（食品科学专业论文）小鼠味蕾细胞分离纯化技术建立及应用研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文 小鼠味蕾细胞分离纯化技术建立及应用研究 摘要 味觉是人和动物最基本、最原始也是至关重要的感觉功能，人和动 物利用味觉来识别食物的性质、调节食欲和控制摄食量，而细胞界面原 初味觉感受的产生是整个味觉产生的基础，但味蕾细胞分离技术的相对 落后却制约着细胞层面味觉感受研究的进步。所以建立一种获取得率 高、活性好、纯度高味蕾细胞的有效技术和味蕾细胞培养方法是现在亟 待解决的问题。 本研究以i c r 小鼠为实验动物，采用两步酶解法和操作简单的 p e r c o l l 密度梯度离心法分离纯化小鼠味蕾细胞，通过亲和素生物素过 氧化物酶复合物免疫组化方法、电镜技术、荧光免疫技术、激光共聚焦 显微技术相结合检测分离及纯化结果，从而建立了一套有效的小鼠味蕾 细胞分离纯化技术。而后以建立的味蕾细胞分离纯化技术为平台，通过 对纯化的味蕾细胞与直接法分离的味蕾细胞培养的比较，建立了一种味 蕾细胞短期培养方法。最后对纯化的味蕾细胞进行等温量热滴定，检测 不同甜味剂与味蕾细胞相互作用时的热量变化，初步探讨了细胞层面上 味蕾细胞甜味识别热动力学研究的可行性。 实验结果如下： ( 1 ) 小鼠味蕾细胞分离纯化技术研究，确定了分离纯化小鼠味蕾细胞 浙江工商大学硕十学位论文 各个环节的实验条件：两步酶消化法获取味蕾细胞悬液，胶原酶 i i ( 1 5 m g m l ) 与中性蛋白酶i i ( 1 5 m g m l ) 1 ：1 混合酶液用于剥离味觉上 皮，分离条件室温下孵育6 - 8 m i n ( 6 8 周i c r 小鼠) ；0 2 5 胰蛋白酶+ o 0 2 m m o l le d t a3 7 。c 培养箱孵育味觉上皮1 0 2 0 m i n 制备混合细胞悬液。 将混合细胞悬液铺于p e r c o l l 分离液中静置3 0 m i n 后，2 5 1 2 0 0 r p m 离 心6 m i n 纯化味蕾细胞，纯化前后味蕾细胞的纯度显著提高，从少于1 0 到高于6 5 ，电镜和免疫组化结果证明此方法的可行性与时效性。 ( 2 ) 小鼠味蕾细胞体外培养方法的建立，通过实验得出以i m d m ( 含 有1 ：5m c d b l 5 3 ：1 0 f b s ；2 0 n g m li n s u l i n ；1 0 0 u m l 1 0 0 m g m l p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i n ) 作为培养液，以i 型鼠尾胶原作为贴壁因子， 5 c 0 2 培养箱3 7 。c 培养，酶法分离的味蕾细胞培养效果优于直接法分 离的味蕾细胞。而且增殖实验及免疫组化结果表明虽然味蕾细胞在培养 两周后仍然具有与味觉感受相关的关键分子0 【g u s t d u c i n 等，但味蕾细胞 在体外的增殖能力较弱，只适合短期培养。 ( 3 ) 同种浓度的不同甜味剂与味蕾细胞相互作用的等温量热结果表 明，不同甜味剂与味蕾细胞的相互作用的热量变化与其甜度具有一定相 关性，甜度越高其热效应结果的绝对值越高。初步证明利用等温量热技 术从细胞层面上研究味觉感受的可行性，为后续研究奠定技术基础。 关键词：i c r 小鼠；菌状乳头；味蕾；0 【一g u s t d u c i n ；p e r c o l l ；等温量热 滴定；扫描电子显微镜 i i 浙江工商大学硕士学位论文 t h es t u d yo f0 ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n t e c h n o l o g yo ft a s t eb u dc e l l so fm o u s ea n d a p p l i c a t l 0 n a bs t r a c t t a s t e ，w h i c hi so n eo ft h em o s te s s e n t i a l ，p r i m o r d i a la n dn e c e s s a r y s e n s o r yf u n c t i o n s ，i su s e dt or e c o g n i z eq u a l i t yo ff o o d ，r e g u l a t ea p p e t i t ea n d c o n t r o lq u a n t i t yo ff o o di n t a k e h o w e v e r , t h ep r i m a r yt a s t er e c e p t i o no nt h e c e l l si st h ep r e r e q u i s i t ef o rt h et a s t ep e r c e p t i o n ，s t u d yo nt h ec e l l u l a rt a s t e p e r c e p t i o nh a sb e e nh a m p e r e db e c a u s eo ft h er e l a t i v e l yo u t d a t e dt e c h n o l o g y f o rs