（食品科学专业论文）油茶蒲减肥降脂功能因子研究.pdf

ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt oz h e j i a n gu n i v e r s i t yf o r t h e d e g r e eo fd o c t o ro fp h i l o s o p h y a u t h o r ： s u p e r v i s o r s ： q 墨量q r 丕h 盆壁g 至i n g s u b j e c t ： 至：q q 立s i 宝銎宝 一 c o l l a g e ： h q q lq 旦i q 基y 墨l 宝班墨e 卫g i 壁金金r i n g s u b m i t t e dd a t e ：丛垒显2 q 呈曼 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎鎏盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：良城辛 签字日期：为，年多月孑日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 逝鎏盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权逝鎏基堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：藤撅 导师签名： 签字日期：矽，年舌月矽日 签字日期：沙年月猡咱 摘要 油茶( c a m e l l i ao l e i f e r a a b e l ) 是我国重要的木本油料作物，在我国有一千多 年的种植历史。山茶油富含不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值，被誉为“东 方橄榄油”。油茶蒲为油茶果的外种皮，占油茶果湿重的6 0 ，但是目前利用 率极低。本论文对油茶蒲中的活性物质进行分离鉴定，并对其减肥降脂作用进 行系统研究。主要研究结论如下： ( 1 ) 用5 0 的乙醇水溶液热回流提取得到油茶蒲提取物( o c e ) ，采用高 速逆流色谱直接从油茶蒲提取物中分离制备获得3 个化合物单体，通过红外光 谱、紫外光谱、质谱、核磁等技术鉴定其分别为没食子酸( g a ) 、鞣花酸( e a ) 和3 - 0 甲基鞣花酸_ 4 o 1 3 - d 吡喃葡萄糖( m e a g ) 。 ( 2 ) 高效液相色谱测得o c e 中g a 、e a 、m e a g 的含量分别为3 6 7 、3 2 0 、 5 5 8m g g 。采用盐酸水解和大孔树脂吸附一解析法对o c e 进行处理，酸水解产 物中g a 和e a 含量分别为o c e 的1 8 倍和4 倍，d 1 0 1 大孔树脂的4 0 7 , 醇洗 脱物中m e a g 的含量是o c e 的2 7 倍。 ( 3 ) 采用脂肪酸合酶( f a s ) 抑制的体外评价体系，测得o c e 、e a 和 m e a g 对f a s 的半抑制浓度( i c 5 0 ) 分别为2 3 0 、2 5 0 和3 7 7 3 鹇, m l 。f a s 抑制动力学研究表明，o c e 对底物a c o a 为竞争性抑制，对m - c o a 、n a d p h 均为混合性( 竞争性非竞争性) 抑制。e a 和m e a g 对m c o a 和n a d p h 的 抑制类型均为混合性抑制和反竞争性抑制。对底物a - c o a 而言，e a 和m e a g 分别为混合性抑制和竞争性抑制。表明e a 和m e a g 主要通过作用于酰基转移 酶结构域，或特异性结合f a s - n a d p h 而使f a s 失活。 ( 4 ) 采用3 t 3 - l 1 前脂肪细胞增殖抑制试验，对油茶蒲中分离得到的活性 化合物进行功能评价，表明g a 能显著抑制前脂肪细胞增殖，2 5 0p m 给药2 4 h ， 对前脂肪细胞的增殖抑制率达6 6 5 ；通过观察3 t 3 - l 1 前脂肪细胞的分化，发 现o c e 、g a 、e a 及m e a g 均对前脂肪细胞的分化有抑制作用，并能减少脂 肪细胞中的甘油三酯( t g ) 含量；同时，发现m e a g 有促进成熟脂肪细胞中 脂肪分解的作用，1 0g m 的剂量即能显著促进脂肪细胞释放甘油。 ( 5 ) 采用预防型小鼠肥胖试验模型，通过对高脂饲料喂养的小鼠分别给 予1 0 0m g k g 、2 0 0m g k ：g 、3 0 0m g k ：go c e 和1 0 0m g k gg a ，结果显示：o c e 对小鼠的减肥作用呈剂量依赖关系，1 0 0m g k g 的o c e 即能显著降低试验小鼠 的体重增长率( 尸 2 时，出峰时间太长，且峰形变宽。当o 5 k 2 时，可以在 合适的时间内，得到分离度较好的峰形【1 1 8 】。分别配制约1 0m l 不同的两相溶 剂体系，加入1 0m g 油茶蒲提取物，充分震荡后静置，使两相达到平衡后，分 离两相。过0 4 5t t m 滤膜后，用高效液相色谱进行检测。通过目标物质在两 相中的峰面积，计算分配系数k 。 2 2 6 高速逆流色谱分离条件的优化 固定相的保留率是指h s c c c 系统达到动力学平衡时，保留在分离螺线管 内的固定相体积与螺线管总体积的百分比。对选定的两相分离体系，固定相保 留率越高，分离效果越好，一般至少保证固定相保留率大于3 0 ，最好大于5 0 。 计算公式如下： 固定相保醉c 呦= 堕型蔫嚣磐型塑。 其中，螺线管总体积为3 0 0m l ，分离螺线管体积2 8 0m l 。- 固定流动相流速为2m l m i n ，分别调整高速逆流色谱的转速为7 5 0 、8 5 0 和9 5 0r m i n ，通过比较固定相保留率，选择合适的转速。在选定的转速下，调 整固定相流速为2 、3 和4m l m i n ，比较固定相保留率，选择合适的流速，提 高分离的效率。 2 2 7 高速逆流色谱制备油茶蒲有效成分 采用氯仿乙醇水乙酸( 4 ：3 ：2 ：o 0 1 ) 两相体系对油茶蒲提取物进行分 塑望奎兰堕主兰垡堡苎整三兰垫茎堕壹整堕坌箜坌塞丝垡型鱼皇堕塑竺塞 离。按比例配制两相溶剂体系，震荡后静置，使其充分达到平衡后，将两相分 离，超声脱气3 0m i n 。采用头一尾的方式，以5m l m i n 的流速将上相泵入螺 旋管柱中，注满后停泵。然后使仪器以9 5 0r m i n 的转速开始转动，同时将流动 相以3m l m i n 的流速泵入柱中，当出口处稳定地流出流动相时，体系达到了 动力学平衡，记录流出的固定相的体积，计算体系的固定相保留率。将3 0 0m g 油茶蒲提取物溶于1 0m l 固定相和流动相中，调整进样阀门后进样，于2 5 4n m 处监测流出的液体。 采用氯仿乙醇水乙酸( 4 ：3 ：2 ：0 0 1 ) 分离油茶蒲提取物的大孔树脂 4 0 0 , 乙醇洗脱相( 4 0 f ) ，选择流速为2m l m i n ，转速为8 5 0r m i n ，进样量为 5 0 0m g ，检测波长2 5 4n l n 。 采用正己烷乙酸乙酯水( 1 ：9 ：1 0 ) 分离油茶蒲提取物的大孔树脂4 0 乙醇洗脱相( 2 0 f ) ，选择流速为2m l m i n ，转速为8 5 0r r a i n ，进样量为4 0 0m g ， 检测波长2 5 4n n l 。 2 2 8 特征性化合物的结构鉴定 通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振( 1 h ，1 3 c ) 等色谱手段，对分离得到 的单体化合物进行结构鉴定。 2 2 9 高效液相色谱分析油茶蒲提取物 采用高效液相色谱法对油茶蒲提取物进行分析及三个特征物质含量测定， 具体方法如下： 色谱条件：色谱柱：l u n ac 1 8 ( 4 6 x 2 5 0m m ，5l a m ) ；柱温：2 5 ；进样 量：l o 此： 流速：1 0m l m i n ；检测波长：2 5 4n m ；流动相a ：乙腈；流 动相b ：l 乙酸水溶液；洗脱梯度：o 1 0r a i n ，5 - 1 0 a ；1 0 1 5m i n ，1 0 一1 5 a ；1 5 2 5m i n ，1 5 3 0 a ；2 5 2 6m i n ，3 0 - 5 a ；2 6 - 3 5r a i n ，5 a 。 