（食品科学专业论文）壳聚糖季铵盐的合成及抗菌活性的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 壳聚糖季铵盐的合成及抗菌活性的研究 中文摘要 壳聚糖在许多领域已经得到了应用，但因其溶解性较差而使它的应用 受到了限制。+ 本文利用壳聚糖上的- n h 2 活性对壳聚糖进行衍生季铵化， 在c ，- n i - 1 2 上接上了季铵基团，改善了其溶解性，并增强了其抗菌活性 觚分子量壳聚糖具有一定的生理活性并有利于- n h 2 的衍生化。为了 取得低分子量的壳聚糖，对壳聚糖的三种降解方法进行比较，发现磷酸降 解的产物脱乙酰度高且稳定，降解速度快，产率也较高。双氯水法降解制 得的壳聚糖脱乙酰度不大，产率不高，但降解速度比较快，若将产物精制 以提高其脱乙酰度。也可以采用。 以不同分子量的壳聚糖为原料分别合成了n n n 三甲基壳聚糖、 n 丙基n n 二甲基壳聚糖，n 苯甲基n ，n 一二甲基壳聚糖、n - 苯乙基- n , n 一二甲基壳聚糖、n - 水杨基n ，n 一二甲基壳聚糖、n 糠基n n 一二甲基壳 聚糖等六种新型季铰盐合成产物有较好的合成收率和较高的取代度其 水溶性与壳聚糖相比有很大程度的提高，最高可达2 0 用红外光谱对壳 聚糖季铵盐的结构进行了鉴定，确定在壳聚糖的- n h ：上接上了季铵基团。广。 通过对草莓的防腐性能测定，证明壳聚糖有抗真菌的特性，且其抗菌 性能与分子量有关，以分子量在1 - 1 0 万抗真菌的效果最好。随过对壳聚 糖的m i c 测定，发现壳聚糖对金黄色葡萄球菌( s a u r e t l s ) 和大肠杆菌( e c o l i ) 有抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的抗菌活性强于对大肠杆菌的抗菌活性。 壳聚糖对大肠杆蕾的抗菌活性随着分子量的降低而增强，对金黄色葡萄球 菌的抗菌活性则髓着分子量的降低而降低。广一 在水溶液中，壳聚糖季铵盐有抗大肠杆菌的特性，且其抗菌性能与分 子量有关，壳聚糖季铵盐水溶液抗大肠杆菌的效果随着分子量的下降而下 浙江大学硕士学位论文 降。 在醋酸溶液中，壳聚糖季铵盐抗大肠杆菌的性能比在水溶液中强，但 其抗菌性能与分子量的关系不是很大，同一分子量级别的壳聚糖季铵盐抗 菌性能相差不大。侥聚糖季铵盐醋酸溶液比壳聚糖有更强的杀菌能力， 对大肠杆菌抗菌效果最好的是n 水杨基_ n n 二甲基壳聚糖。其m i c 最小 为0 0 3 1 3 。壳聚糖季铵盐抗大肠杆菌的性能与醋酸的浓度有关。0 2 5 醋 酸盐溶液的n 冰杨基n ，n 二甲基壳聚糖的m i c 为0 0 6 2 5 ，其杀菌效果是 壳聚糖( 2 5 ) 的4 0 倍。o 5 的醋酸盐溶液的n - 水杨基n n - 二甲基壳聚 糖( i ) 的m i c 为0 0 3 1 3 ，其杀菌效果是壳聚糖( 2 5 ) 的8 0 倍。夕 一4 壳聚糖季铵盐抗金黄色葡萄球蕾的效果比大肠杆菌要差。，n 水杨基 n ，n 二甲基壳聚糖( i ) 抗大肠杆曹的m i c 为0 0 3 1 3 ，而抗金黄色葡萄 球菌的m i c 为o 2 5 壳聚糖季铵盐抗金黄色葡萄球菌效果最好的是n - 苯 甲基- n 。n - - - 甲基壳聚糖和n 一苯乙基- n n 二甲基壳聚糖，其m i c 均为 o 1 2 5 ，抗菌效果是壳聚糖( 1 2 5 ) 的的l o 倍。壳聚糖季铵盐抗金黄色葡 、 萄球菌的效果i 囊着分子量的下降略有下降。， 壳聚糖季铵盐的抗菌性能与其结构有一定的关系。先论对大肠杆菌和 、 金黄色葡萄球蕾，带有苄基基团的n - 苯甲基n n 二甲基壳聚糖、n 苯乙 基- n n 二甲基壳聚糖和n 水杨基- n n -甲基壳聚糖均比未带苄基的 n ，n ，n 三甲基尧聚糖、n 丙基- n n 一二甲基壳聚糖和n 一糠基n ，n 一二甲基 、 壳聚糖有更好的抗菌性能。) 通过抗菌性能溯定，找到了具有最佳抗菌效果 ，、。 的壳聚糖季铵盐。 关键词：壳聚糖、低聚壳聚糖、壳聚糖季铵盐、抗菌活性 本研究来源于 浙江省科委国际合作项目甲 壳素改性合成反应、合成物表征 及应用( 编号9 8110 622 9 ) 浙江大学硬士学位论文 略语表 hh o u r 小时 m i n m i n u t e 分钟 t c n n ，n - t r i m e t h y lc h i t o s a nn n ，n _ 三甲基壳聚糖 p r d c n - n - p r o p y l - n , n - d i m e t h y l c h i t o s a n n - 丙基- n n 二甲基壳聚糖 b d c n - b e n z y l - n , n - d i m e t h y lc h i t o s a nn - 苯甲基_ n n 二甲基壳聚糖 p h d c n - p h e n y l e t h y l - n , n - d i m e t h y lc h i t o s a n n - 苯乙基n n 一二甲基壳 聚糖 s d c n - s 8 l i c y l - n , n - d i m e t h y l c h i t o s a nn - 水杨基- n ，n _ - - q j 基壳聚糖 f d c n - f u f f u t y l - n , n - d i m o t h y l c h i t o s a n n 糠基n n 一二甲基壳聚糖 q c i q u a t e r n i z e dc h i t o s a n sp r e p a r a t e db y c h i t o s a n tw i t hm w 2 1 4 x 1 0 s 用分子量为2 1 4 1 0 s 的壳聚糖制鲁的一批壳聚糖季铵盐 q c l i q u a t e m i z e dc h i t o m mp r e p m m e db yc h i t o s a n tw i t h 丽1 w 1 9 0 x 1 0 ( 用分子量为1 9 0 x 1 0 ( 的壳聚糖制备的一批壳聚糖季铵盐 q c mq u a t e m i z e dc h i t o s a mp r e p a r a t e db yc h i t o s a n tw i t h 丽新8 0 x 1 0 3 用分子量为7 s 0 x 1 0 ) 的壳聚糖制备的一批壳聚糖季铵盐 s d ci i n - s a l i c y l - n , n - d i m e t h y lc h i t o s a nl a c l m m t e db y c h i t o s a n tw i t h 丽w 1 9 0 1 0 ( 用分子量为1 9 0 x 1 0 4 制备的n 水杨羹- n , n 二甲 基壳聚糖 s d c i i i n s a l i c y l - n , n - d i m e t h y lc h i t o s a np r e p a r a t e db yc h i t o s a n tw i t h 丽0 7 8 0 x 1 0 3 用分子量为7 8 0 x 1 0 3 制备的n 水杨基n n 二甲 基壳聚糖 s b s o l u b i l i t y 溶解度 s b ts o l u b l et i m e 溶解时间 d d d e g r e eo f d c 哟d a 自e d 脱乙酰度 塑兰查堂墨主堂堡堡壅 图表一览表 图l f i g 1 图2 f i g 2 图3 f i g 3 图4 f i g 4 图5 f i g 5 图6 f i g 6 图7 f i g 7 图8 f i g 8 甲壳素和壳聚糖的结构式l s t r u c t u r a lf o r m u l ao f c h i t i na n dc h i t o s a n 壳聚糖季铵盐的合成路线2 6 s y n t h e t i cr o u t eo f q u a t e m i z e d c h i t o s a n 壳聚糖及其季铵盐的红外图谱( 1 ) 3 3 f t - i r s p e c t r a o f c h i t o s a na n d q u a t e m i z e dc h i t o s a n ( 1 ) 壳聚糖及其季铵盐的红外图谱( 2 ) 3 3 f t - i r s p e c t r ao f c h i t o s a na n dq u a t e m i z e dc h i t o s a n ( 2 ) 壳聚糖季饺盐的红外图谱3 4 f t - i r s p e c t r ao f q u a t e m i z e d c h i t o s a n o 2 5 醋酸壳聚糖季铵盐( i i ) 溶液抗e c o i l 的m i c 一4 5 m i c o f q u a t e m i z e d c h i t m a n ( i i ) d i s s o l v e d b y 0 2 5 a c e t i ca c i d a g a i n s te c o i l 0 5 簟馥一壳聚糖季铰盐( i ) 溶液抗e c o l i 的m i c4 5 m i co f q u a t e m i z e d c h i t o u m ( i ) d i u o l v e d b yo s a c e t i ca c i d a g a i n s te c o i l 0 5 醋酸壳聚糖季铵盐( i ) 溶液抗s a n r e u s 的m i c4 6 m i c o f q m t e r a i z , d e h i t m a n ( i ) a g a i n s ts a t e e m 浙江大学硬士学位论文 常温下反应时间对低分子量壳聚糖制备的影响2 0 e f f e c to f r e a c t i o nt i m et op r e p a r a t i o no f l o w - m o l e c u l a r - w e i g h t c h i t o s a na tn o r m a la t m o s p h e r i ct e m p e r a t u r e 反应温度对低分子量壳聚糖制备的影响2 l e f f c g t o f r e a c t i o n t c m p e r a t u