（食品科学与工程专业论文）动力作用对微生物生命结构及生命活性影响的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 摘要 动力杀菌是一种正在开发的食品冷杀菌技术。本课题以酿酒酵母和枯草杆菌为对象，探讨了 强烈剪切、高速撞击、剧烈摩擦、压力瞬间释放等动力作甩对微生物生命结构的破坏效果，以及 对微生物生命活性的影响。 ”“ 通过光学显微镜和透射电镜的观察，发现动力作用使菌体局部击穿、破裂、断裂，直至碎解。 从显微镜观察的结果分析，实验条件下，作用效果明显的动力形式主要有：撞击、震荡、摩擦、 剪切，造成的破坏形式分别为断裂、击穿、剥离、破损。实验发现，压力自1 2 0 m p a 始，经单次 处理后酵母细胞即不再存活；动力作用能够使枯草杆菌数目降低1 0 5 1 07 倍。在所采用的实验条 件下，动力作用对于枯草杆菌芽孢的生命活性没有明显的影响。显微观察和分析后认为：细胞受 到的破坏形式包括表观破坏和隐性破坏，两种破坏形式均对细胞的活性造成影响。 实验以鲜牛乳为原材料，探讨了动力杀菌的可行性。动力作用处理后，鲜牛乳中的大肠菌群 数可以达l j 1 0 c f u m h 细菌总数可以降低3 个对数单位，与巴氏杀菌的效果接近。 关键词：超高压均质，动力作用，动力杀菌，冷杀菌 硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t d y n a m i cp a s t e u r i z a t i o ni s ad e v e l o p i n gn o n - t h e r m a lp r o c e s sf o rf o o dp r e s e r v a t i o n t h i sp a p e rw a s c o n c e r n e da b o u tt h ee f f e c t so nt h em i c r o b i a ll i f es t r u c t u r ea n da c t i v i t yb yt h ed y n a m i ca c t i o n s ，s u c ha s t h e s t r o n gc u t ，h i g h s p e e di m p a c t i o n ，s h a r p f r i c t i o n ，a n ds u d d e np r e s s u r ed r o p ，e t c s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ea n db a c i l l u ss u 6 t i f i ss u s p e n s i o n sw e r eu s e d o b s e r v e df r o mo p t i c a lm i c r o s c o p ea n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，m i c r o b i a lb o d yw a s p a r t - p e n e t r a t e d ，b r o k e n ，r u p t u r e d ，e v e nf r a g m e n t e d t h er e s u l t so fo b s e r v a t i o ns h o w e dt h a ti m p a c t i o n ， s h a k e ，f r i c t i o na n dc u tw e r et h eo b v i o u sd y n a m i ca c t i o n s ，r e s u l t e di nb r e a k ，p e n e t r a t i o n ，p e e l - o f fa n d w o r n - o u t ，r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e y e a s t s w e r ed e a di n s i n g l ep a s s w h e nt h e h o m o g e n i z a t i o np r e s s u r ei s o v e r1 2 0 m p a t h en u m b e ro fb a c r u ss u b t i sw a sd r o p p e db y1 0 5t o1 0 7 t i m e sb yt h ed y n a m i ca c t i o n s ，b u tn om a r k e de f f e c t so nt h el i f e a c t i v i t yo fb a c f f u ss u b t i l i s s p o r e sw e r e f o u n d i tc a nb ec o n c l u d e df r o mt h eo b s e r v a t i o nr e s u l t st h a tt h eb r e a k a g et ob a c t e r i a lc e l l si n c l u d e dt w o w a y s ：d o m i n a n tb r e a k a g ea n dr e