（食品科学专业论文）海藻糖分析方法及高产海藻糖酵母菌的筛选研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 摘要 海藻糖，又名覃糖，是由两个葡萄糖残基以c 【，o 【一1 ，1 键联结而成的一种非 还原性的双糖。其分子式为c n ：o ，分子量( 舍两分子结晶水) 为3 7 8 23 。海藻 糖在生物体内除作为结构成分、提供能量以外，最重要的作用是作为一种典型的 应激代谢物，在干燥、低温、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白质、 脂类、糖类、核酸等组分不受破坏，保护细胞免受伤害。海藻糖应用非常广泛， 在食品、医疗、分子生物学和农业方面都有重要意义。 本研究旨在对海藻糖进行定性定量分析基础上，从1 6 种酵母菌中筛选出海 藻糖产量较高的菌株，并通过诱变的方法优选出优良生产菌株，以提高海藻糖产 量，且对此菌株的生长条件进行深入研究。 首先采用德国制g f 2 5 4 薄层层析板，展开剂为正丁醇：吡啶：水= 1 5 ：3 ：3 ， 点样量0 4 “g ，二次展开后用硫酸：甲醇= 1 ：4 溶液在1 0 5 显色，在此条件下 海藻糖灵敏度为0 0 4ug ，较已报道的薄层层析法提高了近5 0 倍。试验通过采用 二次展开的方法，降低了试验的成本，为预制板的普及应用打下了基础。 为便于一般实验室对海藻糖进行定量检测，本研究采用硫酸蒽酮法、旋光法 和薄层扫描法等传统方法对海藻糖进行了定量检测研究。结果表明，硫酸蒽酮法 相关系数为0 9 8 2 1 ，可以应用于海藻糖的定量检测，但因其受样品中其他糖类成 分的影响，必须用校正系数加以校正。为了能够准确定量从酵母中提取的海藻糖 含量，针对酵母的提取液，分别采用旋光法和用质谱法进行了海藻糖的定量分析。 结果表明，两者之间存在高度正相关，对应的回归方程为“y = o 6 9 7 x + 0 2 53 4 ( 旋 光度为因变量，液质联用仪测定的海藻糖含量为自变量) 。薄层扫描法定量分析 海藻糖的变异系数为1 0 左右，因此也可以作为样品中海藻糖定量检测方法。 分析方法确定之后，本研究即从实验室保存的1 2 种酵母菌和从采自长白山 温泉的土样、发酵蜂蜜中分离出的酵母菌中进行了高产海藻糖菌株的筛选。以酵 母抽提液海藻糖含量为指标，筛选出海藻糖高产酵母b - 1 5 ，经物理和化学相结合 的诱变结果，最终筛选出高产酵母z y d 一1 0 ，其菌体内海藻糖含量为15 5 2 3 m g g ， 比出发菌株提高0 8 倍。 继而对这一高产菌株从温度、培养时间和p h 值等生长条件进行了研究，最 后确立酵母菌z y d 一10 培养条件为培养温度3 2 ，培养时间2 7 小时，初始培养 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 基p h 值为6 5 。经上述条件培养后菌体海藻糖含量为17 0 7 m g g ，比出发菌株提 高了9 9 4 。 最后，本研究对诱变菌种的发酵液进行了检测，结果检测出高含量 ( 1 6 6 4 m g g ) 的海藻糖，与酵母z y - d - 1 0 胞内海藻糖量接近，这是本研究的新发 现。发酵液中海藻糖是茵体生长过程中代谢产生的，还是菌体死亡后溶出的，还 有待于进一步研究。但是，无论是哪一种原因，这一发现都将为海藻糖的生产提 供全新的途径。 综上所述，本研究在总结以往研究成果的基础上，进行大量的试验和分析， 在海藻糖的定量定性检测方面取得了一些突破。同时，试验又对酵母菌进行了诱 变处理，筛选出高产菌株，并且首次从酵母发酵液中检测出较高含量的海藻糖， 为这领域的下一步研究奠定了良好的基础。 关键词： 海藻糖定性定量酵母诱变筛选 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 a b s t r a c t t r e h a l o s ei sak i n do fi n d e o x i d i z e dd i s a c c h a r i d ec o u p l e dw i t ht o wg l u c o s eb yo ， q 一1 1b o n d m o l e c u l a rf o r m u l ai sc l 2 h “0 l i a n dm o l e c u l a rw e i g h ti s 3 7 8 2 3 ( w i t ht w oh 2 0 ) i nt h ec r e a t u r eb o d y ，t r e h a l o s en o to n l yi sas t r u c t u r e c o m p o n e n tw h i c hp r o v i d ee n e r g y ，b u ta l s oi sam e t a b o l i z e ds u b s t a n c ew h i c h canp r o t e c tt h ep r o t e i n ，t h ef a t ，t h eg l u c i d ea n d t h er l u c l e i ca c i di n c r e a t u r ec e l la td r y ，l o wt e m p e