r e t op r e p a r a t i o no f l o w - m o l e c u l a r - w e i g h t c h i t o s a n 6 0 0 c 下反应时间对低分子量壳聚糖制各的影响2 2 e f f e c t o f r e a c t i o n t i m e t o p r e p a r a t i o n o f t o w - m o l e c u l a r - w e i g h t c m t o s e m 砒6 批 h 2 q 浓度对降解产物性质的影响2 3 e f f e c t o f i - 1 2 0 2c o n z e n m a i o n t o 吐哪灌曲目o f d e g m d a t i o n p r o d u c t 超声浚降解时阃对阵解产物性质的影响 2 3 e f f o c to f d e g r a d a t i o nt i m et oc l m a c t e ro f 删i o n p r o d = tu s i n g 删驴奠谢c w b v e 壳聚季铵盐的合成收翠和取代度 2 9 y i e l de n dd e g r e eo f m b s t i t u f i o na b o u t q u a 细m i z e d c h i t o s a n 反应畚件对s d c ( i i ) 合成收率的影响3 0 e f f to f n m c t i o nc o n d i t i o nt oy i e l do f s d c ( i i ) 反应条件对s d c ( m ) 收事的影响一 3 0 e f f e c to f r e a c t i o nc o n d i t i o t = t oy i e l do f s d c ( m ) 壳聚着季饺盐在水中的溶解慵况3 l s o l u t i o ns i t u a t i o no f q m a = a i z e dc h i t o s a ni nw a t e r j 2 2 3 3 4 4 5 5 6 石 7 j 8 暑 9 9 表讪 表协 表协 表协表协 表仙袭铷表贴引队 浙江大学硬士学位论文 表l o壳聚糖的分子量和浓度对草莓防腐效果的影响3 7 t a b 1 0 e f f e c t o f c h i t n s a n m o l e c u l a r w e i g h t a n d c o n c e n t r a t i o n t o a n t i f u n g a l r e s u l ta b o u ts t r a w b e r r y 袭1 1 不同分子量壳聚糖的抗菌活性( m i c ，u g n ：1 1 ) 4 0 t a b 1 1t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo f c h i t o s a nw i t hd i f f v r e n tm o l e c u l a r w e i g h t ( m i c ，u g m 1 ) 表1 2壳聚糖季铵盐抗大肠杆菌的抑菌圈( m m )4l t a b 1 2t h ea n t i m i c r o b i a lc i r c l eo f q u a t e n d z e dc h i t o s a nt oe c o l i ( m m ) 表1 3壳聚糖季铵盐水溶液抗大肠杆蕾的m i c 和m b c4 2 t a b 1 3m i ca n dm b c o f q u a t e m i z e d c h i t o s a nd i s s o l v e d b y w a t e r a g a i n s t e c o l i 表1 4 亮聚i 曹季饺盐醋酸涪治c ( o 2 5 ) 抗大脑杆菌的b t l c 和扣m c 一 4 3 t a b 1 4m i ca n dm b c o f q u a t e m i z e d c h i t o s md i s s o l v e d b y0 2 5 a c e t i c a c i da g a i n g te c o l i 表1 5 壳聚糖季铵盐醋酸溶液( o 5 ) 抗大肠杼菌的m l c 和m b c4 4 t a b - 1 5m i ca n dm b c o f q u a t e m i z e dc h i t o s a nd i s s o l v e d b y o 5 a c e t i c a c i d 蜘阚e e , o l i 表1 6 壳聚糖季铵盐醋酸培液( o 5 ) 抗金黄色葡莓球菌的m i c4 7 t a b 1 6m i c o f q u a t e r n i z e d c h i t o s a nd i s s o l v e d b y0 5 a c e t i ca c i d q p a n s ts 1 赫 浙江大学硕士学位论文 1 前言 1 1 引言 甲壳素( c h i t i n ) 又名甲壳质、几丁质、蟹壳素、明角壳蛋白，学名 为( 1 ，4 ) 2 - 乙酰氨基2 脱氧0 d 葡聚糖，是由n 乙酰2 - 氨基一2 脱氧一 d 葡萄糖通过b 1 ，4 糖苷键聚合而成的天然高分子聚合物。