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甘露低聚糖及其铁配合物制备技术研究 摘要 甘露低聚糖是近年来国际上颇为流行的一种新型功能性低聚糖，它是 由3 9 个甘露糖通过糖苷键连接形成主链，再在主链上连接葡萄糖或半乳 糖的杂聚寡糖。它能有效促进人体内有益细菌双歧杆菌的生长繁殖，调节 肠道菌群平衡，增强人体免疫力等多种功能。可以通过魔芋甘露聚糖( 简 称k g m ) 降解的方法获得甘露低聚糖。本论文通过对魔芋精粉的预处理， 游离酶法制各甘露低聚糖，固定化酶法制备甘露低聚糖，硅胶柱层析法分 离纯化甘露低聚糖，甘露低聚糖铁配合物的制备等的研究，为工业化生产 甘露低聚糖奠定基础。 通过对甘露聚糖预处理的研究发现：酸水解法比氧化降解法甘露低聚糖 得率高，反应物粘度降低多，反应时间短，所需反应温度低。其最佳工艺条 件为甘露聚糖浓度? ，盐酸浓度o o ? 瀚1 l ，酸解温度8 5 ，酸解时间l 。5 h 。 预处理降低了甘露聚糖的粘度，为后面的酶解提高了甘露聚糖浓度，增大了 反应效率。 采用游离酶制备甘露低聚糖，试验得制备甘露低聚糖的最佳工艺条件 为：加酶量6 k u g ，p h 值为4 。2 ，酶解温度6 0 ，酶解时间为2 h 。因素影响 大小顺序为：加酶量 p h 值 酶解温度 酶解时间。按照试验方法，进行 验证试验知甘露低聚糖的最终得率为3 8 0 2 。 固定化酶制备甘露低聚糖的试验得出最佳工艺条件为：加酶量3 0 k u g ， 酶解温度7 5 ，p h 值为3 5 ，酶解时间为4 h 。因素影响大小顺序为：加酶 量 酶解温度 p h 值 酶解时间。按照试验方法进行验证试验知甘露低聚 糖的最终得率为3 4 4 2 。 采用硅胶柱层析分离甘露低聚糖，试验褥知：最佳分离条件是进样量为 l o m l ，柱高为6 0 0 m m ，流速为l m l m i n ，温度为6 0 。此时总糖回收率为9 6 1 ， 甘露低聚糖峰值处低聚糖占此处总糖的7 1 3 4 ，占总低聚糖的2 6 5 9 。 通过对甘露低聚糖铁配合物制各工艺的研究，得出甘露低聚糖铁配合物 的合成影响顺序大小为氯化铁浓度 时间 柠檬酸钠浓度 p h 值。最佳合 成条件是p h 为9 ，时间1 5 小时，氯化铁浓度0 4 5 m 0 1 l ，柠檬酸钠浓度 0 2 0 m o l l 。比较甘露低聚糖和甘露低聚糖铁配合物的紫外和红外扫描图谱 得知铁配合到了甘露低聚糖的o h ，弋= 0 上。 关键词：p 甘露聚糖酶，甘露低聚糖，分离纯化，铁配合物，制备 i i s t u d yo np i 冱p a r a t i o nt e c h n o l o g yo f m a n n o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dm o s f e a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h em a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e sh a sb e e nb e c o m i n gan e w k i n d o ff u n c t i o n a l o l i g o s a c c h a r i d e sa n dm o r ep o p u l a ri nt h ew o r l d t h e m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e sm a i nc h a i nc o n s i s t s o f3 - 。9m a n n a nw i t hi n d i c a n b o n d ，a n dt h eg l u c o s ea n dg a l a c t o s ea r ec o n n e c t e dt ot h em a i nc h a i n ，i tc a n p r o m o t et h eg r o w t ha n dp r o p a g a t i o no f t h eb i f i d o b a c t e r i u m ，w h i c hi st h eb e n e f i t i nt h eb o d y , i ta l s oc a na d j u s tt h ei n t e s t i n a lf l o r ab a l a n c ea n dr e i n f o r c et h eh u m a n b o d yi m m u n ea b i l i t y , a n ds oo n t h em a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e si sg o t t e nt h r o u g h t h ed e c o m p o s i t i o no fk a n j a cg l u c o m a n n a n i nt h i st h e s i s ，w es t u d i e dt h e p r e t r e a t m