r a t u r e ，h i g hp e r v a s i v ec o n d i t i o na g a i n s t d e m o l i s h i n g t r e h a l o s e h a s g r e a t p o t e n t i a l f o r a p p l i c a t i o n i n f o o d ，m e d i c a lt r e a t m e n ta n da g r i c u l c u r e t h en a t u r ed e t e r m i n a t i o no ft r e h a l o s et h r o u g ht l ci ss t u d i e d f i n a l l y t h ee x p e r i m e n ts e p a r a t eg l u c o s e ，s u c r o s e ，m a l t o s et r e h a l o s eb yu s i n gg f 2 5 4 t l cb o a r d ( f r e n c h ) t h e s a m p l e i s s p r e a d e d i n1 i q u i dw h i c hn bu t y l a l c o h 0 1 ：p y r id i n e ：w a t e ris1 5 ：3 ：3 ，a f t e rs e c o n ds p r e a d i n g ，d e v e l o p i n ga t 1 0 5 。ci nl ip u i d1 1 2 s 0 1 ：c i i i o = l ：4 ，l h es e n s i t i v i t yi s0 0 4 ug t h ee x p e r i m e n ta l s os t u d yf i xq u a n t i f ym e t h o di nl a b t h er e s u l ts h o w t h a ta n t h r o n ec o l o r i m e t r i cm e t h o d ，o p t i c a lr o t a t i o nm e t h o da n dt l cm e t h o d a 1 1canf ixt r e h a loseq u a n t jf y m i c r o z y m eb 一1 5i sf l l t e r e df r o m1 2m i c r o z y m ec o n s e r v e di nl a b o r a t o r y a n di s o l a t e df r o mh o t s p r i n g i nc h a n g b a im o u n t a i i 3a n df e r m e n t i v e h o n e y m i c r o z y m ez y d i o ，a b t a i n e d f r o m m u t a g e n i z i n gb - 1 5 ，c o n t a i r l 1 5 5 2 3 m g g ，w h i c h i s0 8m o r et h a nb - 1 5 t h ec u l t u r ec o n d i t i o no f m i c r o z y m ez y d l o i ss t u d i e d t e m p e r a t u r e 3 2 0 c ，ti m e2 7 h ，p h6 5 a f t e rc u l t u r i n g ，t r e h a l o s ec o n t e n ti n t h ey e a s t e x t r a c ti s1 7 0 7 m g g w h i c hi sm o r e9 9 4 t h a nt h ei n i t i a ls t r a i n t h ee x p e r i m e n tf i n da n t h e rw a yt op r o d u c et r e h a l o s et h r o u g h t e s t i n g y e a s t i n o s sw h i c hh a sh i g ht r e h a l o s ec o n t e n t a tt h es t u s yo fm e t h o do fd e t e r m i n a t i o nt h en a t u r ea n df i xq u a n t i f yf o r t h et r e h a l o s e t h i se x p e r i m e n ts c r e e nt h es t r a i nw h i c hh a sh i g hp r o d u c t i o n f r o m1 6k i n d so fy e a s t s t h er e s e a r c h f i l t e r e dt h es t r a i nb ym u t a g e n i z e d m e t h o d ，a n dp i l o ts t u d yt h ec u l t