c e s s i v eb r e a k a g e b o t ho ft h e mi n f l u e n c e dt h el i f ea c t i v i t yo fb a c t e r i a l c e 】l s t h ef e a s i b i l i t yo f d y n a m i cp a s t e u r i z a t i o nw a ss t u d i e db a s e do nt h er a wm i l ka f t e rp r o c e s s e d ，t h e n u m b e ro fc o l i f o r mc o l o n yr e d u c e dt ob e l o w10 c f o m l ；t h et o t a l p l a t ec o u f l t sr e d u c e dt o3 - l o g ，w h i c h w a sc l o s et ot h ee f f e c t so f p a s t e u r i z a t i o n k e y w o r d s u l t r a h i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n ，d y n a m i ca c t i o n s d y n a m i cp a s t e u r i z a t i o n ，n o n - t h e r m a lp a s t e u r i z a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅；学校可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：导师签名：时间：年月日 硕士学位论文 1 绪论 1 绪论 1 1 食品的热杀菌与冷杀菌 食品中微生物的生长繁殖和酶的作用是食品腐败的主要原因。灭菌、灭酶一直是防止食品腐 败变质的必不可少的手段。工业化的食品杀菌技术自诞生以来，一直以热力杀菌为主，热力杀菌 几乎伴随着食品工业的整个发展过程，是食品加工与保藏中用于改善食品品质、延长食品贮藏期、 保障消费安全的最重要的处理方法。热力致死微生物的主要机制是高温使细菌原生质胶体变性凝 固、酶失活、细胞膜损伤等。但是，加热处理在产生致死细菌、钝化酶类等作用的同时，也使 一些热敏性的营养素和风味物质受到破坏，降低了食品的营养价值，并使产品天然色泽变化，改 变了食品原有的风味。有研究表明，食品中的维生素以及色泽、风味、成分的加热破坏速度， 般来说，温度每上升1 0 约增强2 3 倍口】。因而，长期以来人们一直在探索新的食品杀菌方法， 以减少食品加工中品质的损失，同时能够使食品达到长期保藏。 9 0 年代以来，低加工、新鲜食品在食品工业中变得很普遍，并且成为消费者的新的追求。人 们不但要求食品的安全陛，还需要食品的营养性和口感。为了弥补热力杀菌的不足，近年来国内 外出现了一些新的杀菌方法，如超高压杀菌技术、电磁杀菌技术、x 射线杀菌、紫外线杀菌、红 外线杀菌、感应电子杀菌、超声波杀菌、非电离辐射杀菌、臭氧杀菌、抗生素酶杀菌、半导体催 化杀菌及壳多糖杀菌等技术形式，这些技术统称为非热杀菌( 又称冷杀菌) 技术pj 。尽管这些非 热杀菌方法各自在一定程度上克服了热杀菌由于高温造成的主要缺点，但同时也带来了一些新的 问题。例如：直接通电杀菌( 欧姆杀菌) 在原理上是可行的，但在具体应用上还有些难题。对于 非均相态的复杂食品物质，各部分的电阻会不同，通电时会产生内部电流和物科温度的非均匀分 布。另外，直接通电杀菌对于不导电或是g 目导电的食品材料，如油腊类、骨头、纤维素、醇类、 糖浆类等使用效果较差。又如辐射灭菌，由于各种频率的电磁波与食品中微生物的作用不仅仅是 能量高低的问题，而且具有某种特殊性，因此不一定是能级愈高灭菌效果就愈好。这就使电磁波 灭菌的应用研究更加复杂1 4 j 【”。总之，这些技术在食品工业上的产业化应用并不普遍，主要是因 为相关资料尚未得到较系统地总结，各种参数较为缺乏，因此在技术工业化、在设备的设计开发 上尚处于试验研究阶段，可靠性研究有待突破，仍有许多问题需从理论及实践上继续探讨。 国外于八十年代出现了食品超高压技术( u l t r a - h i g hp r e s s u r ep r o c e s s i n g ，u h p ) ，又称为高压 技术( h i g h p r e s s u r e p r e s s i n g ，h p p ) 或超高静水压技术( h i g h h y d r o s t a t i c p r e s s u r e ，h h p ) 。日本、 美国和欧洲一些国家在高压食品的研究和开发方面走在世界前列。食品高压处理就是使用 4 0 0 m p a 以上( 4 0 0 - 1 0 0 0 m p a ) 的压力( 一般是静水压) ，在常温下或较低温度下对食品物料进行 处理，从而达到灭菌、物料改性和改变食品的某些理化反应速度的效果。食品在液体介质中加至 1 - 硕士学位论文 1 绪论 高压作用一段时间后，食品中的酶、蛋白质和淀粉等生物高分子物质分别失去活性、变性或糊 化，同时杀死细菌等微生物。