（食品科学专业论文）玉米胚芽中谷氨酸脱羧酶性质的研究及其γ氨基丁酸的酶法富集.pdf

i i i il lii i f if ii i llliif y 17 7 8 16 2 玉米胚芽中谷氨酸脱羧酶性质的研究及其 y 氨基丁酸的酶法富集 s t u d y o nt h ep r o p e r t i e so fg l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e a n dt h ea c c u m u l a t i o no f 7 - a m i n o b u t y r i c a c i di nc o r ng e r m 专业：食品科学 研究生：王玲玲 指导教师：李楠副教授 生物技术与食品科学学院 2 0 1 0 年5 月 摘要 本论文对玉米胚谷氨酸脱羧酶( g a d ) 的分离纯化、酶学特性等进行了深入的研究， 并应用玉米胚g a d 及其活性调节机制制备了高丫氨基丁酸( g a b a ) 玉米胚粉。 在对g a d 的分离纯化过程中采用了c m 纤维素离子柱层析和s e p h a d e x g 7 5 凝胶柱 层析，从玉米胚中分离得到一个较纯的g a d 组分，并经s d s p a g e 测得玉米胚g a d 亚 基的相对分子质量为5 7 k 。 通过对玉米胚g a d 酶学性质的研究发现其最适反应温度为4 0 * ( 2 ，最适反应p h 为5 7 ； 且热稳定较差，8 5 。c 时酶几乎完全失活；但p h 稳定性较好；玉米胚g a d 对g l u 的k m 值为0 0 5 1 8 7 m o l l ，v m a x 的值为1 8 0 7 m g m i n 。另外，研究发现当c a 2 + 浓度达到4 0 0 1 u m o l l 时，对g a d 活性的激活作用最强，g a d 的表观米氏常数k m 为0 0 5 0 1 3 m o l l ，小于玉 米胚g a d 对g l u 的k m ，说明c a 2 + 提高了底物与玉米胚g a d 的亲和力，对玉米胚g a d 的活性确有较强的激活作用。 在利用玉米胚g a d 富集y 氨基丁酸工艺条件的研究中，首先用币己烷对玉米胚芽进 行了低温脱脂单因素试验；然后通过水浸泡法富集脱脂玉米胚中g a b a ，其工艺条件为： 料水比l ：4 0 ，反应时间5 h ，温度4 0 ，p h 值5 7 。在此工艺条件下添加6 0 0 1 a m o l lc a 2 十 可将g a b a 产量提高到4 m g g ，比未富集时提高l o 倍；另外，还发现添加底物l g l u 及 g a d 激活剂c a 2 + 、v 酯是富集g a b a 的有效方法，其优化反应条件为：脱脂玉米胚与磷 酸盐缓冲液( 0 0 8 m o l l 、p h 5 7 ) l t 例为1 ：4 0 ，v 1 3 6 和c a c l 2 的添加量分别为3 m m o l ( m o l g l u ) 和1 5 m m o l ( m o l g l u ) ，脱脂玉米胚与l g l u 用量之比为4 5 9 g ，4 0 。c t 反应6 h ，g l u 的转 化率可达1 0 0 ，g a b a 产量为1 5 5 7 m g g ，比未富集时提高4 0 倍，并且没有g l u 残留， 产率可达8 8 1 4 ，可在不同功能食品中添加和应用。 关键词：丫氨基丁酸( g a b a ) ：谷氨酸脱羧酶( g a d ) ；脱脂玉米胚；分离纯化；酶学性 质；富集。 s t u d y o nt h e p r o p e r t i e so f g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e a n dt h ea c c um u l a t i o no f v - a m i n ob u t y r i c - a c i di i ic o r ng e r m a b s t r a c t t h i sr e s e a r c hw a sc o n d u c t e dt op u r i f ya n dc h a r a c t e r i z et h eg a df r o mc o r ng e r m ，t os t u d y t h ee n z y m o l o g yp r o p e r t i e so fg a d ，a n dt op r o d u c ec o mg e r mw i t hh i g hg a b ac o n t e n t g a dw a sp u r i f i e df r o mc o r n g e r mb yc mc e l l u l o s ei o nc h r o m a t o g r a p h y a n d s e p h a d e x g 一7 5g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y am a j o r i t yo f h y b r i d p r o t e i nw a ss e p a r a t e d a n dt h e m a i nb a n d f r o ms d s p a g es h o w e dt h es u b u n i tm ww a s5 7 k t h ep u r i f i e dg a ds h o w e di t sm a x i m a la c t i v i t ya tp h 5 7a n d4 0 。