e p a r a t i n gt a s t eb u dc e l l s c o n s e q u e n t l y , i ti sc r u c i a lf o rt h ef u r t h e r r e s e a r c hw o r ki nt h i sf i e l dt oe s t a b l i s ha ne f f e c t i v et e c h n i q u et oo b t a i nt a s t e b u dc e l l sw i t hh i g hp r o d u c t i o n ，h i g hv i a b i l i t y , a n dh i g hp u r i t y , a n de s t a b l i s h am e t h o dt oc u l t u r et a s t eb u dc e l l s i c rm i c ew e r eu s e da st h ee x p e r i m e n t a la n i m a li no u rs t u d y t a s t eb u d c e l l so ff u n g i f o r m p a p i l l a e w e r ep r e p a r e da n d p u r i f i e db y at w o s t e p e n z y m a t i ct r e a t m e n ta n dp e r c o l l d e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，a n d e v a l u a t e db ya v i d i n b i t i n p e r o x i d a s ec m p l e xm e t h o d ，e l e c t r o nm i c r o s c o p e ， i m m u n o f l u o r e s c e n c et e c h n o l o g ya n dl a s e rc o n f o c o ls c a n n i n gm i c r o s c o p y i i i 浙江工商大学硕士学位论文 f i n a l l ya ne f f e c t i v et e c h n i q u ef o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft a s t eb u d c e l l sw a st h u se s t a b l i s h e d t h e no nt h eb a s i so ft h ee s t a b l i s h e dt e c h n i q u eo f s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft a s t eb u dc e l l s ，as h o r t t e r mc u l t u r i n gm e t h o d w a sd e v e l o p e db yc u l t u r i n gt h ep u r i f i e dt a s t eb u dc e l l sf r o mo u rt w o s t e p e n z y m a t i ct r e a t m e n ta n dt h e i s o l a t e dt a s t eb u dc e l l sf r o mt h ed i r e c t m e c h a n i c a lt r e a t m e n t f i n a l l y , t h et h e r m a lc h a n g e so c c u r r i n gd u r i n gt h e m u t u a lr e c o g n i t i o nb e t w e e nt a s t eb u dc e l lsa n ds w e e t e n e r sw e r ed e t e c t e db y i t c ，a n dt h ef e a s i b i l i t yo ft h e r m a ld y n a m i c ss t u d yo fs w e e t e n e rr e c o g n i t i o n b yt a s t eb u d c e l l sw a sd i s c u s s e d t h er e s u l t so ft h i ss t u d yw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h et e c h n i q u ef o rs e p a r a t i n g a n dp u r i f y i n gt a s t eb u dc e l l so f f u n g i f o r mp a p i l l a ew a se s t a b l i s h e db yo p t i m i z i n gt h e c o n d i t i o n sf o rt h e t w o - s t e pe n z y m a t i ct r e a t m e n tt oo b t a i n t h em i x e dc e l l s u s p e n s i o n t h e m i x e d e n z y m e s o l u t i o no f c o l l a g e n a s ei i ( 1 5 m g m l ) a n dd i s p a s e i i ( 1 5 m g m l ) w a su s e dt op e e lo f fl i n g u a le p i t h e l i u mb yi n c u b a t i n gt h e e x c i s e dt o n g u eo f6 - 8w e e k - o l di c rm o u s ef o r6 - 8 m i na tr o o mt e m p e r a t u r e t h e nt h et a s t eb u dc e l ls u s p e n s i o nw a so b t a i n e db yi n c u b a t i n gt h el i n g u a l e p i t h e l i u mf o r10 2 0 m i na t3 7 。cw i t ht h em i x e ds o l u t i o no f0 2 5 t r y p s i n a n do 0 2m m o l le d t a p u r i f i c a t i o no ft a s t eb u dc e l l sw a sc o n d u c t e db y i n c u b a t i n gt h ec e l ls u s p e n s i o nf o r3 0 m i nw i t hp e r c o l lw o r k i n gs o l u t i o na n d c e n t r i f u g i n ga tas p e e do f12 0 0 r p mf o r6 m i na t25 。c t h ep u r i t yo ft a s t eb u d c e l l sw a si m p r o v e df r o ml e s st h a n10 t om o r et h a n6 5 a f t e rt h i s i v 浙江工商大学硕士学位论文 t r e a t m e n t r e s u l t sf r o me l e c t r o n m i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y c o n f i r m e dt h ef e a s i b i l i t yo ft h i sm e t h o d ( 2 ) s h o r tt i m ec u l t u r em e t h o do fm o u s et a s t eb u dc e l l sw a se s t a b l i s h e d t a s t eb u dc e l l sw e r eb e s tc u l t u r e di n5 c 0 2a t3 7 w i t hi s c o v e sm o d i f i e d d u l b e c c o sm e d i u m ( c o n t a i n i n g1 ：5m c d b15 3 ，1 0 f b s ，2 0 n g m li n s u l i n ， 10 0 u m l 10 0 m g m lp e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i n ) a sc u l t u r em e d i u m ，a n dt y p e ir a tt a i l c o l l a g e n a sa d h e s i v ec o a t i n g c o m p a r e dw i t ht h em e c h a n i c a l m e t h o d ，e n z y m a t i cm e t h o ds h o w e db e r e ri n f l u e n c ef o rt a s t eb u dc e l l c u l t u r i n g r e s u l t sf r o mp r o l i f e r a t i o na n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi n d i c a t e d t h a ta f t e rt w ow e e k so fc u l t u r i n g ，t a s t eb u dc e l l ss t i l le x h i b i t e dt h e e x p r e s s i o no ft h ek e yb i o m a r k e ri nt a s t ep e r c e p t i o n ，s u c ha sq g u s t d u c i n h o w e v e lt a s t eb