（食品科学专业论文）柑橘果皮类胡萝卜素提取鉴定及其在果皮成熟储藏中变化规律研究.pdf

柑橘果皮类胡萝h 素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 摘要 柑橘类水果是全世界最大宗产量的水果之一，皮渣作为其主要副产物占柑橘总 量的2 0 4 0 。柑橘果皮中含大量的功能性物质，如类胡萝h 素、香精油、果胶、 橙皮苷、柠檬苦素等，这些物质是重要的化工及医药原料。柑橘果皮功能性物质的 利用已成为柑橘加工的个重要组成部份，对提高柑橘加工厂的经济效益和减少污 染、保护环境都是十分有利的。 本文研究了柑橘果皮中类胡萝卜素的提取、组分鉴定及其在加工储藏过程中的 稳定性，分析了柑橘果皮中类胡萝h 素在光照、高温、氧化剂、酸性条件下的组分 变化，测定了“国庆1 号 ( c i t r u s u n s h i um a r c c v g u o q i n g n o 1 ) 、“宫川”( c i t r u s u n s h i u m a r c c v m i y a g a w aw a s e ) 、“尾张”( c i t r u s u n s h i um a r c e v o w a r r is a t s u m ) 、“锦橙” ( c i t r u s s i n e n s i so s b e e k e v j i n c h e n g ) 在发育和储藏过程中，其果皮中类胡萝i - 素各 组分的含量，探索柑橘果皮类胡萝卜素的积累与转化规律。 1 超声波和机械搅拌辅助提取橘皮类胡萝h 素条件优化 比较了超声波辅助提取和机械搅拌辅助提取对橘皮类胡萝h 素的提取率的影 响，确定的最佳提取方法及工艺参数为：超声法提取，丙酮：石油醚= 2 ：1 ，提取时 间6 m i n ，温度为3 0 ，提取次数为3 次，料液比1 ：4 0 。 2 。宫川”果皮中类胡萝h 素组分的初步鉴定 采用高效液相色谱质谱法从宽皮柑橘果皮中分离出- f 3 2 种类胡萝b 素，结合 紫外可见吸收光谱及质谱特征初步鉴定出1 2 种主要类胡萝h 素，其分别为：紫黄素、 黄体黄质、顺式紫黄素、叶黄素、玉米黄素、5 ，6 环氧叶黄素、叶黄素异构体、a 隐黄质、b 隐黄质、a 胡萝h 素、b 一胡萝h 素、1 3 - j i 颐式b 胡萝i - 素。 3 柑橘果皮类胡萝卜素稳定性研究 柑橘中类胡萝h 素的稳定性实验表明：类胡萝h 素在高温下不稳定；对室外日 光不稳定，室内光对其影响不显著；在碱性环境中比在酸性环境中稳定；加入金属 离子如f 色“、f e “、c u “、舢3 + 不稳定，其他金属离子影响不显著；加入氧化剂、酸 味剂对其有破坏作用，加入还原剂、防腐剂对类胡萝h 素有一定的保护效果。 4 柑橘果皮类胡萝h 素在储藏加工过程中的变化规律研究 采用高效液相色谱法分析柑橘果皮类胡萝i - 素在光照、高温、酸性环境以及氧 化剂影响下的稳定性。结果表明光照、高温、酸性环境和氧化剂对柑橘果皮类胡萝 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 h 素均有较强降解作用，主要是促使类胡萝h 素分子中碳碳双键的氧化断裂。光 照、高温和酸性环境能激发柑橘果皮类胡萝h 素不同方式的异构化。 5 柑橘果皮颜色与类胡萝h 素组分及含量关系研究 测定并分析了“国庆1 号”( c i t r u s u n s h i um a r c c v g u o q i n g n o 1 ) 、“宫川” ( c i t r u s u n s h i um a r c e v m i y a g a w aw a s e ) 、“尾张”( c i t r u s u n s h i um a r c c v o w a r r i s a t s u m ) 、“锦橙”( c t r u s s 加蹦s 西o s b e c k c v d i n c h e n g ) 在发育和储藏过程中其果皮 中类胡萝h 素组分的含量及变化规律。结果表明，在柑橘发育和储藏过程中，宽皮 柑橘类及甜橙类果皮中总类胡萝卜素含量均不断增加，不同的是宽皮柑橘类果皮中 主要以积累b 隐黄质为主，而甜橙类果皮中主要以积累顺式紫黄素为主。 关键词：柑橘；果皮；类胡萝卜素；提取：高效液相色谱；质谱；稳定性 柑橘果皮类胡萝卜素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 a b s t r a c t c i t r u sf r u i ti so n eo ff r u i t sw i t i lh i g hy i e l di nt h ew o r l da n dp e e lp o m a e e ，t h em a i n l y b y p r o d u c tw i t h2 0 4 0 c o n t e n t i nt h et o t a lc i t r u sf r u i t ，h a sm a n ya p p l i c a t i o nv a l u e s c i t r u sp e e l sa r ei m p o r t a n tl a ws t u f f sf o ri n d u s t r