e n to fk a n j a cg l u c o m a n n a n ，z y m o h y d r o l y s i st op r e p a r a t i o nm a n n o o l i g o s a c c h a r i d e s ，t h ep r o d u c t i o no fm o su s i n gt h ei m m o b i l i z e de n z y m e ，t h e s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f g l u c o m a n n a n - o l i g o s a c c h a r i d e s ，s t u d y o n p r e p a r a t i o no fm o s - f e ，w h i c hc a np r o v i d et h et h e o r e t i cb a s ef o rt h ei n d u s t r y p r o d u c t i o n t w om e t h o dc a nb eu s e dt os t u d yt h ep r e t r e a t m e n to fk a n ja cg l u c o m a n n a n ： a c i dh y d r o l y s i sa n do x i d a t i v ed e g r a d a t i o n a f t e rc o m p a r i s o nt h et w om e t h o d ，w e k n o wt h em e t h o do fa c i dh y d r o l y s i si sb e t t e ri na l lf a c t o r s t h eo p t i m u m p r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t i t si n c l u d i n g a c i d o l y s i st i m e1 5 h ，c o n c e n t r a t i o no fh c l0 0 7 m o l 1 ，a c i d o l y s i st e m p e r a t u r e8 5 ，c o n c e n t r a t i o n o fs u b s t r a t e7 a f t e rt h ep r e t r e a t m e n t ，t h ev i s c o s i t yi s d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y u s e dz y m o h y d r o l y s i st o p r e p a r a t i o nm a n n o o l i g o s a c c h a r i d e s t h e o p t i m u mp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t i t s i n c l u d i n ge n z y m ed o s a g e6 k u g ，p h 4 2 ，z y m o h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e6 0 ， z y m o h y d r o l y s i st i m e2 h 。t h er a n k i n go fp r o c e s sf a c t o r si se n z y m ed o s a g e p h i i i z y m o h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e z y m o h y d r o l y s i st i m e a c c o r d i n g t ot h i s c o n d i t i o n s ，m a n n a n - o l i g o s a c c h a r i d e sy i e l di s38 0 2 a f t h es t u d yt h ep r o d u c t i o no fm o su s i n gt h ei m m o b i l i z e de n z y m e w e k n o wt h eo p t i m u mp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e db yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t i t si n c l u d i n ge n z y m ed o s a g e3 0 k u g ，p h 3 5 ，z y m o h y d r o l y s i s t e m p e r a t u r e7 5 c ，z y m o h y d r o l y s i st i m e4 h 。