（食品科学专业论文）墨旱莲黄酮类物质的提取、精制及抗氧化作用的研究.pdf

摘要 摘要 墨早莲是一种药食两用的天然植物资源，其中含有丰富的黄酮类物质。本论 文研究了墨旱莲黄酮类物质的提取和精制工艺，同时探讨了墨早莲黄酮类物质的 抗氧化作用。研究试验得到的结果如f ： 墨早莲中的黄酮类物质可以用乙醇提取，也可以用水提取。醇提的得率随提 取温度、提取时间、乙醇浓度的增加而提高，但醇提温度过高，得率反而下降， 最佳的醇提工艺条件是：提取温度8 0 、提取时间3 h 、乙醇浓度7 0 ，在此条 件下，黄酮的得率可达2 9 7 ：水提的得率也随提取水量、提取温度、提取时间 的增加而提高，但水提时间过长和水提温度过高，都会导致得率的下降，最佳的 水提工艺条件是：提取温度9 0 、提取时间2 5 h 、料液比1 ：3 0 ，在此条件下， 黄酮的得率为2 8 7 。这两种提取方法中，以乙醇为提取剂时，墨旱莲黄酮类物 质的得率稍高。但从提取物安全、低成本的方面考虑，以水提法较为合理。微波 技术用于墨旱莲中黄酮类物质的提取具有省时、高效、节能等优点。经上述最佳 水提工艺条件得到的墨旱莲黄酮粗提物的总黄酮含量为1 7 8 。 选用h p d 一7 0 0 大孔吸附树脂对墨旱莲黄酮类物质的吸附性能最好；其静态吸 附动力曲线符合l a n g m u i r 型曲线；静态吸附率随着墨旱莲黄酮提取液p h 值的增 加而减小，并且酸性或弱酸性条件下的吸附率明显高于碱性条件下的吸附率；静 态吸附率还随着原液浓度的增加而增加，当原液浓度超过一定的浓度时，增加的 幅度明显开始减小；使用体积分数为4 0 的乙醇溶液进行洗脱的效果最好； h p d 7 0 0 树脂对墨旱莲黄酮动态吸附可处理1 8 倍体积的提取液；动态洗脱时， 洗脱剂用量为1 倍树脂体积时，即可基本洗脱完全。经过精制后的墨早莲黄酮提 取物的总黄酮含量达到4 6 3 ，其黄酮类物质属于黄酮、黄酮醇或其苷类化合物。 墨旱莲黄酮类物质对羟自由基( o h ) 具有清除作用，清除能力与浓度具明 显的量效关系；墨旱莲黄酮类物质对邻苯三酚自氧化产生的超氧自由基( 0 2 。) 也有抑制作用，其抑制率随浓度的增大而增大，抑制能力与浓度呈明显的量效关 系，因此墨早莲黄酮类物质具有明显的体外抗自由基作用。连续灌胃三周后，墨 旱莲黄酮类物质可明显提高小鼠血清s o d 、g s h ，p x 活力；降低小鼠血清m d a 含量。表明墨旱莲黄酮类物质有明显的体内抗氧化功能。 关键词：墨旱莲：黄酮类物质；提取；精制：大孔吸附树脂：抗氧化 华南理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t e c l i p t aa l b ai sak i n do fn a t u r a lp l a n tm a t e r i a lu s e db o t hi nf o o da n dm e d i c i n e i tc o n t a i n sa b u n d a n tf l a v o n o i d s t h i st h e s i ss t u d i e do nt h ee x t r a c t i n ga n d p u r i f y i n g t e c h n o l o g yo ff l a v o n o i d s f r o me c l i p t a a l b a ，d i s c u s s i n gt h e e f f e c to ff l a v o n o i d s e x t r a c t e df r o me c l i p t aa l b ao na n t i o x i d a t i o n t h ec o n t e n ta n dr e s u l t so ft h i st h e s i s a r ea sf o l l o w i n g ： t h ef l a v o n o i d si n e c l i p t aa l b ac a nb ee x t r a c t e di n a l c o h o ls y s t e mo rw a t e r s y s t e m i n a l c o h o l s y s t e m ，t h ee x t r a c t i n g r a t ei n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e ，e x t r a c t i n gt i m ea n da l c o h o lc o n c e n t r a t i o n ，b u td e c r e a s e d o n e x o r b i t a n t t e m p e r a t u r e i n a l c o h o l s y s t e m o f7 0 a l c o h o la n d3 0 w a t e r ， e x t r a c t i n ga t8 0 。