u r ec o n d i t i o no ft h es t r a i n 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 t os u mu pt h ea n c i e n t l yr e s e a r c h f u lf r u i t ，t h ee x p e r i m e n t a t i o nm a k es o m e b r e a k t h r o u g ha tt r e h a l o s en a t u r ed e t e r m i n a t i o na n dq u a n t i f yf i x e dt h r o u g h a b u n d a n tt e s t sa n da n a l y s i s t h ee x p e r i m e n td e t e c th i g ht r e h a l o s ec o n t e n t i nt h el i q u i d o fy e a s tf e r m e n t a t i o na n df i n daneww a yf o rt h ec o n t i n u i t y o ft h et a s k k e yw o r d st r e h aoseq u at a tv ea n a l y s i sq u a n t i f i c a t i o ny e a s tm u t a g e n i z ef i l t e r 独创性声明 本人声| 9 j 所呈交的学位i ：仓文足本人在导7 j l i7 1 7 导下进 7 i l ；j t j 7 1 ：究工作及i 仪谢f j 0 蛾究戏裘。锻我疆妇，滁了文r t l 特爨翮以括注矧致i f f l f l s 地方姊，论文t | ，l i 色禽l 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为扶得i 墨林农业大学或1 i d 也救阿机 稔熊学位汪书甄餐翊遥豹材瓣。与我一澍工作豹同志对本镢究掰骰瓣任何负黻均 已在论文一 i f l ；了l 见伽的浇l ! l ：i ， ：农示谢意。 学位鲶文作者躲名：牮卜爿冬麦l签字| _ | j 辨：正。多年，夕 学位论文版权使用授权书 率学位论文于1 ：者完全了解吉林农业大学有关保留、使川学位论文n 勺舰定，即 t ；林农、l k 火靠权像魁，l 二囱幽家警f 关部f 1 或搬瓿邀交沦文驰复t ： 1 f i , f - i i 磁盘，灸y l ： 论文被偷阋和似阅。水人授权吉林农、i k 火学可以将学位沦文的个部或部分ij 、j 样编 入彳f 天数摄跨送 j ：检索。w 滋采j 1 j i t l t 、臻印或霸搽等互乏麓手段豫办、7 1 鳊、俺 沧义。( 保密位沦文赴解崧届适川本授权“ 学位途文镬；者签舅：前红 签。刊例：咖。j t i 艇f 加 学位沦文 ：嚣t i i k 霸支翔 ；l _ f l ：吖：l 位：吾槲收盐心乞馐谶工幢蟮屺 _ j j j l i j 川i i ：毫椰移好“进工刚阻 u | i l | 5 编：7 0 彦 影一断 涮渺 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 刖置 海藻糖是一种稳定的非还原性双糖，在自然界中广泛存在。细菌、酵母、 真菌、昆虫和植物中都发现海藻糖。人体内不能直接合成海藻糖，但从食物中摄 取的海藻糖被小肠黏膜和肾脏的酶所分解。隐生生物中海藻糖的含量非常高，有 的含量竟达到细胞干重的3 5 。常见的隐生生物即是我们常见的活性干酵母。研 究表明”1 ，海藻糖在生物体内除了作为结构成分，提供能量以外，最重要的作用 是作为一种典型的应激代谢物，在干燥，低温，高渗等许多环境条件下保护生物 体细胞内的蛋白质、脂类、糖类、核酸等组分不受破坏，保护细胞免受伤害。 海藻糖的这种作用不仅在体内发挥作用，而且在体外同样发挥作用，由于外源性 的海藻糖同样对生物大分子有良好的非特异性的保护作用，因此近年来有关海藻 糖的研究倍受关注。 1 海藻糖的基本概况 1 1 海藻糖的理化性质 海藻糖( t r e h a l o s e ) ，又名覃糖( m y c o s e ) ，是由两个葡萄糖残基以a 。a l ，1 键联结而成的一种非还原性的双糖。其分子式为c 。：h 。0 。分子量( 含两分子 结晶水) 为3 7 8 2 3 。海藻糖的分子结构如图l ： 图l ：海藻糖的分子结构 f i g i ：m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f t r e h a l o s e 海藻糖”1 1 能溶于水和热醇中，不溶于乙醚；甜味较弱，为蔗糖的4 5 ，其熔 点( 两个结晶水) 为9 7 。c ，将其加热到1 3 0 。c ，海藻糖失去结晶水，形成无水结 吉林农业大学硕士学位论文海藻搪分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 晶体，熔点可达2 1 4 2 1 6 ，其水溶液性质稳定，无色无味。海藻糖和蔗糖是 同分异构体，又具有类似的结构，经常在生物体中同时存在。海藻糖旋光度为 n 2 。