特征成分标准曲线的制作：将g a 、e a 和m e a g 标准品用二甲基亚砜 ( d i m e t h y l s u l f o x i d e ，d m s o ) 溶解后，配制成一系列浓度梯度，过0 4 5 岬 滤膜后，进样检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 样品中特征成分含量的测定：将试样用少量d m s o 溶解后，配制成浓度 2 7 浙江大学博士学位论文 第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制备与结构鉴定 为1 0m g m l 的水溶液，过0 4 5 岬滤膜后，进样检测。根据峰面积和标准曲 线计算各特征成分的含量。 2 2 1 0 油茶蒲提取物的酸水解 称取1 0g 油茶蒲提取物，加入5m o l l 的h c i1 0 0m l ，1 0 0 水浴中加热 回流水解3h ，放冷，过0 4 5 岬滤膜后，h p l c 检测【1 19 1 。根据峰面积和标 准曲线计算水解物中特征成分的含量。 2 2 1 1 实验数据处理 实验数据使用o r i g i n 7 5 处理。数据表示为m e a n 士s d ，数据进行t - t e s t 检验， p 0 0 5 时有显著性差异。 2 3 结果与分析 。 2 3 1 油茶蒲提取物的i - i p l c 分析 图2 2 油茶蒲提取物的h p l c 谱图 f i g 2 - 2h p l ca n a l y s i so f o c e 高效液相色谱分析油茶蒲提取物，谱图如图2 2 所示，它主要含有三个化 合物。紫外光谱分析显示化合物l 的紫外吸收峰为2 2 6r i m 和2 7 2a m ，化合物 2 的紫外吸收峰为2 4 9n m 和3 6 5n m ，化合物3 的紫外吸收峰为2 5 3n m 和3 6 3 n m ，它们极可能均为酚类物质。通过福林酚试剂法进行测定，显示油茶蒲提取 物的总酚含量为2 2 4 。 2 8 寒盏摹袋fl邑8ll叠茜sqv 浙江大学博士学位论文 第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制备与结构鉴定 2 3 2 油茶蒲提取物大孑l 树脂分级洗脱相的成分分析 零 v 壤 缸 窿 辘 祥品： 图2 - 3 大孔树脂分离馏分的多酚含量 f i g 2 - 3t h ep o l y p h e n o l c o n t e n t so f f r a c t i o n so f o c es e p a r a t e db ym a c r o p o r o u sr e s i n d 1 0 1 大孔树脂吸附解析油茶蒲提取物共得到6 个部位，对这六个部位的总 酚含量测定，结果显示：4 0 乙醇洗脱部分( 4 0 f ) 的多酚含量最高，为3 6 7 ， 2 0 乙醇洗脱部分( 2 0 f ) 次之( 图2 - 3 ) 。 4 0 f 及2 0 f 的h p l c 图谱显示( 图2 - 4 ) ：4 0 乙醇洗脱物中含有化合物2 和31 并且化合物2 得到了有效富集；2 0 乙醇洗脱物中含有化合物1 和3 ，且化合 物l 得到了有效富集。 浙江大学博士学位论文 第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制各与结构鉴定 t u n e ( r a i n ) 图2 4 油茶蒲提取物大孔树脂精制部位的高效液相色谱图 f i g 2 - 4h p l ca n l y s i sm a c r o p o r o u sr e s i nd 1 0 1e l u t e df r a c t i o n so f o i l t e ac a m e l l i ae x t r a c t s 注：( a ) d 1 0 1 树脂吸附的4 0 乙醇洗脱物( 4 0 f ) ；( b ) 2 0 乙醇洗脱物( 2 0f ) 2 3 2 高速逆流色谱分离体系的选择及条件的优化 表2 - 2 显示，在氯仿甲醇水( 4 ：3 ：2 ) 体系中加入少量的乙酸后，能够 很好的改善目标物质在两相中的分配系数。