多数生物经i o o m p a 以上加压处理即会死亡，微生物因种类和试验 条件不同有所差异，一般而言细菌、霉菌、酵母的营养体在3 0 0 - 4 0 0 m p a 压力下可被杀死：病 毒在稍低的压力下即可失活：寄生虫的杀灭和其他生物体相近，只要低压处理即可杀死；而芽孢 杆菌属和梭状芽孢杆菌属的芽孢对压力比其营养体具有较强的抵抗力，需要更高的压力才会被杀 灭【6 1 l ”。表1 1 给出了高压处理对乳中主要微生物的影响p i ： 表1 1 高压处理对乳中主要微生物的影响 - 2 硕士学位论文 1 绪论 超高静水压杀菌技术实现了真正意义上的冷杀菌。然而，由于细菌个体的三维尺寸很小，即 使在外界压力很高时，分解到细菌本身的破坏力也变得很小；另外，虽然细菌生命结构绝对强度 不高，但由于细菌生命结构在某一方向存在对称性，而静压对细菌施加的是一种各个方向均匀、 对称的外压力，使得细菌生命结构的强度相对增加，从而使破坏生命结构的难度相对加大，因此 仅靠静压杀灭细菌所需的压力很高( 4 0 0 1 0 0 0 m p a ) ，杀菌过程对装备结构要求高，造价也高。另 外，超高静水压杀菌为批式处理，加工能力小，在实际生产中超高静水压杀菌的应用受到了很多 的限制。并且，超高静水压杀菌只能在包装后进行，其包装材料也只能为柔性材料( 软包装) ， 限制了超高静水压杀菌的应用范围。于是，一种新的冷杀菌方法动力杀菌( d y n a m i c p a s t e u r i z a t i o n ) 技术的发展越来越受到食品研究人员的关注a 动力杀菌技术是一种对液态物料进行的连续冷杀菌技术。利用超高压产生的对液态食品的挤 压作用，以及高压液态物料在压力释放过程中产生的强烈剪切、高速撞击、剧烈摩擦、瞬间膨爆 等联合作用处理食品，使其中的杂菌细胞结构发生破坏和改变，从而失去或钝化其生物活性，达 到抑菌、杀菌和食品保藏的目的。在食品加工中，动力杀菌技术对于加工生、鲜果汁饮料、鲜牛 奶等液态食品是非常理想的杀菌方法。 在动力杀菌中，物料受到的强烈剪切、高速撞击、剧烈摩擦、压力瞬间释放等动力作用，这 些动力作用产生的基本条件为高压，作用形式已经远不止超高静水压杀菌的单纯挤压作用，而是 挤压、剪切、空穴震荡等形式的联合作用，因此，达到同样的杀菌效果，超高压动力杀菌所需的 压力要低于超高静水压杀菌。相对于超高静水压杀菌处理而言，超高压动力杀菌所采用的“高压” 尚属于低压，使用压力仅为后者的下限压力。动力杀菌从原理上与超高静水压杀菌也有显著的不 同，在技术措施和工程措施上更具有可操作性，利于实现食品真正的连续性生产。作为一种冷杀 菌技术，动力杀菌避免了常规热杀菌处理造成的对食品品质的劣化，从营养、风味、色泽等方面 最大限度地保全了食品的自然特性，能够更有效地利用食品原料中的有效成分，尤其是在崇尚天 然低加：l 食品、食品的营养性的今天，这种技术的研究和发展具有更现实的意义_ i 。 1 2 动力杀菌的研究现状 1 2 1 理论研究 从2 0 世纪7 0 年代初开始，就有人尝试着将高压均质机用于微生物细胞的破碎。试验发现， 酵母菌可以比较容易地被均质作用破碎。因此，常用高压均质破碎细菌以回收细胞内的蛋白质、 酶类等物质。早在1 9 7 4 年b r o o k m a n 所做的试验中，使用均质机在1 7 0 m p a 一次下处理酵母，酵 母细胞的破碎率可达1 0 0 ；他的实验还发现，即使采用较高的均质压力，由于失速现象( s t a l l c o n d i t i o n s ) 的影响，流体流经均质阀的流速下降，破碎作用也随之削弱；b r o o k m a n 认为使用均 硕士学位论文 1 - 绪论 质机破碎酵母时，破碎能力的强弱与压力降正相关。并且发现，由于机械作用破坏了微生物细 胞的生命结构，使细胞内物质释放、散失，可降低食品中的细菌数量。这种利用高压均质技术对 微生物菌体的破碎，就是目前动力杀菌技术的一种雏形。 1 9 9 4 年，l a n c i o t f i 等人研究了在中等压力下连续式均质作用对于食品中一些病原菌和腐败菌 细胞存活的影响。实验设备是意大利n i r os o a v i 公司的o b l 2 0 型均质机。实验结果表明，出 口料温与采用的压力有关，在最高压力2 0 0 m p a 下，处理时间为1 6 m s ，出口料温可达到6 5 c 。 实验采用w o 型和o w 型两种配方的胶体物料样品。每个样品在均质处理前分别接入致病菌 l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s 。实验数据如下表1 2 ： 表1 2 均质作用后l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s 的存活能力 ( 单位：l o gc f um i “) 时间样品a 样品b 压强( m p a )压强( m p a ) ( h ) 4 06 09 01 9 02 04 06 09 01 9 0 i53 249 544 8未检出5 5 150 043 048 5未检出 2 45o o48 544 7未检出54 95o o43 044 0未检出 7 243 04 1 14 0 0未检出53 949 243 240 4未检出 9 64 1 040 03 9 0未检出49 646 44 3 138 7未检出 1 2 039 039 037 8未检出45 443 643 037 0未检出 1 4 84o o4o o37 7未检出46 044 042 037 5未检出 1 7 241 040 037 6未检出45 843 04o o38 0未检出 1 9 640 040 037 3未检出45 443 040 037 0未检出 2 2 041 040 037 0未检出4 5 043 040 036 0未检出 2 4 840 039 536 0 未检出 45 044 040 037 0 未检出 说明：1 处理前接种量为1 0 g ： 2 样品a 成分：水5 0 ，油2 5 ，蛋黄2 5 ，氯化钠1 ，黄原胶3 ，乙酸0 1 ； 3 样品b 成分：水2 5 ，油5 3 ，蛋黄2 2 ，氯化钠1 ，黄原胶3 ，乙酸0 1 。 