c t h ee n z y m ew a s i n a c t i v a t e dc o m p l e t e l ya t8 5 。c i tw a ss t a b l ea tp h 4 5 - 7 5 t h ek ma n dv m a xo fg a df o rg l u w a s0 0 518 7 m o l la n d 1 8 0 7 m g m i n i na d d i t i o n ，g a d c o u l db ea c t i v a t e d b yc a 2 + , t h e c o m p a r a t i v ea c t i v i t yr e a c h e d131 w h e n4 0 0 p m o l lc a 2 + w a sa d d e d ，a n dt h ea p p a r e n tk m w a s c h a n g e dt o0 0 5 0 13 m o l l ，l e s st h a nt h ek mf o rg l u t h i ss h o w e dt h a tt h ec a 2 + e n h a n c e dt h e a f f i n i t yb e t w e e ne n z y m ea n dg l u ，a n da c t i v a t e dt h ee n z y m e o p t i m i z i n gt h e c o n d i t i o n so fg a b a - a c c u m u l a t i o ni nd e g r e a s e dc o r ng e r mb yw a t e r s o a k i n gc o u l di n c r e a s et h ec o n t e n to fg a b a t o4 m g g ，i n c r e a s i n g10t i m e st h a nb e f o r e b u ta h i g h e rg a b a c o n t e n tm u s tb eo b t a i n e du s i n gg l ua n dg a da c t i v a t o r t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s w e r e0 0 8 m o l l p h o s p h a t eb u f f e r ( p h 5 7 ) ，a d d i n gvb 6a n dc a c l 23 m m o l ( m o l g l u ) a n d 15 m m o l ( m o l g l u ) ，t h er a t i oo fd e g r e a s e dc o mg e r mt ol g l uw a s4 5 9 g ，r e a c t i o nt i m ea n d t e m p e r a t u r ew e r e6 ha n d4 0 * c t h ec o n t e n to fg a b a i nt h ef i n a lp r o d u c tw a s15 5 7 2 m g g ，t h e e l dw a s8 8 14 3 a n dt h ec o n v e r tr a t eo fg l uw a s10 0 k e yw o r d s ：? - g a b a ；g a d ；d e g r e a s e dc o r ng e r m ；p u r i f i c a t i o n ；e n z y m o l o g yp r o p e r t i e s ； a c c u m u l a t i o n 目录 第一章绪论l 1 1y 氨基丁酸( g a b a ) 概述1 1 1 1g a b a 的合成与分解代谢l 1 1 2g a b a 的生理功能2 1 1 3g a b a 的制备4 1 2 谷氨酸脱羧酶( g a d ) 概述5 1 2 1 动物中的g a d 一5 1 2 2 植物中的g a d 一5 1 2 3 微生物中的g a d 6 1 - 2 4g a