（食品科学专业论文）嗜酸乳杆菌的微胶囊化研究.pdf

摘要 嗜酸乳杆菌的微胶囊化研究 学科专业：食品科学入学时间：2 0 0 7 年9 月 硕士研究生姓名：赵红磊答辩时间：2 0 0 9 年1 2 月 指导教师：陈卫授予学位时间： 摘要 嗜酸乳杆菌是栖息在人体肠道( 主要在小肠中段) 内的有益菌之一。但是嗜酸乳杆 菌在使用过程中容易受到外界条件如光、氧气的影响而死亡，而且食用过程中胃液的强 酸性环境也会导致嗜酸乳杆菌的死亡。微胶囊技术是食品工业中常用的技术之一，它可 以保护芯材物质免受外界条件的影响。雾化法简便快捷，过程也比较温和，在益生菌微 胶囊化的应用中有很大潜力。 本论文以海藻酸钠为壁材，以c a c l 2 溶液为凝固浴制备嗜酸乳杆菌微胶囊。研究了 雾化法的制备工艺，并对该微胶囊的耐酸性及释放特性进行研究。选择壳聚糖包衣作为 加强微胶囊耐酸性的方法，对包衣条件进行了研究。最后对改进后的微胶囊的物化性质、 耐酸性、释放特性及贮藏稳定性进行了研究。 实验采用正交试验研究雾化法制备微胶囊的工艺条件，得到的最佳工艺条件为海藻 酸钠浓度1 5 、喷雾压力0 0 5 m p a 、进料速度1 0 m l m i n 、芯壁比( v w ) 1 ：1 。此最佳 条件下，微胶囊的粒径为5 7 6 2 岬，微胶囊化产率为6 7 4 ，微胶囊化效率为6 3 4 ， 微胶囊有效载量达到1 4 5 x 1 0 9 e f u g 。扫描电镜照片( s e m ) 表明微胶囊成球形，表面没 有裂缝产生，囊壁的结构仍保持完整，说明对芯材形成了良好的包埋。 采用复配法和包衣法对微胶囊的耐受性进行了改进，结果发现包衣法效果最好。对 壳聚糖包衣的工艺条件进行了研究。以微胶囊的耐酸性为指标，确定了壳聚糖包衣的最 佳工艺条件：采用分子量3 2 5 k d a 和脱乙酰度9 1 4 的壳聚糖，浓度为0 3 ，p h 5 0 ， 包衣时间1 0 m i n 。经过壳聚糖包衣改进的微胶囊在人工胃液个消化1 2 0 m i n 后，嗜酸乳 杆菌活菌数仅下降1 9 9 1 0 9 ，而未包衣微胶囊中活菌数则下降了4 4 0 l o g 。 对微胶囊的结构性质进行了研究。红外光谱表明，壳聚糖和海藻酸钙之间存在氢键 作用，没有新化学键的形成。1 6 1 2 c m d 处c o o 吸收峰变宽，这是嗜酸乳杆菌菌体蛋白 酰胺键( - h n c = o ) 中c = o ( 1 6 5 0 c m _ ) ，n h ( 1 5 5 0 c m d ) 吸收峰与1 6 1 2 c m 。1 重叠所 致，表明嗜酸乳杆菌包埋在微胶囊中。 d s c 分析和储藏实验结果表明，微胶囊有良好的贮藏性质：2 5 下经过4 周的储藏， 未包衣和包衣微胶囊活菌数分别下降了1 5 0 l o g 和0 9 6 1 0 9 ，而未微胶囊化的嗜酸乳杆菌 则下降了2 3 3 1 0 9 ；4 c 储藏4 周后，未包埋的微胶囊活菌数下降了1 0 3 l o g ，未包衣和包 衣微胶囊分别下降了提高了0 5 9 1 0 9 和0 2 7 1 0 9 。这说明采用壳聚糖对海藻酸钙微胶囊进 行包衣后可以提高其储藏稳定性。 关键词：嗜酸乳杆菌；微胶囊；雾化法；海藻酸钠；壳聚糖 a b s t r a c t a b s t r a c t l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u si so n eo fp r o b i o t i c sl o c a t i n gi nh u m a ni n t e s t i n a lt r a c t ，a n di s b e n e f i tt op e o p l e b u tt h e r ea r es o i b ep r o b l e m sf o rs u r v i v a lo fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ，s u c h a se f f e c t so fl i g h t ，o x y g e nd u r i n gs t o r a g ea n dg a s t r i ca c i dw h e ne a t e n m i c r o e n c a p s u l a t i o ni sa u s e f u lt e c h n o l o g yi nf o o di n d u s t r y 。