（食品科学专业论文）液体发酵法发酵豆粕制备大豆肽的研究.pdf

山东轻工业文学院硕士学位论文 摘 大豆肽在食品和保健品生产领域应用广泛，是一种很有前途的功能性食品。 豆粕含4 5 0 - 5 5 0 的大豆蛋白，大豆蛋白经水解可得大豆肽。但是水解后的大 豆肽往往产生苦味成分，影响了制成品风味，而且脱苦步骤繁琐，成本高。利用 枯草芽孢杆菌1 3 8 9 ( b a c i l l u ss u b t i l i s l 3 8 9 ) 和黑曲霉a s 3 3 5 0 ( 4 s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ) 或米曲霉a 9 0 0 5 ( a s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ) 混合发酵豆粕，可以同时完成水解和 脱苦工艺，降低生产成本，提高豆粕的利用率，加速了功能性肽的产业化进程， 此方法在国内外尚未有相关报道。本文主要进行了以下研究：枯草芽孢杆菌1 3 8 9 、 黑曲霉a s 3 3 5 0 、米曲霉a 9 0 0 5 分别单独发酵豆粕制备大豆肽以及枯草芽孢杆菌 和黑曲霉、米曲霉分别混合发酵豆粕制备大豆肽过程中理化指标的动态研究，并 通过对动态发酵结果的分析确定单因素条件进行单因素实验，最后运用正交试验 法确定发酵豆粕制备大豆肽的最佳发酵条件。研究结果如下： ( 1 ) 在接种量1 0 、摇床转速2 0 0 r m i n 的发酵条件下，枯草芽孢杆菌1 3 8 9 发酵豆 粕产蛋白酶的最佳发酵条件为：豆粕浓度6 、初始p h 值7 6 、培养温度3 1 、 发酵时间4 8 h ，此条件下蛋白酶酶活可达3 8 9 8 2 u m l 。枯草芽孢杆菌13 8 9 发酵 豆粕产大豆肽的最佳发酵条件为：豆粕浓度4 、初始p h 值7 4 、培养温度3 5 、 发酵时间4 8 h ，此条件下大豆肽转化率可达8 8 1 9 。 ( 2 ) 在接种量1 0 、摇床转速2 0 0 r m i n 的发酵条件下，黑曲霉a s 3 3 5 0 发酵豆粕 产蛋白酶的最佳发酵条件为：豆粕浓度4 、初始p h 值5 6 、培养温度3 2 、发 酵时间4 8 h ，此条件下蛋白酶酶活可达2 7 0 5 u m l 。黑曲霉a s 3 3 5 0 发酵豆粕产 大豆肽的最佳发酵条件为：豆粕浓度4 、初始p h 值5 8 、培养温度3 2 、发酵 时间4 8 h ，此条件下大豆肽转化率可达6 0 7 3 。 ( 3 ) 在接种量1 0 、摇床转速2 0 0 r m i n 的发酵条件下，米曲霉a 9 0 0 5 发酵豆粕产 蛋白酶的最佳发酵条件为：豆粕浓度2 、初始p h 值6 2 、培养温度3 2 、发酵 时间4 6 h ，此条件下蛋白酶酶活可达2 4 6 8 u m l 。米曲霉a 9 0 0 5 发酵豆粕产大豆 肽的最佳发酵条件为：豆粕浓度2 、初始p h 值6 6 、培养温度3 2 c 、发酵时i 日j 4 6 h ，此条件下大豆肽转化率可达7 7 19 。 ( 4 ) 在接种量1 0 、发酵时间4 8 h 、自然p h 值、摇床转速2 0 0 r m i n 的发酵条件下， 枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和黑曲霉a s 3 3 5 0 混合发酵豆粕产蛋白酶的最佳条件为：菌 种混合比( 枯草芽孢杆菌：黑曲霉) 3 ：2 、豆粕浓度3 、发酵温度3 2 ，此条件下 蛋白酶酶活可达1 8 6 0 9 u m l 。枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和黑曲霉a s 3 3 5 0 混合发酵豆 粕产大豆肽的最佳条件为：菌种混合比( 枯草芽孢杆菌：黑曲霉) 3 ：2 、豆粕浓度 3 、发酵温度3 2 ，此条件下大豆肽转化率可达8 8 3 2 。 摘要 5 ) 在接种量1 0 、发酵时间4 8 h 、自然p h 值、摇床转速2 0 0 r m i n 的发酵条件下， 枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和米曲霉a 9 0 0 5 混合发酵豆粕产蛋白酶的最佳条件为：菌种 混合比( 枯草芽孢杆菌：米曲霉) 3 ：2 、豆粕浓度4 、发酵温度3 2 ，此条件下蛋 白酶酶活可达2 0 1 7 8 u m l 。枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和米曲霉a 9 0 0 5 混合发酵豆粕产 大豆肽的最佳条件为：菌种混合比( 枯草芽孢杆菌：米曲霉) 3 ：2 、豆粕浓度4 、 发酵温度3 2 ，此条件下大豆肽转化率可达8 9 0 7 。 