d 的活性调节6 1 2 5g a d 的应用一7 1 3g a b a 类食品的研究开发进展8 1 4 立题的意义9 第二章玉米胚谷氨酸脱羧酶的分离纯化与鉴定1 l 2 1 前言1 l 2 2 材料与方法1 1 2 2 1 实验材料与设备1 1 2 2 2 主要药品与试剂1 2 2 2 3 实验方法1 2 2 3 结果与讨论1 5 2 3 1 玉米胚g a d 的分离纯化1 5 2 3 2 玉米胚g a d 相对分子质量测定1 8 2 4 本章小结2 0 第三章玉米胚谷氨酸脱羧酶酶学性质的研究2 1 3 1 前言2 l 3 2 材料与方法2 l 3 2 1 实验材料与设备2 1 3 2 2 主要药品与试剂2 1 3 2 3 实验方法2 1 3 3 结果与讨论2 2 3 3 1 温度对玉米胚g a d 的影响2 2 3 3 2p h 对玉米胚g a d 的影响2 4 3 3 3 酶浓度对酶反应的影响2 5 3 3 4 玉米胚g a d 的动力学常数2 6 3 3 5 金属离子和其它化学物质对玉米胚g a d 的影响2 7 3 3 6c a 2 + 对玉米胚g a d 的激活动力学2 8 3 4 本章小结一2 9 第四章利用玉米胚内源酶富集y 氨基丁酸工艺条件的研究3 0 4 1 前言3 0 4 2 材料与方法一3 0 4 2 1 实验材料与设备3 0 4 2 2 主要药品与试剂3 0 4 2 3 实验方法3 0 4 3 结果与分析一3 2 4 3 1 玉米胚芽的氨基酸组成3 2 4 3 2 脱脂玉米胚g a d 活性测定3 4 4 3 3 玉米胚芽脱脂单因素试验3 4 4 3 4 内酶法富集玉米胚芽g a b a 一水浸泡工艺3 5 4 3 5 内酶法富集玉米胚芽g a b a 一添加l g l u 反应工艺4 0 4 3 6 富含g a b a 玉米胚芽的产率计算4 5 4 4 本章小结一4 5 第血章结论与展望4 7 5 1 结论4 7 5 2 展望4 7 参考文献4 9 攻读硕士期间发表的论文及学位论文使用授权声明5 5 致谢5 6 第一章绪论 1 1y 一氨基丁酸( g a b a ) 概述 y 一氨基丁酸( y - a m i n ob u t y r i ca c i d ，以下简称g a b a ) 又称氨酪酸、哌啶酸，广泛存 在于动植物中。它的分子式为c 4 h 9 n o z ，分子结构是h 2 n c o o h ，在丁酸的丫位上 有一个氨基，以非结合念的形式存在，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸。g a b a 合成 的主要途径是谷氨酸( g l u ) 脱羧反应，即由谷氨酸脱羧酶( g a d ) 催化转化谷氨酸产生。 早在1 9 世纪八十年代，就已经可以通过人工合成的方法生产出g a b a 。之后又对 g a b a 在真菌、细菌以及植物中的代谢情况做了一定的研究。1 9 5 0 年后，人们发现动物 体内的g a b a 几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量可达0 1 0 6 m e d 克组织，免 疫学研究表明，其浓度最高的区域为大脑中黑质。g a b a 在哺乳动物中枢的各部位可起 到普遍的抑制作用，在中枢神经系统发育过程中，可由兴奋性神经递质转变为抑制性神经 递质。它属于神经递质中的氨基酸递质，首先是在螫虾螫肢开肌与抑制性神经纤维所形成 的接头处发现的。直到1 9 7 5 年第二届国际g a b a 专题讨论会上g a b a 的意义和作用力 真j 下被确认。在这次讨论会上，g a b a 被正式确认为哺乳动物腩和脊髓中的一种抑制性 神经传递物质。 g a b a 作为抑制性神经传递物质不仅在哺乳动物脑和脊髓中参与多种代谢活动，起 着重要的作用，而且在高等植物中也广泛存在。如豆属、参属、中草药等的种子、根 茎和组织液中都含有g a b a 。过去对g a b a 的研究大部分在哺乳动物中，近年来研究 发现g a b a 还与植物x , j - 环境产生的应激反应有一定关系【2 1 。 1 1 1g a b a 的合成与分解代谢 g a b a 可由l - g l u 脱羧合成，谷氨酸脱羧酶( g a d ) 在这一过程中起主要的催化作用。 该酶主要含于脑灰质中，参与g a b a 的合成。在一些特殊情况下，丁二氨及鸟氨酸也可 经过转化产生g a b a ，但它们都可由l g l u 生成，所以可以说g l u 是合成g a b a 的唯一 来源【3 1 ，这对开发利用g a b a 具有一定的指导意义。 第一章绪论 在正常情况下，脑内g a b a 由突触前神经元利用g l u 合成，并在中椒神经系统内分 解。g l u 脱羧反应与g a b a 转氨作用、琥珀酸生成反应等共同构成了g a b a 支路【3 1 ，如 下： 转氨酶 _ 一符氯教 1lr 6 如 动物g a d 微生物g a d ，也就是说，植物g a d 与底物的亲和能力 最弱，这提醒我们在利用植物来源的g a d 制备g a b a 时，要尽量提高底物浓度，这样有 利于g a d 充分发挥作用。