体对纯化p p a r 融合蛋白进行w e s t e r nb l o t 印迹分析，获得 特异性条带。结果证明，该抗体可用于检测a c c r o y a l i s i n 的存在。 2 m a t u r ea c e - r o y a l i s i n 的原核表达及表达产物可溶性分析 本试验完成了对m a t u r ea c c r o y a l i s i n m r ) 的基因克隆、原核表达及产物的可溶性分析。 w e s t e m b o l t 分析结果表明m a r 成功在大肠杆菌中成功的与g s t 进行了融合表达，表达的 g s t - m a r 占表达总蛋白的1 8 6 ，其中可溶性部分占9 0 以上。 3 g s t - p r e p r o - a e e r o y a l i s n 、g s t - a c c - r o y a l i s i n 纯化及a c e r o y a l i s i n 蛋白的获得 本实验利用g e n s c r i p tc o r p o r a t i o n 蛋白纯化试剂盒，将获得的g s t - p p a r 及g s t - m a r 的基 因表达产物进行纯化，分别在5 0 0m l 的菌液中纯化出0 0 1 3 4g 及a n d0 0 2 0 6 9 蛋白。w e s t e m b o l t 印迹表明，纯化的三种蛋白g s t - p p a r 、g s t - m a r 和g s t 均对g s t 一抗产生了很强的特异性的 反应，证明g s t - p p a r 、g s t - m a r 融合蛋白纯化成功。同时，将纯化后的g s t - m a r 用凝血酶 酶切获得了单体m a r 。 4 a c c r o y a l i s i n 重组表达产物对革兰氏阳性细菌的抑菌活性研究 浙江大学硕士学位论文 摘要 用g s t - p p a r ，p p a r 及m a r 的纯化产物分别对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，黄色微球菌m i c r o c o c c u sl u t e u s 和枯草芽孢杆菌b a c i l l u ss u b a l i s 进行 了抑菌试验，结果表明：三种纯化产物对这三类革兰氏阳性菌均有拮抗作用，且效果明显，与属 于具有防腐功能的商品化食品添加剂抗菌肽n i s i n 的具有类似的抑菌效果。这三中产物的活性强 度依此为：m a r g s t - m a r g s t - m a r 。 本研究克隆和分析了中华蜜蜂王浆抗菌肽a c e r o y a l i s i n 的编码序列，在世界上首次将其进 行原核表达。表达产物抑菌活性分析表明，经原核表达的a c c - r o y a l i s i n 蛋白对革兰氏阳性菌有 抑制作用，且效果明显。预期可应用于医药及食品防腐领域。 关键词：r o y a l i s i m 中华蜜蜂：蜂王浆；原核表达；抑菌 i i 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec h i n e s eh o n e y b e e ( a p i sc e r a n ac e r a n a ) i sn a t i v eh o n e y b e ei nc h i n aa n da n t i d i s e a s e e f f e c t i v e l yt h a ne a s th o n e y b e e ( a p i sm e l l i f e r a ) r o y aj e l l yi sp r o d u c t e db yn b r s eh o n e y b e e ， m i l k i n e s sa n dh a sl o t so fb i o l o g i c a la c t i v i t y r ja r en u t r i t i o n a lb u tm e t a m o r p h o s eh a r d l y , i ti s d e p e n do nt h ea n t i b a c t e r i a lc o m p o n e n t m a ri sa l la n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ，b e l o n gt ob e ed e f i n s i n s p e c i e s a sr e p o r t e di th a v ea n t i g + b a c t e r i ae f f e c t t h i sr e a c h e rf i n i s h e dp r e p r o - a c c - r o y a l i s na n d m a t u r ea c c m y a l i s i ne x p