甲壳素广泛存 在于自然界甲壳类动物如虾、蟹、贝、蜗牛的外壳，昆虫类如蜘蛛、蟋蟀、 独角仙的骨胳和低等植物如真菌、藻类的细胞壁中。甲壳素在自然界中资 源非常丰富，每年生成量约有1 0 0 亿吨左右，产量仅次于与之结构相似的 纤维素( c e l l u l o s e ) ，是地球上作为天然多糖仅次于纤维素的自然资源。 甲壳素进一步经浓碱处理脱去乙酰基，即为壳聚糖( c h i t o s a n ) ，又名脱乙 酰度甲壳素、甲壳胺，学名为( 1 ，4 ) 2 - 氨基2 脱氧d d 葡聚糖，分子 式为( c 6 h 。n o ) 。甲壳素和壳聚糖的结构式如图所示： c h 2 0 h 甲壳素 c h 2 0 h 壳聚糖 o 图1甲壳素和壳聚糖的结构式 f i g u r e1 s t r u c t u r a lf o r m u l ao f c h i t i na n de h i t o s a n n 塑兰查堂塑主堂垡垒奎 甲壳素最早由法国科学家b r a e o n n o t 于1 8 1 1 年从霉菌中发现，1 8 2 3 年，o d i e r 发现在昆虫外壳中广泛存在甲壳素，并把它命名为“c h i t i n ”。1 8 5 9 年r o u g e t 把甲壳素与k o h 共煮发现了甲壳胺，以后1 0 0 多年间对其研究 时断时续，直至二十世纪五十年代，才对甲壳素有了比较详细的了解，六 十年代以后，世界各国对甲壳素的研究开发工作变得日益活跃。国际会议 自在美国、日本召开后又相继在意大利、挪威、波兰、法国等地召开，2 0 0 0 年9 月又将在日本山口县召开第八届甲壳素壳聚糖学术会议和第四届亚 太地区甲壳素会议。我国自1 9 5 4 年即开始有关甲壳素的研究，但只在最 近十几年才对甲壳素壳聚糖的开发和应用予以重视。1 9 9 6 年l o 月和1 9 9 9 年4 月中国化学会分别在大连和武汉召开第一届和第二届甲壳素化学与应 用研讨会，1 9 9 8 年7 月中国化学会又在浙江玉环召集了甲壳素专家论坛 报告会，这些活动均推动了我国甲壳素化学的发展。 近年来，甲壳素和壳聚糖的应用研究越来越广泛，已经涉及到医药、 化工、食品、纺织、印染、农业、化妆品和生物工程等领域。甲壳素由于 呈紧密的微晶结构，结晶性较强，所以溶解性能很差，不溶于普通溶剂， 化学性质也相对不活泼。而壳聚糖分子中有游离的氨基和羟基存在，其溶 解性和反应性能都大为改善，但分子中一些氢键作用( 0 h o 型及n h o 型) ，使其很难溶于一般的有机溶剂和水中，从而限制了其应用，也影 响了研究工作的广泛开展。 浙江省也是一个甲壳素生产大省，仅以蟹壳和虾壳为原料，浙江省每 年就能生产甲壳素近1 0 0 0 吨。但是近几年中，由于甲壳素和壳聚糖的外 贸出口量及价格均有所下降，使我省的生产企业和外贸库存积压，生产企 业陷入困境，所以立足于国内市场，针对壳聚糖应用受限制的情况，利用 壳聚糖上c 。- o h 和c ，- n i - 1 2 的反应活性将其进行化学改性，以开发更广泛 的新用途，如开发出食品添加剂、化妆品添加剂、医药品和医药试剂等， 浙江大学硕士学位论文 这是对我省发展和开拓海洋生物资源，短期内使我省的海洋生物工程水平 提高到国内先进水平的有力措施，因而对壳聚糖进行衍生化，也是甲壳素 和壳聚糖研究中最为活跃而又深入的课题。 本文通过对壳聚糖进行其中一种衍生化一季铵化，以期引入多功能基 团来改善壳聚糖的溶解性，拓宽其应用前景，从而赋予其更多的特殊功效， 使壳聚糖的衍生化得到更进步的发展。 塑垩盔堂塑主堂焦笙奎 1 2 文献综述 1 2 1 壳聚糖的衍生化研究现状 壳聚糖由于分子中含有反应活性很强的氨基n h ：，己广泛应用于化 工、食品、化妆品、环保和医药行业，但由于壳聚糖分子量高，无强的亲 水基团，且分子内或分子间有较强的氢键作用( o - h o 型及n h o 型) ， 使其很难溶于一般的有机溶剂和水中，从而限制了其应用范围。壳聚糖分 子中含有羟基o h 和氨基- n h ：。可以对其进行化学修饰，引入多功能基团， 以改善它们的溶解性，拓宽其应用前景。 壳聚糖的衍生化主要有酰化反应、羧基化反应、醚化反应、席夫氏反 应、n 烷基化反应、酶化反应及其它反应。 ( 1 ) 酰化反应 酰化反应可在羟基( o 酰化) 和氨基( n 酰化) 上进行，酰化产物 的生成与反应溶剂、酰基结构、催化剂等有关，可以通过控制反应条件而 控制反应在羟基或氨基上进行。酰化衍生物的溶解性大大增强，如壳聚糖 与6 葡萄糖酸内醣、b 。丙醇酸内酯和缩水甘油进行酰化，可得到水溶性 产物( l o u b a k iz ，1 9 8 9 ) ：壳聚糖与丁二酸酐、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲 酸酐反应而生成n 酰化壳聚糖可溶于水、稀酸和稀碱中( r o u td k ，1 9 9 3 ， 1 9 9 4 ) ，琥珀酰基壳聚糖也可溶于水、稀酸和稀碱( y a m g c h ir ，1 9 8 1 ) 。