（食品科学专业论文）柑橘果胶酯酶的基因克隆.pdf

柑橘果胶酯酶的基因克隆 食品科学专业 研究生叶华指导教师马力 摘要 果胶酯酶( e c ：3 1 1 1 1 ) 是果胶酶的一种，它是一种能催化、水解果胶生 成果胶酸和甲醇的酶，英文名为p e c t i n e s t e r a s e ，又称p e c t i nm e t h y l e s t e r a s e 、p e c t i n d e m e t h o x y l a s e 或p e c t i nm e t h o x y l a s e 。英文简称p e 或p m e 。国际酶委员会将它 妇类为果胶一果胶酰基水解酶。它存在于所有植物组织中。一些酶菌和细菌， 如能引起软腐病的欧氏杆菌、干蓝黑腐黄杆菌和甘蔗流胶病黄杆菌等也能产生 p e 。 果胶酯酶是一种广泛使用的工业酶类，主要用于果蔬饮料加工业中。目 前，对果胶酯酶用于制备低酯果胶的研究也越来越受到人们的重视。对果胶酯 酶基因方面的研究，国内鲜有报道，而在国外却是研究热点之一。 本文对柑橘皮中的p m e 进行了研究。具体研究结果如下： 1 根据核苷酸序列分析结果设计引物，利用r t - p c r 技术从柑橘皮组织总r n a 中扩增获得p m e 基因，并成功地克隆到p g e mte a s y 载体上，基因全长为 1 7 9 7 b p ，开放阅读框架长1 7 8 5 b p ，编码5 9 4 个氨基酸。 序列分析表明：氨基 酸序列中含有5 个潜在的糖基化位点，在2 9 到4 8 位之问可能是信号肽区域。 其最大可能剪切( m o s tl i k e l yc l e a v a g es i t e ) 位点可能在4 5 和4 6 位之问即： v v 卜f f 。大约在2 ( 】一5 0 位氨基酸之问含有一个典型的疏水性区域。这很有可能 含有一个跨膜区。但是亲水性分析表明该p m e 序列具有高度亲水性。另外通过 序列对比分析发现p m e 基因含有四个非常保守的c y s 残基，笔者认为这个四个 保守的c y s 残基参与二硫桥的形成，因此与p m e 结构有很大关系。 2 通过c l u s t a l w 软件分析表明，该p m e 基因其实就是可隆正确的c it r u s s i n e n s i s 的c s p m e 4 基因。但是它与c i t r u ss in e n s i s 其他的p m e 基因在进化 上有很大差别，从而他们的性质应该有很大不同，而这与文献报道的c s p m e 4 是一种不同于另外两种p m e 的热稳定性酶一致。同时，根据进化分析表明，笔 者认为在亚麻( i j n u m u s i t a t i s s i m u m ( f l a x ) ) 中很可能存在类似该热稳定性的p m e 。 3 本实验采用盐提法从柑橘皮中提取果胶酯酶，用p h - s t a t 法测定酶在不同温 度和不同p h 下的活性，得到如下结果：所提取的酶最适温度在5 0o c 左右，且 在该温度下对热稳定性好：在5 0 。c 时热处理5 0 m i n 后仍保有8 0 以上的活力。 当温度高于5 0 。c 时，酶的活力下降较明显。最适p h 在8 左右。当p h 大于8 时，酶活力下降。由此表明，该酶的最适宜工作环境是5 0 。c ，p h = 8 。 关键词：柑橘果胶酯酶基因克隆 a b s t r a c t g e n ec l o n i n go fo r a n g ep m e s p e c i a l t yo ff o o ds c i e n c e p o s t g r a d u a t e ：y eh u a a d v i s o r ：m al i p e c t i nm e t h y l e s t e r a s e ( e c ：3 1 1 1 1 ) ，w h i c hb e l o n g st os a p o n i f c a t i o n a le n z y m e ，c a l l r a n d o m l yh y d r o l y z et h em e t h y le s t e rb o n do fp e c t i n i ti sd i s t r i b u t e di na l lo fp l a n t s a n ds o m eo fm i c r o o r g a n i s m s p m ei so n eo fe n z y m e st h a tw i d e l yu s e di n i n d u s t r y ，e s p e c i a l l yi nb e v e r a g ei n d u s t r y r e c e n t l y ，t h ep r e p a r a t i o no fl m 。