0 = 1 7 8 0 ( 2 0 。c 1 水溶液) ，海藻糖化学性质稳定，几乎不被一般的酶所水 解，只为具有特异性的海藻糖酶水解。 1 2 海藻糖生产方法 1 2 1 生物抽提法 利用海藻糖含量较高的一些微生物，采用适当的方法进行抽提。酵母中约含 1 0 一2 0 的海藻糖( 对于干物质计) ，故可利用面包酵母，啤酒酵母为原料，在一 定温度下采用三氯醋酸等有机溶剂抽提出海藻糖。同本科学家”1 用紫外线或亚硝 基胍诱变获得一株海藻糖营养缺陷型菌株，产率较高。 1 2 2 发酵法生产 用一定的基质培养微生物，通过微生物发酵法生产海藻糖，再由培养液中精 致而得。郑玉娟”3 等从长白山天池冷水中分离出一种菌，此菌种的发酵液中可检 出海藻糖。 1 2 3 酶法生产 以葡萄糖，蔗糖或麦芽糖等为底物，通过不同的酶催化，生成海藻糖。到目 前为止，发现的有应用价值且适合工业化生产的酶有“4 1 ： 1 2 3 1 海藻糖合成酶 海藻糖台成酶 麦芽糖海藻糖 在水生栖热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 中海藻糖合成酶相对分子量1 0 5 ，等电 点2 3 ，最适p h 为6 5 ，最适反应温度6 5 。在3 0 - 4 09 c 时合成率8 0 一8 2 。该 酶热稳定性好，有利于酶的保存。较高反应温度可防止杂菌污染，而且反应简单， 底物麦芽糖价格便宜，适合于工业化生产。脂肪杆菌( p i m e l o b a c t e rs p ) ，恶 臭假单孢菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) ，水生栖热菌( t h e r m u sq u a t i c a s ) 等都含有 此酶。 1 2 3 2 低聚麦芽糖寡糖基海藻糖合成酶( m t s a s e ) 和低聚麦芽寡糖基海藻糖基 水解酶( m t h a s e ) 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 ( c 洲。o - ) 。 坚! 翌! 呈一文c 枷魄) 。一t r e h a l o s e ( n 3 ) m t h a s e ( c 6 h 1 1 0 s ) 。一2 一t r e h a l o s e ( c 。h i i o s ) 。一2 + t r e h a l o s e ( n 3 ) ： 节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) 3 6 中发现的低聚麦芽寡糖糖基海藻糖合成酶 ( m t s a s e ) 和低聚麦芽寡糖基海藻糖基水解酶( m t h a s e ) ，两种酶的协同作用才 能将麦芽寡糖转变成海藻糖。但m t s a s e 的底物特异性是，麦芽糖本身不能作底 物，对麦芽三糖的作用较差，而对麦芽三糖以上的麦芽寡糖都可以作用。 k a t o “”等发现嗜酸嗜热古细菌，硫矿硫化叶菌( s u l f o l o b u ss o l f a t a r i c u s ) k m l 的无细胞匀浆物可将可溶性淀粉转化为海藻糖，其反应机理同m t s a s e 和 m t h a s e 相似，是新型葡萄糖基转移酶和新型a 一淀粉酶。 1 2 4 基因重组法 采用分子生物学技术，通过基因重组的方法，构建转基因植物生产海藻糖成 为一个时期的热点。荷兰植物生物技术公司曾将大肠杆菌的海藻糖合成酶基因导 入甜菜，马铃薯中，获得海藻糖。 2 海藻糖的应用前景 海藻糖的独特的生物学特性，使其在分子生物学，医学，食品工业，化妆品 工业，农业等领域有广l ；i i 的应用盼景。 2 1 食品工业中的应用“”町 海藻糖是一种能改善干燥加工食品质量和风味的天然食品添加剂，如果有廉 价来源的海藻糖，对它的需求可能扩展到很多方面。表1 举出海藻糖在食品中的 部分应用实例： 表1 ：海藻糖在食品中的应用 作用应用范围 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 抗淀粉老化剂 低吸湿剂 蛋白抗变形剂 低成色剂 口感改良剂 抗干燥剂 保鲜剂 糯米点心，面条等 脆饼，加餐点心，营养糖，保健食品等 鱼制品，肉制品，蛋制品，乳制品，面团等 无油蛋糕，甜饼，火腿等 冰淇淋，调味料，咖啡用糖等 干燥食品加水复原 新鲜蔬菜，水果，肉类等 2 2 医疗中的应用 海藻糖在医疗方面用途非常广泛。用海藻糖作保护剂干燥的抗体，血小板， 酶，病毒，淋巴细胞等生活活性物质无需冷冻，复水后，均能恢复活力。海藻糖 代替血浆作为生物制品的稳定剂，不仅能常温存放，而且还可以防止因血源引起 的乙肝，爱滋病等致命疾病的传播，从而保证生物制品的质量和安全性“”。 黄成根“”等研究海藻糖对医用诊断工具酶具有保护作用，利用海藻糖作为诊 断酶稳定剂，可置于常温，干燥下保存，不仅能简化酶制剂的制备，特别是给农 村等偏远地区的疾病诊治带来方便。 2 3 分子生物学上的应用”们 c a m i l o 等将d n a 限制性内切酶，d n a 连接酶和d n a 聚合酶在含海藻糖 1 0 一1 8 的缓冲液中，于3 7 或室温下通风干燥几个星期，发现完全可保存其活 性，而且在7 0 下保存3 5 天后，仍可以准确地切断d n a ，这是其他种类保护剂 都达不到的效果。