u dc e l l sp o s s e s s e do n l yw e a kp r o l i f e r a t i o na b i l i t ya f t e r c u l t u r i n g s ot h i sm e t h o dw a sj u s ts u i t a b l ef o rs h o r t t e r mc u l t u r e ( 3 ) r e s u l t sf r o mi t ci n d i c a t e dt h a tt h e r m a lc h a n g e sd u r i n gt h em u t u a l r e c o g n i t i o nb e t w e e nt a s t eb u dc e l l sa n dv a r i o u ss w e e t e n e r sa tt h es a m e c o n c e n t r a t o nw e r er e l a t e dt ot h es w e e t n e s so ft h es w e e t e n e r s t h eh i g h e rt h e s w e e t n e s sw a s ，t h eb i g g e rt h ea b s o l u t ev a l u eo ft h e r m a lc h a n g ew a s f o rt h e l o w - s w e e t n e s s s w e e t e n e r ，t h e i n t e r a c t i o nw i t ht a s t eb u dc e l l sw a s e x o t h e r m i c ，w h i l ef o rt h eh i g h s w e e t n e s ss w e e t e n e r , t h ei n t e r a c t i o nw a s e n d o t h e r m i c i ns h o r t ，i t cw a sf o u n dt ob ef e a s i b l ef o rt h es t u d yo nt a s t e p e r c e p t i o ni nt h el e v e lo fc e l l sa n dl a yaf o u n d a t i o nf o rt h ef o l l o w i n gs t u d y v 浙江工商大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：i c rm o u s e ；f u n g i f o r mp a p i l l a e ；t a s t eb u d ；0 t - g u s t d u c i n ； p e r c o l l ；i s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y ( i t c ) ；s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e v i 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获 得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 签名：b 之釜三鲨丝日期：加7 年。月哆日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文的 规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名乡迎 导师签名： 日期：1 加a 年。月 二 ， i 予日 浙江i 墒火学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 味觉概述 人和动物利用味觉来识别食物的性质、调节食欲、控制摄食量。从简单的水生 动物到复杂的哺乳动物以至人类都有其特异的味觉系统：味觉是动物最基本、最原 始也是至关重要的感觉功能。在低等动物中味觉与嗅觉是不加区分的，随着生物的 进化，嗅味觉才得以分离，产生和发展出形态与生理上有着明显差异的味觉系统与 嗅觉系统。各种动物利用它们特殊的味觉感受器高度敏感和高度专一的对外界环境 中的水溶性化学物质识别，并做出相应的趋向性或是规避性的行为应答；动物也利 用它们的味觉系统来寻找食物、调节食欲和逃避有害或恶劣的环境。因此，味觉对 于动物个体的发育以及动物种群的生存延续至关重要。 1 2 味蕾的分布 味觉的主要感受器官是昧蕾，在哺乳动物中，它主要分布在舌、上软膀、咽、 喉和食道的上部。舌上皮中有四种不同空间分布的舌乳头( 1 i n g u a lp a p i l l a e ) ：丝状乳 头( f i l i f o r m p a p i l l a e ，f d 、苗状乳头响n g i f o r m p a p i l l a e ，f f ) 、叶状乳头( f o l i a t ep a p i l l a e ， f l ) 和轮廓乳头( e i r c u m v a l l a t e p a p i l l a e , c v ) ，其中f f 、c v 、f l 乳头困含有昧蕾而被 称为味乳头( g u s t a t o r yp a p i l l a e ) ( 1 - i x c h a n d r a s h e k a re a 1 2 0 0 6 ) 。 