p e c t i nb y p m ei sm o r ea n dm o r er e g a r d e db ys c h o l a r s t h er e s e a r c ho fp m eg e n ei sh o t s p o t o v e r s e a s ，b u tf l e s hr e p o r t si nc h i n a p m ei nc i t r u sp e e lh a sb e e nr e s e a r c h e di nt h i sa r t i c l e t h em a i nr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 p m eg e n ef r o mc i t r u sp e e l sw a sc l o n e du s i n gr t p c r w eo b t a i n e dal e n g t ho f 1 7 9 7 b pg e n e ，a n di t so r f i s1 7 8 5 b p ，c o d i n g5 9 4a m i n oa c i d t h es e q u e n c ea n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h i sg e n eh a s5p o t e n t i a ln g l y c o s y l a t i o ns i t e s s i g n a lp e p t i d ei s c o n s i s t e do f1 9a m i n oa c i dr e s i d u e s ，t h em o s tl i k e l yc l e a v a g es i t ei sl i k e l yt os i t u a t e d i nb e t w e e n4 5a n d4 6 ( v v t i i ) h y d r o p h o b i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tb e t w e e ns i t e s2 0a n d 5 0i sat y p i c a lh y d r o p h o b i cr e g i o n ，a n di ts t a n d sag o a dc h a n c eas p a nm e m b r a n er e g i o n b u t h y d r o p h o b i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h i sp m eg e n ei sah i g h l yh y d r o p h f l ep r o t e i n p m eg e n eh a s f o u rh i g h l yc o n s e r v e dc y sr e s i d u e s ，w ep r e s u m e dt h a tt h e ye n g a g e di nd i s u l f i d eb r i d g e sa n d h a v eai m p o r t a n tr o l ei np m es t r u c t u r a l 2 t h ec l o n eg e n ei sd i f f e r e n tw i t ho t h e rp m e sf r o mc i t r u ss i n e n s i si na n a g e n e s i s 一嫩了h ei th a sad i f f e r e n tc h a r a c t e r i s t i cw i t ho t h e r s a n dt h i si sh a p p e n e dt oh a v e t h es a m ev i e wt h a tc s p m e 4i sat s p m e f r o mp h y l o g e n e f i ct r e ew ef o u n dt h a t t h es i m i l a r i t yt s p m ei sp r o b a b l ee x i s ti nl i n u m u s i t a t i s s i m u m ( n a x ) ，t o o 3 p m ew a sa b t a i n e df r o mc i t r u s p e e l sb ys a l t s a t u r a t i o n u n d e rd i f f e r e n t t e m p e r a t u r ea n dd i f f e r e n tp h ，t h ep m ea c t i v i t yw a sm e a s u r e db yp h s t a ts t a n d a r d m e t h o d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：j t so p t i m a lt e m p e r a t u r ew a sa b o u t5 0 a n d u n d e rt h i st e m p e r a t u r et h ep m eh a sag o o ds t a b i l i t y ：t h e r ei ss t i l lh a v ea b o v e8 0 a c t i v i t ya f t e r5 0 m i nh e a th a n d l ea t5 0 w h e na b o v e5 0 t h ea c t i v i t yd e c r e a s e d o b v i o u s l y i t so p t i m a lp hi sa b o u t8 a l li n d i c a t e dt h a tp m e so p t i m a lw o r k i n g c o n d i t i o na r e5 0 ，p h = 8 。 