c f o r3 h r ，t h eb e s te x t r a c t i n gr a t ei s2 9 7 i nw a t e rs y s t e m ，t h e e x t r a c t i n gr a t ei n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fw a t e rd o s a g e ，e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e a n de x t r a c t i n gt i m e ，b u td e c r e a s e do ne x o r b i t a n tt e m p e r a t u r eo ri no v e r l o n gt i m e e x t r a c t i n gi nw a t e rd o s a g eo f 3 0t i m e s ，a t9 0 。cf o r2 5 h r ，t h eb e s te x t r a c t i n gr a t ei s 2 8 7 t h ee x t r a c t i n gr a t ei na l c o h o ls y s t e mw a sh i g h e rt h a nt h a ti nw a t e rs y s t e m ， b u tw a t e rs y s t e ma r ea d v i s a b l ef o rs e c u r i t ya n de c o n o m yc o n s i d e r e di nf u n c t i o n a l f o o d t h ea p p l y i n go fm i c r o w a v et e c h n o l o g yi nt h ee x t r a c t i o no ff l a v o n o i d si n e c l i p t aa l b ac a nb em o r et i m e s a v i n g ，e f f i c i e n ta n de n e r g y s a v i n g a f t e rt h e b e s t e x t r a c t i o np r o c e s s i n g ，t h ec o n t e n to ff l a v n o i d si nt h ee x t r a c t i o no fe c l i p t aa l b aw i l l b e1 7 8 t h eh p d 一7 0 0m i c r o p o r o u sa d s o r b e n tr e s i nw a st h e b e s t t y p e t o s e p a r a t e f l a v o n o i d sf r o me c l i a t aa l b a i t ss t a t i c a d s o r p t i o nf o l l o w e dt h el a n g m u i rc u r v e t h es t a t i c a d s o r p t i o n r a t ed e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fp hv a l u e ，a n dt h e a d s o r p t i o n r a t ei na l k a l e s c e n c ee n v i r o n m e n tw a sl o w e rt h a n t h a ti n a c i d i t y e n v i r o n m e n te v i d e n t l y t h es t a t i c a d s o r p t i o n r a t ew a sa l s oi n c r e a s ew i t ht h e i n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o no fl e a c h i n gs o l u t i o n ，b u tt h ei n c r e a s i n ge x t e n tc u ts h o r t e r h p d 7 0 0c a nd e a lw i t h1 8 b vo fl e a c h i n gs o l u t