w h i c hc a ns e p a r a t ec o r em a t e r i a l sf r o me n v i r o n m e n t st o a v o i dd a m a g e a t o m i z a t i o n ac o n v e n i e n t ，f a s ta n dm i l dw a yo fm i c r o e n c a p s u l a t i o n , i s p o t e n t i a lf o rm i e r o e n c a p s u l a t i o no fp r o b i o t i c s l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sw a sm i c r o e n c a p s u l a t e db ys p r a ym i x t u r eo fa l g i n a t ea n d m i c r o b i a ls u s p e n s i o ni n t oc a l c i u mc h l o r i d es o l u t i o n s ，a n dt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sw e r e s t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so b t a i n e da t ea sf o l l o w s ：a l g i n a t ec o n c e n t r a t i o n1 5 ， a t o m i z a t i o np r e s s u r e0 0 5 m p 乱f e e d i n gs p e e d10 m l m i na n dc o r e w a l lm a t e r i a lr a t i o1 ：1 a t t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，m i c r o e n c a p s u l a t i o n sw e r ep r e p a r e dw i t hm i d d l es i z eo f5 7 6 2 1 x r n , m i c r o e n c a p s u l a t i o ny i e l d6 7 4 ，m i c r o e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y6 3 4 ，l o a do f1 4 5 x10 7 c f u g s e m m i c r o g r a p h ss h o w e dt h a tm i c r o e n c a p s u l a t i o nw a sr o u n dw i t hi n t e g r a t e ds u r f a c e ，w h i c h i n d i c a t e dt h a tl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sw a sm i c r o e n c a p s u l a t e dw e l l c h i t o s a nw a sb e t t e rt h a nw h e yp r o t e i na n dr e s i s t a n ts t a r c ho ni m p r o v i n ga c i d - r e s i s t a n c e c o a t i n gp r o c e s sw i t hc h i t o s a nw a ss t u d i e d a sar e s u l t ，c h i t o s a nw i t hm o l e c u l a rw e i g h t 3 2 5 l aa n dd e a c e t y l a t i o nd e g r e e9 1 4 ，c o n c e n t r a t i o n0 3 ，p h 5 0 ，c o a t i n gt i m elo m i n w e r ec h o s e nw i t har e s u l to fs u r v i v a li ns i m u l a t e dg a s t r o i n t e s t i n a li u i c e c h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o c a p s u l e sw e r es t u d i e d i n f r a r e ds p e c t r u mi n d i c a t e dt h a th y d r o g e n b o n dw a sf o r m e db e t w e e nc h i t o s a na n da l g i n a t e ，w i t hn oc h e m i c a lb o n d s b r o a dp e a ka t l612 c m 。