关键词：大豆肽；枯草芽孢杆菌13 8 9 ；黑曲霉a s 3 3 5 0 ：米曲霉a 一9 0 0 5 ；豆 粕 i i 山东轻工业文学院硕士学位论文 a b s t r a c t s o y b e a np e p t i d e s ，w h i c hc o u l d b eak i n do fp o t e n t i a lf u n c t i o nf o o d ，w e r ea p p l i e d w i d e l yi nm a n ya r e a s s o y b e a nm e a lc o n t a i n sag r e a tq u a n t i t yo fs o y b e a np r o t e i n ， a b o u t4 5 0 5 5 0 s o y b e a np r o t e i nw a sas u p e r i o rp r o t e i n i tc o u l db eh y d r o l y z e d i n t os o y b e a np e p t i d e s h o w e v e r , s o m eb i t t e rc o m p o n e n t s ，a f f e c t i n gt h ef l a v o u ro f p r o d u c t s ，w o u l db ep r o d u c e da f t e rh y d r o l y z a t i o no fs o y b e a r lp r o t e i n t h em e t h o d so f d e b i t t e r i n gu s e dn o w w e r en o to n l yc o m p l i c a t e db u to fh i g hc o s t t h em e t h o dc u td o w n p r o d u c t i o nc o s t ，a n da c c e l e r a t e dt h ei n d u s t r i a l i z a t i o no ff u n c t i o n a lp e p t i d e st op r o d u c e p e p t i d e sw h i c hc o m b i n e dh y d r o l y z i n gs o y b e a np r o t e i na n dd e b i t t e r i n gi no n e s t e pw i t l l f o o d - g r a d eb a c i l l u ss u b t i l i s l3 8 9a n da s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0o ra s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 t h e r ew e r en or e l a t i v ea th o m ea n da b r o a dr e p o r t ss of a r t h i st h e s i sf o c u s e d o nt h ef o l l o w i n ga s p e c t ：s t u d i e do nt h ec h a n g e so fp h y s i c o c h e m i c a li n d i c e so fs o y b e a n p e p t i d e sp r e p a r e d eb y b a c i l l u ss u b t i l i s l3 8 9 ，a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ，a s p e r g i l l u s o r y z a ea 一9 0 0 5 ，b a c i l l u ss u b t i l i s l3 8 9i nc o m b i n a t i o nw i t ha s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0a n d b a c i l l u ss u b t i l i s l 3 8 9i nc o m b i n a t i o nw i t ha s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 , m a k es u r et h e s i n g l ef a c t o r sc o n d i t i o nt h r o u g h t h ea n a l y s eo ft h ed y n a m i cf e r m e n t a t i o nr e s u l t sa n dd o s i n g l ef a c t o rt e s t s t h e nb a s e do nt h es i n g l ef a c t o rt e s t s ，b yo r t h o g o n a lt e s t t o d e t e r m i n et h eo p t i m a l p r o c e s sc o n d i t i o n sb yt h ei n d i c a t o ro fs o y b e a np e p t i d e s c o n v e r s i o n ；t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： f