ya n dm e d i c i n e ，w h e r ea r eg r e a td e a l so f f u n c t i o n a ls u b s t a n c es u c ha sc a r o t e n o i d s ，e s s e n t i a lo i l ，p e c t i n ，h e s p e r i d i n ，l i m o n i na n d s oo n t h eu t i l i z a t i o no ff u n c t i o n a lm a t e r i a l sf r o mc i t r u sp e e l sh a sb e c o m eo n eo ft h e m o s ti m p o r t a n tp a r t so ft h ec i t r u sp r o c e s s i n g i ti sb e n e f i t f u lf o rt h ee c o n o m i cp r o f i ta n d t h ee n v i r o n m e n tp r o t e c t i o n t h i sp a p e rm a i n l ys t u d i e dt h ee x t r a c t i o n ；i d e n t i f i c a t i o no fc a r o t e n o i di np e e l so f c i t r u sa n dt h es t a b i l i t yo ft h ep i g m e n td u r i n gs t o r a g e t h ec o m p o s i n ga n dc o n t e n t v a r i a t i o no fc i t u r sp e e l sw 盯ea n a l y s i s e di nt h ec o n d i t i o n so fs u n l i g h t ，h i g ht e m p e r a t u r e ， o x i d a n ta n da c i dp r o c e s s i n g c a r o t e n o i d sf r o mf o u rv a r i e t yo fc i t r u sp e e l sw e r e d e t e r m i n e da sw e l la st h ec h a n g e sd u r i n gt h ed e v e l o p m e n ta n ds t o r a g eo ft h ec i t r u sf r u i t t h er e g u l a t i o n so fc u m u l a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o no ft h ec i t r u sp e e l s c a r o t e n o i d sw e r e a l s oi n v e s t i g a t e d 1 o p t i m i z a t i o no fc a r o t e n o i du l t r a s o n i ce x t r a c t i o na n dm e c h a n i c a ls t i re x t r a c t i o n f r o mc i t r u sp e e l s t h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so fe x t r a c t i o nm e t h o d sb e t w e e nu l t r a s o n i ca n d m e c h a n i c a ls t i rw e r ea n a l y s i s e da n dc o m p a r e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fe x t r a c t i o n w e r ee s t a b l i s h e da sf o l l o w s ：a e e t o n e ：p e t r o l e u me t h e r = 2 ：l ( v v ) r a t i oo fm a t e r i a lt o s o l v e n t1 ：4 0 ，u l t r a s o n i ce x t r a c t i o na t3 0 f o r3t i m e sa n d6 m i nf o re a c ht i m e 2 t h ee s s e n t i a ld e f i n i t i o no fc a r o t e n o i d sf r o mc i t r u sr e t i c u l a t eb l a n c op e e l t h eh p l c - m sa n a l y s i sw a se m p l o y e dt oi d e n t i f yt h em o s t l yc a r o t e n o i d sf