1i n d u c e db ya b s o r p t i o no fp r o t e i na m i d ec a nb es e e ni nt h es p e c t r u m ，w h i c h i n d i c a t e dl a c i d o p h i l u sw a se n t r a p p e di nt h em i c r o c a p s u l e s i tw a si n d i c a t e dt h es t o r a g es t a b i l i t yo fm i c r o c a p s u l a t i o nw a sg o o d b yr e s u l t so f d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) a n ds t o r et e s t a f t e rf o u r - w e e ks t o r a g ea t2 5 ，t h e n u m b e ro fu n c o a t e da n dc o a t e dm i c r o e n c a p s u l a t e dl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sr e d u c e d1 5 0 l o g a n d0 9 6 1 0 9r e s p e c t i v e l y ，a n dt h en u m b e ro ff r e el a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sr e d u c e d2 3 3 1 0 9 a f t e rf o u r - w e e ks t o r a g ea t4 c ，t h en u m b e r l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sr e d u c e d1 0 3 0 9 ， i n d i c a t e dt h a tc o a t i n g 、析t l lc h i t o s a nc a n m i c r o e n c a p s u l a t e di na l g i n a t em a t r i x e s o ff r e e ，u n c o a t e da n dc o a t e dm i c r o e n c a p s u l a t e d 0 5 9 1 0 9a n d0 2 7 1 0 9r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s i m p r o v es t o r a g eo fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ，m i c r o e n c a p s u l a t i o n , a t o m i z a t i o n , a l g i n a t e ， c h i t o s a n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对席, j o f 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅；可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：簦兰：盏 导师签名： e l 期： 引言 1 引言 1 1 嗜酸乳杆菌 1 1 1 嗜酸乳杆茵的生理特性 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 属于乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) ，革兰氏阳 性，不产芽孢，无鞭毛，不运动，同型发酵乳糖，接触酶阴性，最适生长温度3 5 3 8 0 c ， 最适p h 5 5 6 4 ，是一类厌氧或兼性厌氧的微生物【1 1 。 1 1 2 嗜酸乳杆菌的保健功能 嗜酸乳杆菌是柄息在人体肠道( 主要在小肠中段) 内的有益菌之一，当存在一定数 量时，它能有效地调节肠道内有益和有害微生物间的平衡，能够降低血清胆固醇，防止 癌症的发生，从而达到促进宿主健康的功效【2 一钉。其保健作用主要体现在以下几个方面： 1 1 2 1 抑制肠道致病菌的繁殖 那淑敏1 5 1 等研究发现嗜酸乳杆菌发酵代谢产物中大量的有机酸，这些有机酸降低了 肠道内p h 和e h ，从而对很多致病菌的生长繁殖产生不同程度的拮抗作用，如大肠杆菌、 单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等，但对人体肠道巾的正常菌群无损害 作用，并对酵母菌的生长有促进作用。赵瑞刮6 】等人的研究表明，嗜酸乳杆菌对大肠杆 菌、沙门氏菌、和炭疽杆菌有很强的拈抗作用。张帆等【3 】人的研究也有类似的结论。 1 1 2 2 缓解乳糖不耐症 研究表明m ，在存在乳糖时，嗜酸乳杆菌能够诱导产生p 半乳糖苷酶，从而分解和 利用乳糖，减轻乳糖不耐症。 1 1 2 3 降低血清胆固醇 胆固醇在人体生理活动中起着重要作用，是不可缺少的物质。但是，对于血清胆固 醇过高的人来说，显著降低血清胆固醇含量意味着减少心脏病发生的风险。 s e g i l l i l a n d 等【8 】研究表明，在合适的生长条件下嗜酸乳杆菌能移除实验培养基中 的胆固醇。他们又进一步对青年猪喂食高胆固醇含量的饲料，因为它们的消化系统和血 液循环系统与人的相似。