此外，从g a d 作用的最适p h 值来看，动物、微生物和植物 三者之间也存在着一定的规律：动物g a d 植物g a d 微生物g a d ，植物g a d 的最适 p h 值在5 5 6 5 之问，预计玉米胚芽g a d 的最适p h 值也应在此范围内。 1 2 4g a d 的活性调节 磷酸吡哆醛( p l p ) 与脱辅基酶蛋白共同构成g a d ，其中p l p 属于g a d 的辅基，对 g a d 发挥活性起非常重要的作用【3 5 】。 动物体内g a d 酶的活性是通过p l p 与脱辅基酶蛋白的解离和聚合来调节的。腺嘌呤 6 第一章绪论 核苷酸对动物g a d 的抑制性作用包括p l p 的解离和脱辅基酶蛋白的形成，当去除核苷酸 后加入p l p ，g a d 即可恢复币常活性。腺嘌呤核苷酸a t p 使酶失活的能力最强，其次是 a d p ，最后是a m p 。a t p 利于脱辅基酶蛋白的存在，从而对脱辅基酶等产生变构效应来 抑制酶的活性，这种效应可被p l p 和磷酸拈抗。谷氨酸在无p l p 时可促进a t p 导致g a d 酶失活。此外，含碳基试剂、含毓基试剂、巯基复合物等对该酶也都有抑制作l n t ”】。 在植物g a d 中p l p 仍然是其辅基【3 6 1 ，并对g a d 发挥活性起着重要作用【3 7 】。有研究 表明，植物来源的g a d 是一种钙调素( c a m ) 结合蛋创3 8 - 3 9 ，其活性受c a 2 + c a m 控制 4 0 - 4 1 1 。通过对大豆【4 2 1 、蚕豆【4 3 1 等植物g a d 的研究表明，钙调素与g a d 结合后可对g a d 酶活起到调节作用，从而控制谷氨酸和g a b a 的代谢，这是植物的正常生长所需要的m j 。 除此之外，植物g a d 的活性还受到细胞质p h 的影响，当细胞质p h 下降时，g a d 活性 会增加。这些f 是植物在多种逆境条件下可以激活g a d ，使g a b a 含量增加的原因【4 4 彤】。 显然，g a d 在动植物体内的活性调节机制与其生命活动有着密切的关系，但对离体 g a d 的研究报道还很少，尤其是对玉米胚芽中g a d 活性调节机制的研究更是闻所未闻。 离开玉米的g a d 的活性是否也会受到p l p 、c a m 及 c a 2 + 】等因素的影响和调节? 其活性 调节机制有什么特点? 是否有足够的酶活来转化谷氨酸进行g a b a 的制备? 这些问题的 讨论研究对合理利用玉米胚g a d 制备g a b a 具有非常重要的理论和实践价值。 1 2 5 ( i a d 的应用 胰岛素依赖型糖尿病是危害人类健康的一大疾病。人g a d 和猪脑g a d 目前可作为 胰岛素依赖型糖尿病的抗原用于其诊断和预防 4 6 1 。有研究表明，胰岛d 细胞可与血清中 的自身抗体发生反应，损害胰岛p 细胞，从而导致胰岛素依赖型糖尿病；另一种自身免 疫性疾病僵人综合症，是由于自身抗体与分泌g a b a 的神经元起反应而造成的神经 系统损害。如今已研究发现这两类疾病的自身抗原均为g a d 。对抗体进行自身抗原注入 诱导免疫耐受可能预防胰岛素依赖型糖尿病的发生。 人们对植物中g a d 的应用还不是很多，主要就是茶叶和稻米制品中g a b a 的富集。 大肠杆菌g a d 是最常用的制备g a b a 的酶【4 7 4 引，制备出的g a b a 一般应用于化工 方面；乳酸菌、酵母菌和曲霉菌等微生物中的g a d 也具有良好的活性，可以用来制备食 品用g a b a ，目前部分已经实现了工业化生产【4 9 蜘】。 7 第一章绪论 1 3g a b a 类食品的研究开发进展 虽然g a b a 在自然界的分布很广泛，但将其开发作为保健食品功能因子无疑还 需要做大量的工作。动植物组织中g a b a 的含量都较低，例如豆叶中的含量仅为 o 0 4 9 9 g 鲜重，因而从动植物体内直接提取g a b a 并作为食品配料的可行性不大， 其原因主要是g a b a 存在量少并且分离困难【5 。 在食品中应用g a b a ，绝不是对药用g a b a 的简单添加，而是要从制备这个源 头开始，利用天然物质及采用生物技术方法，生产出可安全用于食品并可被视为天 然添加剂的食用g a b a 。目前，应用较多的是利用发酵法生物合成g a b a 添加剂。 也就是纯粹应用微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发酵生产g a b a 制剂。 被公认的安全微牛物有酵母菌、乳酸副5 2 l 等。 g a b a 是2 l 世纪倡导的绿色食品和有机食品的理想配料，也是十分理想的老年 疾病防治保健食品及药品，人体每天摄入3 0 一5 0 m g 纯天然g a b a 就能起到十分理 想的保健作用。