r o mt h e c i t r u sp e e l ，a sw e l la st h er e l a t i v ec o m p a r et ot h eu v v i sc h a r a c t e r i s t i cs p e c t r u ma n d m a s ss p e c t r u mo fc a r o t e n o i d s ，m o r et h a nt w e n t yk i n d so fc a r o t e n o i d sw e r es e p a r a t e d f r o mp e e l so fl o o s es k i nm a n d a r i n sa n dt w e l v eo ft h e m w e r ci d e n t i f i e db yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y a n du v - v i ss p e c t r o m e t r y i d e n t i f i e dc a r o t e n o i d sa r cv i o l a x a n t h i n ，l u t e o x a n t h i n ，z - v i o l a x a n t h i n ，l u t e i n ，z e a x a n t h i n ， l u t e i n 一5 6 - e p o x i d e ，l u t e i ni s o m e r ，z - a - c r y p t o x a n t h i n ，b - c r y p t o x a n t h i n ，a - c a r o t e n e ， b - c a r o t e n ea n d9 z - 8 c r r o t e n c 3 t h es t a b i l i t yr e s e a r c ho fc i t u r sc a r o t e n o i d i l l 华中农业大学2 0 0 7 届硕上学位论文 t h e s t a b i l i t yo fc a r o t e n o i d sw a ss t u d i e d ，t h er e s u l ts h o w e dt h a th i g ht e m p e r a t u r e i n f l u e n c e dt h es t a b i l i t yo fc a r o t e n o i d s ：c a r o t e u o i d sw e r es e n s i t i v et od i r e c ts u n j i g h tw h i l e t h e mw e r ei n a p p a r e n t l ys e n s i t i v et or o o ml i g h t ；c _ , a r o t e n o i d sw e r em o r es t a b l ei na l k a l i n e c o n d i t i o nc o m p a r e dt oa c i dc o n d i t i o n ：t h es t a b i l i t yo fc a r o t e n o i d si sr e d u c e dw h e nf e ”， f e “，c u 2 + a n da 1 3 + w e r er e s p c c t i v ea d d e d1 0i t sm e d i u mw h e r e a so t h e rm e t a li o n sh a v e n os u c he f f e c to ni t ss t a b i l i t y o x i d a n t s 、s o u rt a s t ea g e n th a dd e s t r u c t i v ee f f c c to n c a r o t e n o i ds t a b i l i t y ，o t h e r w i s e ，r e d u c i n ga g e n t sa n dp r e s e r v a t i v e sd i ds o m ep r o t e c t i o nt o c a r o t e n o i d ss t a b i l i y 4 r e g u l a t i o n so fc a r o t e n o i dd i v e r s i f i c a t i o ni nd i f f e r e n tc o n d i t i o n so fp r o c e s s i n ga n d s t o r a g e t h es t a b i l i t yo fc a r o t e n o i d si nc i t r u sp e e l sw a sa n a l y z e dw i t hh p l ci nt h e p r o c e s s i n gc o n d i t i o n so fs u n l i g h t ，h i g ht e m p e r