结果表明，摄食嗜酸乳杆菌能显著降低血清中胆固醇水平。 1 1 2 4 抗癌作用 1 9 7 2 年，d r a s e r 和h i l l 提出肠道细菌能改变人体肠道内部的化学环境，从而在抑制 癌症的形成和发展中起着重要作用【9 1 。临床研究表明，嗜酸乳杆菌能够抑制诱导肿瘤细 胞生成的前体物质的合成，从而能够预防癌变细胞的形成【1 0 1 。 江南大学硕士学位论文 1 2 微胶囊技术概论 1 2 1 微胶囊的定义 微胶囊是由天然或合成高分子制成的微型容器，直径一般为1 1 0 0 0 9 i n 。微胶囊技 术是可以成囊壁或膜的物质对固体、液体或气体等核心物质进行包埋和固化的术。微胶 囊中用于包封的材料称为壁材，被包封的物质称为芯材，也称囊芯。微胶囊粒子的形状 多种多样，以球形居，也有的是谷粒及无定形颗粒等形状，通常液体囊芯形成的微胶囊 多为球形。囊芯可以由一种或多种物质组成，有单核、多核，也有微胶囊簇和复合微胶 囊。按囊壁结构可以分为单层、双层和多层微胶囊1 1 1 】。 1 2 2 微胶囊的作用 微胶囊具有保护物质免受环境条件的影响，屏蔽味道、颜色和气味，降低毒性，改 变物质的性质或性能，延长挥发性物质储存时间，持续释放物质进入外界，将不可混合 的化合物隔离等功能。上述功能使微胶囊化成为许多工业领域中有效的商品化方法【1 2 1 。 1 2 3 微胶囊的壁材 微胶囊壁材在很大程度上决定着产品的理化性质。理想的可以应用到食品、医药行 业的壁材应该符合食品卫生及安全的要求： ( 1 ) 性质稳定；( 2 ) 有适当的释药速率； ( 3 ) 无毒、无刺激性；( 4 ) 与囊芯配伍，不影响囊芯的作用及含量测定；( 5 ) 有一 定的强度及可塑性，能完全包封囊心物； ( 6 1 具有符合要求的勃度、渗透压、亲水性、 溶解性等特征【13 1 。 目前常用的壁材分为天然、半合成、合成的高分子材料儿大类，如明胶、阿拉伯胶、 海藻酸钠、羧甲基纤维素钠( c m c - n a ) 、邻苯二甲基醋酸纤维素、聚丙烯酸树脂等。 制备微胶囊时，壁材应根据芯材的物理化学性质来选择，如芯材为亲油性的，宜选用亲 水性聚合物作为壁材；而芯材为水溶性物质时，则应选用非水溶性合成高分子材料作为 壁材。 1 2 4 倒胶囊化方法 微胶囊化得方法有很多种，根据其原理主要可分为物理法、物理化学法和化学法三 种【1 4 1 。 ( 1 ) 化学法：界面聚合法、原位聚合法、分子包接法、辐射化学法、锐孔法( 聚 合物的快速沉淀法) ( 2 ) 物理化学法：单凝聚法、复凝聚法、油相分离法、囊芯交换法、粉末床法、 熔化分散与冷凝法、复相乳液法 ( 3 ) 物理机械法：喷雾干燥法、喷雾冷却法、空气悬浮法、挤压法、锅包衣法、 静电结合法、真空蒸发沉淀法、旋转分离法。 1 2 4 1 喷雾干燥法 喷雾干燥法是应用最广泛切实用性最强的一种微胶囊化方法【1 4 l 。其工艺是将芯材均 2 引言 匀分散于壁材溶液中，经雾化器雾化成小液滴，高温下水分快速蒸发，从而使得壁材凝 固成囊。喷雾干燥法干燥速度很快，而且物料的温度不会超过气流的温度，因此很适合 热敏性材料的微胶囊化。对于喷雾干燥法有大量关于其技术特点【1 昏1 射、壁材性质 1 9 - 2 4 及产品应用【2 5 。2 7 】的文献报道。 1 2 4 2 复合凝聚法 复合凝聚采用有两种或多种带有相反电荷的高分子材料作为壁材，将芯材分散在壁 材的溶液中，通过改变条件如p h 值等，使得相反电荷的聚合物间发生静电作用结合， 从而凝聚成囊。复凝聚过程的条件比较温和，对那些不能经受剧烈条件变化的活细胞、 不稳定物质的微胶囊化尤为适用。复凝聚法制备微胶囊需要使用两种带相反电荷的高分 子电解质做成成膜材料，经常使用的高分子电解质组合包括：明胶与阿拉伯胶( 羧甲基 纤维素、海藻酸盐、聚乙烯甲基醚马来酸酐共聚物) 、海藻酸盐与聚赖氨酸、海藻酸 盐与脱乙酰壳聚糖、白蛋白与阿拉伯胶等【2 8 】。 1 2 4 - 3 挤压法 挤压法的一般过程如下：将芯材物质分散于壁材物质形成乳状液，然后将其挤压进 入一个热的不互溶的流体中，接着迅速冷却固化芯材液滴周围的壁材；或者将乳状液挤 压进入冷的溶剂或脱水的液体浴中，当浸在液体浴中时，壁材固化剂和残余风味从微胶 囊的表面除去，接着条状的固化材料被破碎、分离、干燥。挤压法制备的微胶囊表面面 积非常小，能防止挥发和氧气的渗入，另外它的操作温度较低，对风味物质的损害小。 挤压法的美中不足是产率不高，只有7 0 左右，而喷雾干燥法可达到9 0 0 o - - , 9 5 ，而且 挤压法的成本也较高。挤压法常用的壁材是蔗糖、淀粉的混和物。 1 2 4 4 锐孔法 锐孔法是将化学法和物理机械法相结合的一种微胶囊方法。它主要以可溶性聚合物 为壁材，用聚合物溶液包裹芯材，然后通过锐孔将其加入到凝固浴中，使聚合物沉淀或 交联固化，从而形成微胶囊。锐孔法主要应用于对非水溶性的固体粉末以及疏水性液体 的微胶囊化，如药物、维生素、香料、催化剂、矿物油以及显色剂等。 在锐孔一凝固浴法中经常使用的壁材有海藻酸钠、聚乙烯醇、明胶、酪蛋白、琼脂、 蜡和硬化油脂等。还可以采用一些自交联的壁材如白蛋白、纤维蛋白原、甲基纤维素 脲醛树脂复合物等。