经 过酰化修饰的壳聚糖在多个领域有广泛的应用，尤其作为生物医学材料在 生物医学工程领域应用，如n 酰化壳聚糖( n 辛酰壳聚糖，n 己酰壳聚 糖) 是血液相容性材料( h i r a n os ，1 9 8 5 ) ，甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁 酰基壳聚糖具有抗凝血的活性( k a i f uk ，1 9 8 0 ) 。 ( 2 ) 酯化反应 堑兰查堂翌主堂垡堡茎 用含氧无机酸作酯化试剂，可使壳聚糖在羟基上形成有机酯类衍生 物，常见的反应有硫酸酯化和磷酸酯化。壳聚糖的硫酸酯化衍生物在结构 上与肝素相似，具有抗凝血作用( d o c z ij ，1 9 5 3 ) 。近年来的研究发现， 壳聚糖硫酸酯化衍生物具有抗病毒和抑制肿瘤的作用( y o k u r as ，1 9 9 4 ； 肖航，1 9 9 9 ) 。特别是壳聚糖硫酸酯化衍生物会抑制h i v 的活性。对于 壳聚糖硫酸酯化衍生物抑制h 1 v 的机理，可能是因为壳聚糖硫酸酯化衍 生物会干扰h i v 早期感染并竞争性抑制h i v 1 逆转录酶的活性( 严共鸿， 1 9 9 9 ) 。 ( 3 ) 羧基化反应 现对羧基化反应研究较多，主要是用氯代烷酸或乙醛酸，在壳聚糖的 6 羟基或氨基上引入羧烷基基团，所以羧基化反应的位置可在o 上，也可 在n 上。羧基化反应研究最多的是羧甲基化反应。根据羧基化反应的位置， 产物分别为o - 羧甲基化壳聚糖( 0 - c m 壳聚糖) 、n 羧甲基化壳聚糖( n c m 壳聚糖) 和o ，n 羧甲基化壳聚糖( 0 ，n c m - 壳聚糖) ( m u z z a r e l l ir a a ，1 9 8 2 ，1 9 8 4 ) 等。壳聚糖在碱性条件下室温时反应产物为o c m 壳聚 糖；温度为6 0 ( 2 时，可得到o ，n c m 壳聚糖：在酸性介质中，采用乙醛 酸做羧基化试剂，可使反应只发生在n 上，还原后得到n - c m - 壳聚糖 ( m u z z a r e l l ir aa ，1 9 8 8 ) 。 羧甲基化壳聚糖有很多用途。n c m 壳聚糖对过渡金属离子有很强的 螯合作用：在水溶液中形成的膜具有选择透过性( 许时要等，1 9 9 3 ) ，因 其一定的抗菌性能和安全无毒性( 刘万顺等，1 9 9 7 ) ，可用于食品保鲜； 由于其保湿性可用于化妆品。n c m 壳聚糖在农业上可用于抑制甲壳素酶 和壳聚糖酶的活性，促进植物的生长( m i r a r os ，1 9 8 6 ) 。o ，n c m 壳聚糖 的钠盐可溶于水，对重金属和大分子有机阳离子经络合反应形成沉淀，可 应用于水的净化；0 ，n c m 一壳聚糖也可用作缓释药物的载体，以控制药 浙江大学硬士学位论文 物的持续释放，因为它们只能被酶或菌类分解，而与水和其它物质不会反 应( t o k u r as ，1 9 9 4 ) 。 ( 4 ) 醚化反应 壳聚糖结构中的羟基( 主要是c 。位羟基) 可与烃基化试剂反应生成醚 ( 董炎明等，1 9 9 9 ) ，如甲基醚、乙基醚、苄基醚、羟乙基醚、氰乙基醚、 羧甲基醚等等，使之改善溶解性或赋予另外的特性，开发出新的用途。 ( 5 ) 席夫氏反应 壳聚糖与醛、酮进行席夫氏反应，生成相应的醛皿胺和酮亚胺类多糖。 利用这个反应，一方面可保护游离n h ：，在羟基上引入其它基团( h a l l ld ， 1 9 8 0 ) 另一方面再还原可得到相应的n 取代多糖。由醛、酮与壳聚糖反 应得到的n - 烷基壳聚糖及其衍生物对金属离子有较强的螯合能力( 黄晓佳 等，2 0 0 0 ：k e i s u k ek ，1 9 9 9 ；y o s h i n a r ib ，9 9 8 ) 。y o s h i n a r ib ( 1 9 9 6 ) 等 人将吡啶甲醛、噻吩甲醛与壳聚糖反应生成的席夫碱用环氯氯丙烷活化， 再用n a b h 4 还原得到的壳聚糖衍生物对多种金属离子有比较强的吸附螯 合能力。 通过席夫氏反应也可以制备n 烷基化衍生物，如壳聚糖与甲醛反应 可使n 上全甲基化( m u z z a r e l l i r a a ，1 9 8 5 ) 。 ( 6 ) 其它反应 除以上几个主要反应外，壳聚糖的衍生化反应还有氧化反应、卤化反 应、季铵化反应、水解反应、接枝共聚与交联反应等等。在本文中将对季 铵化反应和水解反应作详细论述。 1 2 2 壳聚糖季铵化的国内外研究现状 1 2 2 1 国内研究现状 6 浙江大学硕士学位论文 纤维素是地球上资源最丰富的天然多糖，可用作食用纤维，而壳聚糖 的结构与纤维素类似。有学者进行过纤维素上的季铵化( 张黎明等，1 9 9 8 ) ， 他们通过季铵化剂3 氯2 羟丙基三甲基氯化铵( c h p a c ) 与羧甲基纤维素 反应，在纤维素的c ，和c ，位羟基上接上季铵基团，使原本紧密的高分子 链变得较为自由、舒展，结果产物水溶性大大增强。壳聚糖结构中也有羟 基，而且有活性更强的氨基，所以也可将壳聚糖季铵化。 许晨等( 1 9 9 7 ) 进行过壳聚糖季铵盐的合成。他们将壳聚糖与缩水甘 油三甲基氯化铵反应，通过c ：位上季铵盐基团的引入，制得壳聚糖季铵 盐。通过核磁共振和红外光谱测定确证为壳聚糖c 2 位氨基上发生的取代 反应。