i r s t ：u n d e rt h ec o n d i t i o n so ft h ev o l u m eo fi n o c u l a t i o nw a s10 ，2 0 0 r p m ，t h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gp r o t e a s eb yb a c i l l u ss u b t i l w a s138 9 ，w a st h a t t h ei n i t i a lp hw a s7 6 ，t h es o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s6 a t31 f o r4 8 h ，a n dp r o t e a s e a c t i v i t y c o u l dr e a c h3 8 9 8 2 u m l ；t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n g s o y b e a np e p t i d e sb yb a c i l l u ss u b t i l w a s 13 8 9 ，w a st h a tt h ei n i t i a lp hw a s7 4 ，t h e s o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s4 a t3 5 f o r4 8 ha n dt h es o y b e a np e p t i d e sc o n v e r s i o n c o u l dr e a c h8 8 19 s e c o n d ：u n d e rt h ec o n d i t i o n so ft h ev o l u m eo fi n o c u l a t i o nw a s10 ，2 0 0 r p m ，t h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gp r o t e a s eb ya s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ，w a st h a t t h ei n i t i a lp hw a s5 6 ，t h es o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s4 a t3 2 f o r4 8 h ，a n dt h e p r o t e a s ea c t i v i t yc o l dr e a c h2 7 0 5 u m l ；t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n g s o y b e a np e p t i d e sb ya s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ，w a st h a tt h ei n i t i a lp hw a s5 8 ，t h es o y b e a n c o n c e n t r a t i o nw a s4 a t3 2 ( 2f o r4 8 h ，t h es o y b e a np e p t i d e sc o n v e r s i o nc o u l dr e a c h i i i a b s t r a c t 6 0 7 3 t h i r d ：u n d e rt h ec o n d i t i o n so ft h ev o l u m eo fi n o c u l a t i o nw a s10 2 0 0 r p m t h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gp r o t e a s eb ya s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ，w a s t h a tt h ei n i t i a lp hw a s6 2 ，t h es o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s2 a t3 2 f o r4 6 h a n dt h e p r o t e a s ea c t i v i t yc o u l dr e a c h2 4 6 8 u m l ；t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n g s o y b e a np e p t i d e sb ya s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ，w a st h a tt h ei n i t i a lp hw a s6 6 ，t h e s o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s2 a