由于用量微少，可以和其它植物提取物配对，制成适合各种消费群 体需要的胶囊、软胶囊、片剂、粉剂等形态的营养补充剂。可添加到保健食品和普 通食品中 5 3 1 。 在这方面，研究最早的国家是同本，在1 9 8 6 年他们就率先成功开发出了富含g a b a 的g a b a r o nt e a 茶【5 4 1 ，这种茶当时在市场上作为功能性食品进行销售，因为其具有良好的 降压效果，经进入市场，就深受广大消费者特别是高血压患者的喜爱。同本还有专门的 丫- 氨基丁酸研究机构叫g a b a 压力研究中心。日本p h a r m af o o d si n t e m a t i o n a l ( p f i ) ，以 特殊乳酸菌株( l a c t o b a c i 1 l u s h i l g ar d i ik 一3 株) ，采用谷氨酸发酵法制备出了高浓度的 g a b a ，蓝获得f 1 本特许厅发给的独家专利特许( 番号：2 0 0 3 7 0 4 6 2 a ) 。1 9 9 4 年，r 本农 林水产省中国农业试验场成功开发出了富含丫氨基丁酸的米胚和米糠【5 5 1 【5 6 1 ，同年富含丫 氨基丁酸的米胚由同本o r y z a 公司开发并投入市场。此外，r 本f u j i c c o 公司、大洋 香料、y a e g k i 研究所、f a m a f u s t s u 研究所等机构都在积极开发g a b a 食品素材， 涉及的领域除米制品、茶制品外，还包括在西红柿等食品中富集【5 7 1 。 开发含有g a b a 的功能性乳制品也有良好的应用酊景。乳制品的消费量很大， 也是最为普遍的食用消费品之一。强化g a b a 的g l a 0 品可以说是一种理想的组合， 因为富含的g a b a 能进一步增强乳制品的功能性，使其更具竞争力。但是，目前强 化g a b a 乳制品还只是一种构想，国外专利文献中有报道g a b a 在奶粉中的应用 8 第一奄绪论 5 s l ，而在其它品种中的应用较少，还需做大量的开发工作。 在运动食品中应用g a b a 在国外已经比较流行了。用g a b a 配制的运动型饮料， 可满足机体高强度运动的需要，快速恢复在工作、学习、运动中的体力消耗【5 9 1 。 近年来，在日本、欧、美等发达国家还开发出了含有g a b a 的面包、饼干、糕 点等焙烤食品，深受广大消费者的喜爱，特别适合老年人和儿童食用。 我国传统的药材和茶品中大多含有g a b a ，如人参【删【6 、国宾茶【6 2 1 、桑茶6 3 1 等，但 是由于人们对g a b a 生理功能的了解不够深入，我国g a b a 类食品的研究开发爿。只有几 年的时间，还f 在处于起步阶段，目前开发出的产品有湖南茶叶研究所研究出的具有降压 功效的金白龙茶畔】；中国水稻研究所培育出的富含g a b a 的水稻新品种，食用该大米可 以缓解和预防血压上升f 6 | 。虽然目阿国内的产品种类和数量都有限，但已经有越来越多 的公司正在致力于g a b a 类食品的开发，陆续会有新产品问世。 与r 本等发达国家相比，我国在研究开发g a b a 类食品上确实还存在着很大的差距。 因此，我们要加快研究开发高g a b a 食品的脚步，深入了解和掌握g a b a 的生理功能， 并研究与其合成密切相关的g a d 酶的相关性质和作用机制，为生产出更多、更好富含 g a b a 的食品而努力。 1 4 立题的意义 前面介绍了g a b a 作为活性因子，具有镇静神经、抗焦虑、提高脑活力、促进乙醇 代谢、加强肝、肾功能等生理活性，因此将其作为食品配料添加到功能性食品中具有良好 的市场前景。但是如何生产出安全、可靠、等同于天然添加剂的食用g a b a 是研究的关 键。利用稻米中g a d 制备g a b a 的方法已经进行了大量的研究，而利用玉米中g a d 制 备g a b a 却未见相关报道。稻米中的g a d 主要集中在胚芽中，玉米胚芽中也含有g a d ， 虽然其酶活没有米胚中g a d 的酶活高，但以玉米胚芽为原料制备g a b a 也有其自身的优 势： 1 ) 我国是生产玉米的大国，玉米资源丰富却一直未得到充分利用，玉米胚芽大多都 只是用来榨油，榨油后的残渣也只被当作饲料使用。其实，玉米胚芽中含有多种生理活性 物质以及重要营养元素，是一种得天独厚的天然营养源 6 6 1 。它集中了玉米8 5 的蛋白质和 9 5 的脂肪，富含大量氨基酸，其中的g a d 酶活较高，具备富集g a b a 的能力。所以， 可利于其中的内源性蛋白酶和谷氨酸脱羧酶转化谷氨酸产生g a b a 。 2 ) 对玉米胚先进行脱脂取油，再对脱脂玉米胚进行g a b a 的富集，不仅可获得玉米 9 第一章绪论 胚芽油，还可得到富含g a b a 的玉米胚芽粉，作为功能性食品的配料，而且成本低廉， 可充分利用资源，具有研究价值和经济价值。 