a t u r e ，a c i d a n do x i d a n t s t h ec a r o t e n o i d s i nc i t r u sp e e l sw e r ee a s yd e g e n e r a t e db ys u n l i g h t ，h i g ht e m p e r a t u r e ，a c i da n do x i d a n t s t h em a i nd e g r a d a t i o nm o d ew a st h eo x i d i z a t i o na n dt h ec = cd o u b l eb o n d sb r e a ko f c a r o t e n o i d s f u h h e r m o r e ，d i f f e r e n ti s o m e r i z a t i o no fc a r o t e n o i d si nc i t r u sp e e l sw a s e l i c i t e db ys u n l i g h t , h i g ht e m p e r a t u r ea n da c i d 5 r e g u l a t i o n s o ft h ec o m p o s i t i o na n dc o n t e n t so ft h ec a r o t e n o i d sd u r i n g r e f u t a t i o na n ds t o r a g ef r o m4d i f f e r e n tv a r i e t i e sc i t r u sp e e l s t h er e g u l a t i o n so ft h ec o m p o s i t i o na n dc o n t e n t so ft h ec a r o t e n o i d sf r o mp e e l sw e r e s t u d i e dd u r i n gm a t u r a t i o na n ds t o r a g ef r o m4d i f f e r e n t v a r i e t i e sc i t r u s ：c i t r u s u n s h i u m a r c c v g u o q i n gn o 1 ，c i t r u s u n s h i um a r c e v m i y a g a w aw a s e ，c i t r u s u n s h i u m a r c c v o w a r r is a t s u m ，c i t r u s s i n e n s i so s b c c k c v j i n c h e n g t h ee n t i r ec o n t e n t so ft h e4 v a r i e t i e sc i t r u sp e e l sc a r o t e n o i d si n c r e a s e dc o n s t a n t l yb u ti nd i f f e r e n tw a y sw h i c hr e s u l t i nd i f f e r e n tc h a r a c t e r i s t i cc a r o t e n o i d 。sa c c u m u l a t i o n ：b - c r y p t o x a n t h i ni st h em a i n a c c u m u l a t i o nd u r i n gt h ed i f f e r e n ts t a g e so f m a n d a r i n ，c o m p a r a t i v e l yt h es w e e to r a n g e a c c u m u l a t et h e 乙v i o l a x a n t h i n k e y w o r d s ：c i t r u s ；p e e l s ；c a r o t e n o i d s ：e x t r a c t i o n ；h p l c ；m s ；s t a b i l i t y 柑橘果皮类胡萝h 素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 孬 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：刭、明南时间：2 c 纺j 7 年占月，罗日 u 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存使用学位论文昀规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保 存，汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传 播学位论文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：占小d j 萄 导师签名：话也堤 签钔期：劢7 年6 月，予日 签名嘶垆6 月纫日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 柑橘果皮类胡萝h 素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 1 类胡萝i 、素 第一章文献综述 1 1 类胡萝l 、素概述、结构以及性质 类胡萝p 素( c a r o t e n o i d ) 是一类天然化合物的总称，在自然界中广泛存在。