统计结果表明，采用海藻酸盐微胶囊包埋细胞是一种最常用的包埋 系统，与它相关的文章占固定化文章的3 3 2 9 。 1 3 海藻酸盐微胶囊 1 3 1 海藻酸钠的物化特性 1 3 1 1 化学结构 海藻酸是存在于褐藻类中的天然高分子多糖，是由1 3 d 甘露糖醛酸( m ) 和q l 古洛糖醛酸( g ) 通过1 3 ( 1 4 ) 糖苷键连接成的一类线形无分支的链状阴离子聚合物【3 0 1 。 江南大学硕士学位论文 海藻酸钠是其常用的盐。它的分子结构式如图1 1 所示。 ( g )( m ) 图1 - 1 海藻酸钠的分子结构式【3 0 】 f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fa l g i n a t e 1 3 1 2 海藻酸纳的生物相容性 多聚物能否成功地作为人体的药物运输载体，其主要条件之一就是多聚物生物相容 性的好坏。目前已有很多文献对海藻酸钠的生物相容性作了充分的研究，结果表明，海 藻酸钠有良好的生物相容性，对人体无毒性、无致癌性，对组织、血液等无不良反应产 生【3 1 。3 4 】 1 3 1 3 海藻酸钠的生物粘附性 海藻酸钠的生物粘附性子粘膜给药体系中有着很大的潜在应用性。研究表明，电荷 密度较高的多聚物可以作为很好的粘膜粘附剂。由于海藻酸盐带有羧基，属于聚阴离子 多聚物，因此它被归类为阴离子粘膜粘附多聚物【3 5 1 。海藻酸盐的粘附特性有利于它作为 药物输送载体，将药物送至胃肠或鼻咽粘膜，可以增加微胶囊在粘膜组织的停留时间， 达到改善药物生物利用度的目的3 6 。3 8 1 。 1 3 2 常用的海藻酸盐微胶囊制备方法 海藻酸盐微胶囊是根据聚电解质络合原理制备的。海藻酸钠遇n - - 价阳离子或者聚阳离子时， 会发生离子转移，形成既有强度又有弹性的凝胶，由此成囊。这种方法的优点有：制备过程温和； 微囊化的生物活性物质在制备过程中活性损失很少或者不损失等。 1 3 2 1 注滴法【3 9 4 1 】 这是最早被采用、也是使用最多的一种制备方法。通常它是用带有针头或者吸管的 注射器将海藻酸钠溶液直接滴入含( 聚) 阳离子的溶液中，以制得球形的海藻酸盐微胶 囊。该方法缺点在于制得的微胶囊的尺寸较大，一般在1 0 m m 以上。另外，该方法效 率较低，不适合于大规模生产的需要。 1 3 2 2 喷雾干燥法【4 2 。4 6 】 该方法制备的微胶囊的粒径较小，可控制在1 0 1 0 0bm ；生产强度大、成本较低， 利于放大生产。但是该方法在制备过程中要经历膨胀、收缩、破裂以及其他及其复杂的 形态变化，从而导致微球形状的不规则【蛔；另外制备过程的高温也容易对敏感芯材造成 一定程度的破坏。 4 辫 备 巍。婚 引言 1 3 2 3 乳化法 乳化法有多种分类方式，如按照乳化方式可分为机械搅拌乳化法【4 7 】、超声波乳化法 4 5 1 和乳化溶剂挥发法1 4 9 】等；如按照乳化体系可分为单相乳化( w o 或o w ) 法【4 7 1 和复 相乳化( w o w 或o w o ) 法【5 0 】；如按照c a 2 + 与海藻酸钠反应进行的方向可以分为内 源乳化法【”j 和外源乳化法【5 0 】。 乳化法生产规模较大，可制备较小的微胶囊，但历经分布较宽。一般在操作过程中 会使用有机化学试剂，某些乳化方法需要使用大量的油，且油较难去除。 1 4 益生菌微胶囊制剂的研究进展和应用现状 随着人们生活水平的提高，人们开始关注健康饮食，因此，含益生菌的食品或药物 相继推出并日渐普及。益生菌制剂的研究也越来越受到重视。目前国外已有7 0 多种以 上的产品问世，其中大多数为乳制品，包括酸乳、乳粉等。我国从9 0 年代开始将益生 菌应用于各种食品、保健品和药品中，保健品生产文号的有三株口服液、昂立一号等； 药品文号的有金双歧、丽珠肠乐、益彤益生菌等；食品有各种乳制品等。另外在中国市 场上也有大量进口的益生菌制品，如妈咪爱、b l a c k m o r e s ( 片剂) 、汉臣氏益生菌、纽 利兹益生菌、养乐多等。益生菌产品受到重视，使得越来越多专家学者对益生菌微胶囊 化都进行了研究。目前用于益生菌微胶囊化的方法主要有喷雾干燥法【1 9 ，2 1 ，5 2 ，5 3 1 、相分离 法f 4 7 5 4 , 5 5 1 、界面聚合法【5 6 螂1 等。这些研究推动了益生菌微胶囊化的发展。 a p i c o t 掣1 9 】将新鲜培养物直接加入到热变性乳清蛋白中，再喷雾干燥制得微胶囊。 该方法的存活率为2 5 7 0 社0 1 。并且在奶酪的储藏性试验中( 4 0 c ，2 8 天) ，与未包埋的 菌相比，微胶囊化菌数高出了2 6 个对数值。在模拟胃液和肠液中，微胶囊化菌数高出 2 7 个对数值。e u ny a n n 掣5 9 j 利用h y b r i d i s a t i o ns y s t e m 包埋嗜酸乳杆菌a t c c 4 3 1 2 1 ， 采用益生素作为双层包埋的壁材。结果表明，采用益生素( 低聚果糖、乳酮糖和棉籽糖) 作为双层包埋的壁材使得乳酸菌有着良好的耐酸性和耐热性。在2 5 和3 7 下储藏2 0 天，微胶囊有良好的稳定性。