虽然米胚中g a d 含量高是富集g a b a 的很好原料，但目前全世界面临粮食危机，寻 找稻米以外的其他粮食资源迫在眉睫，而我国玉米资源丰富，如果可充分利用这一资源， 在解决粮食危机的问题上将会作出一定的贡献。在美国，r 本等发达国家，利用玉米胚芽 富集g a b a 的相关报道很少，我国对这方面的研究也极为有限，所以这一课题很具有研 究价值。其中，对玉米胚g a d 做出全面、细致的研究是首要任务。 l o 第二章下米胚谷氰酸脱羧酶的分离纯化j 餐定 2 1 前言 第二章玉米胚谷氨酸脱羧酶的分离纯化与鉴定 根据我们目6 订的检索结果来看，国内外对玉米胚g a d 的研究极为有限，因此为了制 备高g a b a 含量的玉米胚粉，充分了解和掌握该酶各方面的性质是十分必要的。 实验的第一个任务就是将g a d 从玉米胚芽中提取出来，并经过分离、纯化，得到相 对较纯的玉米胚g a d 。本章将会详细介绍玉米胚g a d 分离、纯化及鉴定的过程。 在玉米的生长过程中，胚芽起着非常重要的作用，因为它含有植物新陈代谢所必需的 各科，酶系，而g a d 仅仅是这个复杂系统中的一员，所以想要对其进行分离纯化并非易事。 本章主要采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱等技术对玉米胚g a d 进行分离、纯化及鉴定， 为以后研究玉米胚g a d 的酶学性质和g a b a 的酶法富集工艺做好准备。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料与设备 玉米胚芽 层析柱 c e l l u l o s e d e 5 2 s e p h a d e x g 一7 5 岛津l c 1 0 a t 高效液相色谱仪 高速冷冻离心机 高速组织捣碎机 e c p 3 0 0 型三恒多用电泳仪 d y y - i i i 型电泳槽 7 5 2 型分光光度计等 h d 一3 紫外检测仪 小型台式记录仪 b s z 1 0 0 自动部分收集器 天津静海县生产 上海华美仪器厂 w h a t i t i a n 公司 w h a t m a n 公司 日本岛津公司 科大创新股份有限公司中佳分公司 上海标本模型厂制造 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 上海精密科学仪器公司 上海嘉鹏科技有限公司 上海自动化仪表三厂 上海嘉鹏科技有限公司 l l 第_ 二章 下水胚谷氮酸脱羧酶的分离纯化j 茶定 h l 2 s 恒流泵 f w 8 0 型高速力- 能粉碎机 8 6 8 型p h 测试仪 p l 2 0 3 电子天平 s h b b 9 5 a 型循环水式多用真空泵 f d 1 型冷冻干燥设备 k q 2 2 0 0 b 型超声波清洗器 2 2 2 主要药品与试剂 标准蛋白质( 彩虹m a r k ，s d s p a g e 用) l 谷氨酸 p l p 苯甲基磺酰氟( p m s f ) 乙二胺四乙酸( e d t a ) 巯基乙醇( 2 - m e ) 三羟甲基氨基甲烷( 秭s ) ( a e r ) 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 十二烷基硫酸钠( s d s ) 丫氨基丁酸标准品 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( t e m e d ) 考马斯亮蓝g 2 5 0 2 ，4 - - - 硝基氯苯 n ，n 二甲基甲酰胺 2 2 3 实验方法 2 2 3 16 a b a 含量测定：h p l c 法。 上海嘉鹏科技有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 o r i o nr e s e a r c h i n c 5 0 0c u m m i n g sc e n t e r b e v e r l y , m a 0 1 9 1 5u s 梅特勒托利多仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司 郑州长城科工贸有限公司 昆山市超声仪器有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公 司 天津市凯通化学试剂有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市凯通化学试剂有限公司丙烯酰胺 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 s i g m a 公司产品 s i g m a 公司产品 s i g m a 公司产品 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 1 2 第一二章下米胚谷氨眩脱羧酶的分离纯化j 鉴定 ( 1 ) g a b a 标准曲线的制定 精密配制g a b a 标准溶液o 1 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，0 8 m g m l ，用h p l c 法分别测定其峰面积， 以峰面积对标准品g a b a 浓度( m m 1 ) 做线性回归，得出其线性方程为y = 1 9 2 1 3 5 1 0 6 x + 3 9 2 9 1 8 7 2 ，相关系数r 2 = 0 9 9 2 。 