（食品科学专业论文）烟草细胞培养生产辅酶Q10及其动力学研究.pdf

摘要 本实验以黄花烟草( y e l l o wb r i g h t ) 无菌苗为材料，通过固态培养和悬浮培养，建立了快速 生长的烟草细胞椿系，伉亿了烟萃细斑悬浮培养静纂本工艺参数，考察了温发、激素、裔杌物和 蔻体物质对爆擎缨脆生长靼辕酶q l 。含量的影响，搏建立了壤蓁过程鳃动力学模型。褥爨鲍细臌 最佳悬浮培养条件为m s + 6 - b a0 2m g l 十n a a 2 0m g l ，按种量8 ，蔗糖浓度3 ，培养8d 可使细胞干重达到3 6 7g l 。实验发现，2 5 是适合细胞生长和辅酶o i n 合成的温度。0 5m g l 的i a a 虽然不侄迸细胞生长，却能有效握离辅酶q 1 0 韵舍受，最高遮到9 3 4 m l 增幅5 4 6 。 添柏一些有援物质对辕懿q ，8 盼食成套键进佟用，4 0m # l 豹盐酸琉黢素馒辕隳q l 。鲸聚赢鸯量 达到9 9 6m g l ，比对照样增加6 5 2 ：1 0 0m g l 的半胱氨酸使辅酶q 1 0 晟高含凝达到8 9 9m l 。 在辅酶o t 。合成的前体物质中，2 0 m g l 的l - 苯丙氨酸能使辅酶o l o 含孱达到9 3 5 m g l i 3 0 m g ，l 的对羟基苯甲酸篦捷鞴酶q t o 含鬣这到9 9 2r r 蚰。在辅酶q ”台或静优化培养基m s + 6 - b a 0 2 m g l + n a a 2 0m g l + i a a 0 。5m g l + 盐酸巯胺豢4 0m g l + 半裴氮酸1 0 0m g l + b 苯丙氪酸 2 0 m g l + 对羟基苯甲酸3 0 m g l + 茄尼醇0 1 m g l 上，建立了烟草细胞生长、底物消耗和辅酶 o l o 生成的动力学模型，各方程曲线与实验点拟合较好，相关系数均选到9 9 g i 上。 关键词；烟草，细胞培养，辅酶o ”动力学 a b s t r a c t q u i c k - g r o w t hc e l ll i n e sw e r eo b t a i n e da f t e rc a l l u sc u l t u r ea n ds u s p e n s i o nc u l t u r e ，s t a r t i n gw i t hs t e r i l e s e e d l i n g o fy e o w b r a t , ab r e e do fn i c o t i a n at a b a c u n , 1 w i t h h i g hc o q l ac o n t e n t t h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rt h eg r o w t ho ft o b a c c oc e l li sm s + 6 - b a0 。2m g l + n a a2 0m kc o m b i n e dw i t h3 s u c r o s ea n d8 o r i g i n a lc e l lc o n t e n t ，w h i c hm a d et h em a x i m a ld r y w e i g h to fc e l lp r o d u c t t ob e3 6 7g 几 s e v e r a lc o n s t i t u e n t sa f f e c t i n gt o b a c c oc e l lg r o w t ha n dt h ep r o d u c t i o no fc o q mw e r es t u d i e d 。t h e o p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rc e l lg r o w t ha n dp r o d u c tf o r m a t i o n2 5 。c a sf o rg r o w t hr e g u l a t o r s ，0 5m g l i a ah a sb e e ns h o w nt oi n c r e a s ee f f e c t i v e l yt h ec o n t e n to f c o o _ l s ，t h o u g hi td i dn o tp r o m o t e t h eg r o w t h o ft o b a c c oc e l l y i e l do fc o q l 0w a si n c r e a s e db y5 4 6 t oa r o u n d9 3 4m e l t h ea d d i n go fs o m e n u t r i e n t sc o u l dc o n s i d e r a b l y p r o m o t e t h ef o r m a t i o na n da c c u m u l a t i o no f c o