实验结果表明，均质压力的增加可以明显减少小肠结肠炎耶尔森氏菌( y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a ) 、李斯特氏菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) 、枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l l i s ) 的数目，并 且对细菌产生了不可逆的致死效果。这种依靠高压均质进行杀菌的尝试，为液态食品连续非热杀 菌提供了一种新的研究思路。 u l 1 9 9 6 年，l a n c i o t t i 等还研究了物理化学条件，例如p h 值、温度和水分活度( 旺w ) 对于食品 中一些致病菌和腐败菌抵抗致死均质压力能力的影响。结果表明，食品成分构成和受热情况对于 微生物群体耐压能力有显著的影响。n 2 j 4 硕士学位论文 1 绪论 真菌菌丝在理论上讲也能被破碎，但关于均质作用对于真菌孢子的试验数据还未见到。但是 可以预测孢子对于机械作用有抵抗力，至少b y s s o c h l a m y s 类的孢子囊可以保护孢子来抵御均质作 用。并且，机械力产生的温度由于低于致死温度也可能导致其发芽。所以，多次均质或者均质前 用超高静水压进行预处理是很有效的。i l “ 细胞溶解酶可以作用于微生物的细胞壁，从而使微生物体对于随后的机械力或热作用更敏 感。因此，溶菌酶、脂肪酶、磷酸脂酶、蛋白酶、壳多糖酶和葡聚糖酶都可以在均质前加到液态 食品中，以降低微生物细胞的对于机械力量的抗性。均质前用壳聚糖进行预处理，也可破坏细胞 壁的强度，从而增强破碎效果。i i ” 1 2 2 实用研究 近1 0 年来，国内外一些研究部门和公司已着手开展连续常温动力杀菌技术在食品保藏中应 用的研究，并且出现了许多种动力杀菌的设备，新的动力杀菌技术在很大程度上避免了常规杀菌 处理造成的对食品品质的劣化，从营养、风味、色泽等方面最大限度地保全食品的自然特性，更 充分地利用食品原料中的有效成分。除杀灭杂菌外，超高压与动力的联合作用，还可以对食品中 构成风味或滋味物质的分子的排列结构产生影响，改变其原有的传统特性，赋予食品以新的食用 特点。与无菌包装方法配合，将生产出新型食品。在实际应用中，动力杀菌使食品加工生产的连 续性成为可能。连续常温超高压动力杀菌彻底解决了常规杀菌必须使食品经受高温处理的难题， 以及辐照杀菌等高能射线杀菌引起的化学成分的改变带来的食品品质和风味的变化，保全了食品 的天然特性。 美国a t h e n s 大学的t o l e d o 教授使用4 5 0 0 0 p s i ( 3 1 02 7 m p a ) 的压力处理橙汁，发现高压均质 处理过的鲜橙汁，货架寿命可以达到六个月。t o l e d o 教授认为，低于3 0 0 0 0 p s i ( 2 0 68 4 m p a ) 的 均质压力降低细菌数量不足1 0 5 c f u m l ，均质杀菌过程温度升高为2 4 。c ，即采用进料温度为4 。c ， 出料产品温度不超过2 8 。c 。显然，这要比热力致死微生物的温度低很多。如采用更高的压力进一 步降低细菌数量，但耍考虑物料过高的温升。品尝处理后的样品表明，经过高压均质处理过的橙 汁、葡萄汁、苹果汁的滋味与未经任何处理的原汁滋味相差无几。热敏性的芒果汁和桃汁经均质 处理后，在冷藏下贮存一年，滋味与鲜汁无异【 3 1 。在雅典娜的实验室里，t o l e d o 教授存放了一些 经过高压压力瞬间释放方法处理过的牛奶，存放时间已经达到四个月，仍然保持新鲜f “1 。 1 9 9 3 年，美国c o c a - c o l a 公司申请了高压均质、压力释放对橙汁进行杀菌方法的专利。他们 的实验是利用均质处理鲜果汁，来有效地降低细菌活力，达到和巴氏杀菌同样的延长果汁货架寿 命的效果。实验发现，鲜橙汁在1 5 0 0 0 p s i ( 1 0 3 4 2 m p a ) 的压力下均质，微生物活力降低9 9 ， 没有必要再进行热力杀菌。并且在3 8 4 0 。f ( 3 4 “4 。c ) 下或更低的温度保藏4 0 天，还保持口味 硕士学位论文 1 绪论 纯正。而未经超高压均质处理过的果汁在同样的保藏条件下的货架寿命是1 0 天。如果提高均质 压力，会带来更显著的保藏效果。 1 5 1 u n i l e v e r 公司的一项专利认为用高压均质的方法处理液态食品，由于压力在极短的时间内( 几 个毫秒) 下降，剪切力过大，会破坏食品成分的微观结构；并且在均质过程中动能在微小的剪切 体积中转化为体积能，会导致温升过高。为此，他们提供了一种管式高压杀菌装置( 见图1 1 ) 。 