根据方程，将h p l c 所得的峰面积y 代入可得浓度x ，再乘以稀释倍数及溶液体积， 即可得g a b a 的富集产量，公式如下： m = ( y - 3 9 2 91 8 7 2 ) 19 213 5 6 0 3 0 4 9 宰n 枣v 其中，m 为g a b a 的富集产量；y 为样品出峰面积；n 为样品稀释倍数；v 为样品总 体积。 1 8 0 0 0 0 0 0 y = 1 9 ，2 1 3 ，5 6 0 3 0 5x + 3 9 ，2 9 1 8 7 2 1 6 0 0 0 0 0 0 ” r 2 = 0 9 9 2 ， ， 1 4 0 0 0 0 0 0 ，7 。 1 2 0 0 0 0 0 0 峰 1 0 0 0 0 0 0 0 ： 丽 积8 0 0 0 0 0 0 。，7 j 6 0 0 0 0 0 0 。 4 0 0 0 0 0 0j ， 2 0 0 0 0 0 0j 0 ：一- 一 一- - * 一一v 一 标准品浓度( 1 a g m 1 ) g a b a 的标准曲线 f i g 2 1c u r v eo fs t a n d a r dg a b a ( 2 ) 测定玉米胚中g a b a 含量： 图2 1 将粉碎后的玉米胚在一定料液比、温度、p h 等条件下富集g a b a 后，灭酶活，离心分 离，取上清液l m l ，在8 0 ( 2 条件下衍生化l 小时。用h p l c 法对样品进行分析，记录峰 值，代入标准曲线方程，可得出g a b a 的含量。 ( 3 ) 测定酶反应液中g a b a 含量： 第二幸玉米胚斧氨酸脱黢酶的分离纯化j 鉴定 将一定量酶液与底物溶液( 1 g l u ，p h 5 7 ) 反应后，灭酶活，离心分离，取上清液 l m l ，在8 0 条件下衍生化1 小时。用h p l c 法对样品进行分析，记录峰值，代入标准曲 线方程，可得出g a b a 的含量。 l g 玉米胚芽粉+ 磷酸盐缓冲液 l 浸泡1 0 m i n 加入底物l 谷氨酸 i 摇匀 酶液+ 底物溶液一在所需温度条件下反应 l 取上清液l m l l + 1 m l 衍生剂 8 0 衍生化1 h i h p i c 表2 1h p l c 分析的条件 t a b l e2 1a n a l y t i c a lc o n d i t i o n so f h p l c h p l cs h l m a d z ul c - 1o a v p 流动相a ：0 0 5 m o l l 乙酸钠缓冲液( p h = 6 4 ) 流动相b ：1 0 0 甲醇( 色谱纯) 流速：1 0 m l m i n 紫外检测器波长：3 6 0 n m 分析柱：c h e m p a kk r o m a s i l c1815 0 m m x 4 6 m m 柱温：3 8 进样量：1 0 t l 梯度沈脱：流动相b 沈脱程序( 0 - - - 8 m i n ，2 0 3 3 ； 8 - 2 7 m i n ，3 3 0 o - 4 7 ；2 7 - 3 l m i n ，4 7 5 5 ；3 1 - 4 3 m i n ， 5 5 一6 7 ；4 3 - 4 8 m i n ，6 7 l o o ：4 8 - 5 8 m i n ，1 0 0 2 0 ) 2 2 3 2g a d 酶活性的定义和测定 将5 m l 粗酶液( 提取方法参见2 2 3 4 ) 加入5 m l 磷酸盐缓冲液( p h 5 7 ，含1 ( w v ) l 谷氨酸) ，4 0 c 下反应2 h ，微波煮沸2 m i n 灭酶，离心5 m i n ( 4 0 0 0 r m i n ) 取上清液测定 产物g a b a 含量( 参见2 2 3 1 ) 。以每3 0 m i n 生成1 p m o l 的g a b a 作为一个酶活力单位。 2 2 3 3 蛋白质含量测定 1 4 第二章玉米胚谷氨酸脱羧酶的分离纯化1 j 搭定 采用考马斯亮蓝g 2 5 0 结合法测定蛋白浓度【6 7 1 。 2 2 3 4 玉米胚芽g a d 粗酶液的制备 取玉米胚芽2 0 0 9 ，加入提取液8 0 0 m l ( 5 0 m m o l l 磷酸盐缓冲液，p h 5 7 ，2 m m o l l 毓 基乙醇，2 m m o l le d t a ，l m m o l lp l p ，l m m o l lp m s f 和1 0 甘油) ，用高速分散器打 成匀浆，四层纱布过滤，8 0 0 0 r m i n 、4 。