abc 圈l - l 味蕾模式幽( a ) 、味乳头( b ) 、人舌( c ) ( c h a n d r a s h c k a r “a l ，2 0 0 6 ) f i g u ml is e h e n n a l i e d i a g r a m s o f t a s l e b u d ( a ) t a s l e p a p i l l a e ( b xa n d t o n g u e ( c ) o f h u m a n e b e i n g ( c h a n d r a s h e k a r e f a l ，2 0 0 回 浙江：i ：商人学硕十学位论文 舌面上，丝状乳头的数量最多，覆盖在整个舌前部背面，呈锥形，它们不含有 味蕾，起机械支持作用( z h e n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 菌状乳头分布在舌前部三分之二的区域，穿插在丝状乳头之间，在舌尖与舌边 缘分布较为密集。菌状乳头呈蘑菇状，顶端为圆形。越靠近舌后部，其体积越大， 而舌边缘的则较小，呈圆j 髟( d o t y , 2 0 0 3 ) 。不同物种，菌状乳头中所含的味蕾数量存 在很大差异，啮齿类动物每个菌状乳头中仅有一个味蕾，而有的哺乳动物每个菌状 乳头中可含有多个味蕾( n e l s o n ，1 9 9 8 ) 。 轮廓乳头位于舌后部界沟的前方，圆形，形体较大，顶端平坦，乳头周围的粘 膜凹陷形成环沟，沟两侧的上皮中分布着数百个味蕾，味孔开口于环绕每个轮廓乳 头的沟内。各种哺乳动物的轮廓乳头数量不等，啮齿类动物只有1 个轮廓乳头，兔 子和食虫类有2 个，有袋动物有3 个，食蟹猴有7 8 个，人类有9 一1 5 个( n e l s o n ，1 9 9 8 ； l i e b l a 1 ，19 9 9 ；k o b a y a s h ik e la 1 ，2 0 0 3 ；k o b a y a s h ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 叶状乳头位于舌的两侧，沿舌背面的后外侧边缘分布，位置稍前于轮廓乳头。 它形如叶片，由数条嵴和沟平行排列组成。味蕾存在于沟两侧的上皮中，味孔开口 于沟内。叶状乳头数随物种的差异变化也很大。一般而言，肉食类动物( 如猫、狗等) 的叶状乳头发育比较差，往往不具有叶状乳头或者仅形成一些指状的突起；而食草 动物中，非反刍动物( 如马和驴等) 和兔形目叶状乳头发育良好，但反刍动物( 如牛、 羊等) 几乎没有叶状乳头，或其发育较弱( k o b a y a s h ie ta 1 ，2 0 0 5 ) ；灵长类和啮齿类也 有叶状乳头适量发育。这些差异被认为是由于它们的饮食结构及饮食方式不同造成 的。 1 3 味蕾形态及味蕾细胞分型 哺乳动物的味蕾多呈球形和椭球形，其顶端在口腔的上皮表面有个开口，称为 味：f l ( t a s t ep o r e ，t p ) ，昧孔是味蕾与空腔连通的门户，也是i 味觉兴奋的起始部位，通 常呈圆形或卵圆形。味孔的出现是味蕾功能发育成熟的标志，味孔的形念和数量与 味觉的敏感性紧密相关( s e g o v i ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。味蕾由5 0 一1 5 0 个味蕾细胞组成，这些细 胞根据其超微结构可以分为4 种类型，其中基细胞是圆形增贿细胞占味蕾细胞的3 左右，它们位于味蕾的撼部，相剥+ 较少而且细胞体积较小。其它三种均是细长的柱 状上皮细胞，它们从咪莆的丛部一直延仲到味孔，根据结构的差异m u r r a y ( 1 9 9 3 ) 将 其分别定义为：i 型、i i 型和i i i 型细胞( 表1 1 ，图l - 2 ) 。 2 浙江工商大学硕士学位论文 表l - l i 、i i 、i i i 型味蕾细胞的形态特征( r o n a e ta l ，1 9 8 6 ；m u r r a y , 1 9 9 3 ； s e t ae ta 1 ，1 9 9 7 ；r u i ze la 1 ，2 0 0 1 ；f i n g e r , 2 0 0 5 ) t a b l el - lt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft y p ei ，i i ，i i it a s t eb u dc e l l s ( r o n ae la l ，19 8 6 ；m u r r a y , 1 9 9 3 ；s e t ae la 1 ，1 9 9 7 ；r u i ze ta 1 ，2 0 0 1 ；f i n g e r ，2 0 0 5 ) i 型细胞是暗细胞，呈纺锤形，它们数量最多约占味蕾细胞的6 0 。这些细胞 的项部末端有许多长短不一的细长微绒毛一直延伸到味凹与味孔之间，其胞浆中含 有丰富的微丝和粗面内质网，细胞核形状比较不规则，通常含有大量的异染色质。 