r e s s i o ni ne c o l ib l 21a n da n t i b a c t e r i a la n a l y s i s 1 e x p r e s s i o no fr o y a l b i nf r o mr o y a lj e l l yo fa p i sc e r a n ac e r a n ai ne s c h e r i c h i ac o i la n d p r e p a r a t i o no fi t sp o l y c l o n a la n t i b o d y t h ep a r to fp p a rw a sa m p l i f i e df r o m 卸t sc e r a n a e e r a n ae d n al i b r a r ya n ds u b c l o n e di n t o t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - 4 t - 2w i t hag l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) a tt h en - t e r m i n u s f u s i o np r o t e i ng s t - p p a rw a se x p r e s s e di ne c o l ib l 21 s d s p a g es h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n p r o d u c tw a s4 6k uw h i c hw a sa c c o r d a n c ew i t hi t se x p e c t e ds i z e l a y e rs c a n n i n gs h o w e dt h a tt h e a m o u n to fg s t - p p a ra c c u m u l a t e du pt oa b o u t1 6 3 o ft h et o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s w e s t e r n b l o t t i n gw i t hg s tm o n o a n t i b o d yc o n f i r m e dt h ec o r r e c te x p r e s s i o n a l s op u r i f i e dg s t - p p a rw a s i n j e c t e ds u b c u t a n e o u s l yt oi m m u n i z en e wz e a l a n dw h i t er a b b i t st op r e p a r ep o l y c l o n a la n t i b o d y s p e c i f i cf o rp p a r t h et i t e ro ft h ea n t i b o d yw a se v a l u a t e db ye l i s aa n a l y s i sa n di t ss p e c i f i c i t y w a sc o n f i r m e db yw e s t e r nb l o tw i t hp u r i f i e dg s t - p p a rw h i c hm e a n st h er a i s e dp o l y c l o n a l a n t i b o d yc o u l db eu s e dt od e t e c tp p a r 2 e x p r e s s i o no fp r o - p r e - r o y a l i s i na n dp u r i f i c a t i o na n a l y s i so fe x p r e s s e dp r o t e i n t h eg e n ec l o n e ，e x p r e s s i o na n da n a l y s i so ft h es o l u b l ep r o t e i n sa r ea c c o m p l i s h e di nt h i s r e s e a r c h w e s t e r n b l o t t i n g w i t hg s tm o n o a n t i b o d yc o n f i r m e dt h ec o r r e c te x p r e s s i o n e x p r e s s e df u s i o np r o t e i n ，g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s eg s t - p p a ro f 31 6k d