t3 2 cf o r4 6 h t h es o y b e a np e p t i d e sc o n v e r s i o nc o u l d r e a c h7 7 1 9 f o r t h ：u n d e rt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ev o l u m eo fi n o c u l a t i o nw a s10 2 0 0 r p m ，n a t u r a lp hf o r4 8 h ，t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gp r o t e a s eb y b a c i l l u ss u b t i l w a s l 3 8 9i nc o m b i n a t i o nw i t ha s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ，w a st h a tt h er a t i o o fi n o c u l a t i o nw a s3 ：2 ( b a c i l l u ss u b t i l w a s l 3 8 9 ：a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ) ，t h es o y b e a n c o n c e n t r a t i o nw a s3 a t3 2 。c ，a n dt h ep r o t e a s ea c t i v i t yc o u l dr e a c h1 8 6 0 9 u m l ；t h e b e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gs o y b e a np e p t i d e sb yb a c i l l u ss u b t i l w a s l38 9 i nc o m b i n a t i o nw i t ha s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ，w a st h a tt h er a t i oo fi n o c u l a t i o nw a s 3 ：2 ( b a c i l l u ss u b t i l w a s l3 8 9 ：a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ) ，t h es o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s3 a t3 2 。c ，a n dt h es o y b e a n p e p t i d e sc o n v e r s i o nc o u l dr e a c h8 8 3 2 f i f i t h ：u n d e rt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h ev o l u m eo fi n o c u l a t i o nw a s10 ， 2 0 0 r p m ，n a t u r a lp hf o r4 8 h ，t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gp r o t e a s eb y b a c i l l u ss u b t i l w a s l3 8 9i nc o m b i n a t i o nw i t ha s p e r g i l l u so r y z a ea 9 0 0 5 ，w a st h a tt h e r a t i oo fi n o c u l a t i o nw a s3 ：2 ( b a c i l l u ss u b t i l w a s13 8 9 ：a s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ) ，t h e s o y b e a n c o n c e n t r a t i o nw a s4 a t3 2 。c a n dt h e p r o t e a s ea c t i v i t yc o u l d r e a c h 2 01 7 8 u m l ；t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n g s o y b e a np e p t i d e sb y b a c i l l u ss u b t i l w a s138 9i nc o m b i n a t i o nw i t ha s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ，w a st h a tt h e r a t i oo fi n o c u l a t i o nw a s3 ：2 ( b a c i l l u ss u b t i l w a s l 3 8 9 ：a s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ) ，t h e s o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a s4 a t3 2 。