其杀菌原理为，在一细管中通入稳定流动的流体，保持管进出口的压力差为l o o m p a 或更高，产 品在流经细管中的温度升高可以控制在5 c 以下。为了维持至少1 0 0 m p a 的压力差，需要考虑细 管进出口直径和长度以及处理物料的粘度和工作时的流量等因素的平衡。试验发现，在1 0 0 0 m l 的甘油中添加酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，含量约1 0 0 0 个m l ，采用内径为l m m 、长2 5 m 的细管，进口压力为3 0 0 m p a ，处理时间为6 0 s ，环境温度为2 1 。处理酵母悬浮液后，在出口 接取样品，经检测发现没有活的酵母细胞被检出。l l ”严格意义来讲，因为流体在管路中流速并不 高，这种处理物料的方式还是属于一种连续保持高静压力杀菌，但是在管路的出口处仍存在压力 释放的效果。 d 图1 1 管式动力杀菌装置 在高于8 0 m p a 的均质压力下处理液态食品，除了可以减少细菌的数量外，还能导致蛋白质等 大分子物质的物性变化。1 9 9 9 年，g u e r z o n i 等人探讨了在羊奶干酪的制作过程中，u h p h 处理原 料对产品微生物和理化指标的影响。除空白样品外，实验采用三种手段处理原料奶：i 1 0 0 0 b a r ( 1 0 0 m p a ) 均质；2 7 2 。c 1 5 s 巴氏杀菌；3 6 1 0 c 2 0 m i n 巴氏杀菌。实验结果发现，u h p h 处理与 其它两种热处理对于嗜冷好氧菌的作用效果相同，但对于肠球菌的作用要差一些。干酪成熟3 0 天后，在电子显微镜下观察，u h p h 干酪表面为均匀的聚合物网络状结构，其它三种样品表面均 可见酪蛋白胶粒的凝块。对于制成品，u h p h 干酪具有较好的滑腻感和延展性。用五点法来评价 滋味、质地、苦味、颜色、后味等，对u h p h 干酪的评价均优于其它三种样品。 1 7 1 1 3 论文的研究内容 动力杀菌应用于食品保藏是一个新的课题。动力作用对于细菌生命结构的破坏，以及由此产 6 硕士学位论文1 绪论 生的细菌生命活力的降低或丧失的机理以及采用的设备形式都在探索和完善中。虽然已经有一些 试验证实了动力作用对于细菌结构的破坏效果，并且出现了许多种设备形式和工作流程，但是对 细菌细胞致死机理尚缺乏系统的研究及权威性结论，作为成熟的应用技术，还存在细菌的杀灭效 率、芽孢较难破碎、物料的适应性、处理量小等很多理论和实际问题。但是，随着纳米技术、材 料科学、激光技术等相关基础科学的发展，动力杀菌的研究条件日益完善，尤其是随着生物科学、 显微科学的发展，微生物细胞的力学特性也在被逐渐揭示。在食品工业上，高压动力杀菌技术的 应用将会使传统食品加工发生革命性的变化，带动工业化食品加工技术上升到一个新的层次。作 为一种新型的非热系菌技术，目前动力杀菌必然会存在缺点和不足，但是其应用前景诱人，有必 要从理论和实践上加以深入研究，研制和开发相应的机械和设备，以适应工业化生产。本课题的 研究拟从高压均质这种最基本的微细化加工形式出发，探讨动力作用对于微生物失活的机理，以 及动力杀菌在食品工业中的应用，研究工作主要包括以下几方面的内容： 1 动力作用对于微生物生命结构的破坏效果。 2 动力作用对于微生物的生物活性的影响。 3 动力杀菌在作为冷杀菌手段可行性的研究。 - 硕士学位论文 2 动力杀菌的机理 2 动力杀菌的机理 现在，人们对食品的要求越来越高，不仅要求食品满足正常生理( 提供基本能量和营养) 和 心理( 色、香、味、形等享受) 需要，更要满足营养与健康要求。所以食品的安全性是食品生 产与消费中最应值得重视的问题。控制和预防细菌性危害是保证食品安全的重要内容，细菌性危 害是指细菌及其毒素产生的生物性危害。食品受细污染菌，特别是受致病菌污染后，不仅会引起 腐败变质，而更严重的是能引起食物中毒，进而危及消费者的生命。一般常见的引起食物中毒的 细菌有：沙门氏菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、变形杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、 致病性大肠杆菌和志贺氏菌等。l l ” 动力杀菌的机理在于利用力学作用破坏微生物细胞的生命结构。在生物工程上，各种环境因 素和操作参数对于破碎微生物细胞的效果已经有很多研究。无论是原核微生物还是真核微生物， 抵抗外力的结构，主要就是细胞壁和细胞膜。其中，细胞壁为外壁，具有固定细胞外形和保护细 胞免受机械损伤或渗透压破坏的功能。细胞膜为内壁是一层具有高度选择性的半透膜，控制细 胞内外一些物质的交换渗透作用。细胞膜较薄，厚度为7 1 0 r i m ，主要由脂质和蛋白质组成，二 者之和占细胞膜构成成分的8 0 1 0 0 。细胞膜紧贴在细胞壁内侧柔软、脆弱、富有弹性，强 度比较差，易受渗透压冲击而破碎，因此，细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。各种微生物细胞 壁的组成和结构差异很大，取决于遗传信息、培养生长环境和菌龄。当细胞的细胞壁和细胞膜 受到破坏( 使通透性增大) 或破碎，细胞内容物得到释放而散失。 探讨动力杀菌的机理，需要从两个方面来考虑，一方面是作用的受体，即微生物：另一方面 是动力作用的施加体，即破碎作用的力学形式。 