ai so b t a i n e d ，w h i c h a c c o u n t i n gf o ru pt o 18 6 b a c t e r i a lp r o t e i n i na d d i t i o n , n e a r l y10 0 o fg s t - m a rw a s s o l u b l ep r o t e i n i i i 浙江人学硕士学位论文 a b s t r a c t 3 t h ep u r i f i c a t i o no fg s t - p r o - p r e - r o y a l i s i na n dg s t - r o y a l i s i n b o t hg s t - p p a ra n dg s t - m a r p r o t e i na r ep u r i f i e db yg e n s c r i p tc o r p o r a t i o nk i t w eg a i n 0 013 4 9a n d0 0 2 0 6 9p r o t e i nf r o m5 0 0m lb a c t e r i a lc u l t u r er e s p e c t i v e l y w e s t e r nb l o t t i n gw i t h g s tm o n o a n t i b o d yc o n f i r m e dt h ec o r r e c te x p r e s s i o n i n c i s e db yt h r o m b i n , g s t - m a rr e l e a s e d m a r 4 a n t i b a c t e r i a la n a l y s i s b o t hl y s a t e so ft h et w op u r i f i e df u s i o np r o t e i n sd i s p l a y e da n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s ，s i m i l a rt o t h a to fn i s i na g a i n s tg r a m p o s i t i v eb a c t e r i as t r a i n s ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，b a c i l l u ss u b t i l i sa n d m i c r o c o c c u sl u t e u s m a rp e p t i d er e l e a s e df r o mt h et h r o m b i n - c l e a v e dg s t - m a rf u s i o np r o t e i n h a sas t r o n g e ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t yt h a nt h a to fg s t - p p a ra n dg s t - m a rf u s i o np r o t e i n k e yw o r d s ：r o y a l i s i n , 4 p sc e r a n a c e r a n a , r o y a lj e l l y , p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n , a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝至三盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解滥姿盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝鎏盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 浙江大学硕士学位论文 第1 部分文献综述 浙江大学硕士学位论文第一章抗菌肽的研究进展 第一章抗菌肽的研究进展 1 抗茵肽的起源及分布 1 1 抗菌肽的起源 抗菌肽又称抗微生物肽( a n t i m i c r o b i a ip e p t i d e ) 是一类可以抑制或杀灭微生物的肽类物 质( h a n c o c k , e ta 1 1 9 9 9 ) 。最初人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“抗细菌肽”。但是随着 研究的深入，发现这类“抗细菌肽”还有非特异性的抗肿瘤、病毒等功能，并得到了大量的应 用，所以又被称为“多肽抗生素”。( a n d r e a s ，e ta 1 2 0 0 3 ) 由于动植物在遭受细菌或病毒侵害时，自身产生的能够抵抗侵害的抗菌肽，所以抗菌肽 在动植物体内分布广泛，是很多动植物天然防御免疫系统的一部分。