这种技术可能推出自动化的带干池或干p c r 反应试剂盒等新型 生化工具。 2 4 化妆品工业中的应用 海藻糖保湿性强，稳定性高。它可用于皮肤化妆品，如作为沽肤剂，皮肤保 湿剂，紫外吸收剂，口红，唇膏的品质改良剂，稳定剂。海藻糖的脂肪酸衍生物 还可作为优良表面活性剂，用于各种皮肽化妆品或香波配方中。 2 5 农业中的应用 海藻糖的无水结晶在r h 3 0 以上环境中有吸湿性，在种子包衣剂中掺入适量 4 的海藻糖可以提高作物的抗旱能力。通过生物技术构建含海藻糖的转基因植物， 不仅提高作物的抗旱能力，而且能使作物在收获加工之后显得更新鲜，更具风味 m 】。这种转基囟植物将有可能为改造沙漠、绿化荒地作出重要贡献。 3 本论文的立题意义及研究内容 3 1 立题意义 目前，国内对海藻糖的生产研究报道较多，但还没有以玉米淀粉为原料进行大 规模的工业化生产的实例，主要原因是生产成本高，缺乏适合工业化生产的菌种。 本研究通过物理、化学方法进行诱变，筛选出生产海藻糖的菌株，为进一步通过 细胞融合、基因克隆等生物技术获得工程菌，进而为玉米淀粉作原料生产海藻糖 的工业化生产奠定基础。 3 2 研究内容 ( i ) 海藻糖定性定量检测方法研究 ( 2 ) 筛选高产海藻糖的酵母菌 ( 3 ) 菌种培养条件研究 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 正文 1 海藻糖定性检测方法的研究 海藻糖为非还原性双糖，化学性质非常稳定，用常规的分析方法很难检出，国 内外有很多关于这方面的研究报道u ”5 ，。薄层层析法m ，是目前用于单糖、低聚糖 定性检测的比较常规的方法，也称薄层色普法，属于平面色谱法范畴。薄层层析 法是将固定相于玻璃等载板上涂稚成均匀的薄层，将被分离物质点在薄层的一端 置于展丌剂中，展丌剂( 流动相) 借毛细作用将样品从薄层点样的一端展丌到另一 端，在此过程中不同物质可以得到分离。按固定相的不同，薄层层析法可分为吸 附薄层法、分配薄层法，离子交换薄层法以及凝胶薄层法等。 薄层层析法具体操作方法见图2 0 l 匝亟亟丑 样品的制备一l 一薄层板预平衡 困 l 互 ll 圈圜 图2 ：薄层层析法操作过程 f i 9 2 ：o p e r a t i o np r o c e s so ft l c 薄层板分为手工制版和预制板，手工制版又分为不含黏合剂的软板及含黏合 6 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 剂的硬板两种；预制板不仅使用方便，而且薄层质地非常均匀，所以分离的效果 以及定量重现性等方面比手工制的薄层好。 样品通过薄层分离，并用适当方法定位之后进行定性，定性的方法一般有： ( 1 ) 斑点的r f 值 在一定条件下，r f 值应该是常数，但由于薄层色谱是开放式、不连续的离线 操作，因此除固定相、流动相有一定规范外，不同的操作技术、操作环境( 如温 度、湿度等) 的影响，对r f 值有较大的影响，因此每次定性必须随行对照品。 ( 2 ) 斑点的显色定性 在自然光下观察斑点的颜色或在紫外灯光下观察斑点的颜色或荧光，或用专 属性显色剂显色后，斑点显色的情况与对照品比较可以定性。 1 1 材料与方法 1 1 1 材料 薄层层析板：s i l i c ag e l6 0g f 2 5 4 2 0c m * 2 0 c m德国m e r c k 制 试剂：海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、9 5 乙醇、正丁醇、f 丙醇、吡啶、 冰乙酸、浓硫酸、甲醇，以上试剂均为分析纯级 样品：实验室自制 1 1 2 方法 ( 1 ) 将海藻特、葡萄糠、麦芽糖、蔗糖分别溶于乙醇溶液中，浓度均为 0 4 m g m l 。 ( 2 ) 硫酸和甲醇配制成1 ：4 的溶液，作为显色剂。 ( 3 ) 将薄层板用剪刀剪成5 c m * 7 c m 大小，放入干燥箱中待用。 ( 4 ) 点样：点样距底边l c m 左右，边点样边吹干，点样点直径不超过2 m m 。 ( 5 ) 展丌：先将展丌剂倒入层析缸中使之饱和，再将薄层板置于层析缸进行展 开，展开剂前沿到距板l c m 时停止展丌，记录展丌时问和展丌剂前沿位置。 ( 6 ) 显色：经展丌过的薄层板自然晾干后，快速浸入盛有显色剂的容器中，取 出、晾干后置于1 0 5 的干燥箱中加热使之显色。 1 2 结果与分析 1 2 1 点样量确定试验 将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖标样各点在薄层板上，点样量为0 1p1 、 0 2 u1 、0 4ul 、0 6 ul 、0 8 1 tl 、1 0 “l 、2 0 ul ，用显色剂显色。试验结果 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 见图3 。出图3 可以看出此薄层板的灵敏度非常高，0 1ul 即0 0 4 扯g 的点样量 都显色很好，从斑点的大小，清i i i i 度综合考虑，本试验点样量确定为1 0 “l 即 可。 。 