目 前已经鉴定的类胡萝h 素分子共有6 0 0 多种，其中具有重要生物学功能的约有5 0 余种，如番茄红素( l y c o p c n e ) 、叶黄素( l u t e i n ) 、玉米黄素( z e a x a n t h i n ) ，肛胡 萝卜素( b - c a r o t e n e ) 和虾青素( a s t a x a n t h i n ) 等。 类胡萝h 素具有共同的化学结构特征，大多数为c 4 0 分子，分子中心都是多烯 键的聚异戊二烯长链，以此为基础，通过末端的环化、氧的加入或键的旋转及异构 化等方式产生出很多衍生物。在自然界中，绝大多数类胡萝卜素以全反式异构体 ( a l l e - i s o m e r ) 的形式存在。顺式异构体( z - i s o m e r ) 在生命体内也具有着重要的 生物学功能。根据其分子结构，类胡萝h 素可分为含氧类胡萝h 素及不含氧类胡萝 卜素。含氧类胡萝卜索包括叶黄素( x a n t h o p h y l l ) 及类胡萝卜素酯( c a r o t e n o i de s t e r ) 等；不含氧类胡萝h 素被称为胡萝h 素( c a r o t e n e ) 。 类胡萝h 素是亲脂性的，几乎不溶于水、乙醇，大多易溶于石油醚或己烷。其 遇光、酸、氧及高温时不稳定，易降解。其分子结构中所具有的发色 ( c h r o m o p h o r e ) 使其在紫外可见光区有着独特的吸收区，因而其结晶或溶液在可见光下具有十分绚 丽的颜色。其颜色从黄、橙到红，黄、橙色素包括：a 胡萝h 素、b 胡萝h 素、卜 胡萝h 素、叶黄素、隐黄素、堇菜黄质、玉米黄素、b 一从一8 胡萝p 醛；红色素包括： 番茄红素、辣椒红素、虾青素。 1 2 类胡萝l 、素的生物活性及其应用 1 2 1 维生素a 源活性 维生素a 具有重要的生理功能。维生素a 缺乏时，会引起角膜上皮的脱落、 增厚和角质化，使原来透明的膜变成不透明，导致角膜溃疡，晶体脱落以致失明； 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 还会损害上皮组织细胞的生长与分化，使人的皮肤变厚、干燥、痴变或产生皱纹。 人体大量缺乏维生素a 也会丧失生育能力。缺乏维生素a 的婴幼儿易引起肺炎、 麻疹以及腹泻等传染病，严重时会造成死亡。 早在半个世纪前，人类就了解到类胡萝b 素中的b 一胡萝h 素可在哺乳动物的 小肠中水解生成维生素a ，进而参与视觉生理代谢。肛胡萝卜素缺乏时也会造成 维生素a 缺乏症，因此，b 一胡萝卜素又被称为维生素a 源。除了b 一胡萝h 素以 外，还有大量的类胡萝h 素也有维生素a 源活性，如a 一胡萝h 素、卜胡萝h 素、 肛隐黄素等。当然，也有类胡萝b 素不表现维生素a 源活性，如番茄红素。 1 2 2 抗氧化作用 研究表明，某些类萝h 素是预防肿瘤、心血管疾病和某些慢性疾病的重要因子。 自由基学说表明，人体的许多疾病和衰老均与自由基的作用有关。因此，清除 体内过多的氧自由基有利于预防疾病和延缓衰老。而清除氧自由基，除依靠体内的 抗氧化酶外，还依赖于非酶的抗氧化物质，类胡萝h 素便是其中之一。类胡萝h 素 可以有效地清除植物体中的活性氧而保护植物免遭强太阳光的灼伤，在动物体内的 类胡萝h 素也可捕获清除单线态分子氧和羟基自由基，通过抗氧化作用而保护动物 细胞免遭自由基的破坏。在细胞中，膜脂和膜蛋白是自由基攻击的对象，由于含不 饱和脂肪酸，易导致自由基链反应，发生脂类降解和蛋白质氧化。而类胡萝b 素( 包 括叶黄素) 是非常重要的结合于膜上的抗氧化剂，可以与自由基起反应，生成无害 产物或通过破坏自由基链反应将自由基清除。 在人体代谢过程中同样会产生氧自由基，人体内形成高度活泼的具有损伤能力 的自由基后，就可能激活脂质的过氧化作用，进而损伤核酸、蛋白质、细胞膜、细 胞。特别是羟基自由基可以使9 0 的d n a 受损，单线态氧和羟基自由基能使d n a 链断裂，这种损伤分为可修复损伤和不可逆损伤两种后果。后一种生物氧化损伤的 存在严重的潜在危害，因为d n a 的不可逆损伤会导致突变。脂肪的损伤能导致恶 性增殖，两者相加就能导致癌变。研究表明，与衰老过程相关的多种缺陷都是细胞 内的多点位氧化损伤积累的直接后果。然而类胡萝h 素如b 胡萝h 素、虾青素、番 茄红素以及叶黄素等可以有效地阻断体内的链式自由基反应，抑制自由基的产生， 阻止脂质过氧化，延缓衰老和预防癌症，是治疗和预防由自由基引起的许多顽疾的 理想药物。 2 柑橘果皮类胡萝卜素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 1 2 3 增强免疫活性 2 0 世纪8 0 年代初s e i f t e r 和他的工作组发表了增补类胡萝h 素可以增强免疫活 性的报道( s h r o e d e re ta l ，2 0 0 0 ) 。