抗菌肽和常规的抗生素 不同，它是某些特定基因编码产生的蛋白，因此具有独特的抗菌机制( h a n c o c k , e t a l 1 9 9 8 ) 。 b o m a n 等人于1 9 7 2 年发现果蝇中存在抗菌活性物质( b o m a n ，e ta 1 1 9 7 2 ) ，并子1 9 8 0 年从感 染细菌的惜古比天蚕蛹血淋巴细胞中分离得到了两种抗菌肽p 9 a 和p 9 b ，将其进行氨基酸序 列化分析，确定了这两种抗菌肽的一级结构并命名为c e c r o p i n s ( b o m a n , e ta 1 1 9 8 1 ) 。 c e c r o p i n s 是第一个被发现并确定结构的抗菌肽。同年，l e f u r 等人从兔的巨噬细胞中分离得到 了另一种抗菌肽- d e f e n s i n 。至今，人们已经陆续从昆虫、植物、鱼类两栖动物及哺乳动物中 发现了近千种抗菌肽。 抗菌肽具有以下特点：1 ) 光谱性：抗菌肽分布广，种类多，由不同基因调控表达的不 同的抗菌肽可以单一或广谱的对革兰氏阴性阳性菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤细胞具有抑 制作用。2 ) 高快速，效性，稳定性。在很低的浓度下就可以抑制微生物的生长，而很多抗 菌肽还有耐酸、耐碱、抗热的特性。甚至有些抗菌肽在1 0 0 。c 加热1 0m i n 仍具有活性。3 ) 选 择性毒性，大部分抗菌肽对正常的哺乳类动物的细胞都没有毒性，对肿瘤和微生物细胞有选 择性毒性。 1 2 抗菌肽的分布 1 2 1 昆虫抗菌肽 昆虫是世界上最庞大的生物种群之一，种类超过8 0 0 万，占整个动物数量的9 0 以上。 2 浙江大学硕士学位论文第一章抗菌肽的研究进展 昆虫分布广泛，除海洋外几乎所有生态环境都有昆虫的踪迹，这与昆虫具有极强的适应能力 和防御能力密不可分。但是昆虫没有哺乳动物的完善的免疫系统b 和t 淋巴系统，也无免疫 球蛋白和补体存在。大量研究表明，昆虫在感染细菌、真菌或体壁损伤等的情况下，体内的 一些特异基因便能迅速编码产生大量抗菌肽，组成第二道防御体系，迅速杀灭已侵入的病菌， 并阻止病菌的继续侵染( h o f f m a n ，e ta 1 1 9 9 4 ；h o f f m a n ，e ta l1 9 9 9 ) 。 根据结构和成分特征，昆虫抗菌肽大致可分为四类( c o c i a n c i c h , e ta 1 1 9 9 4 ) ： 1 ) 天蚕素( c e c r o p i o m ) 这类抗菌肽1 由2 9 - - - 4 2 个氨基酸残基组成，一般不含半胱氨酸，没有二硫键，呈线形。 目前已经在鳞翅目和双翅目昆虫中分离, w , 2 0 多种天蚕素类似物，其中常见的有s a r c o t o x i n s 、 h y p h a n c i n 、e n b o c i n 和s p o d o p s i n 等( o t v o s ，e ta 1 2 0 0 0 ) 。 2 ) 昆虫防御素( i n s e c td e f e n s i n s ) 昆虫防御素是已知分布最为广泛的一类抗菌肽，迄今发现的所有昆虫中几乎都有防御素 的存在。昆虫防御素一般由3 3 - 4 6 个氨基酸残基组成，分子中含有多个c y s ，形成3 - - 4 个二硫 键来稳定其结构，并形成1 3 片层，分子内的二硫键与其抗菌活性密切相关。大多数的昆虫防 御素对革兰阳性菌有着极强的活性，而对革兰阴性菌、真菌及真核细胞几乎无效( c o c i a n c i c h , e ta 1 9 9 4 ) 。很多昆虫防御素与动植物的防御素结构相似。从果蝇中分离到抗菌肽 - - d r o s o m v e i n ，其中3 8 的氨基酸序列与植物防御素相似，表明其与植物抗菌多肽的进化有 一定的同源关系。从蜂王浆中分离出的r o y a l i s i n 也属于此类抗菌肽。 3 ) 富含脯氨酸的昆虫抗菌肽。 这类抗菌肽分子量为2 - 4k d ，富含脯氨酸和精氨酸，其中脯氨酸的含量大于2 5 。可以 在双翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目昆虫中分离得到。大部分此类抗菌肽对革兰氏阴性菌具 有很强的活性，而对革兰阳性菌几乎不起作用。例如：在膜翅目昆虫中发现i 构l a p i d a e c i n s ( c a s t e e l s ，e ta 19 9 4 ) 。 4 ) 富含甘氨酸的抗菌肽。 3 浙江大学硕上学位论文 第一章抗菌肽的研究进展 此类抗菌肽在结构上与a p i d a e c i n s 有一定的相似，分子量大小约为8 - 3 0 k d 。这类抗菌 肽含g l y 量很高，其对提高肽链的弹性及广谱抗菌等可能起到重要作用( m a c k i n t o n s h ，e t a 1 1 9 9 8 ) 。