这可能是由于目标物质为多酚，中 等极性，当溶剂体系中加入乙酸一方面可以抑制酚羟基的解离，另一方面增加 了流动相的极性，根据相似相溶的原理，增加目标物在有机相的溶解。根据前 期活性筛选结果( 具体见3 3 2 ) ，化合物2 和化合物3 为主要的目标物质。因 此，综合三个目标物质的k 值，选用两相溶剂体系( 氯仿：乙醇：水：乙酸= 4 ：3 ：2 ：0 o l ，v v v v ) 分离制备目标化合物。由于油茶蒲提取物经大孔树脂 精制后化合物2 和化合物3 主要集中在4 0 f 中，氯仿- 乙醇- 水- 乙酸 ( 4 ：3 ：2 ：0 0 1 ) 体系同样适用4 0 f 中目标物质的分离纯化。正己烷- 乙酸乙 酯水( 1 ：9 ：1 0 ) 体系中，化合物2 仅在一相中检出，而化合物l 和化合物3 的k 值则落在较为合适的范围，因此该体系适合制备化合物l 和化合物3 。从 3 0 舱 硷 o m 9 霍荨nn一置一。磊电osd 浙江大学博士学位论文第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制备与结构鉴定 图2 - 4b 中可见，2 0 1 = 中含有这两个目标物质，适合采用正己烷乙酸乙酯水 ( 1 ：9 ：1 0 ) 溶剂体系对其进行分离制备。 表2 2 油茶蒲特征性成分在不同两相分离体系中的分配系数k t a b l e2 - 2t h ek - v a l u eo fe aa n dm e a gi nd i f f e r e n tt w o - p h a s es o l v e n ts y s t e m s 注：目标物质只在一相中检出 表2 3 高速逆流色谱分离条件对固定相保留率的影响 t a b l e2 - 3e f f e c t so f s e p a r a t ec o n d i t i o no f h s c c co nr e t e n t i o no f s t a t i o n a r yp h a s e 保留率是评价高速逆流色谱分离效果的一个重要指标，通常保留率越高分 离效果越好。对于氯仿乙醇水乙酸( 4 ：3 ：2 ：0 0 1 ，v v v v ) 溶剂体系，我 们比较了相同流速下，仪器转速对固定相保留率的影响，如表2 - 3 所示，转速 越高，保留率越高。由于仪器自身条件的限制，转速最高只能达到1 0 0 0r m i n ， 转速过高仪器损耗较大，且会导致分离体系乳化，影响分离效果。因此，这里 我们选用转速9 5 0r m i n 为后续实验的参数。通过比较同一转速下不同流速对固 定相保留率的影响，我们发现随着流速的提高，固定相保留率越低。而流速越 大，实验效率越高。综合考虑，我们选用3m l m i n 为后续实验的参数。 3 l 浙江大学博士学位论文 第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制各与结构鉴定 2 3 3 高速逆流色谱分离油茶蒲提取物 如图2 5 所示，3 0 0m g 油茶蒲提取物进样后，可以直接得到三个目标化合 物，出峰顺序依次为化合物3 、化合物2 和化合物l 。每次进样分别可制备得 到化合物1 ，2 ，3 的量为lm g 、1 5m g 和lm g 。h p l c 检测这三个峰的物质， 由2 5 4n n l 处计算峰面积，结果( 图2 6 ) 表明这三个化合物的纯度都大于9 5 。 ：= 。： _ ： 04 08 01 2 0】6 0 ：2 0 02 4 0 ： ， 。 ： ：o 。