k e yw o r d s ：c i t r u sp m e g e n ec l o n i n g 西华大学硕士学位论文 1 综述 1 1 果胶与果胶酶 1 1 1 果胶 果胶物质( p e c t i n ) 在自然界中分布非常广泛，它是植物体中一类复杂的 胶体性质糖类，是天然的高分子化合物，分子量约5 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 。它是植物细 胞壁的重要组成成分，主要存在于细胞壁的中问层( m i d d l el a m e l l a ) ，初生壁 ( p r i m a r yw a l l ) 也有一部分，而次生壁( s e c o n d a r yw a l l ) 则很少有果胶物质存在【”。 所以，果胶物质是细胞与细胞之间的连接物质【2 l 。适当的酶处理可使中层细胞 与细胞分离。 w e c k l e r 3 l 采用甲基化分析方法结合其他分析方法得知，果胶分子中主链是 为a 一( 1 4 ) 糖营键结合的d 一半乳糖醛酸一鼠李糖的重复结构以及多聚半乳糖 醛酸组成的聚台体，侧链结合有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖等分子。果胶( p e c t i n ) 的代表性结构如下： c o o h 在植物果实组织中，果胶是以原果胶( p r o t o p e c t i n ) 、果胶( p e c t i n ) 和果胶 酸( p e c t i ca c i d l 三种形式存在的。未成熟的果实中的果胶物质大部分以原果胶的 形式存在，不溶于水，与纤维素等将细胞与细胞紧紧的结合在一起，果实显得 坚实脆硬。随着果实的成熟，原果胶在原果胶酶的作用下，分解成可溶于水的 小分子量的果胶并与纤维素分离，进入果实细胞质中，果实组织就变软且富有 弹性。当果实进一步成熟时，果胶在果胶酯酶的作用下继续分解成为果胶酸和 甲醇，由于果胶酸不具牯性，果实就变成软疡的过熟状态。 各种果胶物质之间的重要差别是它们的甲酯含量和酯化程度，它随植物成 第1 页其6 8 页 凹华大学硕士学位论文 熟度的增加而有些下降。果胶中平均每1 0 0 个半乳糖醛酸残基c 。位上以甲酯 化形式( 带有甲氧基) 存在的百分数称为果胶的酯化度d e 值( d e g r e eo f e s t e r i f i c a t i o n ) 或d m 值( d e g r e eo fm e t h o x y l a t i o n ) ；同样每1 0 0 个半乳糖醛酸残 基c 。位上以酰胺化形式存在的百分数则称为d a 值( d e g r e eo fa m i d a t i o n 酰胺 化度) 。f c c 规定：d e 值高于5 0 的果胶称为高甲氧基果胶( h i g hm e t h o x y l p e c t i n ，h m p e c t i n ) ，反之称为低甲氧基果胶( l o w m e t h o x y l p e c t i n ，l w - p e c t i n ) ， 后者包括酰胺果胶。自然界天然存在的果胶大多是高甲氧基果胶。 目前生产果胶主要原料是柑桔皮，也有以柠檬皮渣、苹果皮渣等果实皮渣 为原料生产果胶。我国果胶资源丰富，柑桔皮、甜菜亚粕、苹果皮渣、柠檬皮 渣、向日葵等均含有大量果胶，已经成为具有工业化生产价值的主要原料。但 是不同来源的果胶，由于分子量、甲酯化程度、带有其他基团的多少等均有区 别，所以在性质方面也有所不同，而且原料自身带有的特殊色泽和气味对果胶 产品质两也有影响【4 j 。商品化果胶有果胶液、果胶粉和低甲氧基果胶粉三种， 呈乳白色或淡黄褐色，稍有特异臭【5 】。传统的工业化生产果胶主要是酸提取法。 然而这一加工过程存在一些不足：残渣分离困难，设备容易腐蚀，能源消耗很 大，同时还产生大量酸性废弃物对环境造成污染。而酶法生产果胶有着更多的 优点：分子量大，质量稳定，含有较多的中性多糖且果胶提取完全，发酵液中 果皮不破碎，也不需要进行热、酸处理，产品容易分离。例如用原果胶酶催化 原果胶生成果胶。 有关资料表明：全世界果胶的年需求量近2 0 0 0 0 吨，其中美国就高达4 5 0 0 吨，据有关专家预计果胶的需求量在相当长的时间内仍将以每年1 5 的速度增 长。据不完全统计我国每年约消耗1 5 0 0 吨以上，其中从国外进口约占8 0 ， 目前需求量仍呈高度增长趋势。果胶主要生产国有丹麦、英国、美国、以色列、 法国等，亚洲国家产量极少，特别是消费量约占世界产量1 0 的日本因无生产 厂家，完全依靠进口。