q l o f o re x a m p l e ， h c l - t h i a m i n ea t4 0m g le n h a n c e dt h ec o n t e n to fc o o l ob y6 5 2 t ob e9 9 6 m e l , 1 0 0m e j l l - c y s t e i n em a d ei tt ob e8 9 9m g l w i t hp r e c u r s o rf e e d i n g ，t h ec o n t e n to fc o q l oc o u l db e9 3 5m g l a t2 0 m g ll - p h e n y l a t a n i n e ，a n d9 , 9 2m e t ea t3 , 0m g l p - h y d r o x y b e n z o i d ，b a s e d o nt h ee x p e r i m e n t , w ee s t a b l i s h e dak i n e t i cm o d e lt oc h a r a c t e r i z et h eg r o w t ho ft o b a c c oc e l l g r o w t h ，l i m i t i n gs u b s t a n c e c o n s u m p t i o na n dc o q l op r o d u c t i o n 。t h i sm o d e lc a np r e f e r a b l yf i tt h ee x p e r i m e n t a ld a t aw i t hah i g h r e 】a t i v em o d u l u sa b o r e9 9 k e y w o r d s ：n i c o t i a n at a b a c u m ，c e l lc u l t u r e ，c 0 0 1 0 ，k i n e t i c s 撼 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 弓咖华 时间：泖；年易月陪同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 弓咖鳝 时间： 加码年6 月j 8 日 导师签名 时间：多。护岁年月) 矿同 编略词及符号列表 v 2 ，4 二氯苯氧己酸 6 一苄藻腺瞟岭 吲哚乙酸 激动綮 萘乙酸 m s 培养基 细胞比生跃速率 最大细胞比生长速率 饱和常数 细胞浓度 细胞的初始浓度 细胞的最高浓度 培养时闻 细胞生长的时间常数 底物激发 用于细胞生长的底物消耗 用于维持细照代谢约底物消耗 用于产物生成的底物消耗 期予绷腮生长的底物浓度系数 用于产物生成的底物浓度系数 翅予缨骢生长翡褒物比消耗速搴 用于产物生成的底物比消耗速率 庶物溺耗曲时澜常数 产物的极限浓度 产物物始浓度 产物浓度 产物生成系数 产物生成比速率 娜似姒船撇懈段k q，是筑邬鼢跏酝砩毽如 童星查些銮耋鎏：耋缝篁塞薹；黧堑丝 第一章绪论 1 。1 植物细胞培养搜术 1 概述 辕物缁艟培葵援术跫将檀秘蓓熬祭一鄢努经过茏蕊处理嚣，藿予a 王墙姜基主使葵鬣藏增 殖，进而按需要进行培养的技术。横物的各个部位，如根、茎、叶、花、泉、花药和花粉等郝可 以痒为於挺体来癌渤缨疆蝰荐，所形裁约聪分纯缨骢毯称为惫秘缝缓，将愈痿组织转移裂渡髂培 养基中避行培养称为悬浮培器。从完整植株建立细胞繇到得到有用产物的过程如图1 - 1 。 恳一恳喜氢 外檀体愈伤诱导懋浮培养反应器培养 产物 匿 簌蛰攘俸建立缨魏蔡酝过程 f i 9 1 - 1p r o c e s s o f f o u n d a t i o n o f c e l ls e r i e s f r o me x p l a n t 较疆磷究强弱不窝，毯铹蠡藤臻葬技零可分为赣繁臻按米、鼙倍俸诱萼技术、艨生葳讳培养 技术、体细施杂交技术、体细施变异釉选择、种质保存技术釉栋物细胞大舰模培嚣技术等。就细 腿培葬本爨嚣言，蟥究躲露戆在子敞番辞矿貔元素、缨生素、醛妻羹耪、生长谖繁裁熬娥分积浓疫 等之间找出最佳璐游条件，以达到绷胞量的快速扩增或有用物质的大量积累。植物的取材、预处 理、培养的物理条件等也都是需要考惑豹河题，为了商业化应用，还可进行半连续培养、连续培 莽、固定他培养等方式”。 2 捷物绥臆墙葬燮产鸯爱物蒺 随蒜纯学都生物技术豹发展，诲多天然化台趣已经w 以遵过人工会戏趣方法大爨生产，想起 些结年；复杂盼诧台物和混合物，用人工合成非常困难，甚至根本不可熊，还是要从天然物质中 获得。耳前，人类融经应用囊勺3 万多种天然物质中有8 0 v r 上来源于植物。3 ，包描辅拈、番料、 色素、涵潞移巍荻等，施球上7 5 静a 口跌耱秘作为治瘸、防瘸豹药物慕源，美国现有1 2 1 释处 方药来自槭物t 欧洲也有麴i 4 的处方药是植物药”3 。人们越来越多地发现，植物所具有的商活 拣爨痿对大落毒重癸熬豫护捧用，露许多天王合成蕊色素、化牧鼙，帮药物弼j 霹a 舔健袋有不建副 作用。