c i y e r 等【6 0 】以海藻酸钠为壁材，益生素( h i m a i z e t m 、 r a f t i l i n e 、r a f t i l o s e ) 作为共包埋的壁材( c o e n c a p s u l a t i o n ) ，并进一步用壳聚糖进行 包埋，在i n o t e c he n c a p s u l a t o r 中进行嗜酸乳杆菌的微胶囊化。n t 舢m a n 【6 l 】等用京尼 平交联明胶后制得初始微胶囊，然后分别以内源乳化法和外源乳化法制备海藻酸钠包衣 微胶囊，并对比了两种微胶囊的耐酸及肠溶特性。 微胶囊化的方法虽然很多，但不是所有的方法都适合益生菌的包埋。它必须具备下 列条件：微囊化过程要温和，快速，不损伤细胞，尽可能流动状态和生理条件下制备； 微囊化所用试剂和膜材必须是食品级的，对细胞和人体无毒害作用；微囊要有足够的机械 强度以抵抗培养过程中的搅拌，不破裂。 1 5 立题背景和研究内容 1 5 1 立题背景 目前益生菌制剂已经越来越普及。但是多种因素影响乳制品中乳酸菌的活性，包括 5 江南大学硕士学位论文 贮存和销售过程中益生菌的死亡，以及食用过程中人胃的酸性环境的危害 6 1 o f a o w h o 建议食品干质每克含菌量为1 0 6 1 0 7 c f u ( 菌落形成单位) ，这样益生菌才能有效的发挥 益生作用【6 2 】。因此，食品中活菌数量的大量下降，不仅造成了浪费，而且很难起到真正 的益生作用。微胶囊技术被广泛应于益生菌制剂，不仅能够创造一个良好的无氧微环境， 将益生菌与氧气等外界不利因素分开，而且能保护益生菌抵抗人胃的酸性环境，顺利到 达人体肠道发挥益生作用。因此，益生菌的微胶囊化研究非常有意义，有一个广阔的发 展前景。 目前益生菌微胶囊的制备方法有很多，但是都存在一些问题，工艺比较复杂，或者 是制备过程条件比较苛刻。雾化法过程温和，便于大规模生产，操作简便，是一种有很 大潜力的微胶囊制备方法。 1 5 2 研究内容 本课题选用雾化法，以海藻酸钠为壁材，对嗜酸乳杆菌进行微胶囊化进行研究。主 要研究内容有以下几方面： 1 对雾化法制备嗜酸乳杆菌微胶囊的工艺条件进行研究，研究了不同工艺条件对微 胶囊的包埋效果的影响，并采用正交实验确定了最佳工艺条件o 2 研究了海藻酸钙为壁材的嗜酸乳杆菌微胶囊的耐酸及在人工肠液中的释放特性， 3 对比不同改进海藻酸钙微胶囊的方法，确定一种较有效的改进方法。 4 研究了海藻酸钙壳聚糖微胶囊的制备工艺，并比较与海藻酸钙微胶囊耐酸性、 释放特性、储藏特性的差异。 6 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验菌种 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ，l a ) ，本实验室保藏。 2 1 2 主要试剂 壳聚糖济南海得贝海洋生物工程有限公司；抗性淀粉 国民淀粉化学( 上海) 有限 公司；乳清分离蛋白美国g l a n b i a 公司；胰酶国药集团化学试剂有限公司；胃蛋白 酶国药集团化学试剂有限公司；吐温8 0 国药集团化学试剂有限公司；脱脂乳上海 光明乳业；其他均为a r 级试剂。 2 1 3 培养基及主要溶液的配制 2 1 3 1m r s 液体培养基1 3 】 蛋白胨1 0 9 ，牛肉浸膏1 0 9 ，酵母膏5 9 ，葡萄糖2 0 9 ，柠檬酸氢二铵2 9 ，乙酸钠5 9 ， 吐温- 8 0l m l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 8 9 ，m n s 0 4 4 h 2 0o 1 9 9 ，k 2 h p 0 42 9 ，水1 0 0 0 m l 。用1 mh c i 调节p h 值为6 3 ，l1 5 c 湿热灭菌灭菌2 0 m i n 。 2 1 3 2m r s 固体培养基 在m r s 液体培养基基础上，添加2 琼脂。l1 5 ( 2 湿热灭菌2 0 m i n 。 2 1 3 3 主要溶液的配制 ( 1 ) 人工胃液【删 胃蛋白酶3 ，n a c i2 ，用1 mh c i 调节p h 值为1 5 ，然后用0 2 2 9 i n 膜过滤除菌， 备用。 ( 2 ) 人工肠液 称取取磷酸二氢钾6 8 9 溶于5 0 0 m l 超纯水中。用0 i m o u l 的氢氧化钠溶液调节p h 至7 4 ；另取胰酶1 0g 加水适量使溶解，将两液混合后，加水至1 0 0 0 m l 即可。 ( 3 ) 0 2 mp h 7 4 磷酸缓冲液( p b ) 的配制 准确量取19 m l0 2 m o f l 的n a h 2 p 0 4 7 h 2 0 和81m l0 2 m o f l 的n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 ， 充分混合即为0 2 m o f l 的p b ( p h 约为7 4 7 5 ) 。若p h 偏高或偏低，可通过改变二 者的比例来加以调整，室温保存即可。 ( 4 ) 海藻酸钠溶液 称取1 5 9 海藻酸钠粉末，加入1 0 0 m l 去离子水，搅拌过夜使其完全溶解。 ( 5 ) 变性乳清蛋白溶液1 9 】 称取l o g 乳清分离蛋白( w p i ) 溶解于1 0 0 m l 去离子水中，用磁力搅拌器搅拌1 h ， 然后室温静置2 h ，使其完全复水。然后将该溶液在8 0 c 水浴中保持3 0 m i n 中，使其完 7 江南大学硕士学位论文 全变性，用流水使其快速冷却至室温，置于4 c 冰箱中过夜，备用。 2 2 实验仪器 压力喷雾设备上海沃迪科技有限公司；l r h 1 5 0 生化培养箱上海一恒科学仪器 有限公司；光学显微镜日本m o t i c 公司；u l t r a t u r r a xt 8 均质机德国i k a 公 司；分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司；冷冻干燥机美国l a b c o n c o 公司；激光 粒度分析仪b t - 9 3 0 0 h 辽宁丹东百特仪器有限公司；超低温冰箱美国a s h e v i l l e ， n o r t hc a r o l i n a ；电子扫描显微镜荷兰f e i 公司；压力蒸汽灭菌锅 日本s a n y o 。 2 3 实验方法 2 3 1 嗜酸乳杆菌菌种活化 取少量7 0 c 保存的嗜酸乳杆菌种于m r s 液体培养基中，3 7 c 静置培养2 4 h ，连续 传代2 3 次，使菌种完全活化。 2 3 2 茵体生长曲线的测定 将活化好的l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 按5 ( v v ) 接种至液体m r s 培养基中，3 7 ( 2 下培养，测定不同培养时间内培养液在6 0 0 n m 的o d 值。并对进入稳定期的菌液进行平 板计数。 2 3 3 浓缩茵悬液的制备 将活化好的嗜酸乳杆菌以1 0 接种量接种于3 0 0 m lm r s 液体培养中，3 7 0 c 静置培 养1 8 h 。将此培养液于4 0 c 条件下4 0 0 0 9 离心2 0 m i n 收集菌体，将收集的菌泥用无菌生 理盐水清洗2 次，再分散于3 m l 无菌水中制成浓缩菌悬液，备用。 2 3 4 活茵计数方剁舒1 吸取l m l 样品，用无菌水进行梯度稀释( 1 0 ，1 0 之，1 0 0 ) ，吸取适当梯度的 溶液1 0 0 p l 于装有m r s 固体培养基平板中，用无菌玻棒涂布均匀，然后将平板倒置于 3 7 c 培养箱中静置培养4 8 小时，观察菌落生长情况，并计数。 活菌计算公式：活菌数( c f u m l ) = 平板菌落数稀释倍数。 2 3 5 海藻酸钙微胶囊的制备工艺 将2 3 3 制备的菌悬液2 m l 加入到1 0 0 m l 海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，将料液用 蠕动泵输送到雾化器中，通过一定的压力将料液喷雾至0 1 mc a c l 2 溶液中( 图2 - 1 ) ， 搅拌固化3 0 m i n 。用w h a t m a n4 号滤纸过滤收集湿微胶囊。用无菌水清洗2 次后，一7 0 c 冷冻过夜，然后真空冷冻干燥制得微胶囊粉末。 8 材料与方法 料液一 压缩空气- - 4 i 量三三三三i 三i 图2 - 1 雾化法制备微胶囊装置示意图 f i g 2 - 1s c h e m a t i co fa t o m i z a t i o nd e v i c e 2 3 6 海藻酸钙微胶囊性能改进方法 复配微胶囊：将1 5 海藻酸钠溶液( 含嗜酸乳杆菌) 与1 5 等体积的抗性淀粉或 乳清蛋白溶液混合，室温下搅拌3 0 m i n ，使其完全混合均匀。其他工艺与海藻酸钙微胶 囊制备工艺相同。 包衣微胶囊：将2 3 5 过滤收集的海藻酸钙湿微胶囊l o g 加入到5 0 r a l0 3 的壳聚 糖溶液( p h 3 0 ) 中，缓慢搅拌1 0 分钟，用w h a t m a n4 号滤纸过滤收集湿微胶囊。用无 菌水清洗2 次。 2 3 7 海藻酸钙一壳聚糖微胶囊的制备工艺 将2 3 5 过滤收集的湿微胶囊l o g 加入到5 0 m l 壳聚糖溶液中，缓慢搅拌1 0 分钟， 用w h a t m a n4 号滤纸过滤收集湿微胶囊，用无菌水清洗2 次，7 0 c 冷冻过夜，然后真 空冷冻干燥制得微胶囊粉末。 2 3 8 微胶囊包埋效果的测定 微胶囊包埋效果的测定采用曹永梅等【删的方法进行。 2 3 8 1 微胶囊化产率、效率的测定 微胶囊化产率( m i c r o e n c a p s u l a t i o ny i e l d ) 是指微胶囊产品中芯材的含量与制备微 胶囊时初始加入的芯材含量之比，反映的是微胶囊制备过程中芯材的保留率。微胶囊化 产率受很多因素的影响，如微胶囊制备方法、芯材的状态和物理性质、壁材种类和配比 等。 微胶囊化效率( m i c r o e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y ) 是指微胶囊产品中被包埋的芯材含 量与微胶囊产品中总的芯材含量之比，它是衡量微胶囊包埋效率的重要的指标，反映有 多少芯材物质未被包埋而留在微胶囊产品的表面。