从双翅目昆虫中分离得到的d i p t e r i c i n s ；从鳞翅目昆虫中分离得到的a 仕越i n s 、g l o v e r i n s ； 从鞘翅目昆虫中分离得到的c o l e o p t e r i c i n 、h o l o t r i c i n l i 、h o l o t d c i n n l 、t e n e c i n n l ；从半翅目昆虫 中分离得到的h e m i p t e r i c i n 等，都属于此类抗菌肽。 1 2 2 鱼类抗菌肽 鱼类抗菌肽其组成和结构复杂多样，分子量大小和氨基酸组成不尽相同，由多个基因家 族所编码。但是他们也有一定的特点，例如：含较多的半胱氨酸；有较保守的螺旋结构；含 有较多的阳离子氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；分子带正电。鱼类抗菌肽多以前肽原的形式 合成，通过酶解切除信号肽和羧基端酸性片段后，形成具有活性的成熟肽。 o r e n 等从豹鳎中得到含有3 3 个氨基酸残基的p a r d a x i n ，具有较强溶血作用和抗菌活性； p a r k 等从泥鳅中分离f l 勺m i s g u r i n ，表现出了广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性、阴性细菌及真 菌均有抑制作用。( o r e n ，e ta 1 1 9 9 6 ；p a r k ，e ta 1 1 9 9 7 ) 1 2 3 两栖动物抗菌肽 两栖类动物皮肤光滑、裸露，且没有鳞片、甲壳和毛发的保护但能分泌具有保护作 用的皮肤粘液，其中含有大量分子结构特殊、功能复杂能够抗菌的活性物质。 1 9 7 0 年，c s o r d a s 等在研究欧洲铃蟾皮肤分泌物中的c y t o t r o p i c 时发现了第一个具有溶血 作用的蛙皮抗菌肽b o m b i n i n 。到1 9 8 7 年，z a s l o f ) a 非洲爪蟾的皮肤分泌物中提取出了蛙皮抗 菌肽m a g a i n i n s 族，人们开始重视对蛙类抗菌肽的研究( z a s l o f , e ta 1 1 9 8 7 ) 。迄今已从7 0 0 多种两栖类动物中分离获得了1 0 0 多种皮肤抗菌活性多肽和3 0 多种生物活性胺。并进行了结 构与功能上的研究。其中一部分抗菌活性多肽或其化学结构修饰物己在临床上得到了应用 ( m a l o y , e ta 1 1 9 9 5 ；b a t i s t a , e ta 1 2 0 0 1 ) 。 两栖类抗菌肽绝大多数此类抗菌肽都是由单个多肽链组成。从结构上可以分为两大类： 一类为线性的a 螺旋多肽，不含二硫键，代表物为来源于非洲爪蟾的m a g a i n i n s ，其二级结构 的主要成分是g t 螺旋；另一类是环性肽，含有分子内二硫键，如来源于日本林蛙的j a p o n i c i n ( i s s a e s o n ，e t a l 2 0 0 2 ) ，其分子中含有由l 对半胱氨酸组成的二硫键。 4 浙江大学硕士学位论文第一章抗菌肽的研究进展 1 2 4 哺乳类动物抗菌肽 哺乳动物抗菌肽基因的表达发生在正在分化的嗜中性白细胞、巨噬细胞和上皮细胞中。 健康组织细胞中抗菌肽的基因表达水平较低，然而在细菌、蛋白炎症因子或脂多糖( l p s ) 等 刺激因子的作用下，抗菌肽的含量升高。目前，在哺乳动物中发现的抗菌肽主要有防御素 d e f e n s i n s 和c a t h e l i c i d i n s 两类( r a m a n a t h a n , e ta 1 2 0 0 2 ) 。防御素是研究最多也最清楚的抗菌 肽，其分为a - d e f e n s i n 和p - d e f e n s i n 两大类。s c h o n w e t t e r 等( s c h o n w e t t e r , e ta l1 9 9 5 ) 研究表 明，在牛气管上皮发现的抗菌肽t a p 和舌上皮发现的抗菌肽l a p 均属1 3 d e f e n s i n 家族，分别由 4 2 和3 8 个氨基酸组成，都有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌及真菌活性作用。 1 2 5 贝类抗菌肽 此类抗菌肽现在研究的还比较少，现阶段研究表明：贝类的抗菌肽分子量一般在1 0k d a 以下：多数是阳离子分子。其中有代表性的为c h a r l e t 等在1 9 9 6 年从蓝贻贝和h u b e r t 等在同年 从地中海贻贝血液中分离到的m g d l 、2 ，其分子中存在4 个二硫键，在结构上与d e f e n s i n s 家 族十分相似( c h a r l e t , e ta l19 9 6 ；h u b e r t , e ta 1 19 9 6 ) 。 1 - 2 6 鸟类抗菌肽 关于鸟类的抗菌肽的研究现阶段也比较少。