霹此，“回j j = 1 天然”的浪潮骤然兴起，在工业文明高度发达的今天。天然植物提取依然是 不可或缺懿莛要来溅。 宝里堡些奎兰丝圭耋堡墼銮篁= 童丝篁 然而，提供这些活性物质的植物资源是有限的，这是因为植物自然生长的局限性：( 1 ) 随着 人口的大量增加，工业化程度的不断提高，用于非粮食性植物生长的土地面积越来越小。( 2 ) 植 物生长受土壤、气候、季节、病虫害等自然因素的影响，种植地域受到限制。( 3 ) 植物生长周期 太长，如生产奎宁的金鸡纳树，至少要有七年的树龄，而且往往是二十年以上。( 4 ) 有的植物中 有效成分极低，如从美登木中提取的美登素，是目前公认的一种较理想的高效、低毒抗癌药物， 但产率仅为百万分之零点二左右“3 。 利用植物细胞培养生产有用物质的技术正好弥补了这些不足。与栽培的整株植物相比，用体 外培养方法生产有价值的天然产物具有以下优点： 1 培养在无菌条件下进行，可排除病菌和虫害侵扰； 2 代谢产物的生产完全在人工控制条件下进行，可以通过改变培养条件和选择优良培养体 系得到超过整株植物产量的代谢产物； 3 可以进行特定的生物转化反应； 4 可以探索新的台成路线和获得新的有用物质等。 迄今为i e ，全世界已对近千种植物进行过细胞培养方面的研究，许多植物的细胞培养已完成 实验室阶段研究，正向工厂中试过渡，有的已完成t 厂化生产规模的实验”1 。利用植物生物工程 生产有崩物质，按其生产方式及生产物质种类可大致划分为三个方面。 1 生产酶、蛋白、多肽等生物大分子物质。这类物质在活性提纯及商品保存上具有相当的 难度，因而应用实例较少，多数仍处于科研探索阶段，目前还只有小分子量蛋白，如类 胰岛索等物质的应用报道。 2 将有机物进行生物转化。植物培养细胞能通过酯化、葡萄糖基化、羟基化、异构化、甲 基化等各种反应，将有机物转化为有用物质。 3 生产植物次生代谢物质。这方面的研究应用相对较多，包括生物碱、苷类、醌类、黄酮 类、萜类、甾体类等色素、芳香油、调味剂、香精、农药。常用的长春碱、吗啡、地高 辛和黄连素等药物也都属于次生代谢产物”7 ”1 。 1 ，1 3 植物细胞培养生产次生代谢物的研究进展 植物细胞培养对研究次生代谢物的生物合成是有价值的，它作为优质高效的生物反应器，具 有许多微生物、动物细胞发酵系统所不具备的优点，它利用自身丰富的底物进行生物合成，成本 相对低廉，并且不涉及公众关心的有关转基冈动物伦理道德的问题，因而很可能是最终提供生产 上重要的植物产物的有效方法。正是基于这一点，中外学者在这方面不懈地进行着探索，特别是 一些商用、医_ _ j 价值高的次生代谢物，引起了世界的广泛关注和研究热潮。 1 9 7 7 年，z e n k 等从长春花悬浮细胞培养中获得宿根碱和阿玛碱，其中阿玛碱为细胞干重的 1 o ，佰根碱可达细胞干重的o 8 ，超过亲本水平，他们还成功地应用放射免疫测定技术( r t a ) ， 2 圭垦蜜些奎耋堡圭耋堡鎏塞 丝= 耋堑丝 对欧春花悬浮培养的细胞进行选择，得到生物碱含量提高5 - 6 倍的细胞系“。1 9 6 7 年，s o l t 等从 烟草根尖的细胞培养中获得吡啶生物碱，含量高达干重的2 9 。决明愈伤组织培养获得的蒽醌含 量比原植物的种子高1 0 倍，约为干重的6 “。从紫草的悬浮培养细胞中提取萘醌，含量比原植 物提高8 倍，约为干重的1 2 ，现己进行工业生产。到目前为止，用细胞培养法培养过的植物种 类己超过1 0 0 种，在药物、色素、食品添加剂和香精香料等方面尤为突出，迄今所能鉴别的有用 成分包括几十个类别，3 0 0 多个品种“。 在植物细胞大规模培养方面，也有许多成功应用的例子。1 9 6 7 年g a u l 和s t a b a 采用多升发 酵罐对牙签草( a m m iv i s n a g a ) 进行了细胞大规模培养的研究，并首次用此方法得到了药用成分 呋喃色酮( h s n a g i n ) “。1 9 8 0 年，a l f e r m a n n 等在2 0 0 l 气升式反应器中培养洋地黄( d i g i t a l i s l a n a t a e h r h ) 细胞，利用它将b 甲基毛地黄甙转化为b 甲基地高辛：培养1 8d 后，b 甲基地高辛 产量为6 0 0 - - 7 0 0m g l ”。1 9 8 3 年，日本三井石油化学工业公司利用大规模培养紫草细胞生产紫 草宁，产物终浓度达1 4 0 0m g l ，是天然细胞的1 0 0 0 倍，于是将紫草宁作为燃料和药物进行工业 化生产，现在日本紫草素的商业来源主要就是细胞组织培养“。u s h i y a m a 等在2 0 0 0 0 l 生物反应 器中成功地进行了3 3k g d 的人参( p a x a x g i n s e n g ) 愈伤组织培养：德国人建立了由7 5l 、7 5 0 l 、 7 5 0 0l 、1 5 0 0 0l 、7 5 0 0 0l 系列搅拌式生物反应器组成的植物细胞培养工厂，并利用这些反应器 培养紫松果菊( e c h b l a c e ap u r p u r e a ) 细胞，生产具有免疫活性的多糖”。 