i o n ，a n de x p e n d1 b vo fe l u t i n g s o l u t i o nc o n t a i n e d4 0 a l c o h 0 1 a f t e rt h ep u r i f i c a t i o n ，t h ec o n t e n to ff l a v n o i d si n t h ee x t r a c t i o no fe c l i p t aa l b aw i l lb e4 6 _ 3 t h ef l a v o n o i d sp u r i f i e d a r et h e f l a v o n e ，f l a v o n o l ，f l a v o n eg l y c o s i d ea n df l a v o n o lg l y c o s i d e s f l a v o n o i d sf r o me c l i p t aa l b ah a dag o o ds c a v e n g i n ge f f e c to nh y d r o x y lr a d i c a l a n d s u p e r o x i d e a n i o nr a d i c a l ，ai m p r o v i n ge f f e c to ns o d 、g s h p xa c t i v i t y i n h a b s t r a c t s e r u mo fm i c ea n da r e d u c i n g e f f e c to nm d ac o n t e n ti ns e r u mo fm i c e k e y w o r d s ： e c l i p t aa l b a ：f l a v o n o i d se x t r a c t i n gp u r i f y i n g m i c r o p o r o u sa d s o r b e n tr e s i n ：a n t i o x i d a t i o n i i i 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于， 不保密吖 ( 请在以上相应方框内打“j ”) 作者签名：_ 方尹矿 导师签名：舭 日期：一髟年彳月，白 日期：砌牛年月，日 第一章绪论 1 1 墨旱莲概述 1 1 1 墨旱莲简介 第一章绪论 墨旱莲( e c l i e t aa l b a ) 是菊科植物鳢肠( e c l 咖t ap r o s t r a t al ) 的干燥地上部 分。在各个不同的地区有许多别名，如旱莲草、水旱莲、墨斗草、水石榴、野日 头花、水葵花、乌心草、摘落乌等等f l j 。墨旱莲外观如图l 一1 所示，全体被白色 茸毛，茎呈圆柱形，有纵棱，直径2 5 m m ，表面绿褐色或墨绿色。叶对生，茎 无柄，叶片皱缩卷曲或破碎，完整者展平后呈长披针形，全缘或具浅齿，墨绿色。 头状花序直径2 6 m m ，瘦果椭圆形而扁长2 3 r a m ，棕色或浅褐色。气微，味 微咸。7 到1 0 月开花，8 到1 1 月结果1 2 j 。 图1 1 墨旱莲外观图 f i g l 一1v i e wo fe c l i p t aa l b a 墨旱莲全国各地均有出产，主要生存于路边草地或稻田、水沟、河边等地。 药用墨早莲每年夏秋两季开花时采割，除尽泥沙、杂质，晒干或阴干【1 1 。 在2 0 0 2 年中华人民共和国卫生部的卫法监发 2 0 0 2 1 5 l 号文件中，墨旱莲被列 入“可用于保健食品的物品名单”之中。墨早莲在食用及药用方面均有较广泛的 华南理工大学硕士学位论文 应用，有“亦蔬亦药”的说法。 1 1 2 墨旱莲的食用功能 墨旱莲的食用部分为植物嫩株。除含有碳水化合物、脂质、蛋白质等常规营 养成分外，每1 0 0 克墨早莲含胡萝b 素3 7 4 毫克，维生素b 2 1 0 3 毫克，还含有 黄酮、皂甙、挥发油等物质。 墨旱莲的食用方法较多，如夏季采集嫩株，洗净后略烫，去除黑色汁液，捞 出用水洗干净，沥干水分，切段与肉类炒食；也可用鲜草全株洗净后挤取汁液与 鸡蛋、面粉等做饼煎炸食用；还可以在大米煮粥快熟时，放入洗净的墨旱莲煮至 熟，加入调味品即可食用。 1 1 3 墨旱莲的药用功能 墨旱莲入药始载新修本草，其味甘酸、性寒凉，入肝、肾二经。功能滋阴 益肾，凉血止血。适用于肝肾阴虚症及各种出血症。治肝肾两亏、头昏目眩、视 物昏花、须发早白、腰膝酸软，常与女贞子配伍同用，或煎服或蜜丸服，又治热 迫血行的各种出血。 墨旱莲的药理作用，可归纳如下： ( 1 ) 止血作用 如吐血：用鲜墨旱莲加生侧柏叶同煎；治咳血：鲜墨旱莲6 0 克，绞汁，开水 冲服；肠风下血不止：墨旱莲子适量，瓦上焙后研末，每服6 克，米汤饮下；外 伤出血：既可用鲜草捣烂外敷，亦可用干品研末撒敷。