并且对该盐的水溶性、吸湿性和保水性进行了测定：反应2 h 时在 水中溶解度为5 0 。6 h 时8 5 溶解，1 4 h 时全部溶解：当相对湿度为8 1 时，样品吸水量很大，放置2 4 h 后仍然继续吸水，认为这是由于壳聚糖分 子中引入的季铵盐基团的增加，增强了分子的水合能力，从而使样品的持 水量增大，发现有望成为来源丰富、性能良好的化妆品保湿材料。 季铵盐是一种表面活性剂，具有较好的水溶性和抑菌杀菌能力。汪祖 模等( 1 9 9 2 ) 认为，对于分子结构为【r n ( c h 3 ) ：r d a r 的季铵盐阳离子 表面活性剂，当r 2 为c h ，时，随碳链r l 长度的增大，杀菌能力增强( c i h ， ( c 1 2 h ( c l 心( c 6 k ) ，而当r 2 为苄基时，杀菌能力比前者大大提高。 说明季铵盐阳离子表丽活性j l 的杀菌能力与本身的分子结构有很大的关 系。所以我们可以考虑在壳聚糖分子上接上苄基基团。 1 9 9 4 年，有学者将高度脱乙酰度的壳聚糖与缩水甘油基三甲胺氯化 物( g t m a c ) 反应，使壳聚糖季铵化，将产物壳聚糖季铵盐作为食用纤 维及降胆固醇药物使用( 夏文水等，1 9 9 4 ) ，可见壳聚糖季铵盐具有一定 的安全性，为壳聚糖季铵盐的应用拓宽了范围。壳聚糖季铵盐还可作为重 金属的选择性捕集剂、絮凝荆、抗菌素和离子交换材料( 蒋庭大，1 9 9 6 ) 。 塑兰查堂塑主堂堡垒壅 1 2 2 2 国外研究现状 壳聚糖的季铵化在国外研究得比国内早，1 9 8 5 年m u z z a r e l l i 和 t a n f a n n i 就报道了碘化n 三甲基壳聚糖的合成方法，即将n 二甲基壳聚 糖与碘甲烷反应生成壳聚糖季铵盐，但此法合成的壳聚糖季铵盐是不溶 于水的；d o m a r d 等于1 9 8 5 年报道了用碘甲烷和n 甲基2 吡咯烷酮直接 从壳聚糖合成季铵盐的方法，用此法获得的壳聚糖季铵盐是溶于水的。 但壳聚糖碘代季铵盐的稳定性不如氯代季铵盐好，所以将碘化n 三甲基 壳聚糖溶于水，通过离子交换树脂即可转型为氯化n 三甲基壳聚糖。日 本的t o a h i h i r o 等( 1 9 9 5 ) 将n 烷基壳聚糖季铵化以后，季铵盐表现出 了较大的溶解范围，在p h 从1 1 1 范围内均可溶，且能溶于有机溶剂如 甲醇等。 甲壳素，壳聚糖季铵盐具有抗菌活性。有学者进行过甲壳素上的季铵 化，并对抗菌性进行比较( k i m e ta l ，1 9 9 7 ) 。他们将二乙氨乙基( d e a e ) 基团接入到甲壳素的c 6 位羟基上形成二乙氨乙基甲壳素( d e a e e h i t m ) ，然后用乙基卤化物将其季铵化得到三乙氨乙基甲壳素( t e a e c h i t i n ) 。另外将d e a e - d f i t i b 脱乙酰化得d e a e - e h i t o s a n ，比较其抗大肠 杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，发现其抗菌活性从大到小顺序依次 为t e a e - c h i t i n d e a e - c h i t o s a a d e a e - c h i t i n ，可见抗菌性与产物的结构 有关，季铵盐抗菌性大于壳聚糖。 k i m 等于1 9 9 7 年通过席夫碱中间物，将烷基接到壳聚糖的氨基上， 所得到的n 烷基壳聚糖衍生物再用甲基碘季铵化，得到壳聚糖季铵盐， 进行水溶性测定发现由于季铰盐基团的引入其水溶性大大增强。再进行 抗菌性测定并与壳聚糖比较，发现壳聚糖季铵盐抗大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌的抗菌活性大于壳聚糖，且随着烷基链长度的增加，活性也增强。 8 浙江大学硬士学位论文 壳聚糖季铵盐与壳聚糖相比，在溶解性、抗菌性等方面均有所加强， 所以我们进行壳聚糖的衍生季铵化的研究，这将有利于拓宽壳聚糖及 壳聚糖季铵盐的应用范围。 1 2 3 壳聚糖及其衍生物的抗菌活性 1 2 3 1 壳聚糖的抗菌活性 壳聚糖以其独特的结构，对许多真菌和细菌有抑杀作用。据日本报道 ( u c h i d a ，1 9 8 8 ) ，壳聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用。蒋玉 燕等( 1 9 9 6 ) 对壳聚糖的体外抗菌活性测定表明，壳聚糖有抗革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性，且对革兰氏阳性菌的敏感性高于革兰氏阴 性菌。对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，壳聚糖均显示快速和强大的杀菌 作用，当壳聚糖浓度为8 m g m l 时。2 h 能杀死大部分的大肠杆菌，8 h 能杀 死等量的金黄色葡萄球菌，2 4 h 能1 0 0 0 , 6 杀死金黄色葡萄球菌。 壳聚糖在医药工业上可用作杀菌剂。