t h er a n k i n go fp r o c e s sf a c t o r si s e n z y m ed o s a g e z y m o h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e p h z y m o h y d r o l y s i st i m e a c c o r d i n gt ot h i sc o n d i t i o n s ，m a n n a n - o l i g o s a c c h a r i d e sy i e l di s3 4 4 2 t h es i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i su s e dt or e m o v e g l u c o m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e s ，t h r o u g ht h er e s e a r c h ，w eg e tt h eo p t i m a lf e e d q u a n t u mt h a ti s lo m l ，t e m p e r a t u r ei s6 0 。c ，c o l u m no fr e s i nw a s6 0 0 m m ，t h e v e l o c i t y o ff l o wi slm l m i n ，t h r o u g ht h i s m e a s u r e ， w e g e t g l u c o m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e st h a tt h ep u r i t yi s 71 3 4 ，t h ei d e a le f f e c t w i l l g a i n e di fh i g h e rc o l u m na l t e r i nt h i sp a p e r , t h ee f f e c t so ff o u rf a c t o r s ：p h ，r e a c t i o nt i m e ，c o n c e n t r a t i o no f f e c l 3 ，c o n c e n t r a t i o no fs o d i u mc i t r a t e o nt h ep r e p a r a t i o no fm o s f ew e r e d e t e r m i n e db yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t t h eo p t i m u mp r o c e s s c o n d i t i o n s i n c l u d i n gt h ep hw a s9 ，t h er e a c t i o nt i m ew a s1 5h o u r , t h ec o n c e n t r a t i o no f f e c l 3w a s0 4 5 m o l l ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u mc i t r a t ew a so 2 0 m o l l a n dt h ei r , u v s c a n n i n gt od e t e r m i n ei t ss t r u c t u r e k e y w o r d ：f l - m a n n a s e ，g l u c o m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e s ，s e p a r a t i o n ， i r o nd e r i v a t i v e s ，p r e p a r a t i o n i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：泣奎至王 颦 期：至鲤墨垒三墨 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 争借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学 位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：选查纽导师签名：篮搓丑+ 暑期：2 垒坌塞圭苎旦 甘露低聚糖及其铁配合物制备技术研究 1 绪论 1 1 课题背景 随着社会的发展进步，人们生活节奏加快，生活压力增大，亚健康也已成为普遍现 象。生活水平的提高导致的文明病、富贵病( 糖尿病、心脑血管疾病、肥胖症等) 也己 成为损害人们健康状况的重大顽症。人们开始更多的关注自身健康状况，不断的增强保 健意识，也对食品提出了更高的要求。人们期望食品不仅具有良好的感官享受和营养价 值，而且希望它具有特定的保健功能，以预防亚健康的发生，减轻疾病的症状和痛苦， 以及促进疾病的康复。这时功能性食品因运而生，并不断的发展。 