c 离心4 5 m i n ，上清液即为玉米胚g a d 粗酶提取 液。 2 2 3 5 玉米胚g a d 分离纯化 采用以下步骤对玉米胚g a d 粗酶液中的g a d 进行分离纯化： 玉米胚g a d 粗酶液 l 透析 l c m 纤维素离子柱 l 酶活峰 l s e p h a d e x g 一7 5 凝胶柱 l 酶活峰 l 纯化玉米胚g a d 2 2 3 6 玉米胚g a d 相对分子量测定 采用s d s p a g e 凝胶电泳，分离胶浓度为1 2 ，标准相对分子质量蛋m a r k e r 分别为 l7 0 k d a ，13 0 k d a ，7 2 k d a ，5 5 k d a ，4 3 k d a ，3 4 k d ，2 6 k d a ，17 k d a 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 玉米胚g a d 的分离纯化 2 3 1 1c m 纤维素离子柱层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团( 活性基团) 对各种离子的亲和力不 1 5 第二章玉米胚芥氮酸脱羧酶的分离纯化。j 签定 同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂通常是一种不溶的高分化合物，如树 脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等1 6 引。 由于实验条件有限，本次实验中采用了c m 纤维素离子柱进行层析。据文献报道， 目前已知植物中g a d 的等电点大多集中在4 6 4 8 之问f 6 9 。，所以纯化过程中所使用的缓 冲液p h 值大于5 0 即可。酶在分离纯化过程中很易失活，所以要时刻注意保持酶在各阶 段的活性。因为p l p 是g a d 的辅基，它的存在有利于g a d 保持较高的酶活；p m s f 可 以防止柑酶液中的蛋白酶对g a d 的分解【7 们，所以在洗脱液中添加一定量的p l p 和p m s f 可以起到保护g a d 酶活的作用f 纷7 。本章所使用的缓冲液中都含有i m m o l lp l p 和 1 m m o l lp m s f ，以减少实验过程中g a d 酶活的损失。 为了确定实验中所选用的洗脱液、浓度梯度和沈脱流速，查阅了大量相关资，并不断 通过试验摸索，最后发现：用5 0 m m o l l 、p h 5 7 、含不同n a c i 浓度的磷酸钾缓冲液进行 梯度沈脱时可以获得较为理想的分离效果。但是，如果先沈脱不被柱吸附的杂蛋白再梯度 沈脱g a d ，整个过程耗时较长，g a d 酶活下降较明显。所以采用直接进行梯度沈脱g a d 的洗脱方法。通过不同n a c i 浓度梯度沈脱实验发现，5 0 0 m l 含0 1 4 m o l l n a c l 的磷酸钾 缓冲液( p h 5 7 ) ，流速为o 5 m l m i n 的梯度沈脱可以得到最佳的沈脱效果。 实验过程中采用5 0 m m o l l 、p h 5 7 、含o 1 4 m o l ln a c l 的磷酸钾缓冲液进行梯度沈 脱，可以获得较为理想的分离效果。测定各收集管中溶液在a 2 8 0 波长下的吸收峰，同时 采用h p l c 法测定各管的相对酶活，得到沈脱曲线见图2 2 。 1 2 1 0 8 口 爱0 6 0 4 0 2 0 01 02 03 0 4 05 06 0 f r a c t i o nn u m b e r 一1 2 8 0 + 相对酶活 图2 2g a d 在c m 纤维素离子柱层析 f i g2 - 2g a d o nc m - c e l l u l o s ec o l u m n 1 6 一 、 一 o e u 巾 z 日0 一墨一晏锰蓠罂 伍 似 加 拍 。 第二章玉米胚斧氦酸脱羧酶的分离纯化j 签定 色谱柱啦6 c m 4 0 c m ，起始缓冲液：5 0 m m o l l 、p h 5 7 磷酸钟缓冲液，内含l m m o v lp l p 和l m m o l l p m s f ；梯度洗脱：5 0 0 m l 含0 1 4 m o l ln a c l 的起始缓冲液；流速：0 5 m l m i n 。 从沈脱曲线2 2 中可以看出，在梯度洗脱过程中，当n a c l 浓度达到0 4 2 m o l l 时， g a d 开始被沈脱下来，即第二个a 2 8 0 峰有酶活性，酶活峰只有一个，且与蛋白峰重合， 分离效果较好。经测定，层析后玉米胚g a d 的比酶活为1 2 4 u r a g ，比g a d 粗酶液比酶 活2 6 u m g 提高了4 8 倍。 将经c m 纤维素离子柱分离收集的酶液透析除盐，浓缩至蛋白质含量约为5 m g