1 9 8 4 年a l l a ng g 等发现，在烧 伤病人发生绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌感染时，壳聚糖具有 显著的抑菌作用，对于般人体表皮存在的皮肤细菌如表皮葡萄球菌、肠 细菌如大肠杆菌、人体真菌如白色念珠菌，壳聚糖也有显著的抻菌作用。 壳聚糖的抗菌性在农业上得到应用。a h m e de g 等( 1 9 9 2 ) 研究了壳 聚糖对采摘后的草霉病原体的抗真菌活性，发现壳聚糖抑制了采摘后草莓 病原体的生长，控制了草莓的腐败。 壳聚糖不溶于水，但是可以溶于乙酸溶液中，许多学者对其安全性进 行过测定( a r a ik ，1 9 6 8 ；h i r a n os ，1 9 8 9 ：l a n d e sd r a n db o u g hw a ， 1 9 7 6 ：g a r d o nd t a n dw i l l i f o r dc b 。1 9 8 3 ) ，并在食品领域得到不断的应 用试验。s h a ow e 等( 1 9 9 4 ) 用壳聚糖对金桔蜜饯的防腐试验测定了壳 9 堑兰查堂塑主兰垡笙壅 聚糖抗真菌的活性，试验表明，壳聚糖对黑曲霉和寄生曲霉的生长以及黄 曲霉毒素产物的产生均有抑制作用。谷田孝雄等用水解壳聚糖( 分子量为 1 万5 万) 作抗菌试验，结果表明其对有害菌有抑制作用( 谷田孝雄，1 9 8 9 唐雪蓉等，1 9 9 6 ) 。王光华等( 1 9 9 2 ) 报道，在猪肉的保鲜过程中，壳聚 糖可用于防腐保鲜，壳聚糖乙酸混合液对猪肉中的各种腐败菌( 如假单胞 杆菌、肠杆菌科菌、乳酸杆菌、霉菌、梭状芽孢杆菌和葡萄球菌等) 及致 病菌( 如金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和李斯特单核增生菌等) 均有 一定的抑制作用，且抑制作用比相同浓度的乙酸溶液好。t s a i 等( 1 9 9 7 ) 报道，高脱乙酰度的壳聚糖对海产品有较好的防腐作用，其中对蜡状牙孢 杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、亲水性产气单孢菌、白色念珠菌有较好的抗菌性， 可用于海鲜保鲜。有学者证实，在2 0 和5 条件下在鱼糕中添加壳聚糖 均能明显延长保存时间( 黄俊儒，1 9 9 7 ；c l m ajk 1 9 9 4 ) 。日本的内田和 庄司舆成濑报告，0 0 5 壳聚糖添加于腌制花瓜或白菜，可延长保存期限 6 0 天以上( 庄司祯，1 9 9 0 ；黄俊儒，1 9 9 7 ) 。壳聚糖的抗真菌和抗细菌的 特性，对壳聚糖延长产品的货架期起到关键的作用。 陆淼泉等用改良q u m n 法对用壳聚糖处理过的织物做抗菌试验，证 明亮聚糖对金黄色蕾萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抗菌率为1 0 0 ， 经皂洗5 0 次后，对上述三种菌的抗蓄率仍在7 5 以上，显示出良好的抗 细菌和抗真菌作用此外，对抵抗力较强的枯草杆菌( 芽胞菌) 也有一定 的抗菌作用( 陆淼泉，1 9 9 7 ) 。n i s h i m u r a t 等( 1 9 9 5 ) 发现羊毛织物在吸 收壳聚糖以后显示一定的抗菌性，可以在羊毛织物上用做抗菌剂和除臭 剂。 1 2 3 2 壳聚糖衍生物的抗菌活性 不仅壳聚糖有抗菌活性，一些壳聚糖衍生物也具有抗菌活性，且衍生 物改善了溶解性，扩展了应用范围。壳聚糖在氨基上羧甲基化成n c m 浙江大学硕士学位论文 _ - _ _ _ _ _ - _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ c h i t o s a n ，在羟基上羧甲基化成o c m c h i t o s a n ，在氨基和羟基上都羧甲 基化成n ，o c m c h i t o s a n ( 简称n o c c ) 。三种壳聚糖羧甲基化衍生物都 有抗菌活性：o c m c h i t o s a n 可以抑制甲壳素酶和壳聚糖酶的活性；n c m c h i t o s a n 可使黄曲霉素减少9 0 0 , 6 以上，真菌生长降低一半以上；n c m 。c h i t o s a n 能抑制孢子发芽和真菌体孢子的形成，而且n - c m - c h i t o s a n 对口腔细菌尤其是蛀齿细菌特别敏感( m u z z a r e l l i r a a ，1 9 8 7 ，1 9 8 8 ) ；n ， o c m c h i t o s a n 在水溶液中易形成牢固膜，不利于细菌和大部分真菌的生 长( 夏文水，1 9 9 5 ) 。利用其水溶性和杀菌性，c m c h i t o s a n 已用在清洗 液和洗面奶中，利用其抑菌和增粘保湿作用，c m c h i t o s a n 也已添加于牙 膏和化妆品中了。另外壳聚糖在乙酰丙酸作用下得到的n 羧丁基壳聚糖 据报道也有很强的抑菌作用，n - 羧丁基壳聚糖溶于水和乙醇- 水溶液中， 可用作人造皮肤、乳化稳定剂和化妆品中的活性成分( m u z z a r e l l ir aa ， 1 9 9 0 ) 。 另外，一些壳聚糖季铵盐也具有抗菌活性。t s u m g a ik 等( 1 9 9 4 ) 发 现n ，n ，n 三甲基壳聚糖季铵盐有抗大肠杆菌a t c c2 5 9 2 2 和葡萄球菌 属a t c c1 4 9 9 0 9 的活性。