i 型细胞的显著结构特征是在其顶端细胞质中存在许多1 0 0 - 4 0 0 n m 的致密团粒结构。 显微图谱显示，这些细胞像神经角质一样包裹在其它类型细胞的周围，对其他味蕾 细胞起到一种支持作用；免疫组化分析也证实，该型细胞表达一种神经角质谷氨酸 盐转运载体一谷氨酸盐天门冬氨酸盐转运载体( g l u t a m a t e a s p a r t a t et r a n s p o r t e r g l a s t ) ，这些特征表明i 型细胞具有神经角质功能( 图1 2 ) 。此外，b a r t e l 等人( 2 0 0 6 ) 的研究表明i 型细胞上表达了能够灭活或摄取神经递质的酶( a n 分解酶) ，这与细 胞间信息传递具有密切关系，并且最新研究得知i 型细胞还表达了能够感受咸味的 利尿剂敏感型钠离子通道( v a n d e n b e u c he ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 i i 型细胞是亮细胞占味蕾细胞的3 0 左右，也呈纺锤形，多数位于味蕾的外周， 其胞浆透亮，缺乏粗面内质网，细胞核大而圆，缺乏异染色质。l i 型细胞的顶端细 胞质中没有致密的团粒结构，其顶部末端有多个短微绒毛，它们的长度比较一致， 一直延伸到味凹底部。i i 型细胞上表达了甜、苦和鲜味转导所需的所有功能因子以 及能够与这些呈味物质结合的g 蛋白偶联受体( 如图1 2 ) ，并且有研究表明这些g 蛋白偶联受体在微绒毛上的表达量显著高于细胞的其他部位。综上特点，i i 型细胞 被广泛认为是味物质的感受细胞。 i u 型细胞又叫中间细胞约占味蕾细胞的7 ，位于味蕾的中间区域，胞浆透亮， 浙江工商大学硕士学位论文 有少量的大而致密的团粒浓集于细胞核周围，其显著特征是具有单个大而硬的微绒 毛一直延伸到味孔。它还具有突触与神经突起相连接，表达突触膜蛋白2 5 ( s y n a “c t y p e h p c l i t y p e i i i s i n g l ei h i c ka p i c a l 西e l o n 。g 。a t e 。, 。 x 。嚣? “ g l i a l l i k e t r a n s d u c i n gc e l l f o rs w e e t ， s y n 印s e s w i t h u m a m i ，b i t t e r g u s t a t o t ) t l t g i - v e s 往堆顶端行显示了i 、i i 、h i 型味细胞的关键形态特征；中间行列举了每个细胞类型的生化特征：最j 毫行显 示了每种细胞粪型可能的功能 图l 2 不同味细胞类型的主要特征示意图( k a i k a “甜。2 0 0 8 ) f i g u r e l - 2s c h e m a t i cd i a g r a m ls h o i n g t h e m a j o r f e a t u r e s o f t h e d i f f e r e n t t 越t cc e l l t y p e s ( k a t z 【o k a e l 耐2 0 0 8 ) m e m b r a n ep r o t e i n 2 5 ，s n a p 2 5 ) 和神经细胞支持分子( n e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e n c a l v 0 ，并且可出释放5 h t ( s e r o t o n i n ) 表明这些细胞在味觉信号传递到神经系统 的过程中发挥着作用( r o n ae ta l ，1 9 8 6 ；m u r r a y , 1 9 9 3 ；s e t ae ta l ，1 9 9 7 ；r u i ze t a l ， 2 0 0 1 ，k a a o k a 剖a | 2 0 0 8 ) 。 三种类型味蕾细胞除了特征分子和形态差异外，另一个值得注意的是i 型味蕾 细胞只有电压依赖性外向电流，缺少电压门控内向电流。1 i 、1 i i 型味蕾细胞既有电 压依赖性外向电流，又有电压门控内向电流，但i i 型细胞与i i i 型相比缺少了门控 c a “j 甩道( v a n d e n b e u c he l a l ，2 0 0 8 ) ，这些通道特征与他们的功能具有密切相关性。 关于味蕾生命周期中从胚胎祖细胞增殖分化成以上三种细胞类型的过程，目前 主要存在两种假说。一种假说认为，原始胚胎祖细胞产生增殖能力受限的基细胞， 浙江工商大学硕士学位论文 然后某些基细胞转化为i 型细胞，而其他一部分基细胞分别转化成i i 、u i 型细胞( 图 1 3 a ) ；另一种假说则认为，胚胎祖细胞产生多功能干细胞，这些干细胞再生成世 系受限的增殖细胞，这些细胞进一步生成不同类型的味蕾细胞( 图1 3 b ) ( s t o n ee ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 19 8 6 年d e l a y 等用高电压电子显微镜( h i g h v o l t a g ee l e c t r o nm i c r o s c o p i c ，h v e m ) 自动射线照相术( a u t o r a d i o g r a p h y , a r g ) 记录了小鼠单个味蕾注射3 h 胸腺嘧啶脱氧 核苷后其中标记味蕾细胞的整个生命周期。