我国最早从事植物组织培养研究的先驱，可追溯到上世纪6 0 年代中国科学院上海植物生理 研究所罗士韦研究员，他采用悬浮法培养人参细胞，使细胞产率日增一倍。培养物总人参皂甙含 量高达1 0 5 ，超过栽培人参( 4 1 ) ，每立方米培养液可获得干参1 3 9 8k g ，目前此技术己进入 工业化生产“”3 。据不完全统计，半个多世纪以来，我国已对4 0 0 多种植物建立了组纠和细胞培 养体系，并从中分离出6 0 0 多种代谢产物”。近年来，中国林科院对东北红豆杉愈伤组织进行了 细胞克隆及悬浮磁头研究，获得了生长量高达0 ，4 9 e , g d 的细胞系，每升细胞培养物紫杉醇的产 量可达0 2 5m g “。中国科学院植物研究所研究紫草细胞大规模培养，其发酵培养规模已达百斤， 有效成份紫草素的含量可达细胞干重的1 0 以上。“。上海中医药大学在黄芪毛状根大规模培养和 利用毛地黄细胞培养进行生物转化方面已取得了突破性进展。另外，正在进行的三七、三分三、 贝母等药用植物的细胞培养，发展前景也十分诱人”“。 尽管植物细胞培养技术的研究已经有了极其重要的进展，但还存在一些急待解决的问题，尤 其是实验室研究向商品生产的过渡。由于在目前的技术水平下，工厂生产所需的能源和运转成本 还难于和大自然提供的条件相比，因此，这项技术形成产业的关键，是如何提高单位培养基中有 用物质的产量，以此降低目的产品的生产成本“”。 近年来，植物细胞培养技术的研究主要致力于悬浮培养技术、多级培养和固定化细胞技术、 培养工艺优化控制、生物反应器开发、分离纯化技术等方面，并取得了较大进展“7 2 “。有些药用 植物种类已实现工业化生产，如利用希腊毛地黄细胞培养物通过生物转化生产地高辛、利用黄连 细胞培养物中生产黄连碱，利用青蒿细胞培养生产青蒿素等。在获取次生代谢物方面，目前发展 较为迅速的技术是，在植物细胞培养中加入诱导剂及前体物，以促进代谢产物的生成。甘烦远 等通过在红豆杉的嫩茎和针叶诱导出的愈伤组织中加入前体物质，米对紫杉醇的代谢进行调控 3 耋雪奎些盔主翟圭耋堡墼圣笙= 耋缝鲨 。也有报道正在研究诱导愈伤组织中有效成分的细胞外渗，以便直接从培养基中收集有效成分， 降低分离提纯的难度。 尽管植物细胞培养的成本较高，但是由于一些天然植物有效成分含量低，或难于进行化学合 成，或其天然产物具有无与伦比的效用( 如紫杉醇抑制肿瘤生长的独特作用) ，它们还是有着巨 大的市场需求和高昂的售价。成功的植物细胞大规模培养不仅是解决天然植物资源匮乏、活性成 分不稳定等问题的有效途径，而且有着丰厚的利润。 1 2 烟草细胞培养 1 2 1 概述 烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 是一种重要的茄科植物。烟草研究，确切地说用烟草作为一种模 式植物，起始于1 9 1 8 年对其光周期现象的研究，1 9 2 2 年植物细胞组织培养开始之后，许多科学 家就开始了烟草组织及细胞培养方面的研究。5 0 年代是烟草生物技术的关键时期，在遗传学、细 胞学、育种、分类学、形态学、生物学、营养、有机代谢和栽培技术等各个方面的研究都非常活 跃。同时发现，烟草除做卷烟外，还可以用来生产高价值的药品、化学品和食品，通过固氮提高 光合效率，或者作为污染物指示剂等。 烟叶中富含优质蛋白质、糖、生物碱、天然香料物质及一些贵重的化工原料。烟草蛋白是一 种优质蛋白质资源其氨基酸组成比例平衡。不存在限制性氨基酸，营养价值超过了牛奶中的酪 蛋白，还有十分理想的溶解性、乳化性、胶凝性等，而本身没有气味和味道，因此可提纯加工成 人类食用和工业用蛋白质，如生产硒蛋白、化妆品用蛋白等”“。烟草中的烟碱是很好的无公害生 物农药，具有迅速降解无残留的特点，粗提即可生产杀虫剂；在医药工业上，烟碱是研制治疗心 血管疾病、皮肤病、蛇毒等疾患药物的特种原料”“。市场对烟碱，特别是高纯烟碱的需求量一商 很大，并与日俱增。烟草中的天然香料物质可以作为食品添加剂使t | = j ”。总之，烟草的综合利用 将使烟草获得更高的商业价值，各种贵重化工产品的生产成本也将大幅降低。 1 2 2 烟草细胞培养生产有用物质的研究进展 烟草细胞培养生产有用物质最成功的例子，是从烟草细胞中提取烟碱。1 9 7 2 年，k a t o 利用 3 0l 的生物反应器半连续培养烟草细胞以获取尼古丁，随后他们又成功地在1 5 0 0l 生物反应器 上对烟草细胞进行了5d 的连续培养，这个实验最后放大到在2 0 ，0 0 0l 的生物反应器上进行连续 发酵，持续培养了6 6d ，其生产能力为5 8 2k g ( d w ) m 3d ，这是迄今为止所见报道中最大的 植物细胞大规模培养反应器”。其它的有用物质还包括，1 9 8 4 年，s c h i e l 采用批式培养方法培养 烟草细胞，在生产肉桂酰胺的过程中添加磷，使肉桂酰胺的产率从1 6 0 m g l 上升到4 0 0 m g l ”。 2 0 世纪7 0 年代从烟草中分离出第一种萜烯类植保素，以后又从各种受不同病害侵染的烟草中发 现了多种植保素，有关类萜代谢的一系列合成酶、环化酶已被分离、纯化、克隆，其晶体结构的 资料最近也有报道”“”1 。 