2 1 微生物细胞的结构与功能f 1 9 【z o 】【2 i 2 ： 除病毒外，微生物都具有细胞结构。个细胞即为具有独立生命的个体。细胞虽小，但结构 并不简单，是一个能够进行复杂化学反应的系统，同任 口f 作生物的纯化学反应有本质区别。 2 1 1 原核微生物的细胞壁 细菌是最常见的原核微生物。细菌细胞壁是位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被，主要由 肽聚糖构成。原核微生物细胞壁的主要功能有： 固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤； 为细胞的生长、分裂和鞭毛运动的必需，失去了细胞壁的原生质体也就失去了这些重 要的功能； 阻拦酶蛋白和某些抗生素等犬分子物质( 相对分子量大于8 0 0 ) 进入细胞，保护细胞免 硕士学位论文 2 动力杀菌的机理 受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤； 赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。 细菌的结构主要随菌株、年龄和营养的不同而不同，革兰式5 h 性细菌和革兰式阴性细菌就有 很大差别。革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌结构和成分的比较，见图2 一l 和表2 一l 。 肽聚 壁磷壁 膜磷璧 嬲质空 镪胞质 图2 - 1革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞壁构造的比较 表2 1革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞壁成分的比较 空间 质膜 占细胞壁干重的百分比 成分 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌 肽聚糖含量很高( 5 0 9 0 )含量很低( t 1o ) 磷壁酸含量较高 5 0 尤 类脂质一股无( 2 ) 含量较高( t2 0 ) 蛋白质尢含量较高 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链 上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越紧密，破碎的难度也就越大。 革兰氏阳性细菌细胞壁的特点是厚度大( 2 0 8 0 n m ) 和化学成分简单，一般只含9 0 的肽 聚糖和1 0 的磷壁酸。肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ) 又称粘肽( m u c o p e p t i d e ) 、胞壁质( m u r e i n ) 或 粘质复合物( m u c o c o m p l e x ) ，是真细菌细胞壁中的特有成分。以金黄色葡萄球菌为代表，它的肽 聚糖层厚约2 0 8 0 n m ，由4 0 层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。磷壁酸与细 胞生长有关，细胞生长有自溶素( a u t o l y s i n s ) 酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，防止胞 壁过渡降解和壁溶。因为细胞在正常分裂时，自溶素可使旧壁适度水解并促使新壁不断插入，而 当其活力过强时，细胞会因细胞壁迅速水解而死亡。 9 硕士学位论文2 动力杀菖的机理 革兰氏阴性细菌的细胞壁在肽聚糖层的外侧还有分别由脂蛋白和脂多糖系磷脂构成的两层 外壁层。其中，肽聚糖层厚约1 5 2 n m ，外壁层约8 1 0 r m 。以大肠杆菌为例，它的肽聚糖埋藏 在外膜层之内，是仅由1 2 层肽聚糖网状分子组成的薄层( 2 3 n m ) ，含量约占细胞壁总重的 1 0 。因此，革兰氏阴性细菌对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性细菌弱。 2 1 2 真核微生物的细胞壁 具有细胞壁的真核微生物主要是真菌和藻类。真菌细胞壁的主要成分是多糖，另有少量蛋白 质和藻类。多糖构成了细胞壁中有形的微纤维与无定形基质的物质基础。微纤维部分似建筑物中 的钢筋，基质似混凝土等充填物。以酵母菌为例，酵母菌细胞壁厚多为1 0 0 3 0 0 n m ，幼细胞的 细胞壁较薄，有弹性，以后逐渐变厚、变硬。研究表明，有可能仅有一部分厚度对细胞壁的刚性 和强度起重要作用。酵母细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主要成分是葡聚糖( 3 0 3 4 ) 、 甘露聚糖( 3 0 ) 蛋白质、( 6 8 ) 和脂类，不含一般真菌所具有的几丁质或纤维素。细胞 壁的结构可分为三层。最里层为葡聚糖层，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状。 葡聚糖的分子量为2 0 0 0 0 u ，是一种分支多糖聚合物，主链以p 1 ，6 糖苷键结合，支链以b 1 ，3 糖 苷键结合。