功能性低聚糖又名功能性寡糖，是指由三到九个单糖通过糖苷键聚合在一起( 聚合度 小于10 ) ，形成链状或环状的碳水化合物。人体肠道内没有水解这类低聚糖的酶，因而不 能被消化吸收而优先被肠内双歧杆菌利用，是双歧杆菌的增殖因子n 1 。双歧杆菌的增值 能带来许多良好的效应，而且功能性低聚糖还能抑制有害菌的繁殖，这些独特的生理功 能使其成为一种重要的功能性食品基料。 甘露低聚糖( m a n n o - - o l i g o s a c c h a r i d e s ) 又称甘露寡聚糖，是唯一能结合肠道中外 源性病菌的新型功能性低聚糖，它是甘露聚糖类物质的酶降解产物，广泛存在于魔芋粉、 瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁内h 1 ，是由甘露糖与葡萄糖以b 一1 ，4 糖苷键相连 的非吸收性低聚糖嵋1 。它具有低热、稳定、安全无毒等良好的理化性质，以及如下生理 功能：优化动物胃肠道微生态环境，降低胃肠道疾病。调节免疫防御机制，增强 动物免疫力。发挥多样生物活性，吸附霉菌毒素旧。 甘露低聚糖通过化学改性，一方面可以提高其原有的特性，使其作用效果更高更好； 另一方面通过引入各种功能基团而赋予其新的生理功能，从而应用于新的研究领域，扩 大应用范围。 甘露低聚糖可由甘露聚糖水解而得。魔芋为天南星科魔芋属多年生草本植物，其块 茎中富含葡甘露聚糖，有资料显示魔芋精粉中葡甘露聚糖的含量达到7 0 8 0 n 1 ，是生产 甘露低聚糖的优良原料。我国陕西、四川、云南、贵州等地有丰富的魔芋资源。多年来， 人们将魔芋块茎简单加工后，直接制成粉条、豆腐等食用，很少对其进行深加工。甘露 低聚糖产业的发展必将带动我国魔芋产业的发展。用魔芋为原料制备甘露低聚糖的成本 大约为6 万元吨，而甘露低聚糖的市场价格约为2 0 万元吨，实现了农副产品的增值， 增加了我国外汇收入，具有十分重要的经济价值。 陕西科技大学硕士学位论文 1 2 甘露低聚糖国内外研究进展 1 2 1 甘露低聚糖的组成、结构与性质 按照低聚糖中单糖的成分，甘露低聚糖可以分为三类：均一甘露低聚糖、葡萄糖甘 露低聚糖和半乳糖甘露低聚糖，它是一系列甘露低聚糖的混合物，所用制备原料的来源 和水解条件不同得到的产物不同，如从长角豆和瓜儿豆的胚乳中提取的角豆胶和瓜尔豆 胶为原料制取的低聚糖均为半乳甘露低聚糖，而以魔芋精粉为原料制取的是葡萄糖甘露 低聚糖。不同来源的甘露低聚糖的分子量、甘露糖与葡萄糖或半乳糖的比例、分枝点位 置等都不同伸1 。s h i m a h a r ah 等( 1 9 7 5 ) 将魔芋甘露低聚糖经过b 甘露聚糖粗酶液( 从魔芋 块茎中提取) 水解后得到m m 、g m 、g g 、m m m 、g m m 、m g m 、 g g m 、m m m m 、g m m m 、g m m g 、g g m m 、m m m m m 、g m m m m 等一系列甘露低聚糖的产物( g 代表葡萄糖，m 代表 甘露糖) ( 9 , 1 0 o 李庆国等测得酶解后魔芋甘露低聚糖平均相对分子质量为3 9 1 5 。 甘露低聚糖的形态为白色或淡黄色粉末，味微甜。低吸潮性优于所有低聚糖，粘度 低，耐酸、耐热，在p h 2 3 - 8 0 的范围内较稳定，1 0 0 加热1 h 不分解。水分活度与葡 萄糖一致，贮存于1 0 也不结冰。热值几乎为零( 不产生能量，对糖尿病人和肥胖病人 无副作用) n 2 1 引。 1 2 2 甘露低聚糖的生理功能 由于甘露低聚糖是功能性低聚糖中的一种，它首先具有功能性低聚糖的生理特性： 调节肠道菌群平衡，防止便秘改善脂质代谢，改善矿物质的吸收，难消化和低能量性和 低龋齿性等。除此之外，还具有刺激动物免疫作用和强大的竞争性排斥作用，包括阻断 病原菌定植和不给病原茵提供能量等，它将有望作为抗生素的替代品n 4 。1 9 1 。 ( 1 ) 对非免疫防御机制的调节 胃肠道非免疫防御系统的主要组成部分是内源微生物菌群，而内源微生物群又常分 为有益微生物群( 如双歧杆菌属、真杆菌属、乳酸杆菌属) 和有害微生物群( 如大肠杆 菌属、产气夹膜梭菌属、葡萄球菌属) ，有益微生物茵群覆盖在胃肠道粘膜上皮，能防止 其它微生物附着，阻断了病原微生物定殖和感染动物的关键步骤一粘附到粘膜组织。很多 肠病原体利用能与含d 一甘露糖的受体结合的1 型菌毛附着于肠上皮。最近发现试验组 6 6 的大肠杆菌具有甘露糖敏感性茵毛，能与甘露糖受体结合的鼠伤寒沙门氏菌和肠炎 沙门氏菌分别为8 0 和6 7 。8 0 年代后期科学家发现，日粮中的甘露糖或甘露糖衍生物 能与肠道病原体结合，阻止有害菌趋近肠壁，从而降低其在胃肠道中的浓度。试验结果证实 甘露低聚糖确实对胃肠道菌群有影响。甘露低聚糖能降低禽盲肠鼠伤寒沙门氏菌浓度， 减少携带都柏林沙门氏菌的禽数，甘露低聚糖还能减少通过1 型菌毛在盲肠定殖的大肠 杆菌( 减少量7 5 1 5 ) 。甘露低聚糖提高肉鸡对纤维的消化率，可能是通过其对盲肠和 2 甘露低聚糖及其铁配合物制备技术研究 结肠纤维降解菌群的浓度及其生物效率的影响而实现。甘露低聚糖提高了狗对含甜菜渣 日粮的可溶性纤维的消化率。甘露低聚糖的作用机制主要是干扰肠道病原菌的定植。甘 露低聚糖为细菌提供了丰富的甘露糖源，从而可避免细菌与肠壁的亲和。