4 黧垦堡些套誊塑圭耋堡麓圣墼= 茎垄鎏 烟草妻i 玎胞中含肖约9 5 的水分，从含水量大的组织中提取蛋白，将不可避免地造成部分爆白 水解，从而降低加工效率并增加成本。因此，翅烟草细胞生产价格商昂的生物药剂才能充分体现 其商业价 燕。现在露2 0 0 家生物技术公司正采埔不同的技术路线，戬使烟牮生产出符台人类需要 的蛋白质、酶、抗体和各类敬生代谢物”“。目前美国已将从烟孳中提取的化合物、抗体等生物 露裁，篇予洽疗癌瘰疆及英镶疾病静赣采试验“l 。 由于烟草繁殖系数非常离，而且单株生物产量很高，所以在植物细胞培养生产谢用物质的研 究中，全球许多垒褥技术公筠更看中粼草，醵霸腻中有新突破。我国在滔蕈细斑缀织韵培养方冠 也做了不少工作，但多数局限于植株樽生、器宙分化、撇生质体培养或育种，在烟草细胞培养生 产莓蒯谚矮方嚣魏磅究与霹努还毒缀大差距。 1 ，3 辅酶q ，。概述 1 3 1 辅酶0 ，。的性质 辅酶q 1 0 ( c o e n z y m e q w , u b i q u i n o n e 5 0 ；商品名u b i d e c a r e n o n e , n e u q u i n o n ) 是种醌类化台 物，存在于多莉生物体内，是一静脂溶性天然维生素类物质。其他学结构式为： l k c i k c o 疆酶q # 兹化学名称是：2 , 3 一二黟蓑基_ 5 一甲基一6 - ( + ) 裂一f 2 _ 甲基了褥旺) 基3 一苯鼹。 它是一种淡黄色结晶，无臭无味。易沼于氯仿、苯、四镶化碳；能溶于丙酮、乙醚、石油醚；微 潞予乙醇；不溶于水、甲醇。遇光易分解成微红色物质，对湿度承1 温度较稳定，熔点4 9 * ( 3 “”。 辅酶q 1 0 广泛存在于各爽动植物体内，表1 - 1 表明了辅酶0 1 0 在部分渤物组织、植物和微生 物中的含撼”。可见熘时和微生物中辚酶q ，o 食璧较高，本论文援是基于这一点，毒虑剥赐粼革 细胞培养，获得较商的辅酶q ，。产量。 衷1 1 藉煞o m 在足静动耪缀鲠、撼糖秘教生物孛势含爨 f i g1 - 1c o n t e n to fc o q l o i ns o m ea n i m a l f i s s u s ，p l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m s b n j 罐 c k i p vj le ，- b ， h 窒垦奎些盔差堡圭耋垡篁耋 蒌= 璧垄鎏 1 3 2 辅酶0 ，o 的生化作用及临床应用 辅酶q 。在动物、植物、微生物等细胞体内与线粒体内膜结合，接受n a d h 脱氢酶及其它脱 氢酶脱下的氢，并将电子传递给细胞色素b ，所以辅酶0 1 。在电子传递链中处于中心地位“3 。“。 它的生物活性主要来自于其醌环的氧化还原特性和其侧链的理化性质。由于它在呼吸链中和蛋自 质结合不紧密，因而在黄素蛋白类和细胞色素之间能作为一种特殊灵活的载体而起作用。在生物 能学及抗氧化性方面，新的研究结果证实，当辅酶0 1 0 处于膜的外层时，可能有助于控制细胞生 长，特别是控制淋巴细胞的生长，辅酶o ，o 也存在于细胞线粒体膜以外的其它膜结构中”1 。 辅酶q t o 的主要生化作崩包括“”： 1 抗氧化作用。辅酶0 1 0 具有与维生素e 相类似的抗氧化功能。在用辅酶0 1 。防治大鼠内 毒素休克及防治离体大鼠心肌细胞缺氧试验中，发现辅酶q 。o 能显著提高动物或细胞的 存活率，明显减少组织细胞中的脂质过氧化物含量。 2 清除自由基作用。辅酶o l o 可明显降低线粒体耗氧量，降低细施对a t p 的消耗。研究表 明，辅酶q ，。可以显著降低化疗药物阿霉素的心脏毒性，而阿霉素的心脏毒性很可能与 自由基的产生密切相关，这很好地解释了辅酶q ：8 具有涛赊自由基的作用。 3 稳定生物膜功能。辅酶o ，o 是一种与网状内皮组织系统有关的醣类化合物，能够激活细 胞代谢，防止因过量维生素a 所致的红细胞膜及溶酶体膜的不稳定性，保护和恢复生物 膜结构的完整，提高机体的免疫力。超微结构检查证实辅酶0 1 0 能维持细胞线粒体结构 的完整性，防止细胞水肿、细胞膜破裂、线粒体溶解和肌原纤维的排列紊乱。 4 对呼吸系统的作用。辅酶0 1 0 作为电子传导系统中的递氢体，是生成a t p 的必需辅酶。 它不仅是呼吸链的氧化还原成分，还是调节琥珀酸脱氢酶与细胞色素b - c 复合中间产物 的重要物质。 辅酶q 。是所有类型细胞发挥正常功能不可或缺的基础，补充辅酶q m 有益于各种不同的疾 病。自1 9 8 7 年至1 9 8 9 年首次将辅酶0 1 0 用于心力衰竭的治疗以来，辅酶q 1 0 用于各种疾病治疗 的临床经验正在世界范围内缓熳而稳定地积累起米，辅酶q 1 0 的生物能量催化作用在临床医学中 被认为是最根本的，特别是对于像心肌细胞这样具有超高的新陈代谢需求的细胞。辅酶q 。o 的作 用更不可忽视“7 ”1 。 辅酶q ，o 的主要临床应用包括： 1 心肌保护a 辅酶q 能防止心肌缺血和再灌注所导致的结构和功能异常。