c a n dt h es o y b e a np e p t i d e sc o n v e r s i o nc o u l d r e a c h8 90 7 k e yw o r d s ：s o y b e a n p e p t i d e s ，b a c i l l u s s u b t i l i s l3 8 9 ，a s p e r g i l l u s n i g e r 3 3 5 0 ， a s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 ，d e f a t t e ds o y b e a nm e a l i v 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者虢堕亟壅 导师签名： 囊尘选 同期：丑俎年月显日 日期：俎年上月监同 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 豆粕简介 第一章绪论 我国是世界大豆的主产国之一，油脂加工副产品豆粕是目前为止可开发最丰 富的植物蛋白资源之一。豆粕一般呈不规则碎片状，颜色为浅黄色至浅褐色，味 道具有烤大豆香味，豆粕的主要成分见表1 1 ，其蛋白含量大，在4 5 0 , - - - 5 5 o 之 间，其中8 0 o 以上都是水溶性蛋白。但榨油后所得的豆粕目前主要用作饲料，只 有少部分用于发酵食品生产，近4 0 的优质大豆蛋白未得到有效利用，造成大量蛋 白资源的浪费。以豆粕为原料进行深加工和综合利用的研究显得相对薄弱【l j 。 表1 1 豆粕的组成【2 】 t a b l e1 1c o n t e n t so ft h es o y b e a nm e a l 1 2 大豆肽简介 大豆肽是大豆蛋白质经酶解后的降解产物，它是由不同氨基酸排列的低分子 肽混合物组成。主要成分为分子链不等的各级肽类，还包括一些游离氨基酸、少 量糖类、水分、灰分等【3 】。大豆肽含有人体必需的8 种氨基酸，除蛋氨酸为限制 氨基酸外，其他氨基酸均超过或接近w h o 推荐标准，通过分析表1 2 可得大豆肽 具有较高的营养价值1 4 j 。大豆肽与传统大豆蛋白相比较，具有易消化吸收、能迅 速给机体提供能量、无蛋白变性、无豆腥味、无残渣、分子量小、易溶于水且在 发酵条件也不产生沉淀，溶液黏性小和受热不凝固等特性，是一种比较理想的新 型大豆深加工产品1 5 】。其营养功能及应用领域均优于大豆蛋白质，是大豆蛋白质 的最佳营养方式。 第一章绪论 表1 2 人豆肽与其他产品的成分比较( ) 1 6 】 t a b l e1 2t h ec o n t e n t sc o m p a r a t i o n so fs o y b e a np e p t i d e sa n do t h e r s 1 2 1 大豆肽的生产现状 随着大豆深加工产品开发的不断深入，以大豆肽为原料的功能食品在国外不 断被开发出工艺来。2 0 世纪8 0 年代酶化学的迅猛发展，美国、日本对于大豆蛋 白的酶解工艺和酶解过程的感官特性，功能特性及营养价值改善的研究取得了较 大的进展【7 j 。国内在这方面也进行了广泛的研究，而利用酶对大豆蛋白进行水解 被认为是最有效的大豆肽制备工艺【8 】。从作用的方式上来分，蛋白质的酶水解可 分为直接酶解和间接酶解。 目前国内外对多肽的制备研究主要集中在利用纯酶制剂进行直接酶解，其中 酶的选择是关键。不同来源酶理化特性的差异，会导致其水解工艺条件和最终多 肽产品特性的差异。但是由于商品酶制剂成本高昂，直接酶解法生产大豆肽代价 巨大，限制了其在发展中国家的工业化生产。因此，基于间接酶解法的微生物发 酵制各大豆肽的工艺，已日益受到研究人员的关注 9 1 。 1 2 2 大豆肽的生产工艺 1 2 2 1 直接酶解法生产大豆肽 2 0 世纪8 0 年代后，酶化学的迅速发展，大豆蛋白的酶解工艺和酶解过程的研 究取得了较大的进展，蛋白酶水解因其反应温和、对氨基酸破坏小等优点，成为 当前最主要的大豆肽制备方法【1 0 】。 ( 1 ) 酶法生产大豆肽的工艺l 2 山东轻工业学院硕士学位论文 大豆饼粕 l 大豆一粉碎一脱脂一乙醇提取一分离一液体一回收溶剂 iij 脂肪豆粕浓缩 il 碱提取两次干燥 ll 酸沉一杀酶一酶解一分离液一分离一粗渣大豆低聚糖 i1 分离一酸沉渣一脱色一脱水一干燥干燥一饲料蛋白 ij 肽液大豆蛋白 l 脱色一浓缩一干燥一大豆肽 在酶解法生产大豆肽的初期研究中，一般采用单酶水解法生产大豆肽，但由 于大豆蛋白经酶水解后其疏水性氨基酸残基暴露出来，得到的大豆肽往往带有较 明显的苦味，限制了其在食品中的应用i l2 1 。与单酶水解相比，多酶水解要复杂得 多，最显著的差别在于多酶复合水解的d h 要高于单酶，其最高可达到 0 8 4 4 ( 8 4 4 ) 【l 引。