结果发现，最初9 0 以上的标记细胞为 基细胞，随后出现的标记细胞为i 型细胞，它们在注射四天后达到最大值，然后逐 渐减少；标记的i i i 型细胞在i 型细胞后出现，并在注射后第五天达到顶峰；标记的 a b o qq q 耐p e ：可p e1 i1 怕i i l i n e a g e - r e s p i t e d b a s a lc e i l s d i f j 融舒慨d t 罄kc e l l s o qq 1 mi 耐p 。i i1 y p ei l l 图1 - 3 味蕾中可能世系关系的示意图( s t o n ee ta 1 ，2 0 0 2 ) f i g u r e1 - 3s c h e m a t i cd i a g r a m s h o w i n gp o s s i b l el i n e a g er e l a t i o n s h i p si nt a s t eb u d s ( s t o n ee la 1 ，2 0 0 2 ) i i 型细胞出现最迟，持续增长直至第十天，达到总标记细胞的4 5 。d e l a y 等根据 这一结果提出了新的假说，他们认为首先产生的是i 型细胞，它转化成i i i 型细胞， 然后在成熟时发育成i i 型细胞( d e l a ye ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 但也有人认为，这三种细胞类型不仅仅是同一细胞类型的不同发育阶段。因为 在转基因小鼠中，表型成熟i i i 型细胞表达p g a l 蛋白，这种蛋白质即使在无蛋白合 成的条件下也能稳定存在几天。研究表明，i i 型和i i i 型细胞都是在有丝分裂后的 3 - 4 天达到表型的成熟，如果i i 型细胞是由i i i 型细胞转化而来的，那么2 4 h 后，应 该有大量含有高水平p - g a l 蛋白的i i 型细胞，但事实并非如此，含有p 鸣a l 蛋白的i i 型细胞非常稀少；再者，i i i 型细胞转化成型细胞需要在2 4 h 完成顶端结构的重 组并失去突触，这似乎不太可能。但是，目前各种假说都尚需要大量的实验去验证 ( f i n g e r , 2 0 0 5 ) 。 x 霁、鳋 龟lllqll毒。臼lll 浙扛工商大学硕士学位论文 14 昧觉感受 141 昧觉现象 摄食行为是人体最重要的生理行为，而味觉对于摄食行为中的辨味与促进食欲 起着十分重要的作用。食物中的化学物质( 味质) 溶解在唾液里，通过味蕾的味孔与 分布在味细胞顶端微绒毛上的味觉受体结合，使其被激活，通过变构作用引发味觉 信号转导的级联放大，引起分布于味细胞下部的感觉神经纤维兴奋，并逐级经脑干 向上传递至中枢进行信号处理，最终导致味觉的适应性反应( 李蕾蕾等，2 0 0 6 ) 。殊觉 是人们了解最少的一种感觉，如何从细胞和分于水平上研究并解释这些阀题，已成 为目前国际上研究的热点。 a 图i - 4 人舌“味觉图”。( a ) 人舌背面f f 、c v 、f l 乳头的分布模式；( b ) 苦( b i t t e r ) 、酸( s o u , r ) 、甜 o w e 吣、成( s d t ) 味觉敏感区( 阴影部分) ( s m i t he t a l ，2 0 0 1 ) f i g u 珥1 - 4 t h e ”t a s t e m a p ”o f h u m 锄t o n g u et h e d i s l f i h u f i o no f f f , c v , f l o n t h e b a s c r a lo f t o n g u e ( a ) a n d t h es e n s i t i v ea l c a o f b i t t e r , s o t ! l - ，s w a t ，s a k ( i n d i c t a t a db ys h a d o w p a r o ( b ) ( s m i t h “a ，2 0 0 1 ) 味觉生理和味觉行为学研究表明，舌面上各个区域的味蕾都能感受到酸、成、 苦、甜、鲜五种基本味感，但是不同区域对不同味感的敏感程度有所差异，这种差 异取决于味蕾的种类、性质及其分布密度。通过对人舌形态学、行为学和电生理学 得研究的研究，目前人们普遍认为人舌昧觉敏感区域的分布如图1 - 4 所示( s m i t hp f a l ，2 0 0 1 ) ：舌尖部位对甜味比较敏感，两侧对酸味比较敏感，两侧前部对成味比较 敏感，而软腭和舌根部位对苦味比较敏感。 142 昧受体 6 一o粤 一一一 一 一受 b 浙江工商大学硕士学位论文 目前已确定的哺乳动物味觉受体基因家族有两个：味觉受体第一家族( t a s t e r e c e p t o rf a m i l y l m e m b e r s ，t 1 r s ) 和味觉受体第二家族( t a s t er e c e p t o rf a m i l y2 m e m b e r s ，t 2 r s ) 。