用辅酶q 。处 理过的动物心脏可在一定程度上保持细胞氧化磷酸化及a t p 生成能力，减少细胞和线粒 体的负荷“”1 。 2 治疗呼吸肌疲劳。辅酶q 1 0 可增强呼吸肌收缩力。据报道，以1 0m g 辅酶0 。救治以呼 吸困难为主的呼吸系统疾病患者，用药3 个月后，最大吸气量显著升高，乎吸困难症状 明显改善“。 6 塞里垒些蠢警堡占差缝婆耋薹= 黧塑堡 3 治疗冠心痫。在实验性心肌梗塞中发现，梗塞区心肌的辅酶0 1 0 含量比非梗塞区少。辅 酶q ，。能保持急性缺血心肌细胞线粒体的形态结构，防此心肌收缩力减弱，使异丙肾上 豫素实验往心蕊缺氧减轻，防止磷酸和a t p 禽譬减少”“。由_ f ：可觅辅酶q l o 程缓解 斌心病病情，治疗心绞痛，缩小心肌梗塞范围等方面均有治疗意义。 此外，辅酶q 。还有抗肿瘤作用，稿床上对于晚期转移性癌症有一定疗效，程缓解坏死性牙 周炎、治疗十二指肠溃疡及臀溃疡、促进胰腺功能和分泌、增强人体免疫功能方耐有显著效果， 谯l 盔采上，辕藩q l n 韵片裁已畜效建餍予治疗鬣形茬莞笈疰和蒋气静，箕注射渍治疗支气管哮崤有 鼹著的作用，对昕嫩障碍和先天性冉生性贫m 也有一定的意义。“。 人钵w 遥过懿下两条途径获得辕酶q 埘 1 从食物中吸收。几乎所有盼食物中均鸯有一定量的辅酶q l 鱼油、坚累、绿叶蔬菜、 家禽和蛋类中辅酶q ，o 的含餐较高。尽管均衡饮食能掇供一定藏的辅酶q 但缁耱通 过食物获得的辅酶q ，。含量，远远无法满足人体正常生理功能的需要。 2 体内制造。人体的肝脏是辅酶q 。o 的制造器，它能生成足够的辅酶0 。，以维持生理功 毵的正常造作，但随着年龄的增长，特别是2 0 岁以詹，人体肝脏所产生的辅酶q 。含 羹会不舔下降，鼠褥无可避免逢藤逮了人体斡老住。 当机体处于过度疲劳、代谢亢奋溅急性休克等状态时。体内鞴酶q 驰自速消耗将导致煦液 辅酶o ，o 承平下降。茈外，警辅酶q l o 被机体爝作自由器清除期辩，也会簿致体内辅酶o ，o 缺乏。 w 见，造成人体辅酶q 1 0 缺麓的原因是饮食摄入不足、体内生物合成障碍、身体过度消耗或上述 j t 静霆豢综台 睾焉。 凡代谢旺盛的器官组织，均对辅酶0 1 0 缺琵高度敏感。有研究表明，减少辅酶q ，。的饮食摄 入，会 l 笈馒淫营养不蠢或篓瘫消瘦“无论是夫还是动戆，大多数疾病黎会使体肉辅酶q 的含 凝显著下降，可以推测，好的营养状况，包括难常的辅酶0 1 0 水平，将有助于任何疾病的恢复， 嶷症也不獭静。担黼i e 搀强调，g 髫釜活孛，人窘i 营速孬在营莠缓a 不嚣合理魏媾撬，压不合理 的营养摄入，则间接地妨碍了辅酶q l o 的生物合成”。由此可见，通常人们所说的体内辅酶q 。 辩所谓正鬻含量承乎，实跟上是未达擐佳标准的。因此，无论是健康a 嚣述是疾病患者，都澍辅 酶o 。o 有相当的需求，也正囡此，形成了辅酶q i o 的巨大商机。 3 3 糖酶0 。潼悫穸| 、辑究臻浚 辅酶q 最早在1 9 5 7 年妇美国的f r e d e r i c kc r a n e 教授麸牛心脏豹线鞑体中分离出来。瘸年， 焚格兰的m o r o n 教授定义了种从缺乏维生紊a 的老鼠的瓣中分离得到的化台物，称其为辅酶 q m1 9 5 8 年，m o r o n 教授向世人介绍名字“u b i q u i n o n e ”，其窘义就是茏所不在的“醌”。阁时， k a r l f o l k e r s 在m e r c k 公霹鞲确测定r 辅酶q i o 的化学结构并避行合成。的年代中期，日本镌 y a m a m u r a 教授成为世界上旃个使用辅酶0 7 ( 种相关的化合物) 治疗心肌梗塞的人。1 9 7 2 年， 憝犬嚣麴g i a n p a o l o l i t t a r r a 鞠k a r i f o t k e r s 教袋 正瑗了缺乏辕酶q m 是心藏等疾病戆滠西。1 9 7 7 7 童垦蜜些奎警丛圭耋鸯选奎 基二：璧辇鎏 年，日本首次实现辅酶0 1 0 的发酵法一1 ：= 业化生产，但是效率较低，生产成本高。j 魄后，随着酶工 穰和基因工程的迅猛发展，辅酶q 1 0 的生产工艺有了长足的进步“”。1 9 7 8 年，p e t e r m i t c h e l l 用化 学渗透理论解释了生物能量转移，诞实辅酶q t o 在能鬣转换系统中起妥重簧的质子转移律髑，并 因此获得了诺贝尔奖。8 0 年代早期，辅酶q 1 0 的l 临床试验，无论在数量上还是规模上都有相当大 鞠撩速菱袋，这使褥罄奉裁药金显女够提供太蘩钓魏晶鞲簿q l 并显舂缝力直接遘过嘉簸滚耱 甑谱测定m 和组织中辅酶q 1 0 的含量”。 据绕计，g t 蘩袅球9 0 靛藕酶q i e 来鑫鑫奉，在鑫举，辅酶q 己成为主市蘸物，翟程荚蓬 和欧洲市场上，辅酶q 1 0 却只能以“食品添加刺”的名义销售。近几年来，美国国内形成了真正 瓣天然景健磊热，馒褥辅酶q ，在美强枣场上年链量达鼹t ，耀妖率为1 5 - 2 0 。含窍辕黪q 1 8 的营养保健品与其宦天然保健品一样，可在超市、食品连锁店和药店里自由出售，凭需医生处方。 