类胡萝h 素能增加免疫系统中b 细胞的活力，从 而消灭外源入侵的病源菌：类胡萝h 素能提高淋巴辅助t 细胞( c d 4 细胞) 的活力， 能协助b 细胞产生抗体，并提高其它免疫组分的活性；类胡萝h 素能增加自然杀伤 n k 细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞( b e n d i c h ，1 9 9 1 ) 。关于b 胡萝h 素能增加免疫功能也有较多报道( a l b r e a c he ta l ，2 0 0 1 ；g a r e w a lh se ta l ， 1 9 9 2 ) ，目前有研究报道除b 胡萝h 素外，番茄红素以及斑蟊黄素等其它类胡萝h 素也具有增强机体免疫功能的作用。 1 3 类胡萝i 、素的应用 类胡萝卜素呈天然的黄色或橘黄色，是一种有效的着色剂。以红色类胡萝h 素 为例，它是一种油溶性的色素，适宜于用作乳酸饮料、果子露、冰淇淋、果酒和清 凉饮料等食品着色剂。另外，类胡萝h 素还可用作药品片剂色素，在家禽体内沉积 于爪、咏及皮下脂肪中使其着色，提高家禽品质。在产蛋家禽的体内，类胡萝h 素 沉积于卵黄中使其呈黄色，提高蛋的品质。鱼虾类肤色的深浅取决于类胡萝卜素的 摄食量。类胡萝卜素的着色功能目前主要应用于饲料工业尤其是水产品饲料中，水 产动物皮肤色素中主要是胡萝h 素二醇、叶黄素、虾青素、玉米黄素等类胡萝h 素。 正常情况下，鱼、虾皮肤以及肌肉和卵的色泽大都来自饲料中的类胡萝h 素，而吸 收来的类胡萝卜素以原来的形式或转化为其它类胡萝卜素在鱼体内沉积而显示出 固有的体色和肉色。 1 4 类胡萝i 、素的制备与食品中类胡萝i 、素的分离提取方法 1 4 1 溶剂萃取法 溶剂萃取法是类胡萝h 素常用的提取方法，不同结构的类胡萝h 素要用不同的 溶剂进行萃取，如极性较强的含氧类胡萝h 素通常用丙酮、甲醇等，极性弱的类胡 萝h 素通常用石油醚、正己烷等。h a r t 和s c o t t 使用甲醇一四氢呋喃( 1 ：1 ， v v ) 分析蔬菜和水果中的各种类胡萝h 素。也有研究使用：甲醇一乙醚，甲醇一氯仿， 3 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 甲醇一正己烷，甲醇一丙酮一正己烷。一些实验室偏向于单独使用丙酮，或是与石 油醚混合使用。c h e n 等分析番茄果实和胡萝b 的类胡萝b 素组份时，使用了更复杂 的混合溶剂正己烷一丙酮一甲醇一甲苯( 1 0 ：7 ：6 ：7 ，v v ) 。 1 4 2 超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术( s f e ) 是一种快速，选择性好，容易操作的类胡萝b 素 提取方法。t o n u c c i 和b e e c h e r 对超l 临界c 0 2 静态的和动力学萃取进行了研究，在不 同的压力和温度下使用1 的夹带剂( 甲醇，乙醇和2 一丙醇) 进行提取，提取率的 变化主要依赖于样品的组成，高脂肪食品的提取率比较高，大约为9 6 。 1 4 3 超声波提取法 天然植物成分大多为细胞内产物，提取时往往需要将细胞破碎，而现有的机械 或化学破碎方法有时难以获得理想的破碎效果，超声波提取法在这方面有着明显的 优势。当液体处于稀疏状态下时，液体在超声波的作用下会被撕裂成很多小的空穴， 这些空穴一瞬间就闭合，闭合时产生瞬间高压，即产生空化效应。超声波的空化效 应产生极大的压力造成被粉碎物细胞壁及整个生物体瞬间破碎；同时，超声波产生 的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，有利于胞内有效成分的提取。李 大婧等利用超声波提取万寿菊中叶黄素提取率达9 5 以上。 1 5 类胡萝i 、素的分析检测方法 1 5 1 分光光度法 类胡萝b 素分子主链上的共扼不饱和结构，使其在可见光区具有强烈的光吸 收，因此，可通过分光光度法进行类胡萝b 素定量测定。这种方法能用于测定纯类 胡萝b 素的量或浓度，或用来估算混合物或天然萃取物中的总类胡萝h 素含量。在 定量测定前，应使用紫外一可见分光光度计测定样品的最大吸收波长。对于纯品来 说，类胡萝b 素特征光谱也可作为定性分析的依据。 朱蕾等在确定玉米黄色素提取条件时采用了分光光度法。李玉环等在9 5 下对 番茄加工原料进行皂化，破坏番茄细胞组织从而提取番茄红素，并选择四氢呋喃作 萃取荆，用h p 6 0 1 0 紫外可见分光光度计对番茄红素定量测定。 4 柑橘果皮类胡萝卜素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 1 5 2 薄层色谱法 薄层色谱法是一种重要的分离手段，经薄层色谱分离后的有效成分斑点与标准 样品斑点进行面积比较以求得样品中有效成分的含量，同时可根据与标准样品对照 比值来进行定性分析。薄层色谱法的优点是设备简单、操作方便、分离速度较快， 可以分析热不稳定化合物，应用范围广。 卢艳杰等分别以硅胶和氧化镁为固定相，对玉米黄色素进行分析，取得了较好 的效果。 t e o d o 等人用硅胶板对番茄红素提取液进行分析，以1 5 丙酮石油醚溶液和纯石 油醚作为流动相两步展开分离。