由于甘露低聚 糖不会被消化酶降解并携带病原体通过肠道，因此可以起到防止病原菌定植于肠道的作 用。病原菌不能利用甘露低聚糖作为供其生长的能量来源，而有益细菌可以被甘露低聚 糖激活。这表明甘露低聚糖可促使有益菌成为肠道优势菌群。 ( 2 ) 对免疫防御机制的调节 大部分动物免疫防御系统用于保护胃肠道表面免受病原菌侵害。机体约7 5 的免疫 细胞和肠淋巴组织作为肠相关淋巴组织( g u t a s s o c i a t e dl y m p h o i dt i s s u e ，g a l t ) 的一部分存 在于肠上，g a l t 具有非特异性免疫和特异性免疫作用。非特异性免疫是阻止入侵病原 菌的第一道防线，巨噬细胞在非特异性免疫反应初期吞噬和杀死入侵微生物过程中起重 要作用。吞噬抗原是对巨噬细胞的最初刺激，随后由t h 细胞的细胞素和入侵微生物细 胞壁分泌物进一步激活。外源微生物细胞壁分泌物通过旁路途径可激活免疫系统的补体， 调节吞噬细胞活性，这加速了对病原菌的清除。在体外系统中将巨噬细胞直接放于甘露低 聚糖中或将甘露低聚糖喂给大鼠时均能激活巨噬细胞。 胃肠道特异性免疫反应的关键部分是抗体( i g a ) 系统，粘膜i g a 能抑制入侵菌和毒素 在肠上皮的附着，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用直接杀死细菌。b 淋巴细胞的 再循环使其能在粘膜上与病原菌接触并产生免疫反应。俄勒冈大学的研究结果表明添加 甘露低聚糖可增加i g a 分泌量( 2 5 ) 。 甘露低聚糖在激活免疫应答上也有一定作用。由于源自微生物的特殊多糖在加入疫 苗时具有佐剂作用，因而添加适量的甘露低聚糖还可显著提高抗体反应能力，从而加强 疫苗的保护效能。甘露低聚糖除具有辅剂和抗原特性之外，还有能刺激肝脏分泌甘露糖 结合蛋白，从而影响免疫系统的作用。这种结合蛋白可结合细菌被囊，从而启动免疫系 统产生应答反应。 实验发现，甘露寡糖能使肉鸡胆汁中i g a 水平提高1 4 2 乜训，也可提高火鸡肠粘膜 中i g a 的水平，并显著提高火鸡血液中i g g 的含量幢。邵良平等报道，甘露寡糖能极显 著提高哺乳仔猪白细胞分化抗体c d 3 ，的水平心引。 ( 3 ) 吸附霉菌毒素 肠粘膜结构的变化可反映肠道的健康状况。食糜中存在的应激原，因紧邻肠粘膜，能迅 速影响粘膜形态。肠粘膜的结构变化如微绒毛变短和小囊加深都与毒素的存在有关，微 绒毛变短减少了营养物质吸收的面积，小囊( 微绒毛的加工厂) 变大说明组织代谢加快以 及新组织需要增大。与其他器官相比，肠、维持肠所需蛋白质和能量较多，快速生长的 肉鸡新合成蛋白质的1 2 用于消化道。组织代谢加快意味着维持所需营养增加，动物生 3 陕两科技大学硕士学位论文 产效率降低。肠形态的变化意味着营养物质的吸收减少，胃肠道的分泌增加，如下痢降 低了疾病抵抗力及生产性能。近年来大量研究表明，甘露低聚糖能够在肠道内抑制有害 菌如沙门氏菌、大肠杆菌、黄曲霉菌等在肠道上表皮的附着，同时并包裹上述有害菌， 迅速从肠道排出，因而它是抑制细菌在体内扩散的物质，也成为细菌附着抑制剂。 m i r e l m a n ( 1 9 8 0 年) 进行了甘露低聚糖截取病源菌实验心引。动物试验结果表明商品甘露 低聚糖( 如b i o m o s ) 能减少肠道病原菌，调节动物免疫反应，提高肠粘膜的完整性，最终 改善畜禽的生产性能。 1 2 3 甘露低聚糖的制备方法 多糖( p l o y s a c c h a r i d e ) 为单糖组成的天然高分子化合物，约3 0 0 多种，广泛存在于 各种植物，动物和微生物组织中，具有许多重要的功能。多糖在水里不能形成真溶液， 只能形成胶体溶液幢4 。 糖结构的多样性和复杂性使糖链的降解或裂解成为一件十分复杂的工作，没有一个 完全定型普遍采用的模式，多糖降解有物理降解、化学降解和酶降解法。 1 2 3 1 酸催化降解 糖链易被稀酸催化而水解，使其苷键发生断裂。反应一般在水或稀的醇溶液之中进 行，所有的酸为质子酸：无机酸类有盐酸，硫酸和硝酸等，有机酸类有甲酸，乙酸和草 酸等。也可用阳离子交换树脂，一般应在加热条件下进行。 糖苷键属于缩醛结构，苷原子易质子化，其反应历程以氧苷为例说明。糖分子中苷 原子氧接受质子而形成了质子化的苷键，即所谓的羊盐1 ，从而削弱了碳氧键，进而发 生断裂，游离出h o r ，同时形成了c 1 碳阳离子的半椅式的中间体，该中间体在水溶剂 中得到o h 而产生游离的糖，这种游离的糖一般应为a 和p 构型的混合物。从中可见， 苷键的断裂与苷原子的种类，空间环境以及糖原，苷元的性质有关。原则上认为，凡有 利于苷原子质子化的因素，都易为酸所水解。如有利于苷原子电子云密度增高的结构， 即苷原子碱度高的结构，或是空间位阻小的结构易于苷原子的质子化，形成碳阳离子中 间体，以减少空间张力，使苷键易于水解。 综合各种因素，苷键的酸催化水解有如下规( 1 ) 苷键的水解由易到难的顺序为： n 苷 o 苷 s 苷 c 苷，最易质子化的是n 原子，因而n 苷最易被水解；而c 一苷中 c 原子不存在未共用电子，不能质子化，因而c 苷最难被酸水解。( 2 ) 呋喃糖苷较吡喃 糖苷易水解，水解速度前者大于后者1 0 , - 一1 0 3 倍。( 3 ) 酮糖较醛糖易水解。