其中，t i r s 家族由三个基因组成：t 1 r 1 、t 1 r 2 和t 1 r 3 ，它们 以异源二聚体的形式发挥作用：t 1 r 2 和t 1 r 3 结合形成甜味受体，t 1 r 1 和t i l l 3 起作为鲜味受体，而t 2 r s 家族是苦味受体。对t 1 r s 、t 2 r s 基因的表达类型的 研究显示，t 1 r 1 和t 1 r 3 共表达的细胞中不含有t 1 r 2 ，表达t 1 r s 的细胞中不含 有t 2 r s ，这说明t 2 r s 苦味受体、t 1 r 2 + t 1 r 3 甜味受体和t 1 r i + t 1 r 3 鲜味受体分 布在不同的味觉受体细胞( t a s t er e c e p t o rc e l l s ，t r c s ) 中，同一味蕾中一个味细胞只能 表达一种味觉受体，只能识别一种味感( a m r e i ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，最近确定的酸味受体 也支持了上述论断( h u a n g e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 4 2 1 甜味受体 共表达t 1 r 2 t 1 r 3 的h e k 2 9 3 细胞的钙影像研究结果表明，这两种蛋白质共 同形成感受各种糖和人工甜味剂的功能受体，并且发现小鼠对应t 1 r 3 的s a c 基因 是其感受糖和人工甜味剂的主要遗传位点( n e l s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ；l ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 。敲除 t 1 r 2 或t 1 r 3 基因中的任何一个都会导致小鼠对各种人工甜味剂的反应消失，说明 这两种受体是识别人工甜味剂所必需的；但小鼠对天然糖的反应并没有完全消失： 对低浓度糖液的反应降低强烈，但对较高浓度糖液的反应则是部分降低。而 t 1 r 2 + t 1 r 3 基因的双敲除使小鼠对所有测试的不同浓度糖液的行为学与电生理学 反应均会消失，这表明，t 1 r 2 + t 1 r 3 是人工甜味剂的功能性受体与糖的高亲和力受 体，而t 1 r 2 、t 1 r 3 仅是糖的低亲和力受体( n e l s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ；张根华等，2 0 0 5 ) 。 值得注意的是，原位杂交分析显示，味蕾中有一部分味细胞只表达t 1 r 3 ，意味着 这个受体是一个在味细胞上独立存在的低亲和力糖受体，而t 1 r 1 或t 1 r 2 在任何 味细胞中均不会单独表达。这样的表达模式基本能解释味细胞识别糖与人工甜味剂 存在的差异性。 t 1 r 2 + t 1 r 3 主要集中表达在舌后部轮廓乳头、叶状乳头和上腭，但k i m 等( 2 0 0 3 ) 研究发现，其在菌状乳头中也具有表达。t 1 r 2 和t 1 r 3 在与甜味剂的结合中发挥着 不同的作用。t 1 r 2 虽然在昧细胞内不能单独表达，但它介导某些甜味剂的感知， 它的胞外n 端区是阿斯巴甜、莫内林等的重要结合位点，它的c 端与g 蛋白偶联 ( x ue t a l ，2 0 0 4 ) ；而目前至少有一种甜味剂c y c l a m a t e 是与t 1 r 3 的七次跨膜区相结 7 浙江工商大学硕士学位论文 合的，此区域某些氨基酸残基的差异导致人和小鼠对c y c l a m a t e 具有不同的甜味感 受，另外，推测认为，t 1 r 3 的跨膜区可能在受体从基态向激发态的转变中发挥着 关键作用( j i a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。目前已经证实，甜味受体t 1 r 2 + t 1 r 3 具有多个结合位 点，从而对应识别结构各异的甜味刺激物( d u b o i s ，2 0 0 4 ；n i ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 4 2 2 鲜味受体 鲜昧受体t 1 r i + t 1 r 3 在舌面的某些味细胞亚型中具有表达；它对l 型氨基酸 具有高度的选择性，而不与d 型氨基酸和天然、人工甜味剂结合( n e l s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ； 它的活性能被单磷酸肌苷( i n o s i n em o n o p h o s p h a t e ，i m p ) 矛 i 单磷酸鸟苷( g u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ，伽) 这两种典型的鲜味增强剂增强，t 1 r 1 或t 1 r 3 基因单敲除后， 小鼠对i m p 增强的特征型鲜味感完全消失。t i r l 或t 1 r 3 基因单敲除小鼠对谷氨 酸和其它氨基酸的行为学和电生理反应都严重下降；虽然该小鼠对谷氨酸钠 ( m o n o s o d i u m 9 1 u t a m a t e ，m s g ) 仍有残留的神经反应和行为学喜好，但z h a o 等( 2 0 0 3 ) 证实，这是由于钠盐组分的存在，而非谷氨酸根本身。这些结果确