在我国由于进口果胶价格远高于国产果胶，国产果胶成 了众多企业的期盼，因此大力开发我国丰富的果胶资源，生产出优质果胶，满 足国内外市场需求已显得极为迫切。 随着社会的发展、人们生活水平的不断提高、消费观念的变化以及人们对 人生价值的理解，健康越来越受到人们的重视。低热量食品则是众多消费者消 第2 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 费的首选食品。低甲氧果胶除了有果胶的种种用途外，还可以制成低糖、低热 量的果酱类食品，在保健食品工业上已日益受到重视。由于低酯果胶属于低热 量食品，倍受消费者的欢迎，尤其是糖尿病患者。因此低酯果胶食品的需求量 将呈增长趋势，对低酯果胶食品的研究和开发将具有不可估量的市场前景。尽 管可以从大量植物中获得果胶，但是商品果胶的来源是非常有限的，而且天然 存在的果胶主要是高甲氧基果胶，因此需要开发其他果胶资源和改造现有果胶 以获得理想品质的低酯果胶。目前制备低酯果胶的方法很多，有酸催化法、碱 催化法、酰胺化法、酶解法等。但用酸直接对高酯果胶催化脱酯，甲酯化程度 的改变不大【6 】。用碱催化脱酯，由于果胶特有的b 一消除作用不仅使得产物的平 均分子量大幅度下降，而且产物的甲酯化程度实际上很难控制。尽管在低温下 使用弱碱氨水催化有所改善，但是果胶却伴随发生酰胺化作用，从而影响了产 品的性能和使用范围。而用酶法脱酯具有很多优点：简化工艺流程和设备，提 高生产效率，工艺易于控制，且能更好地保持产品的胶凝度。因此酶法是制备 低酯果胶的一种较稳定的方法，也是目前研究的热点。 果胶在工业中有着广泛的应用。主要应用于食品、医药、化工和其他工业 中。 1 ) 在食品工业中主要作为胶凝剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂和组织成型 剂等。按我国g b 2 7 6 0 8 6 规定，果胶作为增稠剂可以用于罐头、果酱、糖果、 果汁、冰淇淋和巧克力，用量按正常生产需要。果胶作为食品亲水胶体，主要 是利用其凝胶特性，增加产品的稳定性。例女u s z j 作果酱、果脯、果冻、蜜饯等 食品。制备特殊食品在选择果胶时，要考虑多种因素，如质构要求、p h 、加工 温度、某些离子的影响、蛋白质和期望的产品货价期等1 7 j 。如在制作酸奶制品 时，使用高酯果胶能增加稳定性，而低酯果胶则能防止果肉在酸奶中漂浮和不 均匀分布【8 9 】。近年来，果胶在低热量食品中还用作脂肪或糖的替代品。 2 ) 在医药工业中，果胶是一种优良的药物基质【l o j ，可以防止有毒阳离子 中毒、维持血液中正常的胆固醇含量【1 1 】，还具有抗菌、止血和降血脂等作用1 1 2 】。 在化妆品和微生物的培养方面也有应用【l3 1 。果胶与其他药物配合可用于防治 砸心病、动脉硬化、高血脂等病。与其他胶结合使用被广泛用于治疗腹泻，特 别是婴幼儿的腹泻。果胶还可替代肝磷脂( h e p a r i n ) ，可以通过静脉注射果胶， 第3 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 缩短流出血液的时间，从而控制血液流出。另一方面，果胶硫酸盐还可以延长 血液凝结时间。但是果胶酸盐有毒，长期和高剂量使用则受到限制。果胶还可 以治疗过食紊乳症忠者【7 l 。 3 ) 在其他工业中，果胶可用作造纸和纺织的施胶剂、水油乳浊液的乳化 稳定剂。由于果胶具有成膜特性，果胶还可用于制各超速离心膜和电渗析膜等。 天然果胶制成的薄膜可被微生物降解并易于回收利用，因此，引起了学者的极 大兴趣。果胶酶可以用来制作饮料吸管，当液体流过吸管时，果胶层中的色素 和风味物质就会释放出来1 7 】。e n d r e s s 1 4 1 还报道了果胶的其他非食品用途。 高酯果胶主要用于带酸味的果酱、果冻、凝胶软糖、糖果馅芯以及酸菌饮 料的稳定剂。 低酯果胶主要用于一般的或低酸味的果酱、果冻、凝胶软糖以及冷冻甜点、 色拉调味酱、冰淇淋、酸奶等的稳定剂。 果胶是人类饮食的基本成分。目前以水果和蔬菜计量的果胶消耗量是工业 果胶分离量的很多倍，而且，由于其安全性促进了这种天然产物的广泛应用。 专家认为，利用柑、橘、柚类果皮果肉为原料，生产高、低酯果胶，有利于农 副产品深加工增值、农业增产、农民增收。低酯果胶可应用为食品添加剂、医 药保健品生产原料，在纺织工业、木材工业等方面，市场前景也卜分看好。相 信，随着对其研究的不断深入，果胶工业将会有更大的发展和更新的前景。 1 1 2 果胶酶 果胶酶f p e c t i n a s e ) f - ；：f f _ 存在于果蔬组织及许多高等生物中( 称内源性果胶 酶，e n d o g e n o u sp e c t i ce n z y m e s ) ，它在植物的成熟、采后生理变化、储藏加工 中扮演重要角色。果胶酶在果胶质的三种状态( 原果胶、果胶、果胶酸) 之问 的转化起着重要的作用。 我国水果资源极为丰富，近几年来随着饮料行业的快速发展，对果胶酶的 需求也日益俱增。目前，商品果胶酶主要来自酶菌，是混合制剂。工业生产果 胶酶的菌种主要有文氏曲霉、苹果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等， 此外，小质壳霉、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、葡萄孢霉、镰刀霉也能产生果胶 酶。