动物止血试验证明，将 墨旱莲粉敷于伤口上，对脾部分切除时的伤口止血，平均止血时问为2 分钟，而 对股动脉半切断的伤口止血时间也为2 分钟p j 。 ( 2 ) 保肝解毒作用 墨早莲( 缅甸产) 的提取物对四氯化碳所致豚鼠的肝损伤，有明显的保护作 用，在给予四氯化碳后2 4 小时，对照组动物死亡率为7 7 7 ，而给药组的死亡率 为2 2 2 ；给药组动物血清a s t 、a l t 、碱性磷酸酶的活性比对照组明显下降。 病理切片检查，结果给药组肝实质细胞小叶坏死，水样变性及脂肪变等也较对照 组明显减轻4 1 。后又经大鼠或小鼠试验，也证明墨旱莲的乙醇提取物对四氯化碳 所致肝损伤均有明显的保护作用1 5 。进一步证明，墨早莲抗肝毒的主要活性成分 是螃蜞菊内酯与去螃蜞菊内酯，这两种成分对四氯化碳、半乳糖胺、与鬼笔碱 ( d h a l l o i d i n ) 等所致大鼠肝损伤，均有明显的降s g p t 作用，并发现它们能促进 肝细胞的再生【6 j 。 第一章绪论 ( 3 ) 对5 脂氧酶的抑制作用 为了从药用植物中发掘能强力抑制5 - 脂氧酶( 5 - l i p o x y g e n a s e ) 的活性成分， 采用体外法，在猪淋巴试验系统中，以筛选能抑制花生四烯酸经代谢后的炎症物 质形成的药用植物。结果表明，从墨旱莲中分离出的螃蜞菊内酯是一种对5 一脂氧 酶具有强力选择性的抑制剂。进一步用化学发光技术测定，发现螃蜞菊内酯对5 一 脂氧酶的抑制作用是通过消除氧自由基的机制而实现的 _ ”。 ( 4 ) 对免疫系统的影响 墨旱莲煎剂对小鼠灌胃，可明显增加幼年小鼠胸腺重量；尚能提高小鼠碳粒 廓清清除速率；明显增强s r b c 所致小鼠足跖肿胀及d n c b 所致小鼠耳肿胀度； 提高外周血中w b c 数目及t 淋巴细胞百分率。此外，对小鼠脾细胞分泌抗体功 能及小鼠血清溶血素抗体含量均无明显影响，但可对抗体磷酰胺所致溶血素抗体 含量的降低，以上结果表明墨早莲可提高机体免疫功能【8 】。 ( 5 ) 对环磷酰胺致染色体损伤的保护作用 通过微核试验，以小鼠骨髓多染红细胞和有核细胞的微核率为指标，检测墨 早莲对活体染色体是否有潜在的诱变活力，作为初步评价该药的抗遗传毒性效应。 结果表明，墨旱莲给药途径不论以灌胃或腹腔注射，均对环磷酰胺诱发的小鼠骨 髓多染红细胞微核有明显的抑制效应，这表明该药对染色体损伤有一定的保护作 用 9 1 。 ( 6 ) 对心血管系统的作用 应用豚鼠离体心脏观察到墨早莲有增加冠脉流量的作用，并能使其心电图t 波改变得到改善，亦有试验表明，小白鼠在常压缺氧情况下注射墨旱莲能明显延 长生命，在减压缺氧耐力的情况下，同样可提高小鼠的存活率：给药组的存活率 为7 6 5 ，对照组为2 3 5 ，p 一般酚o h 5 o h 。 一一一一兰曼翌三奎兰堡主堂垡笙苎 根据分子中的酚羟基和y 一吡哺环的性质，黄酮类化合物具有一些特征的显色 反应：如盐酸一镁粉反应、钠汞齐还原反应等还原显色反应，与金属盐类试剂的络 合反应，与碱反应，与五氯化锑的反应等，其中有些反应可以作为其鉴定反应。 各种黄酮类物质植物成分的颜色反应见表1 - 1 所示【2 0 1 。 表1 1 黄酮类物质的颜色反应 t a b l el - 1t h et i n c t o r i a lr e a c t i o no ff l a v o n o i d s 1 2 3 黄酮类物质的生物活性及药效 黄酮类物质植物成分范围很广，种类数目繁多，不同的成分可能具有不同的 生物活性、不同的药效作用。 黄酮类化合物抗油脂过氧化的活性 2 u 在2 0 世纪6 0 年代就已经被证实，认为 它是作为一级抗氧化剂而起作用的。2 0 世纪8 0 年代以来，对黄酮类化合物的研 究逐渐转向其对活性氧自由基的清除及对老年病的防治功效上 2 2 - 2 5 ，许多黄酮类 化合物已被证实有很强的清除活性氧自由基的能力。 黄酮类化合物具有亲水性和亲脂性，其主要的抗氧化活性基团是酚羟基，特 别是b 环4 位羟基和3 、4 位的邻二羟基，其次是2 、3 位的双键。对黄酮类化合 物的生物活性的研究已经进行很多，经证实，黄酮类化合物是优良的活性氧清除 剂和脂质抗氧化剂 2 6 - 2 ”。它们抗自由基和抑制脂质过氧化的机理是：与氧阴离子 反应阻止自由基反应的引发；与铁离子络合阻止羟基自由基的生成；与脂质过氧 基反应阻止脂质过氧化过程。黄酮类化合物能在高胆固醇模式的大鼠体内抑制脂 质过氧化作用，降低血脂及胆固醇。体内的槲皮素能明显抑制血小板聚集，选择 6 第一章绪论 性地与血管上血栓结合，起到抗血栓形成的作用。槲皮素及其衍生物能抑制动物 体内m d a 类物质的生成。美国加州大学教授l e i g h t o n c h e n ：槲皮素是已知最强 的抗癌剂之一，能在毫摩尔浓度直接阻滞癌细胞增殖。