( 4 ) 不同种 类的糖苷水解由易到难的顺序为：脱氧糖苷 羟基糖苷 氨基糖苷。这是与端基碳邻位 上连有能吸引质子的竞争基团有关。邻位上所连基团的碱性越大越易水解。( 5 ) 苷元基 团较大者，处于竖键的苷键比处于横键的苷键易水解，这是由于前者苷的不稳定性促使 水解。( 6 ) 吡哺糖苷中随c 。上所连的取代基体积的加大而水解变难。其水解速率大小次 4 甘露低聚糖及其铁配合物制备技术研究 序：五碳糖 甲基五碳糖 六碳糖 七碳糖。( 7 ) 构象相同的糖，其不稳定性高者，苷 键易水解。 化学法所用的剂便宜，虽然降解产物的均一性差，但作为多糖降解的前期处理还是 有一定的可取之处，陶兴无为提高魔芋葡甘露聚糖( k g m ) 的溶解度，研究了酸酶结合法 水解k g m 的工艺条件。在最佳条件下，水解率为2 0 6 5 ，产品收得率为5 9 5 4 ，多数 水解产物分子的大小在三糖以上幢引。 1 2 3 2 物理降解法 物理降解法是一种绿色高效的降解方法，操作简单，可控性好，常用的方法如微波 法、辐射法和超声波法。目前，对超声波降解法的研究比较多乜引。 超声波与声波一样，是物质介质中的一种弹性机械波，其频率范围为2 x1 0 4 1 0 9 h z 3 大分子物质的主要机理是机械性断键作用以及自由基的氧化还原反应。超声波的机械性 断键作用是由于物质的质点在超声波中具有极高的运动加速度，产生激烈而快速变化的 机械运动，分子在介质中随着波动的高速振动及剪切力的作用而降解。这种快速变化的 机械运动足以引起高分子物质中共价键的断裂，而导致高分子物质的降解。自由基的氧 化还原反应主要是由于液体在超声波作用下产生空化效应而导致的。当声波在媒介中传 播时，若声强足够大，液体所受到的负压也足够大，媒质分子间的平均距离就会增大， 超过极限距离后，破坏液体结构的完整性，造成空穴。这些空穴破碎时会产生局部性的 高压和剧烈的温度变化，为自由基的产生提供能量。溶剂类型不同，形成的自由基也不 相同，所造成的超声波的反应结果也不相同。自由基和热效应对低分子量物质较有效， 机械效应对高分子物质的效应更为显著，而且机械效应随物质分子量的增加而增加。部 分学者认为机械效应所作用的位点靠近最大分子的中心1 。 目前超声波已经在淀粉、壳聚糖、真菌多糖等的降解中得到很好的应用。就现状来 看，对超声波主要的研究焦点仍然集中在特征超声场施加对纤维素、淀粉、壳聚糖、真 菌多糖的降解等宏观效应的数据采集和积累上，而且更加关注从宏观角度来改变过程因 素而考察其降解效果的宏观表象，还没有系统地从各种超声场作用机理的角度深入其微 观本质来揭示其内部本征的自然属性，致使其进一步产业化的许多关键科技问题( 如超 声场施加的类型、方式和强度、与其他过程的耦合匹配等) 未能从根本上给予解决。因 此，超声的作用时间、强度、频率等物理因子对多糖介质各物化性质作用的具体机制还 需做更多的基础研究，探明超声对多糖生物大分子键断裂的作用机理和自由基反应机理， 并建立物理因子和化学因子对多糖生物大分子微观结构与宏观性能影响机理的物理与数 学模型，从根本上解决该技术产业化的科技问题。 1 2 3 3 酶降解法 相对于多糖的酸，碱催化水解，酶的催化水解多糖具有条件温和和酶促反应专一性 5 陕西科技大学硕士学位论文 的特点。不像酸，碱水解后的产物复杂化。用于多糖降解的各种糖酶主要是聚糖水解酶 和转移酶，前者尤为常用。酶水解多糖的程度取决于酶的种类和p h 值，以及酶本身的纯 度。外切酶一般自非还原端开始，沿着糖链有规律地逐级降解，停止在糖链的分支点处， 不能水解分支点的苷键，逐一释放出还原糖，使溶液粘度缓慢下降。而内切酶作用于糖 链的一定类型的苷键上，它在水解多糖时，主要从多糖分子内部开始水解，使糖溶液的 粘度突然下降2 1 。与其他方法比较，酶法生产因转换率高，副反应少，易实现工业化， 成本低等优点而被广泛使用。 酶法制备甘露低聚糖是指用1 3 甘露聚糖酶( b m a + m a s e ) 水解甘露聚糖得到甘露低 聚糖。由于酶的专一性和高效性，酶法制备甘露低聚糖已被广泛采用口3 。 1 3 1 , 4 d 甘露聚糖酶( 1 3 1 , 4 d m a j + m a _ r l _ m a n n o h y d r o l a s e ；e c 3 2 1 7 8 ) 是一类能够水 解含有1 3 1 , 4 一d 甘露糖苷键的甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的水解酶，简称1 3 甘露聚糖酶( 1 3 m a n n a s e ) 利。 ( 1 ) b 甘露聚糖酶的来源 b 甘露聚糖酶广泛存在于自然界中。在一些低等动物( 如海洋软体动物l i t t o r i n a b r e v i c u l a ) 的肠道分泌物中，豆类植物( 如四棱豆、长扁豆等) 的发芽的种子中，天南星科 ( a r a c e a e ) 植物魔芋萌发的球茎中都发现了1 3 甘露聚糖酶的存在。而微生物( 包括真菌、 细菌和放线菌) 则是b 甘露聚糖酶的主要来源。已报导的有细菌中的芽孢杆菌5 圳、假 单胞菌、弧菌，真菌中的曲霉渺4 1 1 、青霉、酵母和放线菌中的链霉菌等。