这些由微生物产生的果胶酶为外源性果胶酶。 第4 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 1 1 2 1 果胶酶的分类 通常所说的果胶酶是指一类分解果胶的多酶复合酶体系。果胶酶按其对果 胶底物作用方式可以分为四类： ( 1 ) 聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ，p g ) 能分解半乳糖醛酸中的a 一1 ， 4 糖苷键，根据其作用方式，可分为： a 内聚半乳糖醛酸酶( e n d o p g )从分子内部无规则地切断q 一1 ，4 糖苷键， 可使果胶或果胶酸的粘度迅速下降，其最佳作用底物是果胶酸，最终降解产物 是单半乳糖醛酸、二半乳糖醛酸和三半乳糖醛酸； b 外聚半乳糖醛酸酶( e x op g )从分子末端逐个切断旷l ，4 糖苷键，生成 半乳糖醛酸，粘度下降不明显。 ( 2 ) 果胶裂解酶( p e c t a t el y a s e ，p l ) 由b 消去反应裂解a l ，4 糖苷键，在反 应产物的非还原端残基c 一4 和c 一5 之问产生一个双键。可裂解高度酯化的果胶， 能迅速降低粘度。目前仅发现内切型。其又可分为： a 内切果胶酸裂解酶( e n d o p e c t a t el y a s e ，e n d o p a l )以随机方式裂解底物， 最佳底物是低甲氧基果胶； b 外切果胶酸裂解酶( e x o p e c t a t el y a s e ，e x o p a l ) 由非还原末端将半乳糖 醛酸二聚体裂解下来只能裂解与游离羧基相邻的糖苷键，最佳底物是果胶酸， 能降解二聚体。 ( 3 ) 果胶甲酯酶( p e c t i n e s t e r a s e ，p e ) 可促使果胶脱酯，生成果胶酸。p e 对 果胶溶液的粘读几乎没有影响，去酯化后的低酯果胶或果胶酸很容易与c a “ 交联。 ( 4 ) 原果胶酶使不溶性原果胶生成可溶性果胶。 一直以来，关于果胶酶的研究主要侧重于果胶复合酶方面，对单一酶的研 究却不多。最近，对于果胶酯酶和原果胶酶的研究越来越受到学者的广泛关注。 1 1 2 2 不同果胶酶( 外源性) 及其组合在工业中的作用 果胶酶在食品工业中应用非常广泛，尤其是水果加工业，对提高果汁出汁 率和果酒的澄清度有良好的效果。在果汁制备过程中，应用果胶酶制剂处理有 助于压榨和提取汁液，在进行沉降、过滤和离心时，能促进凝聚沉淀物的分离， 第5 页共6 8 页 i ! 华大学硕士学位论文 因而使果汁得以澄清，而且经过果胶酶处理的果汁也比较稳定，不会再发生混 浊。果胶酶已广泛应用于苹果汁、葡萄汁、柑桔汁和山渣汁的生产。此外，果 胶酶在木材加工中可增加木材的通透性，提高木材的防腐效果。果胶酶也是较 常用的一种饲料酶制剂。果胶酶具有广泛的用途，已成为世界四大酶制剂之一。 各种酶( 外源性) 及组合的作用如表1 1 。 表卜1 不同果胶酶( 外源性) 及组合在工业中的技术角色 tablel-1thedifferentrolesofpectinaseandtheircombinationsini n d u s t r y 酶及其组合作用 p e果汁澄清 p 札 浸解 p l p e + p g p g ( + p ea n d o r p l ) + 、f 纤维素酶 或纤维素酶 浸解 果汁澄清 酶法提取果汁 提高柑橘汁的稳定性 生产浓缩汁时降低粘度 浸解法生产带肉果汁 果汁澄清 酶法浸提果汁 洗浆工艺的脱果胶 从柑橘皮中提取浑浊悬浮剂 酶法液化 西华大学硕士学位论文 1 1 2 3 果胶酶与果汁中的果胶物质的作用机制 果胶酶是一群复杂的酶，是诱导酶。它一般受果胶、植物维管组织、低浓 度的( 0 1 ) d 半乳糖醛酸、半乳糖诱导，受葡萄糖、较高浓度( 1 ) 的半 乳糖醛酸、抗体、某些抗菌素( 如阿莫西林) 、植物的p g 抑制蛋白( p g i p ) 抑制。 果汁中的果胶在聚半乳糖醛酸裂解酶的作用下，裂解成可溶性的短链果 胶，使果汁的粘度迅速下降。在果胶酯酶的作用下，果胶水解脱去甲基形成低 酯果胶。低酯果胶在聚半乳糖醛酸酶的催化下，水解成可溶性的短链果胶酸。 当低酯果胶的酯化度于1 4 时，与二价阳离子如c a 2 + , m 9 2 + 等作用形成不溶性 的果胶酸盐，并和果汁中的混浊物一起沉淀、析出。果胶酶制剂对果汁中的果 胶物质的作用机制具体可以用下图表示： f f ! 竺酯妊胶i。 价 金 属 离 子 不溶性 果胶酸盐 c a 2 + 等 聚半乳糖醛酸酶 聚半乳糖醛酸裂解酶 果汁中的 混浊物 f i g l 一1t h em e c h a n i s mo fp e c t i n a s ea c t i o nt op e c t i n 图1 1 果胶酶对果汁中果胶物质的作用机制 三j _ i7 页共6 8 页 可溶性短 链果胶酸 共同沉淀 物析出 幽华大学硕士学位论文 1 2 果胶酯酶 果胶酯酶( e c ：3 1 1 1 1 ) 是果胶酶的一种，它是一种能催化、水解果胶 生成果胶酸和甲醇的酶，英文名为p e c t i n e s t e r a s e ，又称p e c t i nm e t h y l e s t e r a s e 、 p e c t i nd e m e t h o x y l a s e 或p e c t i nm e t h o x y l a s e 。