众多的实验研究表明黄酮 类化合物具有较强的抗癌防癌作用，其作用主要通过三个途径，即对抗自由基作 用、直接抑制癌细胞生长、对抗致癌促癌因子。根据文献报道，黄酮类化合物的 生物活性可归纳为以下几方面 2 8 , 2 9 , 3 0 】： ( 1 ) 抗氧化及抗自由基作用 自由基( f r e er a d i c a l ) 与人类的衰老及多种疾病密切相关。黄酮类化合物具 有消除自由基和抗氧化能力。它可阻止自由基在体内的生成，并能阻止脂质的过 氧化过程。活性氧自由基通过产生氧化的低密度腊蛋白( l d l ) ，对动脉粥样硬化 的形成起重要作用，而黄酮化合物能够保护l d l 免受自由基的攻击，可防止动脉 硬化及血栓的发生。 ( 2 ) 抗癌、防癌作用 曾经有关于6 0 多种黄酮类植物成分的抗癌实验结果报道，发现其中1 0 种具 有不同程度的抗癌活性，它们在c 6 位上都有甲氧基，3 和4 位上有羟基或甲氧基。 黄酮类化合物主要通过3 种途径达到抗癌、防癌作用，即抗自由基作用、直接抑 制癌细胞生长和抗致癌因子。 ( 3 ) 维生素p 样作用 延长肾上腺素作用，维持血管的正常渗透压，降低血管的脆性，缩短流血时 间，这种作用称为维生素p 样作用。具有此种活性的成分包括黄酮、黄酮醇、二 氢黄酮和查耳酮类等类型的衍生物。 ( 4 ) 对心血管系统的作用 黄酮类化合物能调节心肌收缩，改善心肌舒张功能，提高机体在常压与低压 下的耐缺氧能力，对抗各种因素造成的心律失常，因此可用于治疗心血管病、偏 头痛、动脉粥样硬化等症。黄酮类化合物还有降血压，防止血管破裂和止血作用。 ( 5 ) 对内分泌系统的作用 黄酮类化合物能够促进胰岛b 细胞的恢复、降低血糖和血清胆固醇，改善血 糖量，对抗肾上腺素的升姐糖作用。同时还能抑制醛糖还原酶，因此可以治疗糖 尿病及并发症。另外，黄酮类化合物因结构与己烯雌酚相似而具有雌性激素样作 用，与甾类激素一样具有兴奋和抑制的双重作用。 ( 6 ) 对免疫系统的作用 黄酮类化合物能增强机体的非特异性免疫功能和体液免疫功能。 ( 7 ) 护肝作用 黄酮类化合物对急慢性抗炎，肝硬化，脂肪肝以及因半乳糖胺和c c l 4 等引起 的中毒性肝损伤有一定的疗效。其护肝机制最终归结于其抗氧化及抗自由基的作 7 华南理工大学硕士学位论文 用。 ( 8 ) 抗菌、抗病毒作用 主要是一些黄酮类衍生物，具有抑菌或杀菌作用，并在低浓抑菌，高浓杀菌。 如银杏黄酮、槲皮素、山奈酚等均具有抑菌和抗病毒作用。 另外，有个别黄酮类化合物具有特殊的药效作用，如解痉挛、抑制胆碱酯酶、 止咳、祛痰、镇痛、泻下作用等。 总之，黄酮类物质大多具有不同的药效作用，对他们的研究是对我国天然药 物医学的贡献。 1 2 4 黄酮类物质的提取分离和分析方法 1 2 4 1 提取分离方法 黄酮类化合物多具有游离的酚性羟基，一般易溶于极性较大的有机溶剂和碱 性溶液。黄酮类化合物大多以黄酮甙的形式存在，少数以黄酮甙元的形式存在。 黄酮甙溶于水、含水乙醇、甲醇和乙酸乙酯等，不溶于非极性强的有机溶剂。黄 酮甙元不溶于水，但溶于有机溶剂，如乙醇、乙醚等。由于具有酚羟基，可在稀 碱液中增加其溶解度，因而提取此类化合物时，除了考虑溶解度外，还需考虑其 结构稳定性、羟基存在部位及后处理工艺来设计合理的提取方法。目前，提取黄 酮类化合物的主要方法有：水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、高效液相色谱 ( h p l c ) 分离法和超临界流体( s c f ) 萃取法等【2 。1 。 ( 1 ) 有机溶剂提取法 这是目前国内外使用最广泛的方法。常用的有机溶剂主要有：甲醇、乙醇、 丙酮、石油醚等。由于甲醇、丙酮等毒性、挥发性较大，因此一般采用乙醇作为 提取剂。原料干燥粉碎后用有机溶剂浸泡、萃取、过滤，滤液中的溶剂用就减压 蒸馏除去后得浸膏粗提物，粗提物中杂质含量较高，通常呈棕黑色。在粗提物基 础上进一步精制，常用的方法有液一液萃取法( 例如用二氯甲烷、氯仿或苯脱脂) 、 沉淀法( 用n h 4 0 h 或p b a c 等沉淀剂) 和吸附一洗脱法( 用大孔吸附树脂、硅藻 土或硅胶等吸附剂) ，即可得精提取物。乙醇作为提取剂具有选择性高、产品得率 高等优点，但是采用乙醇生产的较高成本使其应用受到一定限制。 ( 2 ) 超临界流体萃取法 超临界流体萃取法是近十几年来才发展起来的一种新型技术，它利用超临界 流体作为萃取剂从液体和固体中提取某种高沸点的成分，以达到分离或提纯的目 的。超临界流体是处于临界温度和压力以上的液体，在这种条件下，流体即使处 于临界温度下，也不会浓缩为液体，但流体的密度随压力增大而增加，此时超临 第一章绪论 界流体既不同于一般液相，也有别于一般的气相。其密度接近于液体，粘度却接 近于普通气体，扩散能力又比液体大1 0 0 倍。