影响微胶囊化效率的因素很多，它是 评价微胶囊产品质量的重要指标。 ( 1 ) 微胶囊化产率、效率的计算方法 微胶囊评价指标一般包括微胶囊化产率、微胶囊化效率以及有效载量，其计算公式 9 江南大学硕士学位论文 如下t ，傲胶囊化产率= 嵩黼l o 。 ( 2 - t ) 微胶囊化效率= 焉荔墓霎瓣。 c 2 - 2 ， ( 2 ) 微胶囊中活菌数的测定：称取微胶囊1 9 加入到9 m l 无菌p b 缓冲液( p h 7 4 ) ， 搅拌3 0 m i n 后，用u l t r a t u r r a xt 8 均质机分散1 5 s 1 6 6 1 ，使茵体完全释放，并采用 涂布平板进行活菌计数。 ( 3 ) 微胶囊表面活菌数的测定：称取微胶囊1 9 加入到9 m l 无菌生理盐水中，搅 拌3 0 m i n ，使表层及可泄露的菌体溶出，过滤收集滤液并进行活菌计数。 2 3 8 2 微胶囊有效载量的测定 微胶囊的有效载量是指被包埋在微胶囊中的芯材含量与微胶囊产品的比例。它是反 映微胶囊应用价值的一个直观指标。从应用角度来讲，微胶囊的有效载量越高越好，但 是实际上会受到很多因素的影响。计算公式如下： 有效载量= 型焉雾瓣。 c 2 3 ， 2 3 9 微胶囊物化性质的测定 2 3 9 1 微胶囊粒径的测量 取适量微胶囊分散液加入到激光粒径仪的样品池中，用水作为分散剂，搅拌均匀后， 测量微胶囊的平均粒径及其粒径分布。 2 3 9 2 微胶囊形态观察 ( 1 ) 光学显微镜观察微胶囊的基本形态 固化后的湿微胶囊基本形态用光学显微镜进行观察。取- - d , 滴湿微胶囊分散液置于 载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察其形态并拍照。 ( 2 ) 扫描电子显微镜( s e m ) 观察微胶囊的超微结构 采用s e m 观察微胶囊的表面形态时，样品制备方法如下：在样品台上贴上一层双 面胶，将微胶囊粉末轻轻撒在上面并吹去多余的粉末，然后在样品上喷金供s e m 观察， 加速电压为1 0 k v ，观察时间应尽可能短，以避免电子束长时间照射引起电子损伤。 2 3 9 3 微胶囊及其壁材的红外图谱分析 称取5 m g 样品，加入1 5 0 m g 溴化钾中，进行充分研磨，取少量研磨好的粉末，用 压片机压成透明的片状，然后将样品放于红外仪上在波长为5 0 0 - - 4 0 0 0 波数范围内进行 扫描分析。 仪器：f t 瓜s p e c t r o m e t e r ，傅立叶变换红外光谱仪 型号：n i c o l e tn e x u s 4 7 0 ，d t g s 检测器 1 0 材料与方法 扫描次数：3 2 次，分辨率：4 c m 1 2 3 9 4 微胶囊产品的d s c 分析 用差示扫描量热仪( d s c 7 ，p e r k i ne l m e r ，美国) 测定微胶囊产品的玻璃化转变温 度。取少量样品加到d s c 样品盒中，以空白为参照，以5 m i i l 的速率从2 0 加热至 2 5 0 c ，记录加热过程中的差热曲线，测定样品的玻璃化转变温度t g 。 2 3 1 0 械胶囊性能的测定 2 3 1 0 1 耐酸性实验【6 7 。6 8 】 ( 1 ) 实验组：分别称取1 9 微胶囊加入到5 个无菌离心管中，分别在o 、3 0 、6 0 、 9 0 、1 2 0 m i n 时加入9 m lp h1 5 人工胃液。加入人工胃液后，立即将离心管置于3 7 ( 2 水 浴摇床中震荡培养，在1 2 0 r a i n 时将上述离心管同时取出，并在4 0 0 0 9 条件下离心5 m i n 收集微胶囊，倾去上清液。向5 个离心管中分别加入9 m lp h 7 4 的无菌磷酸缓冲液，3 7 ( 2 震荡3 0 m i n 后，用u l t r a t u r r a xt 8 均质机分散1 5 s 【6 9 】，完全破碎微胶囊以使嗜酸 乳杆菌完全释放。分别取样用涂布平板法计算活菌数。 ( 2 ) 对照组实验：取离心收集浓缩的嗜酸乳杆菌液l m l ，加入到9 m lp h l 5 人工 胃液中，置于3 7 水浴摇床中震荡培养，分别在0 、3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 m i n 取样，稀释 适当梯度涂布平板计数。 以上实验均重复进行3 次。 2 3 1 0 2 菌体释放实验 菌体释放实验按照l e e 等【6 7 】的方法进行，并有所修改，具体如下： 称取1 9 微胶囊，将其加入到9 m l 人工肠液( 或人工胃液) 中，置于3 7 c 水浴摇床 中震荡孵育，转速1 6 0 r p m m i n ，每隔一定的时间取样0 1 m l ，采用涂布平板法进行活菌 计数。 以上实验均重复进行3 次。 2 3 1 1 储藏性实验 将冻干的微胶囊分别置于2 5 和4 条件下储藏4 周。每隔一周取样，测定微胶囊 中的活菌数，以评价其保藏特性。 以冻干菌粉为对照实验。平行进行3 组实验。 2 3 1 2 实验数据处理 实验数据用x ( 三组数据平均值) 士s d ( 标准偏差) 表示，采用s p s s1