国际酶委员会将它归类为果胶一 果胶酰基水解酶。 1 2 1 果胶酯酶的存在与来源 果胶酯酶存在于所有植物组织中，并且存在于至今所发现的所有种属中 1 5 1 。在高等植物组织如番茄、胡萝h 、马铃薯、豌豆、黄瓜、花椰菜、大豆、 洋葱、韭菜、柑桔、苹果、香蕉、樱桃、葡萄、芒果、梨、番木瓜等中都有过 p e 的报道文献。一些酶菌和细菌也能产生p e 。某些植物病原菌，如引起软腐 病的欧氏杆菌、干蓝黑腐黄杆菌和甘蔗流胶病黄杆菌也能产生p e ，但是，值 得注意的是，能够产生p e 的微生物，一般只是在其生长的过程中，也即某个 阶段内产生，而在另一些阶段不一定产生【l 。 1 2 2 果胶酯酶的分子量及分子组成 由于果胶酯酶来源广泛，且有很多同工酶，是一个多基因家族酶。因此它 们的性质有所差别。但是总的来说，果胶酯酶是一种中分子量酶，分子量范围 在2 3 6 2 k d a 之间。一些来源的p m e 的分子量见1 2 4 1 果胶酯酶的性质一节 表1 2 ，由表1 2 可以看出，植物p m e 的分子量要比微生物p m e 的分子量大， 且植物p e 的分子量变化范围较宽大，一股在1 5 0 0 0 3 6 0 0 0 d a 。而微生物p m e 的分子量则大于4 0 0 0 0 d a 。如黑曲霉p e i 的分子量为4 6 0 0 0 d a 。 大部分果胶酯酶都是糖蛋白，含糖的比例不同，糖与蛋白质之间的连接方 式以共价连接为主。其单聚体很活泼。但是也有非糖蛋白p e ，如e c h r y s a n t h e m i 中的p e 则是个脂蛋白酶i ”j 。 1 2 3 果胶酯酶的结构 由于研究方法和仪器的不断进步和改善，对物质的结构力面的研究已经并 不是什么难题。第一个p m e 的一级结构是对番茄p m f , 的研究得到的。当时是由 第8 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 f i g1 2s e c o n d a r yr e n d e ro fe c h r y s a n t h e m ip m ec y s t a f 图卜2e c h r y s a n t h e m ip m e 的晶体结构 f i g l - 3s e c o n d a r yr e n d e ro fc a r r o tp m ec y s t a 图卜3 胡萝hp m e 的晶体结构 第9 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 0 m a r k o v i e 1 8 1 9 】等人对番茄中的p e 同工异构体进行了研究并第一个确定了 番茄p e 的蛋白质序列。后来，d n a 序列表明基因组含有多个p m e 基因，编码 不同的异构体，且这些p m e s 由高分子量前体合成【2 02 。a r a b i d o p s i s 全基因 组序列表明存在有两类p m e 基因：第一类，含有一个长n 末端前区域 ( p r o r e g i o n ) ，称类型l ；第二类，含有一条短的或没有前区域( p r o r e g i o n ) ， 我们称之为类型i i 。n 末端前区域( p r o p e p t i d e s ) 大小和序列是可变的，并 且氨基酸相似性较低。高保守区域是由c 一末端水解区域所取代，它构成了成 熟酶【2 2 1 。 p m e 的三维晶体结构最近由x 一衍射法确定。来自于植物病原体细菌 e r w in i ac h r y s a n t h e m i 、植物软组织部分口】的p m e a 以及来自于胡萝h 根【2 4 】 的p m e 的晶体结构表明，该酶折叠成右手平行b 一螺旋状，与果胶裂解酶的结构 一样【冽。推测其活性位点由两个天冬氨酸和一个精氨酸残基组成。它们位于 由突环形成的裂口处的平行b 螺旋的表面，是果胶的结合位点。植物p m e 和细 菌p m e 的结构的最大不同之处是活性位点裂口( c l e f t ) 的形状不同，植物p m e 的裂口浅，且有较少的细胞壁。其晶体结构如图卜2 、图卜3 。 1 2 4 果胶酯酶的性质与作用机理 1 2 4 1 果胶酯酶的性质 果胶酯酶的来源广泛，无论来自于植物还是微生物，它们的性质都有很大 差别。研究发现，p e 有酸性、碱性和中性三种形式。大部分植物果胶酯酶都 具有中性或碱性等电点，而细菌和酶菌p e 的等电点则在酸性范围内。然而在 一些植物组织的可溶性部分发现了中性和酸性p m e 2 6 】。 不同来源的p m e 的性质如表1 - 2 所示。由表可以看出，植物p m e 的最适 p h 处于碱性范围内，一般情况下是7 5 8 0 。而霉菌p m e 的最适p h 则偏酸性 ( 如黑曲霉最适p h 在3 8 左右) 。在热稳定性方面，植物p m e 比霉菌p m e 的热稳定性要好。例如番茄果胶酯酶在p h = 6 和0 1 m o l 几n a c l 溶液中，在7 0 下加热1 小时后仍有5 0 的酶活力【3 0 j 。 