与一般液体溶剂相比，在超临界流 体中可更快地进行传质，在短时间内达到平衡，从而高效地进行分离。尤其是对 固体物质中的某些成分进行提取时，由于溶剂的扩散系数大，粘度小，渗透性能 好，因此可以简化固体粉碎的预处理。 超临界流体的密度接近于普通液体的密度，因此，超临界流体的液体、固体 的溶解度也与液体相接近。由于超临界流体的溶解能力与密度有很大关系，因此 温度和压力的变化会大大地改变其溶解能力。 在工艺过程中，要求超临界流体具有良好的溶解性能，还要求有良好的选择 性以有效地除去杂质。到目前为止，作为超临界流体应用的最常用的萃取剂是二 氧化碳，它具有无毒、不易燃、不易爆、不腐蚀、价廉易得、临界温度接近常温、 临界压力低、溶解能力好等优点。 随着超临界流体的迅速发展，用该技术提取天然植物中的药用有效成分也越 来越广泛。与传统的提取工艺比，超临界流体具有提取效率高，无溶剂残留毒性， 天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏而保持其天然特性等优点。 同时，还可以通过控制临界温度和压力的变化，来达到选择性提取和分离纯化的 目的。但是超临界流体需要在较高的压力下操作，因此设备费用比较昂贵，而且 需高压技术，在设备和过程设计上还缺乏基础数据和系统的方法，在我国的应用 还未普及。 ( 3 ) 高效液相色谱( h p l c ) 分离法 h p l c 法在分析测定黄酮类化合物方面起着重要作用。随着色谱技术的不断 发展，应用h p l c 分离技术已分离了多种黄酮化台物。低极性甙元近年运用反相 系统进行分离研究，极性较大的甙元一般用c 1 8 或c 8 柱的反相系统分离。分离 中最困难的是含有较多组分的复杂黄酮类化合物。自7 0 年代以来，应用h p l c 技术已成功的分离了大量的黄酮类化合物。由于新技术的不断采用，大大提高了 分离效果，计算机辅助下新的优化设计方法的研究，新的柱子和流动相的研究， 特别是近年应用较多的丙醇一环醚一水体系，使一些用传统的甲醇( 乙腈) 一水 体系难以分离的黄酮类化合物得到了良好的分离。 ( 4 ) 水蒸汽蒸馏法 将原料干燥粉碎后，减压，在9 0 进行水蒸汽浸提，提取液冷却后浓缩，加 入沉淀剂沉淀杂质，过滤，滤液用大孔吸附树脂精制，然后用乙醇洗脱、蒸干， 即得黄酮提取物。该方法设备简单，成本低，且对环境及人类无毒害，但由于目 前水提法具有提取效率低、杂质含量高、后处理工艺难度大等问题，因此研究较 少，但就采用树脂工艺本身来说，由于有机溶剂残留少而比溶剂提取法优点要多， 在天然产物分离中有着广泛的应用前景，并且目益显示出其独特的效果。 9 华南理工大学硕士学何论文 1 2 4 2 微波、超声波等物理方法辅助浸提 在提取黄酮类化合物的同时，还可采用微波、超声波等物理方法辅助浸提过 程。微波具有很强的穿透力，可以在反应物内外部分同时均匀、迅速地加热，故 提取效率较高，因此微波辅助提取黄酮具有简便、快速、高效、加热均匀的优点； 超声波辅助提取是利用超声波具有机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质 分子的运动速度，增大介质的穿透力以提取黄酮的方法，具有节省能源、节约溶 剂、有效成分含量高等优点。 1 2 4 3 大孔吸附树脂分离纯化黄酮类物质 大孔吸附树脂具有多孔骨架，其性质与天然吸附剂活性炭相似，但具有下列 优点，弥补了天然吸附剂一活性炭之不足： ( 1 ) 物理、化学稳定性高，机械强度好，经久耐用。 ( 2 ) 再生容易，一般用水、稀酸、碱或有机溶剂，如低碳醇，丙酮即可，而 且分离出来的物质灰分低。 ( 3 ) 品种多，可根据不同要求，改变树脂孔结构、极性等表面性能适用于吸 附多种有机化合物。 ( 4 ) 树脂一般为小球状，直径为0 2 0 8 毫米之间，因此流体阻力不像粉状 活性使用时不便。 大孔吸附树脂是类不含离子交换基因的交联聚合物。由于它具有交联立体 结构，决定了它不溶于任何酸、碱、有机溶剂及加热不熔的特点；又因它的弹性 结构，使其具有较高的机械稳定性：它的较高交联度而使其产生抗化学性，所以 在较严酷的条件下，大孔吸附树脂比凝胶树脂具有更高的物理及化学稳定性。其 热失重温度为2 6 6 。| c ，耐热、辐照性能好。聚苯乙烯型树脂耐热、耐辐照，一般 可用于1 5 0 左右，在惰性气相中，短时间可经受2 0 0 2 5 0 。c 。对有机物浓缩， 分离作用不受无机盐类及强离子、低分子化合物的于扰。其本身由于范德华力或 氢键的作用，具有吸附性，又具有多孔网状结构和很高的比表面积，而有筛选性 能，所以它是一类不同于离子交换树脂的吸附和筛选性能相结合的分离材料。其 化学结构不带或带有不同极性的功能基。根据树脂的表面性质，可分为非极性、 中极性、极性、强极性四类。