幽- 丁辅酶q 效果确切，所驭根受西方消费者鼬歇迎，消耗辘酶q ；。最多的国家( 地区) 分别为 美国、日本、西欧与澳大剥娩。2 0 0 1 年全球消费量约为1 2 0t ，我国消费量约为1 4t ，价格为 1 , 5 0 0 , 0 0 0 $ t ，预计2 0 0 5 年，全球的消费量将达到2 0 0 t 。 目前，辅酶q l o 在我国产量很小，年产鬣仅几百公斤( 提取法) ，其余依靠进口的辅酶q ，o 原料药，供应国内2 2 家药品生产厂塞分装胶囊。由于辅酶q 1 0 的用途极其广泛，礴较大的鞠际、 豳内市场，它盼开靛与和埔惩受至a 们的关注功效逐渐被认识，市场需求呈直线上升趋势，正 处于寿命期的成长阶段。 生产辅酶o ，o 主要有酞下四种方法： 1 从动植物缀织中提款，援皂化法、游剡萃取法、吸附层辑法制备辚酶q 。提取法楚骞 蒋用得较多的方法，但现有工艺成率缓高，且原料来源受到一定程度的限制“。 2 。鼠耀睁孛提取藻踞簿，进露耀半台或法截蛋辚黪q 。 3 宛全合成法制备辅酶q ，。化学台成制备路线较为复杂，很难实现工业化3 。 4 徽生耪笈群法或植物细胞培养法生产辅酶q m 微生穆发酵法或植物细胞培养法是e 0 较 理想的生产方法，如能选择优良菌株绒品种，并优化培养条件，对开发利用自然资源和 实现经济效益，毫笼疑海会起巨太魏推韵律弱。 我国科学研究潜在微生物发酵法燕产辅酶q i 。方面已做了一些研究和并发工作，并于1 9 8 4 年在浙江天台稍莼厂”完成了发酵法制餐辅酶q i o 静孛试，由于发辩荤位低、纯纯蘩蠲大，闲褥成 本仍与提取法相当。南京化二l _ = 学院工业生物技术研究所也正着手进行辅酶q m 微生物发酵生产的 域究窝开发，著努力将或零黪至提取嬷戆l 罄，早霾达裂芏韭纯东乎。 但是，国内从事辅酶0 1 0 植物细胞培养的单位只有少数几家，也都处于初步研究阶段，还没 蠢避入中试鄹1 韭彳乏生产。鍪予莅兹绷麓培养生产放生饩潺耪豹獭符霞势，鼓及潘 。中较蒜瓣辕 酶o o 含爨，利用烟草细胞培养生产辅酶q 。o 值得深入研究和开技，尽快摸清细胞培养生产辅酶 q * 翦营莽条髂和环境条辑。技到台理熬磁力举方程搓述培养体系中各个参数她变优，对趣抉培 养放大过獠和工业化生产有麓要的意义。 8 童鱼奎些奎耋耍圭耋丝鎏塞 釜= 童堑坌 1 4 动力学模型 目前，有关植物细胞培养的基础研究很多，而工业规模应用却较少，其中很重要的原因就是， 当细胞培养的规模扩大时，细胞表现出不同于三角瓶环境下的特征，包括生物量的增长、对底物 的利用、次生代谢物的释放等。而利用植物细胞培养生产有用物质，必须达到一定的规模，才能 降低生产成本，具有相应的商业价值。因此，植物细胞大规模培养的过程控制及优化工作，在植 物细胞培养生产天然产物中具有重要的作用。 实现过程控制及优化的前提是建立描述培养过程的数学模型，并在实验室条件下研究各种宏 观因素对生物反应过程的影响，虽然生产上的生物反应要复杂得多，但实验室获得的结果，对实 际生产还是具有重要的指导意义。不同于生物学上反应历程和机制的研究，生物反应动力学侧重 于研究生物反应速率的规律和各种因素对反应速率的影响。 细胞生长是一个复杂的生物化学过程，既包括各种细胞内的反应，胞内与胞外的物质交换， 也包含有胞外的物质传递及生化反应，是一个多相、多组分和非线形的体系。由于众多组分的参 与和代谢途径的错综复杂，并且在细胞生长的同时还伴随着代谢产物的生成反应，因此，要用具 有准确系数的反应方程式，来描述生化反应过程几乎是不可能的，必须做出适当的假设，以便于 简化，这样不仅建模相对容易，而且也基本上能满足工程上优化控制的需求”。生物过程的数 学模型常被用于假设检验和过程优化。它要求形式简单，便于实验数据能适当地验证所有模型参 数，而且能预知各种过程行为。因此，研究生物反应过程的动力学关系，有助于实现实际生产中 的优化控制”7 ”1 。 植物细胞培养的动力学研究，一直受到各国学者的关注，各式各样的模型也层出不穷，有考 虑底物缺乏情况的非结构模型，考虑中间代谢物的结构模型，考虑细胞存活率的结构模型，考虑 底物吸收及活化机制的结构模型，考虑磷酸盐或钙盐影响的结构模型等“。”7 7 。”】。 1 9 8 7 年，f r a z i e r 等提出个基于两种代谢中间物的动力学模型，用于解释生长及与生长相关 的产物合成之间的相互作用。1 9 8 9 年，他们叉提出了一个关于植物细胞聚生体的中间代谢物向介 质中释放的生长模型”“。1 9 9 8 年，g l i e k l i s 等在b a i l e y 和n i c h o l s o n 提出模型的基础上，提出了 一个关于植物细胞悬浮培养生成多糖产物的数学模型，该模型的特点是对细胞内多糖产物和细胞 外多糖产物提出了不同的模型。综上所述，植物细胞悬浮培养的建模工作已取得了很多成就， 但由丁植物细胞种类不同，相应的生氏特性也不尽相同，由此建立的数学模型也就各具特色。 1 5 论文思路 本实验以辅酶q 1 0 含量较高的黄花烟草y b ( y e l l o w b r i g h t ) 为材料，从无菌苗诱导出愈伤组 织，筛选利于愈伤组织生长的培养基，建立烟草细胞悬浮培养体系，优化培养条件。