大多数现今发现的鸟类抗菌肽都属于1 3 - d e f e n s i n s ，并且与哺乳动物的p d e f e l l s i n s 同源。例如从鸡的异嗜白细胞中发现的g a l l i n a c i n 和从王企鹅胃中分离出的s p h e n i s c i l l s ，具有抗肠炎沙门氏r 菌s a l m o n e l l a p 刀饱，触拯和空肠弯曲 杆菌c a m p y l o b a c t e r j e j u n i 的活性( b r o c k s ，e ta 1 1 9 9 8 ；l a n d o r t , e ta 1 2 0 0 4 ) 。 1 2 7 植物抗菌肽 由于植物没有特异的免疫系统，但是由于其本身存在的非特异性免疫系统致使其在生长 过程中能够免受微生物的侵害。植物的抗菌机制一直是植物病理学研究的重点。植物类的抗 菌肽主要分为四类：1 ) 硫堇：硫堇分子量为5 k d 左右，是一类首先在禾本科植物种子中发 现的碱性蛋白，氨基酸残基数为4 5 4 7 。能抑制许多革兰氏阳性、阴性菌和真菌的生长。2 ) 植物防卫素：植物防卫素因与动物防御素同源而得名，一般由4 卜5 4 个氨基酸残基组成，含 8 个c y s ，据报道植物防卫素能抑制多种真菌的生长( w i l l e m ，e t a l 1 9 9 7 ) 。3 ) 脂转移蛋白： 脂转移蛋白约含9 0 - - 9 3 个氨基酸残基，同样具有具有8 个c y s 。在体外能将磷脂从线粒体表 面转运到内部。4 ) 橡胶素类抗茵肽：橡胶乳液中的一种主要蛋白，含4 3 个氨基酸残基。这 s 浙江大学硕士学位论文第一章抗菌肽的研究进展 是一类含几丁质结构的植物抗团蚩自，能抑制多种真菌的生长，去几丁质酶的橡胶素也有抑 菌作用，与橡胶素同源的抗菌肽家族能抑制多种革兰氏阳性细菌的生长( 傅南雁，等，1 9 9 8 ) 。 5 ) 含4 个c y s 的抗茵肽：d u v i c k 等从玉米种子中分离出一种抗菌肽m b p 1 ，含有3 3 个氨基酸 残基、4 + c y s ，能抑制大多数真菌以及某些革兰氏阳性和阴性菌的生长( t e r m s 。e ta 1 1 9 9 6 ) 。 2 抗菌肽的理化性质及作用机理 2 1 抗菌肽的理化性质 抗菌肽是一种小分子多肽，通常由1 2 1 0 0 个氨基酸残基组成；大部分抗菌肽水溶呈碱性， 等电点在8 9 1 0 7 之间；能耐高温不变，许多抗菌肽在1 0 0 。c , i 热1 0 m i n 还能保持一定活性； 一些抗菌肽对高离子强度及高p h 值都有较强抗性；部分抗菌肤还可以抵抗胰蛋白酶和胃蛋 白酶的消化( h a n c o c k , e ta 1 2 0 0 0 ) 。 大多数的抗菌肽的氨基酸序列( 一级结构) 有较强的保守性：绝大多数为富含赖氨酸( l y s ) 和精氨酸( a x g ) 等阳离子型氨基酸的多聚阳离子型多肽，其c - 末端富含丙氨酸( a l a ) 、缬氨酸 ( v a 0 和甘氨酸( g l y ) 等非极性氨基酸，而中间部分富含脯氨酸( p r o ) ；绝大多数抗菌肽在第2 位 为t r p ，它对抗茵肽的抑菌活性起至关重要的作用。抗菌肽分子二级结构中的疏水部分和阳 离子氨基酸部分分别位于不同区域；在一定条件下，n 端更易形成a 一螺旋，中间易形成b 一折叠。形成了与水和脂类物质都具有亲和力的两亲性结构( o r e n ，e t a l 1 9 9 6 ；h u l t m a r k , e t a 1 1 9 9 7 ；t r a v i s ，e ta 1 2 0 0 0 ) 。 2 2 抗菌肽的作用机理 几乎所有的抗菌肽都是阳离子型的或两亲性的，这一特征决定了它们的抗菌作用模式， 肽的阳离子部分与微生物膜的阴离子结构相互作用，并最终导致微生物膜被破坏。膜的透化 主要有以下两种机制： 2 2 1 “桶一桶板( b a r r e l - - s t a v e ) ”模型 阳离子抗菌肽对脂多糖( l p s ) 具有较强的亲合作用，而l p s 是g 菌外膜的主要组分。抗 菌肽分子在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子通道，造成细菌细胞膜结构破坏。引起胞内水溶 性物质大量渗出而导致细菌死亡。微生物的细胞膜和多细胞生物的细胞膜在结构特点上的不 6 浙江大学硕士学位论文第一章抗菌肽的研究进展 同决定了抗菌肽作用的选择性。微生物的细胞膜由脂质双分子层组成，其带有负电荷的磷脂 头暴露在外层，而动植物的脂质双层的外层则没有静电荷的分布，其大部分的带负电荷的磷 脂头均面向细胞质而位于脂质双层的内层( o r e n , e t a l 1 9 9 8 ) 。 抗菌肽的正电荷是其结合细菌细胞壁和外膜层的基础。对于革兰氏阴性菌，阳离子型的 抗菌肽易与细菌外膜上带负电荷的脂多糖相互作用，从而破坏外膜结构以穿越内膜；而革兰 氏阳性菌不具有脂多糖，但其表面由于肽聚糖的存在而带负电，抗菌肽也能破坏肽聚糖层而 穿透质膜。