但多酶复合水解工艺条件中需要考虑的因素也比单酶水解要复 杂，除水解时间、p h 、温度等常规因素外，还要考虑酶的配比和加入酶的方式等 因素【14 1 。大豆肽产品的苦味随着水解程度的加深是先升后降的，d h 太低或太高都 是不合适的：以豆粕为原料生产大豆肽时，底物浓度一般不高，对底物浓缩势必 会增加成本，所以酶解工艺中底物浓度不能太高；同时，酶解时间太长肯定也是 不符合工业生产要求的l j 。可以预见，多酶复合水解法将成为今后研究的热点， 多酶水解法将在实际生产中逐步取代单酶水解法。 1 2 2 2 微生物发酵法生产大豆肽 利用微生物发酵来产大豆肽主要利用的是发酵菌株的产酶及酶解能力。通过 微生物发酵法生产大豆肽不仅原料成本低廉、而且工艺过程简便、条件温和、所 得到的大豆肽溶液可以进一步加工，有一定的推广价值【l 刚。豆粕是制油工业的副 产品，富含大豆蛋白，不仅价格低廉( 约为大豆分离蛋白的十分之一) ，而且能提 供了菌体生长所需的碳氮源和无机盐，十分适于作为发酵底物。选择合适的微生 物并在以豆粕为主的液体培养基上良好生长，微生物在生长代谢过程中大量分泌 第一章绪论 胞外蛋白酶和羧肽酶，在发酵过程中可以将原料中的大豆蛋白水解并脱除苦味根 源的肽链末端疏水性氨基酸。因此，选择合适的微生物并且控制好发酵的进程， 便可得到具有特定链长和对应功能的无苦味大豆肽【1 7 】。其工艺流程如下： 配制豆粕发酵培养基一1 2 1 ，灭菌2 0 m i n 一冷却至3 0 c 左右( 接菌) 一发酵 一分离一真空浓缩一喷雾干燥一筛分一成品 微生物发酵法是一项极具潜力的大豆肽制备工艺。进一步的工作有待于在对 发酵液中大豆肽混合物进行分级分离，纯化精制等下游技术上展开【1 8 1 。微生物发 酵法生产大豆肽的特点如下【1 9 1 。 ( 1 ) 改善口感 采用微生物发酵法生产大豆肽，微生物对某些苦味肽基团进行修饰和重组， 使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排【2 0 1 。制得的大豆肽无苦味和异味， 口感好，克服了酶解法产品苦味大和口感差等缺点。产品可广泛用于食品和医药 工业，采用该方法获得的大豆肽含量可达6 0 以上【2 i 】。 ( 2 ) 降低生产成本 微生物发酵豆粕过程中产生丰富的蛋白酶，将豆粕中的大豆蛋白分解成大豆 肽。同时，有些蛋白酶可以特异性地切断疏水性多肽末端的两种疏水性氨基酸， 降低了大豆肽溶液的苦味。因此，利用微生物发酵豆粕生产大豆肽可将大豆蛋白 的水解与苦肽的脱：占步骤合二为一，在很大程度上节省时间，降低生产成本。通 过实验测定其的粘度、乳化性、胶凝性等物理性质与一般大豆蛋白酶解所得大豆 肽相比较，具有更好的加工和功能特性，开拓了其应用领域【2 2 】。 ( 3 ) 大豆抗营养凶子的消除 豆粕中含有丰富的营养物质，营养成分齐全、均衡，是优良的植物性蛋白饲 料源，但是豆粕还存在胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、低聚糖、脂肪氧化 酶、大豆抗原蛋白( 致敏因子) 及致甲状腺肿素等多种抗营养因子【2 3 1 。世界上对 豆粕消除抗营养因子问题的研究在不断完善，主要有以下几种方法：物理( 膨化) 处理、化学消除抗营养因子，生物消除抗营养因子等。在饲料行业，最有效的办 法是生物消除抗营养因子技术。近年，在多菌种混合发酵法去除豆粕中的抗营养 因子，并提高豆粕的营养价值方面做了比较深入的研究，取得了不错的进展【2 4 1 。 4 山东轻工业学院硕士学位论文 1 3 国内外研究现状 1 3 1 国内研究现状 国内从2 0 世纪8 0 年代开始大豆肽开发和应用方面研究，其中对大豆蛋白酶 水解方面进行了深入探索，已在蛋白酶选择，酶解工艺参数，水解液脱苦、脱盐、 分离精制等方面取得一定进展。目前国内外对大豆肽的制备研究主要集中在利用 纯酶制剂进行直接酶解，由于商品酶制剂成本高昂，直接酶解法生产大豆肽代价 巨大，限制了其在发展中国家的工业化生产。因此，基于间接酶解法的微生物发 酵制备多肽的工艺，已日益受到研究人员的关注。我国近年来在此领域开展了较 多研究，万琦【2 5 】等筛选到一株能在发酵过程中产蛋白酶和外肽酶的枯草芽孢杆 菌，利用此菌所产蛋白酶的作用将大豆蛋白水解成短肽，利用此菌所产羧肽酶的 作用将短肽末端的疏水性氨基酸切除，从而实现了酶解和脱苦一步完成的大豆肽 发酵生产。邵伟1 2 6 j 等也将一株经驯化处理的枯草芽孢杆菌用于发酵制备大豆肽； 李旱和潘进权【27 】等则研究了利用一株真菌为发酵菌株，通过液体发酵法来制备大 豆肽的工艺。在工业化生产方面，张雁平【2 8 】通过成本核算，认为采用发酵法生产 大豆蛋白活性肽产品与酶解法相比，得率提高1 0 - - - - 2 0 ，成本仅为酶解法的5 0 - - 6 0 。因此，该技术有良好的应用前景和经济性。以上方法都是采用单一菌 种发酵制备大豆肽，目前国内利用多菌种混合发酵来制备大豆肽的研究还比较薄 弱。 当前我国大豆肽研究的主要方向，是肽的定向酶解技术、功能性肽的分离及 功能检测技术等。其中最重要的是肽的定向酶解技术的开发。包括：高效、专 一性强的酶种的选育；复合酶系共同作用的机理、机制。脱苦微生物的分离、 纯化和机理研究；酶解工艺改进技术等【2 9 。 