含有n 长链烷基壳聚糖的季铵盐对月孢子菌、 大肠杆菌有抗菌作用( 于义松，1 9 9 2 ) 。壳聚糖与碘代甲烷在三乙胺中反 应所得到的季铵盐对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用( h i r a n os 。1 9 8 7 ) 。k i m 等通过席夫碱反应得到多种壳聚糖季铵盐，发现在乙酸缓冲液中，1 0 0 p p m 浓度的抗菌剂，经比较其抗菌活性的顺序为壳聚糖 n , n - 二丁基壳聚糖 m w l 2 0 0 0 m w 5 4 0 0 0 ，当衍生物分子量与肝素的分子量接 近时，其抗凝作用最强( 严共鸿，1 9 9 9 ) 。 1 2 4 低聚壳聚糖的制备研究 甲壳素和壳聚糖本身都是由单体聚合而成的聚合物，分子量很大。从 前面可知，壳聚糖和壳聚糖衍生物的生物活性与分子量之间有一定的关 系。所以我们可以考虑在适当的条件下将壳聚糖降解，以不同分子量的壳 聚糖为原料，合成不同的壳聚糖季铵盐，并比较其产物特性。 壳聚糖的降解主要有化学降解法和酶降解法。酶法降解条件温和，降 解过程及降解产物分子量分布易于控制，且不对环境造成污染，是壳聚糖 降解较理想的方法。但是酶法降解持续时间较长，且就目前技术而言，酶 法降解不宜进行大规模的工业化生产，所以考虑用化学降解法。 早在1 9 5 7 年，h o r o w i t z 等就用浓盐酸水解壳聚糖，用d o w e x5 0 x 阳 离子交换柱色谱精制得到单糖到五糖，但单糖含量很高，寡糖含量低，并 且需要大量的离子交换树脂，成本太高( h o m w i t z ，1 9 5 7 ) 。后来又发展 过醋酸法( w o d a s h i1 9 9 0 ) 、酸亚硝酸盐法( t o m a y a1 9 8 7 ) 、浓硫酸法o v l a k s i n o v 1 9 9 0 ) 、氢氟酸法( j a c q u e s1 9 9 0 ) 等许多种，但由于反应很难控制，很少得 到应用。有学者m a k o t oh ( 1 9 9 3 ) 做过用8 5 磷酸降解壳聚糖的实验，发现 用磷酸降解反应相对稳定，且所取得的产物有较高的脱乙酰度，有利于壳 聚糖的进一步衍生化。不过用于工业化生产的主要还是盐酸降解法。 氧化降解法近几年研究较多尤其在日本，每年都有这方面的研究成 果见诸报道。在诸多氧化降解法中，以过氧化氢氯化法开发居多，其中包 1 4 浙江大学硕士学位论文 括h 2 0 2 法( m a s a k i1 9 8 1 ) 、h 2 0 2 n a c l 0 2 法( i s a m u1 9 8 8 ) 、u s 0 2 h c i 法( t s u g u h e i 1 9 9 7 ) ，其它的氧化降解法有n a b 0 3 法( k u b o t a , 1 9 9 2 ) 、c 1 0 2 法c k e n j i1 9 8 9 ) 、 c l ，法( h i r o c h i ，1 9 8 5 ) 等。这些方法中，有的己用于低分予量壳聚糖的工业 化生产，但大部分仍处于实验室研究阶段。 本文以双氧水降解、磷酸降解和超声波降解三种方法相比较，制备低 聚壳聚糖，比较了三种产物的相关性质。 1 2 5 综述 综上所述，壳聚糖及其衍生物具有抗细菌和抗真菌的作用，尤其是壳 聚糖季铵盐，其抗菌作用和溶解性明显地好于壳聚糖，大大扩展了壳聚糖 的应用范围。研究表明，壳聚糖的许多性质与分子量之间存在着密切的关 系，一些低分子量的壳聚糖具有较好的水溶性和抗菌性，且壳聚糖衍生物 的一些性质也与分子量之间存在一定的关系。所以，本文在考虑制备壳聚 糖季铵盐时，也考虑了它与分子量的关系，即以不同分子量大小的壳聚糖 为原料，进行壳聚糖的衍生化在低分子量壳聚糖制备时，以不同的降解 方法进行降解，对产物的降解速度、分子量、水溶性、产率以及脱乙酰度 予以比较，考虑到产物要进一步衍生化，所以选取能获得较高脱乙酰度的 方法进行壳聚糖的降解。在合成过程中，由于有资料表明，季铵盐阳离子 表面活性剂的杀菌能力与本身的分子结构有很大的关系，当季铵盐分子结 构中含有苄基时，其杀菌能力大大提高，所以考虑在壳聚糖分子上接上苄 基基团。最后产物合成以后，对不同的合成产物进行性质比较，尤其是溶 解性和抗菌性的比较，选取有量佳抗菌性的壳聚糖季铵盐这就是本实验 的最终目的。 浙江大学硕士学位论文 _ - _ _ _ _ _ _ _ _ 。i _ _ _ _ _ _ 。_ _ 。_ _ _ - _ 。_ 。_ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ 。_ _ _ 。_ _ _ _ _ 。_ - 。_ 。_ 。- - 。- 。_ _ _ _ 。一 2 低分子量壳聚糖的制备研究 2 1 引言 制备低分子量的壳聚糖有许多方法，本文采取双氧水降解法、磷酸降 解法和超声波降解法，对不同的降解方法在降解速度、产率、水溶性、分 子量大小以及脱乙酰度等方面进行比较，选取最适宜迸一步衍生化的降解 方法。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 原料：