由于微生物来 源的b 甘露聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便以及比动植物更广的作用 p h 、温度范围和底物专一性等显著特点，已在工业化生产和理论研究中得到了广泛的应 用。 ( 2 ) b 甘露聚糖酶的性质 不同微生物所产的1 3 甘露聚糖酶的分子量、最适反应p h 值、等电点、最适反应温 度、酶动力学常数、底物专一性等都有一定的差异。1 3 甘露聚糖酶的分子质量小的只有 2 2 k u ，大的可以达到1 6 2k u ，相差十分悬殊，但大部分在3 0k u 5 5k u 。 真菌来源的1 3 一甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般在4 o 5 5 之间，最适反应温度一 般在5 5 - 7 5 。如1 9 9 0 年j o h n s o n 研究的里氏木霉，最适p h 为5 5 ，最适反应温度为 6 5 ；2 0 0 2 年李江华等人研究的黑曲霉，最适p h 值为5 5 ，最适反应温度为3 5 c t 2 9 】。 细菌和放线菌来源的最适p h 值却常为中性或者偏碱性，最适反应温度为4 5 - - 7 0 。细 菌中，研究最多的是芽孢杆菌，最适反应p h ，除嗜碱芽孢杆菌高至9 0 以上之外，多为 5 5 7 0 。如1 9 9 9 年马建华等人研究的枯草芽孢杆菌最佳反应p h 为6 4 ，最适反应温度 为5 0 。相对于细菌来源的1 3 甘露聚糖酶，真菌来源的酶p h 稳定性，最适反应p h 都 偏低n 引。 6 甘露低聚糖及其铁配合物制备技术研究 ( 3 ) 1 3 甘露聚糖酶的作用方式及产物 1 3 甘露聚糖酶是水解1 ，4 1 3 d 一吡喃甘露聚糖为主链的内切水解酶，作用底物主 要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖及甘露聚糖。不同来源的1 3 一甘露 聚糖酶对不同来源的底物作用深度和作用产物是不同的。1 3 甘露聚糖酶水解底物的方式 和深度主要与q 半乳糖残基和葡萄糖残基在主链中的位置、含量、酯酰化的程度有关， 当然底物本身的物理状态也会影响酶对底物的作用。另外，b 甘露聚糖酶对底物的要求 也不一样。如瓜豆尔胶种子产生的1 3 甘露聚糖酶要求具有5 个连续的甘露糖残基。甘露 聚糖经1 3 甘露聚糖酶水解后，通过h p l c 或纸层析方法分析，主要产物是低聚糖( 2 1 0 个残基) ，产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关，但是，相对来说，产物中单糖含量 很小或根本没有。 e m i s 和s h i m a h a r a 研究证明，1 3 甘露聚糖酶作用于魔芋胶或槐豆胶的作用位点是多 糖链的非还原端的第3 或第4 个糖分子，即魔芋胶经1 3 甘露聚糖酶作用后的产物为m g ，g m ，g g ，m m ，m m m ，g g m ，m g m ，g m m ，m m m m ，g - - m - - m - - m ，g m m g ，g g m m ，m m m m m 。虽然不同来 源的b 甘露聚糖酶对底物的作用深度不同，但主要产物是甘露低聚糖，相对来说，产生 单糖很少或根本不产生【柏1 。 ( 4 ) b 甘露聚糖酶的固定化 ，： 固定化酶最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来成为不溶于水的酶衍生物，所以 曾叫过水不溶酶( w a t e r - i n s o l u b l ee n z y m e ) 和固相酶( s o l i dp h a s ee n z y m e ) 。但是后来发 现，酶可以包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而小分子 产物可以透过超滤膜，这样酶本身还是可溶的，因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不 合适了m 1 。在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用固定化酶( i m m o b i l i z e d e n z y m e ) 的名称。所谓固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指 经物理或化学方法处理后，酶变成不易随水流失即运动受到限制，却又能发挥催化作用 的酶制剂。 固定化酶的优点：( 1 ) 固定化酶和底物、产物易分离。( 2 ) 可以多次重复使用，提 高酶的使用效率，降低成本。( 3 ) 在大多数情况下可以提高酶稳定性。( 4 ) 酶反应过程可 以得到严格的控制。( 5 ) 可以实现生物反应器的构建固定化酶的缺点：( 1 ) 酶活力易 损失。( 2 ) 增加成本。( 3 ) 只能用于水溶性底物。 酶固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法四种。目前国内外对 1 3 甘露聚糖酶的固定化研究十分有限。柯蕾采用壳聚糖交联吸附法固定1 3 甘露聚糖酶， 其活力回收率为5 2 1 h 引。杨伟东通过对固定化方法的筛选，选用一定浓度的戊二醛使 甲壳素功能化，然后再与酶进行固定化，酶的活力回收率为6 4 7 m 1 。 