研究影响细 胞生长和辅酶0 1 0 形成的因素：蔗糖浓度、接种量、温度、植物生长调节剂、有机物、前体。建 立培养过程的生长动力学方程、底物消耗动力学方程和产物生成的动力学方程，为提高烟草细胞 中辅酶o t o 的含量和放人培养提供一定的理论依据。 9 2 1 引言 第二章烟草细胞系的建立和条件优化 虽然烟草的细胞培养技术已经很成熟了，但不同品种的烟草有其自身的特点，需要不同的培 养条件。调整培养基中植物激素的种类、水平及浓度比例，目的是减少细胞中的木质化成分，降 低细胞形成较大聚集体的可能性，获得更多的薄壁细胞，使得愈伤组织呈现疏松的状态。愈伤组 织越疏松，说明细胞的分散程度越高，越适于悬浮培养，能在液态培养基中以单细胞或小细胞团 形式存在，保持良好的细胞形态和较快的生k 速度”5 。“。 本章从黄花烟草无菌苗山发，诱导出烟草愈伤组织，调整植物激素配比，获得适合的生长培 养基，将疏松的愈伤组织转移至液态培养基中进行悬浮培养，确定一种测定烟草细胞生物量的简 便而准确的方法，便于在今后的实验中精确地掌握细胞的生长情况，及时做出相应的调整。研究 接种量、碳源浓度和植物激素对烟草细胞生长的影响，得到烟草细胞悬浮培养的最佳工艺参数， 使黄花烟草细胞在液态培养基中快速地繁殖。 2 2 实验材料和主要试剂、设备 2 2 1 供试材料 烟草( n i c o t i a n at o b a c c u m ) 品种为黄花( y e l l o w b r i g h t ) ，由河北师范火学生命科学院提供 经证实具有较高的辅酶q ，o 含量。 2 2 2 主要试剂 m s 基础培养基 2 ，4 d 6 - b a n a a 浓硫酸 硫酸铜 过氧化氢 氢氧化钠 混合指示剂 硼酸 盐酸 硫酸钾 三氯乙酸 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 1 0 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂二厂 北京红星化工厂 北京益利精细化学品有限公司 北京化学试剂公司 北京化工厂 北京化学试剂公司 北京化工厂 北京化学试剂二厂 2 2 3 主要仪器和设备 电子称 d h 计 微波炉 恒温磁力搅拌器 玻璃仪器气流干燥器 电热干燥箱 高压灭菌锅 超净工作台 生化培养箱 振荡培养箱 其它常规组培设备 微量凯氏定氮蒸馏装置 2 3 实验方法 b s2 0 0 s p h s - 一2 5 p j 2 1 卜b 8 5 2 诗圣牌b 型 c s l 0 1 1 a b y x 一2 8 0 h p s 一2 5 0 h z q 1 0 0 2 3 1 烟草愈伤组织的诱导和继代培养 北京赛多利斯天平有限公司 上海精科雷磁 顺德市美的微波炉制造有限公司 上海司乐仪器厂 河南省巩义市杜甫仪器厂 重庆银河试验仪器有限公司 江阴滨江医疗设备厂 北京半导体设备一厂 哈尔滨市东明医疗仪器厂 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 取无菌苗顶端两片幼嫩叶片，在无菌条件下，去掉主叶脉和大的侧叶脉，然后切成5 m m 5 m m 的小块，接种在m s 4 - 6 - b a1 0m g l 十n a a1 0m g l 培养基上，蔗糖浓度3 ，p h5 7 - 5 8 温 度2 5 1 ，暗培养8d ”1 。 将得到的愈伤组织接种到含有不同浓度2 , 4 d ( o 0m g l ，o 1m g ，l ，0 5m g l ) 6 - b a ( 0 0 5 m g l ，0 1m g l ，0 5r a g l ) 和n a n ( 1 0m g l ，2 0m g l ，3 0m g l ) 正交组合的m s 培养基中， 培养周期1 0d 。对第4 代细胞，测其单位按种量所得的细胞鲜重，根据生长量高低得到烟草愈伤 组织的生长培养基。 2 32 细胞鲜重和干重的测定 愈伤组织去除培养基后直接称其鲜重，悬浮培养的细胞抽滤后称其鲜重。细胞在6 0 。c 下烘干 至恒重，即得干重。 2 3 3 烟草悬浮细胞系的建立 将5 9 疏松的愈伤组织接种于3 0 0 m l 细胞培养瓶中( 含5 0 m l 液态培养基) ，温度2 5 + i c ， 暗培养，摇床转速1 2 0r m i n ，振幅2c m 。7d 后用4 0 目纱网过滤，除去组织块和大的细胞团， 得到相对均匀的细胞悬浮液，再经2 0 0 目纱网过滤，滤出物接种到新鲜培养基中，培养4 代后得 到悬浮培养的种子细胞。 窒垦窒些盔兰堡尘耋垡鎏塞 篁三耋塑墓堡墼垂墼辇耋塑玺j 土垡些 2 3 4 悬浮培养体系中细胞生物量测定方法的确定 2 3 4 1 烟草蛋白的提取和测定 取新鲜细胞5g ，用研钵研碎后放入1 0 0m l 具塞磨口三角瓶中，加入5 的三氯乙酸2 0m l ， 于9 0 。c 水浴中浸提1 5r a i n ，抽滤后将剩余的残渣放入凯氏烧瓶中进行消化。用凯氏常量定氮法测 定样品中蛋白氮含量和粗蛋白含量”