t u n e ( r a i n ) ： ? ：， 7 ， 图2 5 高速逆流色谱分离油茶蒲提取物 f i g 2 - 5p r e p a r a t i v eh s c c cs e p a r a t i o no f o i l t e ac a m e l l i ae x t r a c t 注：分离体系：氯仿乙醇- 水- 乙酸( 4 ：3 ：2 ：o 0 1 ) ；转速：9 5 0r m i n ：流速：3m l m i n , 进样量：3 0 0m g ； 固定相保留率：5 0 油茶蒲提取物中三个目标化合物的含量并不高，通过大孔树脂对油茶蒲提 取物进行精制后，可以提高目标物质的制备效率。如图2 7b 所示，选用与油 茶蒲提取物相同的溶剂体系对4 0 f 进行分离，能够将进样量提高到5 0 0m g ，仍 能够达到很好的分离效果，并且对图中阴影标记的部分进行h p l c 检测，结果 显示化合物2 和化合物3 的纯度均高于9 5 ，一次制备可得到7m g 化合物2 ， 1m g 化合物3 。 化合物l 和化合物3 主要存在于大孔树脂2 0 乙醇洗脱馏分( 2 0 f ) 中， 采用正己烷乙酸乙酯水( 1 ：9 ：1 0 ) 溶剂体系( 图2 7 a ) 可以从2 0 f 中分离得 到纯度大于9 5 的化合物l 和化合物3 ，一次进样4 0 0m g2 0 f 可制备得到3m g 化合物l 和0 5m g 化合物3 。 3 2 椭 湘 m o g毒一n代ai邑oq爱薹 浙江大学苎主兰垒丝奎 蔓三童塑茎堕查茎堕坌箜坌塞丝垡墅鱼皇丝塑鳖塞 - - _ _ _ - _ _ _ - - _ _ _ - _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ - - - _ _ _ - _ - - _ _ _ _ _ _ 一 ： ：- ：一+ t i m e ( m 岫 。 图2 6 高效液相色谱分析高速逆流色谱分离的单体 f i g 2 - 6h p l ca n l y s i sc o m p o u n d s i s o l a t e df r o mo i l t e ac a m e l l i ae x t r a c t sb yh s c c c 注：( a ) 化合物1 ，( b ) 化合物2 ，( c ) 化合物3 3 3 g盘甘&墓邑警叠】o墨 浙江大学博士学位论文 第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制备与结构鉴定 g1 5 0 a 蕊1 2 0 名9 0 、= = ， 蕊6 0 醋 售3 0 乏0 a 0 ：2 0 1 4 06 0。g o _ 1 0 01 2 0 t 4 0 3 2 一o 一4 0，8 0 ，：1 2 0 1 6 0 2 0 0 2 4 02 8 03 2 0 ：、 ，： j ：j ：t i m e ( m i n ) ，：7，、：，： 图2 - 7 高速逆流色谱分离油茶蒲提取物 f i g 2 - 7p r e p a r a t i v eh s c c cs e p a r a t i o no fo i l t e ac a m e l l i ae x t r a c t 注：( a ) 溶剂体系：正己烷- 乙酸乙酯水( t ：9 ：1 0 ) i 转速9 2 5r m i n ：流速：3m l m i n ：进样量：4 0 0m g2 0 f ： 固定相保留率：5 3 6 ；0 - 1 0 0r a i n ：洗脱方式为头到尾，上相为固定相；1 0 0 - 1 4 0m i n 洗脱方式为尾到头， 下相为固定相。) 溶剂体系：氯仿- 乙醇水- 乙酸( 4 ：3 ：2 ：0 o i ) ；转速：8 5 0r m i r a 流速：2m l m i n 进 样量：5 0 0m g4 0 f ) 固定相保留率：5 7 2 3 4 特征性化合物的结构鉴定 化合物l 的结构通过e s i m s ，1 hn m r 和1 3 cn m r 进行鉴定，具体数据 如下( 谱图见附录) ：e s i m sm z ：1 6 9 1 【m - 1 1 。；1 hn m r ( 5 0 0m h z ，d m s o d 6 ) 8 p p m ：6 9 1 ( 2 h ，s ，h - 2 ，h - 6 ) ；”cn m r ( 5 0 0m h z ，d m s o d 6 ) 8 p p m ：1 2 1 3 9 啪 鹏 d 枷 姗 瑚 啪 d 署甘nn县。