西华大学硕士学位论文 番茄1 3 1 脐橙 大豆细胞壁1 7 6 1 a c t i n i d i a c h i n e n s i s 舢i l 【川 p a p a y af r u i t ” 向日葵花盘p 1 s o u r s o pp u l p ”1 葡萄1 3 2 j 胡萝h 1 3 3 1 爱玉果实阻i 刺果番荔枝口l 柑桔i 刈 金尾虎果旧 假单胞菌属i 叫 针尾曲霉瞄】 酶菌果胶酯酶 ( 黑曲霉) c u r v u l a r i ap e 4 1 细菌p e 1 6 】 2 3 7 0 0 3 5 5 0 0 p m e i3 6 2 0 0 p m e 3 6 2 0 0 h m w - p e5 4 0 0 0 p m e3 3 0 0 0 p m e l p m e 2 p m e 2 2 7 0 0 0 p h l e”0 0 0 p m e p m e l p m e 2 t l t s p e i p e p e i p 即 p m e p m e p e 3 s l p e l 3 9 1 p e i l 4 0 l p e l l l 4 0 l p e 2 9 1 0 0 2 4 1 0 0 3 6 0 0 0 5 1 0 0 0 3 4 5 0 0 3 8 0 0 0 2 9 1 0 0 2 4 1 0 0 3 7 0 0 0 1 5 4 0 0 1 5 6 0 0 4 1 k d a 4 3 k d a 3 5 0 0 0 4 6 0 0 0 4 7 0 0 0 8 0 8 5 7 6 7 6 8 0 8 o 8 0 8 0 7 5 7 旷8 o 7 0 7 5 8 0 7 o 一8 0 7 0 8 0 9 0 9 0 9 o 4 5 6 0 4 0 55 4 0 5 5 4 4 7 5 8 o 7 9 3 1 0 0 53 0 1 1 0 7 3 7 3 ) 9 0 9 0 9 0 1 0 0 1 0 0 3 7 3 8 3 8 5 c 仍有活性 1 的耐热性 9 3 3 m g 1 比2 好 9 7 4 m g - 3 5 4 5 0 2 3 8 w a 0 1 s 6 0 6 0 6 0 6 0 4 0 5 0 4 0 - 5 0 4 0 5 0 4 5 第1 1 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 1 2 4 2 果胶酯酶的作用机理 f i 9 1 - 4 t h em e c h a n i s mo fp m ea c t i o nt op c c l i n 图1 4 果胶酯酶的作用机理示意图 果胶酯酶对聚半乳糖醛酸甲酯具有高度的专一性，对聚甘露糖醛酸甲酯不 起作用，但也能水解聚半乳糖醛酸乙酯、丙酯和烯丙酯，但速率较甲酯低。果 胶酯酶很容易从果胶分子的还原性末端或其邻近的游离羧基开始攻击除去甲 氧基，沿着分子以单链机制进行，形成对二价阳离子( 如c d ) 非常敏感的游 离态的半乳糖醛酸区域，因此，很容易与c a ”等离子结合形成不溶物。直到最 近几年，才普遍认为植物p m e s 和真菌p m e 的作用模式是不同的。植物p m e s 倾向予沿着链作用于果胶聚半乳糖醛酸残基，生成羧基，而真菌p m e 随机作用 于链中的酯基【2 34 羽。r w 。p i c k e r s g i l l 和j a j e n k i n s 基于p m e 的三维结构和 序列分析，提出了p m e 一种可能作用机制【”】。他们认为，在p m e 中存在着严 格保守的区域，该区域含有两个天门冬氨酸和一个精氨酸结构。其中一个天门 冬氨酸通过氢键与精氨酸相连，从而形成非质子化过程。而其他的精氨酸倾向 了：质子化。水分子倾向于连接在非质子化的精氨酸上，并可能被激活并把他的 质子转移给精氨酸，产生的羟基攻击羰基碳，其中一个氧原子的质子化导致形 成一个具有四面体结构的中间体，随着甲醇的释放，这个中间体发生崩塌，因 而导致脱酯化。h c mk e s t e r 【删等对黑曲霉p f 的作用机制进行了研究，他们 西华大学硕士学位论文 认为真菌不能从半乳糖醛酸残基的非还原端移走甲基。进一步研究还发现沿着 链进行的非酯化半乳糖醛酸并不是该酶合适的底物结构。黑曲霉p e 它倾向于 攻击寡聚体中间的甲基，反应是根据多链机制进行，每次只能释放一个甲基。 图卜4 是果胶酯酶的作用机理示意图。果胶酯酶促使果胶脱酯，生成果胶 酸，果胶酸在c a “等离子的桥联作用下，细胞间的粘合加强，形成凝胶，从而 提高了果实的硬度、果粒的坚固性。 1 2 5 果胶酯酶活性的调节 p m e 活性的调节一部分是通过同工异构体的差异表达实现的，一部分是通 过遗传翻译后机制( p o s t t r a n s l a t i o n a lm e c h a n i s m s ) 实现的。在细胞生长过程 中细胞壁中p m e 的活性被假设成是通过h + 浓度以循环方式调节的【4 5 】。酶的最 大活性在中性环境下，随着反应的不断进行，h + 的释放，p h 降低，酶的活性也 在降低。如此，p h 的降低激活糖苷酶和糖基化转移酶，促进细胞壁扩增、增 大。