从上到f 点样姑为2 0 、1 0 、0 8 、0 4 、0 2 、0 1u1 ，其浓度为0 4m g m l 图3 ：不同点样量显色结果 f i 9 3 ：d e v e l o p i n gr e s u l to fd i f f e r e n ts a m p l eq u a n t i t y 8 i 2 ，2 震弹方法戆确是： 腿开方法有许多，本研究采用上行展r 丌法，其预试验结果表明一次臌- 丌的r f 值 毙较夺，( 小于0 1 ) ，瓣忿避霉亍二次、三次惩开。惩显惫裁显饿嚣瓣窀其甜篷。 试验结果觅表2 。 表2 震西次数辩骶德黪影酾 t a b l e 2 ：e f f e c to fs p r e a d i n gt i m e st or f i 5 3 5 6 0 0 2 5 5 0 。4 0 3 0 4 7 6 1 8 8 o 。2 9 0 0 3 5 0 氇t 6 6 0 。2 6 0 o 3 1 1 0 ，1 4 5 0 。2 2 5 0 2 6 8 注：展开触：正j 醇：冰醋酸：水= 4 ；1 ；5 痘表2 霹戬潘出箍辫震歼次数豁增期，艇值媳涎之增大，毽是掰菝费豹辩蔫 也髓之增加。综合考虑艏确定正式试验的腻丌次数为2 次。 2 ，3 蓑嚣蘩遥攥试验 将薄板放入盛有不用展丌剂豹鼷析缸中，进行二次展开，用显色荆i 盥色后 灏囊其酲谯。试验结杀燕表3 ；簌袭褥壤判鼗曩开蘩4 耪震嚣裁? 露疆种稳瓣分 离效果比较好，特别是展开剂7 可以把麦游糖和海藻糖的r f 差值增大，分离度 好。 袭3不同臆开剂对r f 德的影响 t a b l e 3 ：e f f e c to fd i f f e r e n ts p r e a d i n ga g e n tt or f 9 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 展丌剂1 ： 展开剂2 ： 展开剂3 ： 展开剂4 ： 展丌剂5 ： 展丌剂6 ： 展开剂7 ： 展开剂8 ： 正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：l ：5 j 下丁醇：冰醋酸：水= 4 ：1 5 ：2 5 正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：1 1 ：2 9 正丁醇：吡啶：水= 6 ：4 ：1 正丁醇：冰醋酸：水：毗啶= 4 ：l ：5 ：l 正丁醇：并醋酸：水：吡啶= 4 ：l ：5 ：3 正丁醇：吡啶：水= 1 5 ：5 ：3 正丁醇：吡啶：水= 1 5 ：5 ：2 1 2 4 混合样品的分离 将混合样品与四种对照标样在上述确定的条件下展丌，即点样量1 0ul ，展 丌剂为正丁醇：吡啶：水= 1 5 ：5 ：3 ，二次展开，其结果见图4 、图5 。图4 、图5 从可 以看出在此条件下四种标样糖分离非常清晰，无重叠现象，无拖尾现象，且混合标 样中的海藻糖完全可以通过薄层层析法加以定性。 1 葡萄糖2 蔗糖3 海藻塘4 麦芽糖5 混合标品 图4 ：混合标品薄层层析结果 f i 9 4 ：t l cr e s u l to fm i x e ds t a n d a r ds a m p l e 0 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻耱酵母茁株的筛选研究 1 葡萄糖2 蔗糖3 麦芽糖4 海藻糖5 样晶6 样品 样品薄层层析结果 t l cr e s u lto fs a m p l e 薄层色谱法定性海藻糖方法，是近几年来海藻糖分析常用的方法。但以往薄 层板均为自制板，因为加入黏合剂影响分离和显色，一般都不加入，这样就增加 了试验的难度和降低了准确性。本研究第一次使用预制板进行试验，虽然提高了 成本( 一次试验费用约1 5 元) ，但却提高了试验的效率和准确度。自制板一次 展丌时问为2 h 以上，预制板只需3 5 m i n ：自制板很难同时分丌四种糖，特别是麦芽 糖和海藻糖，预制板就能非常清晰的将四种糖分丌，而且重复率高：自制板的灵 敏度为2 0ug 。预制板的灵敏度为0 0 4l lg ，灵敏度提高了5 0 倍。使用预制板 的另一优点是可以用薄层扫描仪定量，准确率高达9 0 。 本研究中效果最佳的展丌剂7 即正丁醇：吡啶：水= 1 5 ：5 ：3 ，不仅使海藻 糖r f 值增大，对其他糖的分离效果也相当清晰，证明此展丌剂可在较大范围内 用于糖的分离鉴定。 海藻糖的定性检测还可以用液质联用仪来进行。液质联用仪是用液相色谱仪 分离样品组分，用负离子质谱( e s i 一) 检测，获得被测组分的色谱图和质谱图。 5： 图面 n 沦讨 3i 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 出于液质联用仪很昂贵且检测费用办很高，一般在产物最后验证阶段彳使用。 2 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 2 海藻糖定量方法研究 目前，定量海藻糖的方法主要有物理方法，化学方法，物理化学方法，生物化 学方法等四种方法”1 。物理方法主要有旋光法：化学方法有斐林试剂法：物理化学 方法是实验室最经常用的方法，如葸酮比色法、纸层析法、薄层层析法和高压液 相色谱法等；王兰啪1 等进行酶法分析海藻糖的研究，取得较好的结果。本研究主 要目的是筛选出海藻糖生产的高产菌株，因前期工作是对菌体内及发酵液中海藻 糖进行简单、快速、准确的实验室检测。