外层是甘露聚糖( m a n n a n ) 层，也是一种分支聚合物，主链以n 1 ，6 糖苷键结合，而 支链以c t - 1 ，2 或n - 1 ，3 糖苷键结合，而支链以1 ，2 或1 ，3 糖苷键结合。葡聚糖层与甘露聚糖层 之间靠处于中间的蛋白质交联起来，形成网状结构。近1 0 的甘露聚糖的侧链通过磷酸二脂键与 磷酸连接。同细菌细胞壁一样，酵母细胞壁的破碎阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的 厚度。酵母细胞壁中主要成分的排列形式，见图2 2 。 图2 - 2 酵母细胞壁中主要成分的排列 霉菌细胞壁厚度为1 0 0 - - 2 5 0 n m ，主要由多糖组成( 8 0 9 0 ) ，其次含有较少的蛋白质和脂 类。不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的。 几丁质是由数百个n - 乙酰葡聚糖胺分子以p 1 ，4 葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。由于霉菌细胞 壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。 - 1 0 - 硕士学位论文 2 动力杀菌的机理 2 1 3 细胞壁以外的构造 在某些原核生物的细胞壁外，会着生一层厚度不定的胶状物质，称为糖被( g l y c o c a l y x ) 。糖 被的有无、厚薄除与菌种的遗传性相关外，还与环境( 尤其是营养) 条件密切相关。糖被按其有 无固定层次、层次厚薄又可细分为荚膜( c a p s u l e 或m a c r o e a p s u l e ，大荚膜) 、微荚膜( m i c r o c a p s u l e ) 、 粘液层( s l i m el a y e r ) 和菌胶团。糖被的主要成分是多糖、多肽或蛋白质，尤以多糖居多。荚膜 不是细胞都有的结构成分，但它对细菌有保护作用。 2 1 4 细胞壁与微生物生命活性的关系 细胞壁、细胞质膜等是微生物赖以保持机体完整且能限制物质进出细胞的透过屏障。如果这 层屏障受到破坏，造成细胞膜渗透压和通透性的改变，甚至导致细胞器的分散和流失，必将引起 细胞内外营养物质交换的紊乱，微生物的生命活性不可逆丧失。 2 2 动力杀菌的机理 以超高压均质为例来讨论动力杀菌的机理。相对 于超高静水压处理保藏食品( 需要4 0 0 - - 1 0 0 0 m p a 的 压力) 来说，超高压均质是一种低压力的处理手段。 这里，“超高压”表示在均质前对物料施加的压力。此 后物料以极高的流速( 甚至超过声速) 通过均质阀后 压力降至常压。在高压均质过程中流体流经均质阀前 后压力的变化，如图2 3 所示f ”1 。 目前关于均质作用对细胞破碎的作用形式，有以 下几种解释( 以果汁为例) ： 高压均质机的高压部分对细菌细胞的作用。 从单纯的静压杀菌的角度来考虑，这个压力 不算高，并且维持的时间极短，所以对细菌 细胞破碎的贡献很小。 在高压的作用下，果汁通过均质阀间隙，在 图2 3 均质过程中压力的变化 垂直流束的方向产生很大的速度梯度，使细菌细胞受到极强的转矩和剪切力作用，细胞 壁在这种剪切力的作用下发生破损。由于均质阀的间隙尺寸很小，液流主体的流速又极 高，产生很大的速度梯度，从而使流体中的细菌细胞受到极大的剪力。 果汁流经均质阀前后，所受压力从高压降至常压。在此期间，由于果汁中的细菌所受的 高压瞬间消失，导致内部压力瞬间释放。通过这种白膨爆作用，使细菌细胞被破碎。 硕士学位论文 2 动力杀菌的机理 k l e i n i g 等探讨了基于计算流体力学的细胞破碎与均质阀内压力梯度的关系，得出均质阀 内部的流场和压力场的分布及阀内压力梯度的计算方法，认为压力梯度要比操作压力对 于细胞破碎效果的相关性更大j 。 当液态物料被引入( 吸入) 高压均质系统中时，由于液态物料的局部压力降至低于液体 的蒸汽压，产生部分液体蒸发而形成汽泡：随后，在系统建立均质压力时汽泡又随压力 的升高受到挤压会迅速消失，这种现象叫空穴。空穴的产生在宏观上表现为液体的剧烈 振荡。l a n d e r 等在g a u l i n 均质机的正常操作流动中发现了氧化游离基的存在，证实了均 质操作中空穴的效果口”。另外，均质过程中产生空穴效应，还可以从均质阀表面的空穴 损害( 气蚀) 和空穴噪音的测量证实。果汁流经均质阀狭缝时，流速瞬间增大，压力骤 降，使部分水瞬间汽化而使流体中产生大量微小气泡，这种由空穴效应产生的高频振荡 对细菌细胞有剧烈的冲击和破碎作用。【1 2 】 液体中的细菌细胞由于这种压力骤降、转矩、剪切力、空穴产生的冲击波的振荡( 气泡 的炸裂) 等机械作用破坏，导致细胞壁甚至细胞整体被破坏。并且，接近边界层的蒸汽 可以穿透细胞颗粒，对细胞内部产生伤害。 现在出现的动力杀菌设备对于微生物细胞的破碎作用机理主要就是剪切、压力释放等。不论 是何种破碎原理，最终都造成了细胞壁的破碎甚至细胞整体的破碎，或者是细胞壁受到“内伤”， 通透性增大，从而改变了正常的细胞与环境进行物质代谢的条件。使用高压均质破碎细胞， b r o o k m a n 认为，主要引起细胞破碎的原因是总的压力降和压力降变化的速率”i 。另外，这种动 力的破碎作用还可能使细胞壁与细胞质膜间的水解酶类释 放或激活，导致细胞的自溶。总之，细菌细胞在剪切力、压 力瞬问释放产生的膨爆作用下，完整性被破坏，细胞死亡。 