非极性吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合制得的 不带任何功能基，i l 表疏水性较强，最适于由极性溶剂( 如水) 中吸附非极性物 质。中极性吸附树脂是含酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分，既可 由极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶液中吸附极性物质。极性与强极 性树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫不同极性功能基的吸附树脂， 1 0 第一章绪论 该类树脂最适用于由非极性体系里分离极性物质。 1 2 4 4 黄酮类物质的分析方法 目前，黄酮类化合物的分析方法一般用分光光度法、衍生化一气相色谱法、 高效液相色谱法、薄层色谱扫描法、h p l c 指纹分析法、超临界流体色谱法、毛 细管屯泳法等。 ( 1 ) 分光光度法 黄酮类化合物能与a i ( n 0 3 ) 3 络合产生有色反应，以芦丁溶液为标准溶液，在 5 1 0 n m 处测定。国外采用酸水解法将黄酮苷水解成苷元，再与铝盐形成络合物， 进行u v 光度测定，分析总黄酮含量。此法测定设备价廉，操作简单易学，但样 品未经分离纯化，含有干扰物质，测定值将高于实际黄酮含量3 1 ，3 2 】。 ( 2 ) 衍生化一气相色谱法 由于多数黄酮类化合物的沸点比较高，难以气化，因而需要将样品用衍生化 试剂制成黄酮衍生物，再经气相色谱分离测定。该法装置较贵，操作繁琐，应用 不普遍【33 1 。 ( 3 ) 毛细管电泳法 毛细管电泳是一种基于各溶质组分的迁移率不同而进行分离的分析方法。具 有操作简便、快速、结果准确可靠、重现性好等特点。在分离测定黄岑复方制剂 3 4 1 中的黄岑甙及槟榔中次碱”1 的分析测定中，都应用此法。 ( 4 ) 高效液相色谱( h p l c ) 法 黄酮类作为重要的天然产物称为现代h p l c 最早分析的样品之一。h p l c 在 黄酮类化合物分析中的应用获得了飞速发展，其色谱条件主要是色谱柱的选择和 流动相组成的优化，宜至选出最佳峰形和选择性。黄酮分析中以c 1 8 柱用得最为 普遍，其次是c 8 柱、苯基柱( p h ) 、氰基柱( c n ) 。流动相一般为甲醇水体系和 乙腈一水体系，为了提高分离度，常常要进行梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有 酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致脱尾， 所以黄酮类的反相h p l c 中需要加入酸调节p h 值以抑制解离，克服脱尾现象。 用来酸化流动相的酸可以是乙酸、甲酸、磷酸或高氯酸等，但酸对分析仪器有腐 蚀性，延长分析物的保留时间【3 6 3 ”。 ( 5 ) 薄层色谱法扫描法 李吉来等人3 8 1 采用薄层色谱扫描法对银杏叶黄酮醇苷的3 种水解苷元进行扫 描测定，以黄酮醇苷的平均分子量与各苷元分子量的比值作转化因子，计算总黄 酮醇苷的含量。薄层色谱扫描条件为：硅胶g 薄层板，展开剂为氯仿苯无水乙 醇一冰乙酸水( 5 5 ：2 ：1 ：o 5 ：1 ) 4 1 0 放置的下层溶液，显色剂为8 三氯化 华南理工大学硕士学位论文 铝乙醇溶液，三种苷元斑点呈鲜黄色，紫外( 3 6 5 n m ) 光下显黄绿色荧光，其r f 值分别为0 5 6 ，o 4 5 和0 2 7 。 ( 6 ) i q p l c 指纹分析法 根据黄酮类化合物各自的指纹特征，可以鉴定分析各化合物。w a g n e r 早在 1 9 8 9 年提出h p l c 指纹分析用于银杏叶中分离和确定2 种黄酮和4 种双黄酮，后 来p i e t t a 等用梯度法洗脱，二极管阵列检测器，由6 种已知黄酮对照品和u v v i s 光谱分离和鉴定了1 5 种黄酮3 9 l 。 ( 7 ) 超临界流体色谱法( s f c ) 这是种新的分离技术，它综合了气相色谱法( g c ) 和高效液相色谱法 ( h p l c ) 的优点，所以今年来国际上发展最快。刘志敏等人【4 0 】采用s f c 法测得 了银杏叶提取物中黄酮类化合物的含量，条件为：压力2 5 m p a ，温度5 0 | 。c ，流动 相：超临界二氧化碳一乙醇磷酸( 9 0 ：9 9 8 ：0 0 2 ，v v ) ，流速1 0 0 m l m i n 。色谱 柱：2 0 0 4 6 n m ，苯基固定相，标准品为槲皮素、山奈酚、异鼠李素。该法由于 仪器价格贵，在我国尚未普及应用。 1 3 目前黄酮类化合物提取技术研究进展 1 3 1 常用的提取方法及水平 目前常用的提取方法主要是水蒸汽蒸馏法和有机溶剂萃取法，水蒸汽蒸馏法 虽然提取率低、杂质含量较高，但是设备简单、成本低且对环境和人体无毒害而 适宜工业化大生产；有机溶剂萃取法，选择性高，提取率高，但成本较高，存在 溶剂残留效应，对人体和环境有一定的影响。