镰。时qjo价函 塑望奎堂堕主堂垡丝茎兰三兰塑茎塑互整璺坌塑坌塑丝些型鱼皇笙塑兰塞 ( c 1 ) ，1 0 9 2 9 ( c 2 ，c 一6 ) ，1 4 6 0 1 ( c - 3 ，c - 5 ) ，1 3 8 5 0 ( c - 4 ) ，1 6 8 3 6 ( c 一7 ) m s 、 1 hn m r 和”cn m r 等数据与文献中相比较，化合物l 为没食子酸( g a l l i c a c i d ) 1 2 0 , 1 2 l 】，结构见图2 8 。 化合物2 的结构通过i r 、e s i - m s 、1 hn m r 和1 3 cn m r 进行鉴定，具 体数据如下( 谱图见附录) ：i rc k b r 压片) c m 1 ：3 4 0 5 ( o h ) ，1 6 0 9 ，1 5 7 8 ， 1 4 8 9 ( 苯环) ，1 4 4 6 ( c h 3 ) ；e s i - m sm z ：4 7 7 0 m - 1 。；1 hn m r ( 5 0 0m h z ， d m s o - d 6 ) 8 p p m ：7 7 9 ( 1 h ，h - 5 ) ，7 3 3 ( 1 h ，s ，h - 5 ) ，4 0 4 ( 3 h ，s ，3 - o m e ) ，5 0 1 ( i h ，d ，j = 7 3h z ，h - l ”) ，3 7 3 ( i h ，s ，h - 6 ”) ，3 5 2 ( 1 h ，s ，h - 6 ”) ，3 4 5 ( 1 h ，s ， h - 5 ”) ，3 3 9 ( 1 h ，s ，h - 2 ”) ，3 3 3 ( 1 h ，甄h 3 ”) ，3 2 4 ( i h ，r r l ，h - 2 ”) ；”cn m r ( 5 0 0m h z ，d m s o - d 6 ) 8 p p m ：1 0 7 7 8 ( c 1 ) ，1 3 6 2 9 ( c 一2 ) ，1 4 1 2 5 ( c - 3 ) ，1 4 7 6 7 ( c - 4 ) ，1 1 1 7 6 ( c - 5 ) ，1 1 5 0 7 ( c - 6 ) ，1 5 9 1 ( c - 7 ) ，1 1 2 0 6 ( c - 1 ) ，1 4 2 3 3 ( c - 2 ) ， 1 4 0 5 8 ( c 一3 ) ，1 5 3 2 0 ( c - 4 ) ，1 1 1 9 6 ( c 一5 ) ，1 1 3 5 5 ( c 6 ) ，1 5 9 9 7 ( c - 7 ) ，1 0 2 7 0 ( c - l ”) ，7 7 7 8 ( c 2 ”) ，7 6 0 8 ( c - 3 ”) ，7 3 7 4 ( c - 4 ”) ，7 0 0 4 ( c 5 ”) ，6 1 4 3 ( c - 6 ”) ， 6 1 0 1 ( 3 o m e ) 。1 hn l v l r 和1 3 cn l v l r 等数据与文献中相比较，化合物2 为3 - 0 甲基鞣花酸4 - o p - d - 吡哺葡萄糖( 3 - o - m e t h y l e l l a g i c a c i d 4 - o - p d g l u c o p y r a n o s i d e ) 1 1 2 2 l ，结构见图2 - 8 。 化合物3 的结构通过1 hn m r 和1 3 cn m r 进行鉴定，具体数据如下( 谱 图见附录) ：1 hn m r ( 5 0 0m h z ，d m s o - d 6 ) 6 p p m - 7 3 3 ( 2 h ，s ，h 5 ，h - 5 ) ；1 3 c n m r ( 5 0 0l v l h z ，d m s o - d 6 ) 8 p p m ：1 0 8 3 ( c - l ，c - l ) ，1 1 3 2 ( c - 2 ，c - 2 ) ，1 1 6 4 ( c 一3 ， c - 3 ) ，1 3 0 5 ( c _ 4 ，c - 4 ) ，1 3 6 1 ( c - 5 ，c 一5 ) ，1 4 9 0 ( c 一6 ，c - 6 ) ，1 5 9 9 ( c - 7 ，c 一7 ) a 1 hn m r 和”cm r 等数据与文献中相比较，化合物3 为鞣花酸( e l l a g i ca c i d ) 【1 2 3 ，1 卅，结构见图2 8 。 | | 蛰蠹 化合物1 没食子酸 化合物2 3 0 甲基鞣花酸4 。- o 吡喃葡萄糖 图2 8 油茶蒲特征性成分结构 化合物3 鞣花酸 f i g 2 - 8s t r u c t u r e so f c h a r a c t e r i s t i cc o m p o s i t i o n so f o i l t c ac a m e l l i ae x t r a c t s 3 5 浙江大学博士学位论文第二章油茶蒲有效成分的分离纯化制备与结构鉴定 2 3 5 油茶蒲提取物中特征性成分定量分析 油茶蒲提取物中的特征性成分的含量如表2 _ 4 所示。在粗提物中，三个特 征化合物的含量并不高。经过大孔树脂精制后，g a 主要富集在2 0 f 中，m e a g 主要在4 0 f 中，e a 在2 0 f 和4 0 f 中均有检出。其中，4 0 f 中m e a g 的含量较 o c e 得到了很大的提高，约为其2 7 倍；2 0 f 中g a 的含量为o c e 的2 1 倍， 也得到了很好的富集作用。 将油茶蒲提取物用5m o f l h c l1 0 0 水解3h 小时后，g a 的含量约为水 解前的1 8 倍，e a 的含量约为水解前的4 倍。这表明油茶蒲提取物中含有可水 解的缩合鞣质，采用酸水解可以大大提高油茶蒲提取物中g a 和e a 的含量， 为大量制备这两个化合物提供了新的途径。 表2 - 4 油茶蒲提取物及其分级部位中特征性成分的含量 t a b l e2 - 4t h ec o n t e n t so f t h ec h a r a c t e r i s t i cc o m p o s i t i o n si no i l t e ac a m e l l i ae x t r a c t so fa n di t s f r a c t i o n s 2 4 讨论 高速逆流色谱( h s c c c ) 弥补了很多其他色谱技术固有缺点，几乎能应用 到各类天然活性成分领域，其新药开发、成分研究、指纹图谱的建立以及标准 品的制备等方面将得到更为广泛的应用。由于有足够多的两相溶剂体系可供选 择，从非水相体系，到有机相一水相体系，再到双水相体系，这些都可以应用 于分离。因而，h s c c c 既能分离脂溶性样品的分离，也可分离中等极性、强极 性甚至水溶性样品，应用范围非常广泛f l l 引。它既可用于天然植物粗提物的去杂， 3 6 塑鋈查兰堡主兰垒笙苎 蔓三兰垫茎翌童垫盛坌塑坌堕丝垡型鱼皇竺塑兰塞 也可用于单体化合物的制备。应用h s c c c 甚至可直接从粗提物直接分离制备得 到纯品。我们采用氯仿乙醇水乙酸( 4 ：3 ：2 ：0 0 1 ) 对油茶蒲提取物进行分 离，一步法纯化得到了三个纯度高于9 5 的单体。其中，e a 和m e a g 在结构上 相似，h p l c 分析时保留时间相差不到一分钟( 图2 2 ) ，硅胶柱层析、制备型 高效液相色谱均很难将其分离【1 2 2 1 2 4 1 。可见，采用h s c c c 技术从油茶蒲提取物 中分离e a 和m e a g 具有很大的优势。 油茶蒲提取物中g a 、e a 、m e a g 的定量分析表明，这三个特征性成分在 粗提物中的含量很低，均不到1 ，这给单体制备带来了困难。本课题组研究发 现油茶蒲提取中含有大量的鞣质，因此本章采用酸水解法对油茶蒲提取物进行 预处理，使得g a 的含量提高n 6 6 5 ，e a 提高到1 4 8 ，分别为起始物的1 8 倍 和4 倍，大大提高了后续制备的效率。 有关m e a g 的报道和研究很少，在油茶中是首次被检出和分离制各。由于 它结构上存在糖苷键，不能用水解法进行预处理。故本章采用大孔树脂法对油 茶蒲提取物进行精制，在4 0 的乙醇洗脱物中m e a g 含量得到较大的提高 ( 1 5 1 ，约为粗提物中的2 7 倍) 。 2 5 小结