利用动力破碎细胞，细胞所受的机械作用力主要有压缩 力和剪切力。细胞破碎的机理如图2 4 所示： 假设细胞是直径为d ( m ) 的球体，维持细胞的球体形 态所需的综合维持力为o ( n m ) ，则从作用力平衡关系得到 压缩破碎细胞( 图2 - - 4 a ) 所需的作用力f ( p a ) 为： f ：竺 d 如果细胞受到周围剪切力t ( p a ) 的作用( 图2 - - 4 b ) ， 在牛顿流体中： 1 2 - 几n 尹_ 冬 泛冀 垒：丛- 鼍毛2 1 r u j 参 ( b ) 图2 4 细胞受力和破碎 硕士学位论文 2 动力杀菌的机理 则剪切破碎细胞所需的速度梯度为 d “ f = “一 咖 d u4 盯 砂d 其中，u ( m s ) 为流体流速，y ( m ) 为与流速垂直方向的距离，为流体粘度，p a s 。 从上二式 由可以看出，单纯从细胞直径的角度，细胞越小，所需的压缩力或剪切力越大，即破 碎难度越大。1 2 6 1 在工业规模的细胞破碎中，破碎的动力学方程可表示为【” i n 【i o r ) 】= k ，”6 p 。 式中r 一细胞破碎率 k 一与温度有关的破碎常数 n 一悬浮液通过次数 p 一操作压力 a ，b 一与微生物种类和培养条件有关的常数 由公式可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过次数。一般说来，增大压力和增加破 碎次数都可以提高破碎率。另外，细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同种类的微生物细胞及 同种细胞在不同的环境下，其细胞壁的结构不同，因此破碎性能随菌体的种类和生长环境的不同 而不同。一般说来，酵母细胞较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难 破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎”】。基因重组的菌 株要比自然状态下的菌株难予破碎，这大概是由于重组菌株的细胞壁的交联程度或者成分有了变 化( ! ”。 2 3 动力杀菌实验方案 国内外有关动力杀菌系统研究不是很多，比较多的是一些专利，或是以不同的处理方式提供 的动力杀菌效果的试验报告。这些研究分别采用了不同的设备，如美国a t h e n s 大学的t o l e d o 教 授的双缸式杀菌器，以及u n i l e v e r 公司的管式杀菌器，还有c o c o c o l a 公司的高压均质机等，这 些设备在原理上基本上是相同的，都是利用挤压、瞬间压力降或剪切作用或几种作用的综合来达 到杀灭细菌的目的。 - 1 3 - 坝士学位论文2 动力杀菌的射l 理 研究内容主要包括以下几个方面： 1 通过动力作用处理微生物悬浮液，利用显微成像技术观察微生物菌体的破坏情况；研究 细菌细胞的破碎效果与工作参数( 压力、温度、作用次数等) 的关系。实验采取两种微 生物，葡萄酒酵母和枯草杆菌，分别作为真核微生物和原核微生物的代表进行动力作用 处理。 2 动力作用处理后的微生物悬浮液，通过培养，观察其活力的变化。细菌的活力通过菌液 处理前后的平板培养，考察存活细胞的数目。通过处理前后悬浮液中细菌数目的变化来 考察杀菌效果。 3 ， 牛乳是一种具有典型特点的液态食品，同时还是一种营养丰富的培养基。根据动力作用 处理牛乳的结果，结合l 和2 ，探讨动力作用作为非热杀菌的可行性。 - 1 4 硕士学位论文 3 动力杀菌对于微生物生命结构的破坏 3 动力作用对于微生物生命结构的破坏 3 1 引言 2 0 世纪8 0 年代以来，随着重组d n a 技术的广泛应用，许多具有重大价值的生物产品应运 而生，如胰岛素、干扰素、白细胞介质素一2 等，它们的基因分别在宿主细胞( 大肠杆菌或酵母 细胞等) 内克隆表达为基因工程产品，其中许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物 时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的 关键步骤。生物工程的需求促进了人们对工业化细胞破碎研究的关注。工业上最广泛使用的大 规模破碎细胞的方法就是高压均质【2 8 】。然而，过去的1 5 年来，有关这种技术破碎细胞原理的研 究还相对较少。在2 0 世纪7 0 年代早期，h e t h e r i n g t o n 等人阐述了细胞破碎的动力学原理。另外 一些学者尝试着从理论上去解释细胞破碎的机制，并证实了高压均质阀处的空穴作用影响细胞的 破碎。而对于高压均质机，剪切和空穴在细胞破碎中起同样重要的作用1 ”j 。还有人研究了对传统 均质机的结构作新的改进( 如改变均质阀结构形式) ，以加强破碎效果p o 。对于生化制药的产品， 需要乳化、分散或细胞破碎，均质操作已经被证明是既有效又卫生的操作，是批量生产胞内产品 最好的方法。【3 1 1 常见的均质阀结构形式，如图3 1 ： 轴厂 矛p 图3 1常见的均质阀结构形式 为了考察动力作用对细菌细胞生命结构的破坏，在本次研究中选用了n c j j - - 00 7 5 15 0 型纳 米超高压均质机用于细胞的破碎。该均质机的破碎元件为一单孔式释放器，可对流体产生多重动 力作用，将液态混合物料超微细化，并能达到纳米级或亚纳米级的均质效果。 3 2 实验设备- - n c j j