综合上述方法的特点，采用树脂吸 附工艺不仅可克服两者的缺点，还能大大提高成品的黄酮含量，而且该方法操作 简单、溶剂损耗少。 1 3 1 1 乙醇提取工艺 依据黄酮类化合物的性质，黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶 剂中，因甲醇有毒、丙酮溶剂挥发损耗大，所以选择乙醇作为浸提剂较为合适。 采用该法提取黄酮的工艺流程基本如下： 原料( 干) _ 粉碎浸提_ 过滤+ 回收浸提剂+ 脱脂浓缩 溶液+ 过滤除杂叶滤液减压蒸馏+ 浸膏( 提取物) 1 2 第一章绪论 庄向平等报道4 ”，粉碎的银杏叶用7 0 5 0 5 5 搅拌下加热5 6 小时，热 过滤，回收乙醇，水相用石油醚或氯仿脱脂2 次后浓缩成浆状液，5 0 。c 真空干燥， 浸膏得率为9 6 1 2 1 ，含黄酮1 6 3 1 7 6 ，可作为药剂或原料。 1 3 1 2 水提一树脂吸附法 黄酮类化合物在冷水中溶解度小，但在热水中溶解度较大，而且黄酮类化合 物一般易溶于碱水，酸化后又可以沉淀析出，所以用水作浸提剂既可降低成本， 产品安全，又无环境污染，是代替乙醇的首选溶剂。结合吸附树脂具有选择吸附 的优点，选择合适的吸附树脂吸附黄酮类化合物而让不被吸附的化合物随水流去， 达到精制的目的。该工艺的特点是操作简便，耗能低，投资少，容易工业化。肖 顺昌等 4 2 1 报道用沸水提取3 次，每次微煮沸2 3 小时，浸提液先粗滤，再精滤 后上d 1 0 l 树脂柱纯化，乙醇洗脱，产品得率为1 2 1 5 ，g b e 含量约为3 8 。 1 3 1 3 醇提一树艚吸附法 由于乙醇的浸出率高，选择性好，所以一般常用含水乙醇进行浸提。溶剂萃 取法或树脂吸附法虽都能达到精制的目的，但由于溶剂萃取导致的后续分离工艺 较难，残留溶剂等问题未能得到很好解决，使得树脂吸附法精制黄酮技术的优点 更为突出。醇提一树脂法工艺流程同水提一树脂法相似，但该方法的缺点是由于 乙醇同时浸出了许多其他有机成分，如叶绿素，较难出去，导致吸附过程中树脂 易失活，因而只要设法去除叶绿素以防止树脂失活，这种方法是大有前途的。 南开大学生物系 4 3 】使用m d a 型树脂提取银杏黄酮，用8 0 乙醇洗脱，可得 纯度大于4 0 的黄酮( 以芦丁为标准物) 。陈冲等人 4 3 】采用9 0 乙醇8 0 。c 回流提 取3 次，每次1 5 小时，过滤除杂上a b 8 型树脂精制，g b e 含量高达2 7 6 ， 得率在1 2 1 6 之间。 1 3 2 主要存在的问题 从浸提剂的角度看，水作为浸提剂主要的缺点是浸提效率低，使糖类等水溶 性杂质溶出率高，造成过滤及除杂等后处理困难；使用乙醇作为浸提剂主要的缺 点是生产成本较高，溶剂损耗大，且浸出的有机成分较多，必须进一步除掉有机 成分，这增加了反应设备，同时会会造成黄酮损失和质量下降。 从精制方法来看，树脂吸附工艺优于溶剂萃取工艺。溶剂萃取对黄酮类化合 物等有效成分的萃取选择性强，萃取率高，黄酮得率较高，而且溶剂萃耿所需时 华南理工大学硕士学位论文 问较短，设备简单，不足之处是一些氯代烃、甲苯和铅化合物等有毒物质会残留 在产品中，影响产品质量；如用混合溶剂，则溶剂回收较困难，且费用高。采用 树脂吸附法精制，同样能选择性富集黄酮，得到的产品纯度高，产率也较高，而 且产品安全不存在有毒溶剂的残留问题，工艺较简单。此方法的缺点是树脂吸附 洗脱耗时长，有时树脂再生困难。 1 4 本课题的研究目标及内容 目前，国内外对墨旱莲黄酮类物质的研究主要集中在化学成分分析和免疫作 用的药理研究，而对其应用开发技术和抗氧化作用方面的研究报道甚少。 本研究从提取效果、提取成本以及应用前景等多方面考虑，探讨了用水和乙 醇作浸提剂，大孔吸附树脂精制墨旱莲黄酮的工艺。对料液比、浸提时间、浸提 温度、浸提次数等影响浸提率和浸出效果的因素进行全面考察，并通过正交试验， 寻找出一个最佳浸提工艺。同时，利用微波的特性，探讨了微波强化提取墨旱莲 黄酮的工艺特点。 在大孔吸附树脂吸附墨旱莲黄酮的研究过程中，还对树脂类型选用和影响吸 附率的许多因素，如浸提液的浓度、吸附液的p h 值、洗脱剂用量、洗脱剂浓度 等进行系统研究，取得树脂提取工艺的最佳条件，考察树脂的静态和动态吸附曲 线，以及动态洗脱曲线。 综合利用颜色反应、紫外一可见扫描及高效液相色谱等方法初步鉴定经过上 述工艺提取精制所得到的墨早莲黄酮类化合物。 本研究采用浸提和树脂吸附联合工艺，通过该项研究，将得到高效、安全、 易于操作、易于工业化生产的墨旱莲黄酮提取精制工艺，为我国墨早莲这一药食 两用新资源的开发利用提供可靠的技术保证。 最后，通过墨旱莲黄酮体外抑制羟自由基和超氧