随后由于阴极的稀释p h 的增加导致p m e 活性的恢复，开始一个新的循环。 此外，有报道称，在很多植物中存在有一种p m e 的抑制剂( p m e i s ) ，它可 能是p m e 活性调节的另一种机制。 gp m c m i l l a n l 4 6 】从番茄果实中纯化p m e 同工酶的同时分离到一个p m e i 抑 制剂。这个抑制剂存在于番茄汁液的提取物中，通过离子交换和凝胶过滤层析 得到纯化。它极其稳定( 1 2 0 。c 可温育1 0 m i n ) ，通过凝胶过滤层析得到的分子 量估计1 5 8 2 3 2 k d a 。纯化的抑制剂没有检测到蛋白质，然而通过对糖分析检测 到有乌龙酸( u r o n i ca c i d ) 和中性糖的存在。这个抑制剂分子通过果胶酶p g 和 p l 的作用结果被认为具有果胶质结构。它对番茄p m e 和一些植物来源的p m e 的活性有抑制作用，然而对微生物和真菌p m e 没有影响。 在香蕉中( m u s as a p i c n t u ml ) 发现了一个抑制剂【4 7 】，特别是在橡胶水果 中。抑制分子抑制香蕉p m e 和扁豆( p i s u ms a t i v u m ) p m e ，并且非常稳定( 在 沸水中3 h 后仍有8 0 的活性。) 这个抑制剂的化学性质没有报道。在i e l l yf i g ( f i c u sa w k e o t s a n g ) 瘦果中发现了一个高热稳定性的抑制剂。通过凝胶过滤 和c o n c a n a v a l i n a s e p h a r o s 层析泳分离，发现该抑制剂是由一个分子量范围在 3 5 到4 5 k d a 的多肽组成。 笫1 3 页共6 8 页 西华大学硕士学位论文 1 3 果胶酯酶的研究进展 1 3 1 果胶酯酶的发现 果胶酯酶的研究可以追溯到1 8 4 0 年，p r e m y 首次发现了一种能使可溶性 果胶皂化并且发生凝胶的酶，随之把这种酶称为果胶酶( p e c t a s e ) ，实际上就 是果胶酯酶。 1 3 2 植物果胶酯酶 大多数纯化的植物p m e s 其等电点都呈中性或碱性，通过静电相互作用与 细胞壁联系。然而，在可溶性植物组织中也发现了中性或酸性p m e 的存在。直 到最近几年，才普遍认为，植物p m e s 是沿着链作用于果胶聚半乳糖醛酸残基， 生成羧基，而真菌p m e 随机作用于链中的酯基。最近的一些研究表明一些植物 p m e 的异构体依靠p h 可能有两种作用机制【4 蹦0 】。p m e 作用于植物细胞壁可能产 生两个直接作用位点。一方面，通过产生的未酯化的羧基基团与c a 2 + 作用形成 果胶酸盐凝胶而使细胞壁变硬；另一方面，释放出的h + 离子可能刺激细胞壁水 解酶的活性m5 2 1 ，从而使细胞壁松散。通过对p m e 的调控发现p m e 对植物的 一些生理学过程有影响，对茎干的长度、茎块的产量i ”、根的生长情况f 5 4 】和 水果软化【”】等都有影响。实验证明p m e 在热带豆类属s e s b a n i ar o s t r a t a 的节结 生长过程中起着重要的作用，随后是与小共生体的交互作用【5 “。p m e 在植物病 原体中的角色也已被证实。事实上，n i c o t i a n a 烟草的细胞壁联系的p m e 是作 为烟草镶嵌病毒( t m v ) 运动蛋白的一个寄主。这种交互作用是病毒细胞与细 胞之间的转移所必需的1 5 。”j 。 在双子叶植物中检测到几种p m e 同工异构体，它们的分子量、p 1 、和生物 化学活性都不相同 5 9 4 2 1 。p m e 同工异构体的基因由一个基因家族编码，它们有 些在植物中得到组成性表达( c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s ) i “，然而其他一些在特异组 织和生长阶段得到差异性表达( d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s ) 1 6 4 j 。近来，a r a b i d o p s i s 基因组系统序列已经表明该种属有6 7 种p m e 相关基因。p m e s 大多编码成大的 前蛋白原( p r e p r o p r o t e i n ) 。前区域( p r e - r e g i o n ) 或信号肽是蛋白质结合到内质网 所必需的。前区域( p r o r e g i o n ) 由一个人的多肤组成( 约2 5 0 个氨基酸残基) 。 在细胞壁l 卜| 只发现p m f 的成熟部分( 不包括p r o r e g i o n ) 。因此，多肽原 第1 4 虹共6 8 页 西华大学硕士学位论文 ( p r o p e p t i d e ) 在分泌过程中被剪切除去。p m e 被认为是通过高尔基体与高酯 果胶结合。尽管这个p r o r e g i o n 的作用还不知道，但是它被假设为作用于分 子内的一个伴随体，这个伴随体或者阻止p m e 的正确折叠或者直接抑制酶的活 性，在它们进入细胞壁前以阻止果胶未成熟脱酯化瞄】。 1 3 3 果胶酯酶的生物学特性研究 前人对果胶酯酶的研究一般是多集中在酶提取和酶活测定以及钝化方面， 如j o w