7 陕西科技大学硕士学位论文 目前，酶法因其不可比拟的优势成为甘露低聚糖制备的主要方法，但它也有局限性。 其中阻碍酶法制备甘露低聚糖发展的最大因素就是酶解底物浓度过低。因为多糖在水中 粘度大，呈胶体状，所以酶解反应只能在低甘露聚糖浓度下进行，这样生产效率也无法 提高。 ( 5 ) 甘露低聚糖制备的研究概况 自1 8 9 5 年r o i b u 等人用的h 2 s 0 4 水解魔芋粉，在水解液中检测出大量的甘露糖后， 开始了甘露低聚糖在人类食品上的应用历史。1 9 2 0 年，m a y e d a 等人发现魔芋粘稠物质 中除甘露糖，还含有葡萄糖，进一步研究表明魔芋中的甘露糖主要以葡甘聚糖的形式存 在。自1 9 6 0 年后，日本学者对魔芋甘露低聚糖的结构、食品学性质和保健功能进行了系 统的研究，并由此推动了其在保健品市场的开发与应用。而1 9 9 6 年南开大学的杨文傅等 人从生产的角度探索了利用b 一甘露聚糖酶水解一些植物胶生产甘露低聚糖的条件，为 工业酶法制取甘露低聚糖提供了基础工艺参数h 7 1 。无锡轻工大的金丰秋、金其荣研究开 发以甘露糖苷酶水解魔芋精粉得到反应液中有甘露糖，葡萄糖，甘露二糖，三糖，四糖， 五糖，六糖，七糖等n 引。按常法脱色脱盐和真空浓缩即可的甘露低聚糖浆，也可进一步 采用工业色谱柱分离出单糖后h 引，将高纯度的甘露低聚糖浆经喷雾干燥制成甘露低聚糖 粉。周中凯、夏英也对甘露低聚糖的生产作了研究。用魔芋粉配成胶液，然后加入适量 的酶液，在适当的温度下反应，体系的黏度急剧下降，不被酶作用的杂质呈絮状析出。 离心过滤除去不溶性纤维类杂质即得甘露低聚糖溶液，经浓缩，干燥后得到产品。柯蕾 采用固定化酶法制备甘露低聚糖得率为：3 0 8 。杨伟东采用填充床式反应器制备甘露 低聚糖，最终得率为2 9 5 。目前甘露低聚糖的得率还不是很高，不能应用到工业生产。 1 2 4 甘露低聚糖的分离纯化 功能性低聚糖的生产一般是以多糖或聚糖为原料，利用低聚糖酶的糖基转移作用进 行的，低聚糖的转化率一般在5 0 左右，产品中除含有功能性低聚糖外，还有未反应完 全的多糖及单糖，而且低聚糖的纯度较低。因此必须采用分离的手段提高反应液中甘露 低聚糖产品的纯度。这些副产物的存在，在很大程度上降低了功能性低聚糖的生理功能。 因此，功能性低聚糖的分离纯化己成为功能性低聚糖生产厂家亟待解决的研究课题。然 而，由于功能性低聚糖产品成分复杂且往往性质相近，其分离纯化就变得比较困难，常 规分离法如结晶法难以适用。目前虽己有数种功能性低聚糖产品的纯度达到9 0 以上， 但由于生产成本高而不太实用，开发新型、低成本分离方法将大有前途。下面探讨几种 功能性低聚糖的分离纯化方法嘲1 。 1 2 4 1 膜分离法啼。铷 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔 径的大小而达到物质分离的目的。按分离粒子或分子大小可将膜分离法分为：反渗透、 8 甘露低聚糖及其铁配合物制备技术研究 透析、电渗析、纳膜过滤、超滤、微滤等六种。其中反渗透和纳滤有望用于分离纯化功 能性低聚糖。 反渗透又称逆渗透，是种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂和小分子物质 的膜分离操作。反渗透可用于分离糖类混合物，是由于糖液中各组分和反渗透膜如醋酸 纤维膜的亲和力不同，从而在膜中的渗透率不同。这和色谱柱法中树脂母体的功能团和 糖液中各组分的相互作用力不同类似。由于一般被分离糖液的浓度较高，要求连续柱膜 的长度很长而使分离过程变得不经济。在果糖和葡萄糖的分离中，可通过向料液中加入 n a c i ，n a 2 c 0 3 或n a h s 0 3 加以改善。这些盐类只能和葡萄糖形成络合物而不能和果糖形 成络合物，由于含水络合物笨重而在反渗透膜中的渗透率明显减小，从而使果糖和葡萄 糖的分离变得容易。由于反渗透在分离过程完成的同时，也将料液进行了浓缩，节约了 后续浓缩工艺的费用。因此，对于功能性低聚糖的分离，若能找到加大各组分在反渗透 膜中渗透率差异的措施，反渗透也不失为一种较好的分离手段。 纳膜过滤也是一种以压力差为推动力，介于超滤和反渗透之间，从溶液中分离出3 0 0 1 0 0 0 小分子量物质的膜分离过程。其用来分离糖组分的原理与反渗透类似，但所需操 作压力远低于反渗透，因而与反渗透相比具有节约动力的优点。从纳膜过滤分离物质的 分子量范围来看，选择不同孔径的纳滤膜，可将单糖、二糖、三糖以至五糖以上组分依 次分开。但由于制膜技术的限制，纳滤膜的截留孔径不是绝对的，而是一个范围的平均 值，因此要达到较高的分离度往往需要较长的柱膜长度。和反渗透一样，纳膜过滤也有 分离、浓缩一步完成的优点，除分子量大小差异外，若能增加截留组分和透过组分对膜 渗透率的差异，纳膜过滤用于分离功能性低聚糖将是可行的啼3 。 1 2 4 2 发酵法 该法利用多数功能性低聚糖的难发酵性，选择适当的微生物将非功能性低聚糖成分 发酵除去。例如酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 可以将功能性低聚糖混合物中的葡萄 糖选择性地发酵为酒精而除去。由于酿酒酵母对麦芽糖、蔗糖等的发酵反应具有可变性， 因此通过驯化、诱变