为此，对上述方法进行了大量的筛选性 检测试验，从而建立了比较理想的与本研究相关的海藻糖定量检测方法。 2 1 主要仪器 薄层扫描仪 自动数显旋光仪 7 2 2 可见光分光光度计 高效液质联用仪 2 2 试验方法 2 2 1 硫酸蒽酮法“7 1 将少许分析纯( a r ) 海藻糖放在小表面皿置于干燥箱内，7 0 ，干燥2 小时，取 出后放在一个小干燥器内，冷却。准确称重2 0 0 m g 海藻糖，用蒸馏水溶解、稀释， 并定容到l o o m l 。 取9 支血糖管，分别依次加入0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 、1 2 、1 4 、1 6 、 1 8 m l 海藻糖溶液、2 m l 水以及3 m l 硫酸一蒽酮溶液，沸水浴反应l o m i n ，冷却， 最后在6 2 0 h m 处测定其吸光度。 准确称取样品5 0 m g ，溶于蒸馏水中，定容至l o m l ，取2 m l 样品溶液与3 m l 硫 酸一蒽酮溶液，在沸水浴反应l o m i n ，冷却后在6 2 0 h m 处测定其吸光度( 通过液质 联机测定已知样品的海藻糖含量为2 3 1 m g g ) 。 2 2 2 旋光法“” 将1 2 种新鲜酵母培养后离心，取沉淀酵母加热灭酶后用乙醇提取海藻糖， 经真空浓缩去醇，用微滤膜( 0 2 2 肚m ) 过滤，滤液用蒸馏水定容至2 5 m l ，最后用旋 光仪测定其旋光度。 2 2 3 薄层层析法。” 取待测溶液依次点在薄层层析板上，点样量为lul ，经展开( 展丌剂：正丁 醇：吡啶：水= 1 5 ：5 ：3 ) 、显色( 显色剂：硫酸：甲醇= l ：4 ) ，最后用薄层扫描 仪在4 5 0 n m 下扫描。 2 3 结果与分析 2 3 1 硫酸蒽酮法测定海藻糖 葸酮比色法是目前常用的测定糖含量方法，其原理是糖类在硫酸作用下，脱水 生成糠醛或甲基糠醛，然后葸酮与糠醛或甲基糠醛经脱水缩合，产生蓝绿色的糠 醛衍生物，颜色的深浅可作为定量的依据。海藻糖与硫酸蒽酮溶液反应后测定的 结果见图6 ： 00 4 0 81 21 622 4 2 8 3 2 3 6 海藻糖m g 图6 ：硫酸蒽酮法测定海藻糖的结果 f i 9 6 ：t h ec o n s e q u e n c eo ft r e h a l o s e m e n s u r a t i o no nu s i n ga n t h r o n ec o l o r i m e t r i c 统计分析结果，海藻糖的含量与吸光度之间相关系数为0 9 8 2 1 ，经t 检验差异 极显著，取海藻糖量( m g ) 为自变量( x ) ，吸光度为因变量( y ) ，计算出回归方程 如下： y = 0 2 4 5 6 x + 0 0 4 9 3 因为样品中还存其他糖类物质，需要校正系数来校正，校正后的方程式为： “y = o 3 2 9 7 x + 0 0 6 6 2 4 l 8 6 4 2 o o o o 0 o n o o o 吉林农业大学硕士学位论文海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 2 3 2 旋光法测定海藻糖 旋光法也是测定多糖中常用的实验方法，其优点是操作简便、节省时间。而且 不需要标样。海藻糖的比旋光度比一般的单糖、低聚糖都要大( 海藻糖的旋光度 为1 7 8 。) ，可以考虑用旋光法测定海藻糖的可行性。本试验主要针对酵母菌胞内 海藻糖含量的研究，因此主要对酵母体内海藻糖含量测定方法进行了研究。表4 列出了旋光法和液相质谱法( h p l c g c ) 分别测定酵母体内海藻糖含量的结果。 表4 ：旋光法测定海藻糖的结果 t a b l e 4 ：t h ec o n s e q u e n c eo fm e n s u r a t i o no nu s i n gp l o a r i m e t e r 其中h p l c g c 的检测条件为： 流动相：乙晴：水= 6 5 ：3 5 流速：i m l m i n 柱后分流比：i ：i 料代表0 0 l 水平显著 吉林农业大学硕士学位论文 广 海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 结果表明，旋光度与海藻糖含量有高度的正相关，因此完全可以用旋光法测 定酵母菌体内海藻糖含量。以海藻糖含量为自变量，旋光度为因变量计算出回归 方程如下： y = o 6 9 7 x + 0 2 5 3 4 在以后的试验中可以直接应用回归方程计算出酵母内海藻糖的含量。 2 3 3 薄层扫描法定量海藻糖 薄层层析法定量有几种方法，如洗脱法，扫描法等。沈脱法是指将斑点用一 定的洗脱剂洗脱下来，再用物理化学方法进行定量，但结果受沈脱剂、沈脱情况 等诸因素的影响，影响测定结果。扫描法是指将显色后的薄层上各组分的斑点用 薄层扫描仪进行斑点的色谱扫描，根据斑点面积或峰高与已知量的对照品比较以 进行定量。 定量方法常使用外标一点法： 业：韭 c ”v ”s ” 式中：ck 一标准品浓度( ug u1 ) c + * 一样品浓度( 1 jg 肚1 ) v “一标准品点样体积( u1 ) v i ￥一样品点样体积( u1 ) s “一标准品峰面积值 s t 一样品蜂面积值 表5 、表6 分别表示标准海藻糖和样品经展- 丌后薄层扫描的结果。 