抗菌肽的双亲分子结构决定了其特殊的作用机制，正电荷区域首先与微生物膜外 的负电荷相互作用，接着抗菌肽的疏水部分与微生物膜表面的磷脂发生互换并促使肽分子进 入细胞内部。s i p o sd ( s i p o s ，e t a l 1 9 9 2 ) 等和c h r i s t e n s e nb 等( c h r i s t e n , e t a l 1 9 8 8 ) 一致认为， 通道的形成过程为：首先，在质膜与水相界面上，抗菌肽与脂质双层间通过静电吸引而靠近；接 着，借助于分子中n 端与c 端间的连接结构的柔性，抗菌肽分子中的疏水端插入质膜中，而刚 性分子则不能完成这一步；然后两亲性的螺旋也插入质膜中，从而破坏了脂质双层原有的有 序结构，由于两亲性的存在，抗菌肽分子在质膜上形成通道，细菌因而便失去膜势，不能保持正 常渗透压而死亡( s a b e r w a l ，e ta 1 19 9 4 ) 。 2 2 2 地毯模式 肽分子聚集在膜外面，与膜脂作用，改变其曲率，逐步包裹膜，使之成碎片脱离，最后 导致膜崩解0 a p a g i a r m i ，e ta 1 2 0 0 3 ) 。 c l a g u e 等则认为抗菌肽通过作用于膜蛋白，引起蛋白质凝聚失活，使细胞膜变性而形成 离子通道。o k a d a 等发现抗菌肽在抑菌过程中扮演着离子泵的角色，它使细胞内k 离子快速 析出，使a t p 含量迅速下降，继而导致细胞死亡。 随着研究的深入，人们发现抗菌肽还可以用其他的方式产生抗菌效果，但不同的抗菌肽， 其抑菌方式各有差异，抑菌效果的发挥是多种因素的协同作用的结果。研究发现某些抗菌肽 可以通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌，某些富含脯氨酸的抗菌肽能与细菌的热休克蛋白结合 而发挥抗菌活性。 k r a g o l 等认为( k r a g o l ，e ta 1 2 0 0 1 ) 抗菌肽形成离子通道的时间很短，这样不足以立即 杀死病原体抗。所以抗菌肽很有可能通过进入靶细胞内部导致一系列关键物质的破坏。这 个过程可能有以下两种情况：抗菌肽与细胞膜结合，并诱导菌体产生降解细胞膜的水解 7 浙江大学硕上学位论文第一章抗菌肽的研究进展 酶从而导致整个细胞解体；抗菌肽与胞内多聚阴离子如d n a ) 作用，使d n a 失活，从而 杀死病原体。 3 抗菌肽的分类 3 i 阴离子型抗菌肽 阴离子抗菌肤多分离自哺乳动物上皮组织中，所带净电荷为负。1 9 9 2 年，在山羊的肺 膜表面中发现了能够抵抗大肠杆菌、肺炎球菌和溶血性曼氏杆菌( 导致牛、羊呼吸道传染病 的一种病原菌) 的物质。其中发现三种阴离子的小肽具有天然的抗菌活性，这些阴离子小肽 在肺的新陈代谢中起到重要作用( b r o g d e n ，e t a l 1 9 9 6 ) 。目前发展的阴离子型抗菌肤分为四 类( b o u t i g u e ，e ta 1 2 0 0 0 ；s a l z e t , e ta 1 2 0 0 1 ) ：1 ) 神经肽前体加工过程中产生的磷酸化组分， 最近在牛感染细菌后的渗出液中发现了这种抗菌肤，如p r o - e n k e p h a l i n a 的肽b 和e n k e l y t i n ( l e e m ，e t a l 1 9 9 9 ；c a v e r l y , e ta 2 0 0 1 ) 。具有抗g + 菌活性。2 ) 绵羊和牛肺部表面分离到的阴 离子抗菌肤( s u r f a e t a n t a s s o e i a t e da n i n i ce p e p t i d e ，s a a p ) ，组分中富含天冬氨酸( a s p ) ，主 要具有抗革兰氏阳性菌活性。3 ) 芳香族( a r o m a t i cd i p e p t i d e s ) ，如从双翅目昆虫幼虫体内分离 到的p h y d r o x y c i l m - a l d e h y d e 。4 ) 氧结合蛋白，如血蓝蛋白衍生物。 w e s t e n b l o t 分析证明了肺、肝、小肠、气管中的很多酶都与此肽有相似性。这些肽同 锌离子作用能够得到最大的活性，抗菌机理尚不明确，大部分人推理如下：锌在微生物表面 形成盐桥，使肽能够抵抗细菌表面的负电荷。使肽不用改变自身形态就能够穿破细胞膜。进 入细胞之后攻击核糖体并抑制核糖体的活性。一般在3 0m i n 内便可杀死细菌( l i t t a u e r ，e ta 1 1 9 6 2 ；s e l a , e ta 1 9 6 2 ) 。 3 2 阳离子抗菌肽 此类抗菌肽的种类数量最多，广泛存在于各种动植物中，一般分为三类：a 螺旋、富 含一到两种氨基酸抗菌肽、p 折叠型。这三类抗菌肽的氨基酸序列、结构和大小存在很大的 差异。自然界中以舡螺旋和1 3 一折叠型最为常见。 ( 1 ) 4 - 螺旋型 8 浙江大学硕士学位论文第一章抗菌肽的研究进展 此类抗菌肽的大小约为2 0 4 0r e s i d u e s ( 氨基酸残基) ，呈线性螺旋状，不含半胱氨酸且 肽链中间无分子二硫键。