1 3 2 国外研究现状 关于蛋白质改性研究历史可追溯到上世纪4 0 年代，当时一些西方学者用酶法 改性蛋白质以补充极其紧缺鸡蛋。6 0 年代以来，随着生物技术进步和生命科学发 展，大豆肽生理功能逐渐被人们所认识，一些活性肽结构和功能逐渐明确，也进 一步推动活性肽研究，大豆蛋白酶法改性也成为众多学者关注课题【3 。对大豆肽 的研究，美国和日本无论在基础理论还是在应用研究方面，均处于世界领先地位。 美国2 0 世纪7 0 年代初研究的新型大豆深加工产品一大豆肽，d e h o w ns p e c i a t i o n 公司建成了年产5 0 0 0 t 食用蛋白肽的加工厂。日本2 0 世纪8 0 年代开展此方面的 研究，不二制油公司、雪印和森永等乳业公司均已成功地将大豆肽应用于食品工 业领域【3 l j 。 1 9 7 4 年美国成立了由j a d l e n i s s e n 领导的专门研究水解蛋白课题的机构。 5 第一章绪论 从2 0 世纪7 0 年代到9 0 年代日本不二制油公司在制油副产品的开发中也致力于大 豆肽的研究，从产酶茵的选育，到水解工艺的确定，水解产物的脱苦精制均取得 了技术上的突破【3 2 】。日本k o d e r at o m o h i r o 等在脱苦方面进行研究，他们不添加 任何苦味吸附剂或掩盖剂，而是直接利用酶的作用，即利用一种内切酶切除疏水 性末端氨基酸，得到低苦味值肽类产品，这种肽可添加到食品、药品、保健品及 调味料等中，并不会给产品带来不良风味 3 3 1 。 1 4 立题依据及研究内容 1 4 1 立题依据 我国是世界大豆的主产国之一，油脂加工副产品豆粕是可开发最丰富的植物 蛋白资源之一，其蛋白含量大，在4 5 0 5 5 o 之间，其中8 0 0 以上都是水溶性 蛋白。但榨油后所得的豆粕目前主要用作饲料，只有少部分用于发酵食品生产， 近4 0 的优质大豆蛋白未得到有效利用，造成大量蛋白资源的浪判m j 。 微生物的内源酶中存在着广泛的肽酶谱系，微生物可以充分利用豆粕中的营 养成分，既促进自身的生长又直接参与生化代谢，通过自身作用对某些基团进行 修饰和重组，使小肽之问、小肽与氨基酸之间发生移接、重排，以改善大豆肽的 功能特性和加工特性；在内源酶系中，蛋白酶能水解豆粕中的大豆蛋白，内切酶 从中间切割或端肽酶从肽链末端切割将大分子的蛋白质降解成小分子的物质，能 提高大豆蛋白的水解效率和功能性大豆肽的得率；并且端肽酶修饰苦昧肽基团 切割疏水性氨基酸，去除大豆肽的苦味，不仅降低了大豆肽的生产成本，而且风 味、色泽等感官特性均优于酶法水解的产物p 酬。 本课题选用的枯草芽孢杆菌1 3 8 9 具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性， 尤其蛋白酶有内切酶，酶解能力强，从内部水解大豆蛋白的肽链，易形成低分子 易被吸收的大豆肽【”】。黑曲霉3 3 5 0 可产生多种活性较强的酶系，如c x 酶、淀 粉酶、酸性蛋白酶等。其中酸性蛋白酶( 如天冬氨酸蛋白酶) ，主要是端肽酶具有 良好的热稳定性与较强的耐酸性，还具有良好的金属离子稳定性1 3 8 j ；米曲霉 a 9 0 0 5 可产蛋白酶、淀粉酶和糖化酶等多种酶，其中的端肽酶可以修饰苦味肽基 团切割疏水性氨基酸，去除大豆肽的苦味。黑曲霉和米曲霉对营养要求较低，只 要求培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，是发酵工 业应用常见的菌种之一；另外，黑曲霉和米曲霉发酵豆粕生产大豆肽具有不产生 真菌毒素，符合食品卫生要求，菌丝体易成型，培养条件粗放，有较多的酶系， 生长温度宽，利于常年生产等优点【3 9 1 。若枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和黑曲霉3 3 5 0 或 米曲霉混合发酵豆粕，则内肽酶和端肽酶共同作用豆粕，既能切割中间肽键又能 切割末端肽键，理论上可以得到功能特性更好的大豆肽。 6 山东轻工业学院硕士学位论文 1 4 2 研究内容 ( 1 ) 枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉分别单独发酵豆粕制备大豆肽以及枯草 芽孢杆菌和黑曲霉、米曲霉分别混合发酵豆粕制各大豆肽过程中理化指标的动态 研究，主要包括：对p h 值变化情况的测定、菌体产蛋白酶酶活变化情况的测定、 总糖、还原糖含量变化情况的测定、肽转化率的测定。 ( 2 ) 高转化率发酵条件的确定：以转化率高为主要衡量指标，水解度适度 ( 1 5 5 0 ，平均肽链长度为2 7 ) 为次要指标，通过对豆粕的预处理方式、菌 种( 若混合发酵，还有混合比) 、接种量、豆粕浓度、温度、初始p h 值等发酵条 件的确定来优化生产工艺，提高大豆肽得率。 7 第二章枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备大豆肽的研究 第二章枯草芽孢杆菌1 3 8 9 发酵豆粕制备大豆肽的研究 2 1 引言 目前大豆肽的生产多以大豆蛋白为原料，成本较高，影响了其推广应用。以 往的课题和文献中对枯草芽孢杆菌1 3 8 9 发酵豆粕的研究还不是很深入，本课题的 目的是研究以廉价易得的豆粕为原料，采用液体发酵法，通过枯草芽孢杆菌1 3 8 9 的多种蛋白酶直接对豆粕中的蛋白质进行水解生产大豆肽。