结果表明，预制板薄层扫描法测定标品的变异系数为1 0 3 ，样品测定误差为 7 7 9 。 表5 ： 海藻糖标品4 次薄层扫描的结果 t a b l e 5 ：t l cs c a nr e s u l to ft h es a m ec o n t e n tt r e h a l o s e 注：海藻糖晕均为0 4ng 6 吉林农业大学硕士学位论文 厂 海藻糖分析方法以及高产海藻糖酵母菌株的筛选研究 表6 ： 薄层扫描法与液质法测定样品结果 t a l e 6 ：t h er e s u l to ft l cs c t na n dh p l c g c 2 4 讨论 硫酸蒽酮法是以反应中产生的蓝绿色的糠醛化合物颜色深浅作为指标的一 种定量方法。此法具有操作时间短，减少误差等优点( 试验的相关系数达到 0 9 8 2 ) ，但被测样品往往为多种糖的混合物，因此，用硫酸蒽酮法测定海藻糖时 必须用校正系数来校正。旋光法是测定酵母菌体内海藻糖含量的最佳方法，也可 以用在其他菌体的海藻糖含量的测定，但对其具体的条件有待于进一步摸索；薄 层扫描法虽然试验误差较大，但是可以在定性的基础上直接进行定量，简化试验 步骤，若熟练操作可以将误差减少到5 以内。 查整壅墼丕兰疑圭茎笙浚塞 ，： 篓蕉整坌堑巍造堕壅燕苎壅墓整蹩堡董蓬篓塑垫叠塞 3 离产海藻耱酵母萤筛选及英培养祭件研究 3 材料筠方法 3 1 供试菌种 实验蜜保存的1 2 种酵母蘸和从长白山激泉、发酵蜂蜜中自彳予分离出灼酵母 替 3 1 2 培养鏊 ( 1 斜鬻壤养鏊：疆羚培葵基 黼萄糖4 0 克蛋自胨1 0 克酵璐谢5 党 k h 。p o , 5 毙 糖s & ? h 砖2 毙 农1 0 0 0 毫舞琼鼹2 0 克 ( 2 ) 静予培养蒸 麓萄糖4 0 克蛋白胨l o 嵬酵母膏5 党k h ；p o , 5 宠 魄s 镶? ：o2 觉承1 0 0 0 畿舞 ( 3 ) 摇瓶培养纂：马铃薯、葡萄糖琼月臀培养基 联去蔽黪骂铃麓2 0 0 竞甥成，l 、块，黧永1 0 0 0 繇舞煮沸3 0 癸辩，滤去马耱蓦 块，将滤液补足至1 0 0 0 毫升，加葡萄糖2 0 克，灭筒。 3 ， + 3 役器辩设鼋 ( 1 ) 电热恒温培养箱h g 3 0 3 型南京试验仪器厂 ( 2 电热僵洹予燥耱h g 2 0 2 誉南京试验蔽嚣厂 ( 3 ) 手撬式压力蒸汽消毒锅y x q s g 4 1 2 8 0 上海华绒医用核子有限公司 ( 蓬) 电热僵瀑承浴籍 嚣。s ￥ 黥索毒旋风仪器投表公镯 ( 5 ) 承涤僵温摄荡器p s h z 一3 0 0淀棼太仓市试验设备厂 ( 6 ) 分光先度计7 2 2 凝国东蓠密分轿仪器厂 ? ) 凝转蒸发纹r e - 5 2 c s 上海翌袋生纯纹嚣厂 ( 8 ) 高效液谱磺潜联1 穰 l1 0 0 n - 1 9 4 6 a g il e a c ( 9 ) 光学显微镜o l y m p s翔本 ( 1 0 ) 酸麟话p h s 3 c上海雷磁仪器厂 ( 11 ) 高速离心机l g l o 2 4 a i k 寨医用离心规厂 ( 1 2 ) 宅予天平 b s 一2 l o s ( 1 3 ) 电畎撤 r c t x t t 广州鹾特尔电欢撤厂 ( 1 4 ) 酝办菠拌器8 5 2 整 主海仪表 集甏 供镑公司 ( 1 5 ) 超净工作蠹 s 獬一c j l f苏净嶷翅安泰公司 ( 1 6 ) 獯爆瘩寞空浆s h b - b 9 5 瀑娟长城摹墨王燹毒羧公司 吉林农业大学硕士学位论文 厂 海藻穗分析方法哒丛壹生鲞墓塑壁壁堕竖煎熊垄壁塞 ( 1 7 ) 层析缸 ( i 8 ) 移液器 ( 1 9 ) 薄层扫描仪 ( 2 0 ) 自动数显旋光仪 3 1 4 一般试验流程 斜面种子 1 种子培养 l 2 0 0 - 1 0 0 0 1 11荷兰进口 c s 一9 3 0同本岛津 摇瓶细胞培养 l 细胞液离心( 5 0 0 0 r p m ，l o m i m ) l 细胞沉淀 上清夜一无水乙醇沉淀一离心一上清夜用0 2 2um 微滤膜滤 l l 热处理( 1 0 5 。c ，1 小时) 测定( t l e 、h p l c g o ) l 抽提( 3 0 乙醇，2 0 m i m ) 4 离心( 5 0 0 0 r p m ，lo m i m ) 、刍 上清夜真空浓缩去醇 沉淀干燥( 1 0 5 、2 小时) ll 浓缩液用0 2 2 l am 微滤膜过滤 称重 l 测定( t l e 、旋光法、h p l c g c ) 图7 ：试验流程图 f i 9 7 ： f l o wc h a r to ft e s t 1 9 巍签壅些杰堂塑主堂照造塞旌墓整坌题查鎏坠热萋查蓬燕篓墨堕然堕塑垫篓錾 3 1 5 试验方法 3 。1 。5 。 酵母藿髓内海藻糖提取嵬法瑚1 称取干酵母l o g ，1 0 5 热处理l 小时，在定条件下提敬，离心 ( 5 0 0 0 r p m ，l o m i m ) ，上消夜真空浓缩去醇，用0 2 2 hi l l 微滤膜过滤，定容至5 0 m 。 海藻糖的测定方法采用旋光法。 3 1 5 2 菌种活化及纯化“” 麸绦藏豹裁疆种予中取一夺臻接入翻装舂程| 子培养蓥翡平叛中，蕊线势离攀 菌落，3 0 培养2 4 小时。