李增光等人采用薄层色谱法建立了一种测定番茄红 素的方法。 1 5 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法具有高柱效、高选择性，高灵敏度、用样量少、可重复、分析 速度快等优点，可对样品中类胡萝h 素的含量与组成进行定量定性分析，目前己广 泛应用于化工、医药、农业、食品等方面的科学研究和生产分析。 目前国内外类胡萝h 素测定主要都是通过高效液相色谱法分析。g - r a n a d o 等人 采用s p h e r i 5 r p 1 8 及s p h e r i 5 o d s 色谱柱，流动相为乙腈：甲醇= 8 5 ：1 5 ( v v ) ，流 速：1 8 m l m i n ，检测波长：4 5 0 r i m 和3 2 5 n m ，可有效分离叶黄素、玉米黄素、番茄 红素、b 一隐黄素、卜胡萝h 素，a 一胡萝h 素及b 一胡萝h 素。k o n g i n g s 等人采用 c 1 8 色谱柱，流动相为乙睛：四氢吠喃= 9 5 ：5 ( v v ) ，流速：l m l m i n ，检测波长：4 5 0 r i m ， 可以分离叶黄素、玉米黄素、a - - 胡萝b 素、b _ 一胡萝b 素及番茄红素。l e e 等用c 3 0 色谱柱，在4 0 m i n 内，三元线形梯度洗脱，从皂化后的甜橙中分离出2 5 种类胡萝 h 素，经光电二极管检测，分离出的类胡萝b 素主要有：紫黄质、a 胡萝b 素、b 胡萝b 素、叶黄素、玉米黄质、b 隐黄质。 5 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 柑橘类胡萝i 、素 2 1 柑橘类胡萝l 、素的鉴定 柑橘是类胡萝b 素含量最为丰富的水果之一。尽管国外已做了很多工作，但大 多集中于甜橙和温闸蜜柑等少数品种。我国是柑橘的原产地，蕴藏着丰富的柑橘资 源，测定我国主要柑橘品种资源的类胡萝b 素成分，对合理开发和利用我国柑橘资 源具有重要的理论价值和应用前景。 据s t e w a r t 等报道，柑橘属水果中含有约1 1 5 种不同的类胡萝p 素，其中包括大量 的类胡萝h 素异构体。柑橘属水果中的叶黄素类常被脂肪酸酯化，由于叶黄素类羟 基数量不同，酯化程度也不同，单羟基类胡萝b 素，如b 隐黄质以非酯化或单酯形 式存在；二羟基类胡萝h 素。如叶黄素和玉米黄质以非酯化、单酯或二酯形式存在。 r o u s e f f 等用多聚c 3 0 柱，从皂化后的橙汁中分离出3 9 种类胡萝b 素，其中2 0 余种组分 通过参考文献和光谱数据定性。l e e 等用c 妒r p i - i p l c , 在4 0 m i n 内，三元线性梯度 洗脱，从皂化后的甜橙中分离出2 5 种类胡萝卜素，经光电二极管检测，分离出的类 胡萝卜素主要有：紫黄质，a 胡萝h 素，b 胡萝b 素，叶黄素，玉米黄质，b 隐黄质。 2 2 柑橘类胡萝i 、素的稳定性 柑橘类胡萝卜索和其他类胡萝h 素具有同样的理化特性。在弱碱性环境下较稳 定，在酸性环境下不稳定；在氧、光、热等因素影响下不稳定；受金属离子影响较 大。陶宗娅等研究表明柑橘类胡萝b 素在中性及微碱性环境下较稳定：常用食品添 加剂如糖类及有机酸对色素影响不大；f c 3 + 、3 + 对其影响较大；不易被还原，但耐 氧化性较弱；受温度影响不大。 3 研究的目的和意义 柑橘是世界上最重要的水果之一，其产量为所有水果之首，具有很高的营养价 值、药用价值及保健价值，是世界公认的第一大水果。柑橘加工主要以榨汁为主， 一般柑橘类果实榨汁后会产生4 0 5 0 的皮渣，其中富含类黄酮、类柠檬烯、v c 、 类胡萝卜素等生理活性成份。因此，对柑橘皮渣进行综合利用，既能够提高柑橘加 工业的经济效益，同时也可以减少对环境的污染，符合人类资源可持续发展的需要。 6 柑橘果皮类胡萝卜素提取鉴定及其成熟储藏过程中变化规律研究 国外在柑橘皮渣综合利用方面开始较早，比较成熟的有提取芳香油，生产果胶、 橙皮甙等产品。在日本，果皮经单独干燥后用于调味料、咖喱粉等食品添加剂和避 蚊剂等。柑橘残渣还可以加工为饲科、土壤改良剂和肥料而被利用。此外，国外对 于柑橘皮渣的综合利用进行了多方面的试验和研究。如提取类胡萝b 素、有机盐、 制造酵母等。在印度将柑橘类果实的废料浸提，浸出液作为培养基培植生产蛋白蘑 菇，在美国有一项用生产果汁后的废料制造柑橘粉的专利。而柑橘粉可广泛应用在 面包类及糖果点心的生产中，可提高营养价值，改善味道和香气，延长鲜度保持的 期限。 目前，我国水果加工企业对柑橘果皮的回收利用还不够重视，传统加工业大多 是将这些皮渣进行填埋或加工成饲料，这不仅造成资源浪费，而且对环境还有一定 的污染。最近几年人们尝试把柑橘皮渣加工成果醋、果酱、饮料等，而且从柑橘果 皮渣中提取精油、色素、果胶等的报道也相继出现，但或多或少存在一些不足，如 产率不高，产品不纯等，另外，对橘皮渣的研究常常缺乏综合考虑，产品单一，往 往是提取出了产品得不到效益。因此，探索出一条成功的柑橘皮渣综合利用途径成 为促进柑橘产业发展的当务之急。 本课题是柑橘皮渣综合利用项目的组成部分之一，是在前人实践的基础上，对 一种具有生理活性的柑橘皮色素类胡萝h 素进行提取、鉴定、稳定性方面的研 究，并分析了柑橘皮类胡萝h 素组分在柑橘发育、储藏及加工过程中的含量变化， 以期为柑橘皮渣综合利用研究中橘皮类胡萝h 素的工业化提取及商业化应用提供理 论依据。 