n 末端区域富含亲水性碱性氨基酸残基，c 末端含较多的疏水性氨 基酸残基且不稳定，易酰胺化形成成熟肽；中间有个s e 卜g l u g l y 形成的二硫键；所带正电荷 有利于与细菌膜上的酸性磷脂头负电荷作用而吸附到细菌膜上。对革兰氏阴性菌和部分革兰 氏阳性菌有较强的杀菌作用( g a z i t ，e t a l 1 9 9 5 ；v u n n a m ，e t a l 1 9 9 7 ；l e e ，e t a l 1 9 8 9 ) 。 g t - 螺旋型抗菌肽主要包括天蚕素、爪蟾抗菌肽、c e c r o p i n 等。目前已从多种动物如：牛、 马、猪、兔等哺乳动物以及家蚕果蝇等昆虫中发现c e c r o p i n 的类似物。其中包括p m a p 、 p r o t e g r i n 、o a b a c 、e c a t h 等。它们均具有广谱抗菌的作用( g a z i t , e ta 1 1 9 9 5 ；v u n n a m ，e ta 1 1 9 9 7 ) 。 ( 2 ) 富含一到两种氨基酸抗菌肽 此类抗菌肽含有4 0 8 0 个氨基酸残基，线性，形成伸展性的螺旋结构。不含半胱氨酸但 富含脯氨酸、精氨酸、甘氨酸或色氨酸。此类抗菌肽通过阻止d n a 复制和蛋白质的合成来 抑菌，并攻击细胞，使其变异死亡，对革兰氏阴性菌有较强的抑制作用。 例如：蜂体内分离到的a p i d 勰c i n s 中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达3 3 和1 7 。从果蝇 分离到的d o 麒) c i n 在分子结构上与a p i d a e c i n s 具有一定的相似性。当时认为与哺乳动物的防御 素具有高度同源性而命名为昆虫防御素( i n s e t d e f e n s i n ) 。 ( 3 ) 3 - 折叠型 此类抗菌肽含有1 6 - 4 0 个氨基酸残基，含有半胱氨酸，含有两个或以上的二硫键形成稳 定的p 折叠型的结构。这类抗菌肽主要含有，可分为泓防御素和p 防御素和p r o t e g r i n s 。o r , - 防 御素经常被叫做经典防御素，有2 9 3 5 个a a 残基。p 防御素有3 8 - 4 2 个氨基酸残基，富含精氨 酸。有广谱抗菌、抗滤过性病原体和细胞毒素的功效。p 防御素广泛存在于不同的上皮组织 中，可能参与上皮和粘膜的抗感染防御。1 1 0 0m g l 的浓度便能有效的抵御革兰氏阴性菌、 革兰氏阳性菌、病毒及真菌( g a n z , e t 以1 9 9 5 ；l e h r e r ，e ta 1 1 9 8 3 ；l e h r e r , e ta 1 1 9 8 5 ) 。 9 折叠型抗菌肽现今已从人的中性粒细胞、兔的巨噬细胞、人的小肠p a n e t h 细胞、某 些昆虫( 如蜜蜂) 的血淋巴中分离到。 9 浙江大学硕士学位论文 第一章抗菌肽的研究进展 3 3 蛋白碎片类的抗菌肽 此类抗菌肽主要存在于肠道中，是大分子蛋白被酶解后的产物。氨基酸残基从9 8 - 1 1 2 都有，被叫做l a c t o f i e r r i c i n ( p e l l e g r i n i ，e ta 1 1 9 9 7 ) 。且这些抗菌肽在肠道中能够起到广谱抗菌 的作用( d i o n y s i u s ，e ta 1 1 9 9 7 ) 。 抗菌肽的应用及前景 4 1 抗菌肽在食品工业领域的应用及前景 抗菌肽由于其安全，高校，无残留能特性，有很强的在食品领域应用的潜力。现阶段 在食品领域被广泛使用的主要为乳链菌肽n i s i n 。1 9 2 8 年，r o g e r s tw h i t t i e r 首先发现了乳链 菌肽，并在5 年后成功将其分离，并证明是一种多肽( c h e n b a u m ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。1 9 4 4 年，此 类多肽被证实可以抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌及真菌无抑制作用，并被命名为n i s i n ( m a t t i c k , e la 1 1 9 9 4 ) 。n i s i n 第一次被用作食品防腐剂是1 9 5 1 年，h i r s c h 等人将其应用 在挨门塔尔干酪上，成功的控制了由于肉毒梭菌引起的腐败。1 9 5 3 年，乳链菌肽作为商品 证实进入市场。1 9 6 9 年，f a o w h o 联合食品添加剂专家委员会确认n i s i n 为合法的食品 添加剂。人们已发现的n i s i n 共有六种类型：abcde 和z 。现阶段大量研究的主要为 n i s i n a 及n i s i n z 。 乳制品的加工中可以利用n i s i n 来提高稳定性，并抑制抑制梭状芽孢杆菌的生长和产毒， 同时还可以缓解其由于高温长时间加热等工艺造成的不良