其中枯草芽孢杆菌 1 3 8 9 具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，尤其蛋白酶有内切酶，酶解能 力强，从内部水解大豆蛋白的肽链，易形成低分子易被吸收的大豆肽【4 。这对于 降低大豆肽的生产成本，扩大其应用范围，具有积极的意义。 本课题探讨枯草芽孢杆菌1 3 8 9 发酵豆粕制备大豆肽的动态研究，测定分析发 酵过程中p h 值、发酵时间、蛋白酶酶活、氨基态氮、发酵温度、还原糖、总糖等 理化指标的动态变化趋势，从而确定单因素实验和正交试验的条件，最终以大豆 肽转化率和蛋白酶酶活为指标通过单因素试验和正交试验来优化发酵条件，以确 定用枯草芽孢杆菌1 3 8 9 发酵豆粕制备大豆肽的最佳条件。 2 2 材料和方法 2 2 1 实验材料 ( 1 ) 原料 豆粕，山东力得福集团生产 ( 2 ) 菌种 枯草芽孢杆菌13 8 9 ，本实验室保存 ( 3 ) 培养基1 4 l 】 斜面培养基：枯草芽孢杆菌营养肉汁琼脂培养基 液体活化培养基：枯草芽孢杆菌营养肉汁培养基 发酵培养基：配制不同浓度、p h 条件下的豆粕溶液，装量5 0 m l 2 5 0 m l ，1 2 1 ， 2 0 m i n 灭菌，待用。 ( 4 ) 试剂 0 1 m o l l 标准氢氧化钠溶液，6 m o l l 氢氧化钠溶液，0 2 m o l l 氢氧化钠溶 液，酚酞指示剂，中性甲醛溶液，福林试剂，0 4 m o l 碳酸钠溶液，0 4 m o l 三氯乙 酸溶液，p h 7 2 磷酸盐缓冲液，p h 2 3 乳酸一乳酸钠缓冲液，p h l o 0 硼砂一氢氧化 8 山东轻工业学院硕士学位论文 钠缓冲液，2 酪蛋白溶液，1 0 0ug m l 酪氨酸溶液，l m o l l 盐酸溶液，0 2 m o l l 盐酸溶液，6 m o l l 盐酸溶液，0 0 5 m o l l 硼砂，3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 试剂， l m g m l 葡萄糖标准溶液。 ( 5 ) 仪器设备 f a 2 0 0 4 电子分析天平上海天平仪器厂 赛多利斯酸度计北京赛多利斯仪器系统有限公司 c s 5 0 1 型超级恒温水浴锅上海阳光试验仪器有限公司 2 2 p c 可见分光光度计上海棱光技术有限公司 l g l0 2 g 高速离心机北京医用离心机厂 s w - c j 2 g 型双人净化工作台苏州净化设备有限公司 d s x 2 8 0 a i 型不锈钢手提式灭菌锅上海申安医疗器械厂 药物架盘天平上海医用激光仪器厂 f u m a _ 一振荡器上海福玛实验设备有限公司 三角瓶，比色管，移液枪，移液管，离心管，5 0 m l 容量瓶，烧杯，量筒等。 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 发酵液的制备 ( 1 ) 菌种活化【4 2 , 4 3 】 将斜面保藏的枯草芽孢杆菌1 3 8 9 转接到液体种子培养基中，3 0 ，2 0 0 r m i n 振荡培养2 4 h 后用于发酵。 ( 2 ) 接种 将活化好的菌种接入发酵培养基，在适宜条件下振荡培养( 培养条件依各实 验步骤的需要进行调整) 。 ( 3 ) 离心 发酵结束后对发酵液进行离心，取上清液，即为待测发酵液。 2 2 2 2p h 值的测定 取发酵液2 0 m l ，用p h 计测其p h 值。 2 2 2 3 蛋白酶酶活的测定 采用福林一酚、法【4 4 , 4 5 】 计算： 蛋白酶活力x = k x a x 4 1 0 x n x l w 式中a 平行试验管的平均吸光度 4 离心管中反应液总体积( m l ) l 卜反应1 0 m i n 9 ( 2 1 ) 第二章枯草芽饱杆菌发酵豆粕制备大豆肽的研究 n 稀释倍数 w 酶粉称取量( g ) 2 2 2 4 氨基态氮的测定 采用甲醛滴定法f 4 6 】 计算： 氨基酸态氮( ) = ( n x v 0 0 1 4 1 0 0 ) w x1 0 0( 2 2 ) 式中v 滴定时n a 0 h 标准溶液的消耗量( m l ) n n a o h 标准溶液的当量浓度 w 所用样品的量 0 0 1 4 氮的毫克当量 2 2 2 5 还原糖的测定 采用3 ，5 一二硝基水杨酸比色法【4 7 】 计算： 还原糖( ) = c b x l 0 0 v w 式中c 测定样品溶液查得相当于葡萄糖量( g ) & 一样品溶液稀释倍数 v 比色时吸取样液的量( m l ) w 一样品的重量( g ) 2 2 2 6 总糖的测定 采用3 ，5 一二硝基水杨酸比色法【4 7 】 计算： 总糖( ) = c x b 1 0 0 v w 式中c ：测定样品溶液查得相当于葡萄糖量( g ) b ：样品溶液稀释倍数 v ：比色时吸取样液的量( m l ) w ：样品的重量( g ) 2 2 2 7 大豆肽转化率的测定 采用凯氏定氮法 ( 1 ) 测定酸溶蛋白的操作方法 l o ( 2 3 ) ( 2 4 ) 山东轻工业学院硕士学位论文 量3 0 m l 样品，定容至1 0 0 m l 。混匀后吸取1 0 m l 放入具塞比色管中，再加入 1 0 m l l 5 三氯乙酸