4 研究内容及方法 在单因素实验基础上，采用正交实验和旋转正交实验法优化超声波辅助提取及 机械搅拌辅助提取橘皮类胡萝h 素条件。 采用h p l c m s 对宽皮柑橘“宫川”果皮中类胡萝b 素组分进行鉴定。 采用分光光度法检测分析了光、热、酸、碱、金属离子、氧化剂、还原剂和食 品添加剂等因素对宽皮柑橘“大叶尾张”果皮中类胡萝h 稳定性的影响。 采用h p l c 检测分析了光、热、酸、氧化剂对宽皮柑橘“宫川”果皮中类胡萝h 素 组分变化的影响。 采用h i ? u ：检测分析发育及储藏过程中不同品种柑橘果皮的类胡萝h 素含量变化。 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第二章超声波和机械搅拌辅助提取橘皮类胡萝l 、素条件优化 类胡萝h 素是脂溶性色素，而脂溶性色素提取的特点是提取时间较长，原因是 有机溶剂不易渗透穿过细胞壁和细胞膜，所以，不能快速地将提取物从细胞器中溶 出。机械搅拌辅助提取是一种通过机械搅动促进有机溶剂和原材料之间接触，从而 提高萃取效率的提取方法。超声波提取是目前国内外正在研究开发的一种辅助溶剂 提取技术，它以提取速度快、效率高的特点受到广泛关注。超声波通过溶剂内小气 泡的形成和破碎，产生冲击波，在短距离范围内产生高温和高压，可有效破碎生物 细胞和组织，能在较短时间内达到高效提取类胡萝h 素的目的( 李大婧，2 0 0 5 ) 。 本章在单因素实验基础上，采用正交实验和旋转正交实验法优化超声波辅助提取及 机械搅拌辅助提取橘皮类胡萝卜素条件，以期获得较高的类胡萝卜素得率。 1 材料与方法 1 1 实验材料 实验所选用的柑橘品种“尾张”( c i t r u s u n s h i um a r e e v o w a r r is a t s u m ) 采收于湖 北松滋望春花果汁有限公司柑橘园。采收时间为2 0 0 4 年1 2 月1 3 日，选取树势健 壮、生长结果正常的果树取果。每棵树取2 0 3 0 个果实。 1 2 主要试剂及药品 丙酮、石油醚i i 类均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。 1 3 仪器设备 h s 一2 0 6 0 a 型超声波清洗器( 功率6 0 w ) ；d f o l 0 1 s 型集热式恒温加热磁力搅拌 机，巩义市英峪予华仪器厂；r e 5 2 9 9 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂：u v - 7 5 0 4 型分光光度计，上海欣茂仪器有限公司。 8 柑橘果皮类胡萝t - 素提取鉴定及其成鼎储藏过程中变化规律研究 1 4 实验方法 1 4 1 提取方法 将新鲜柑橘( 大叶尾张) 果皮迅速冷冻干燥后研磨制成粉末，称取一定量的干 燥粉末置于2 5 0 m l 三角瓶中，按既定比例加入丙酮石油醚( 2 ：1 ) 混合溶剂( 含 0 i b h t ) 进行提取，收集提取液，用分光光度计测定其吸光度及体积。按上述方 法反复提取果皮粉末至无色，以此为完全提取的对照品。 根据公式： 提取率( ) = 簇x 1 0 0 a * 为样品吸光度 v # 为样品体积 a 相为对照品吸光度 v h _ 为对照品体积 1 4 2 超声波辅助提取橘皮类胡萝h 素正交实验 通过单因素实验得知，影响超声波辅助提取效率的最为显著的四个因素是提取 时间、提取温度、提取次数以及料液比，因此本文选定上述四个因素进行正交试验， 按照b ( 3 4 ) 正交表设计9 组试验，考察橘皮类胡萝h 素的提取率。( 因素水平表 见表2 - 1 ) 表2 1 超声法辅助提取橘皮类胡萝h 素正交实验因素水平表 t a b l e2 - 1f a c t o r sa n dl e v e l so fo r t h o g o n a lt e s to nu l t r a s o n i ce x t r a c t i o no f c a r o t e n o i d si no r a n g ep e e l s 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 4 3 机械搅拌辅助提取橘皮类胡萝卜素旋转正交实验 通过单因素实验得知，影响机械搅拌提取效率的最为显著的三个因素是转速、 提取时间以及料液比，因此本文选定上述三个因素进行旋转正交试验，按照三因素 二次旋转正交回归设计方案设计2 3 组试验，考察橘皮类胡萝h 素的提取率。( 因素 水平表见表2 2 ) 表2 2 二次回归正交旋转组合设计因素编码表 t a b l e2 - 2t h ef a c t o r sa n dl e v e l so fd u a lq u a d r a t i cr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g n 2 结果与分析 2 1 超声波辅助提取橘皮类胡萝l 、素条件优化 通过单因素试验得知：提取次数越多提取率越高，且提取率的增加量随提取次 数的增加而减少，当提取温度为3 0 ，提取时间为8 r a