（食品科学专业论文）益生菌功能特性及共生性研究.pdf

摘要 摘要 益生菌在促进人体健康和防止疾病中发挥着重要的作用，是未来功能食品发展的重 要领域。本课题采用体外和体内实验，测定了益生菌及联合菌株的潜在功能，筛选共生 性较好的菌株。 本试验共测定9 株潜在益生菌，其中p b l 和a 8 7 8 为嗜酸乳杆菌；i n f 和p b a 为双歧 杆菌；m 1 、p b 2 、a 3 0 、a 3 i 为链球菌；m 2 为枯草芽孢杆菌。分离出一株酪酸梭菌。大 肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌购于黑龙江省临床检测中心。 采用比浊法测定潜在益生菌的生长曲线，结果表明，本实验所测定的9 株菌中，产 酸能力最强的是p b l 和a 8 7 8 、p b a 和i n f , 其次为p b 2 、m 1 、a 3 0 、a 3 1 、m 2 。但是其 中四株链球菌生长速度较快，没有明显的迟滞期。确定各菌株对数生长期末期分别为： p b l 和a 8 7 8 ：1 2 h ；i n f 和p b a ：2 4 h ；p b 2 、m 1 、a 3 0 、a 3 1 、m 2 ：8 - 1 0 h 。 采用牛津杯法测定八种潜在益生菌对大肠杆苗、痢疾杆菌、沙门氏菌的抑制性，结 果表明，嗜酸乳杆菌p b l 、a 8 7 8 和双歧杆菌p b a 、i n f 具有较强的抑菌能力，对三种致 病菌能够形成明显的抑菌圈，而且对三种致病菌的抑菌能力明显不同。其抑菌机理主要 是分解糖类产生酸类物质发挥主要作用。 f 将p b l 和a 8 7 8 分别与m 1 、p b 2 、a 3 0 、a 3 1 以1 ：1 的比例混合发酵后，测定联合 菌株对致病菌的抑制性。结果表明p b i 与各球菌联合后，可以互利生长，其中复合较好 的为p b l 与m 1 和a 3 0 。而a 8 7 8 与各球菌混合发酵后，抑菌性降低。在p b l 与各球菌 混合培养的基础上，再和i n f 和p b a 混合培养，结果发酵液中i n f 和p b a 的生长受到限制， 结果表明，在体外p b a 和l n f 很难与需氧菌共生。 将几株体外性状好的菌株p b a 、p b i 、m l 、p b i + m i 、p b i + a 3 0 ，每天以0 5 m l 每只 发酵液的量灌胃给正常小自鼠，时间3 0 天，测定小鼠免疫器官指数和血清中细胞因子的 变化，并观察小鼠脾脏的变化。结果表明，p b i + a 3 0 、p b l 、p b i + m 1 、p b a 对脾脏的发 育刺激最为明显( p 0 0 1 ) ，脾脏指数分别提高了2 3 4 、2 9 、3 6 6 、2 3 6 。p b a 、 p b i 、a 3 0 与p b i + m i 与对照组相比可以明显提高小鼠血清中i l 2 的含量( p 0 ，0 5 ) 。 p b a 、p b l 与对照组相比。能显著增加i l 6 的含量( p 0 0 1 ) 。所选菌株均能不同程度的 提高实验小鼠血清中t n f a 的含量( p 0 0 1 ) ，菌株之间差异不显著。p b l + m 1 、p b l + a 3 0 诱导生成t n f q 的量最多，分别为1 1 7 n g m l 和1 1 4 n g m l 。由此可见，所选益生菌菌 株能够增强小鼠的免疫功能。 将p b l 、a 8 7 8 分别和各球菌m i 、p b 2 、a 3 0 、a 3 l 接种于高胆固醇培养基中，在有 胆汁和厌氧条件下，3 7 c 混合培养1 6 1 8 h ，测定复合菌株和单菌株降低胆固醇的效果， 以未接菌培养基为对照。结果表明。p b i 与m i 及p b 2 ；a 8 7 8 与a 3 0 及a 3 1 的协同作 用较好降培养基中胆固醇的量都高于4 0 以上。单菌株降胆固醇效果最好的是p b l 、 躺7 8 、朋0 、蚓7 、厂 关键词益生菌：功能性；共& 性：抑菌性：免疫功能；降胆固醇 s t u d y o nt h ef u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o fp r o b i o t i c b a c t e r i aa n di t ss y m b i o s i s a b s t r a c t p r o b i o t i ca r ep r o m i s i n gf i e l df o rd e v e l o p m e n to ff u n c t i o n a if o o d si nt h ef u t u r el i e si ni t s i m p o r t a n tf u n c t i o no nt h eh o s tf o ri t sh e a l t hb e n e f i ta n dp r o p h y l a x i sd i s e a s e t h i se x p e r i m e n t d e t e r m i n e dt h ep o t e n t i a lf u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp r o b i o t i cb a c t e r i aa n di t ss y m b i o s i si nv i t r o a n dv i v oi no r d e rt os c r e e no p t i m a lc o m b i n a t i v ep r o b i o t i cs t r a i n s t e n p o t e n t i a lp r o b i o t i c s s t a i n sw e r et e s t e di nt h i s e x p e r i m e n t i n c l u d i n g t w o l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u ss t r a i n sp b la n da 8 7 8 t w ob i f i d o b a c t e r i as t r a i n sp b aa n di o f , f o u r e n t e r o c o c c u ss t r a i n sm 1 ，p b 2 ，a 3 0 ，a 3 1 o n eb a c i l l u sa b t i c i s m 2 ，o n ec l o s t r i d i u m6 加i c u m s t r a i nw a si s o l a t e df r o mc o m m e r c i a l p r o b i o t i c sb yu s i n gt p yt h ee n t e r p a t h o g e n s w e r e b o u g h tf r o mh e i l o n g j i a n gc l i n i c a lm o n i t o rc e n t e r ，i n c l u d i n ge s c h e r i c h i ac o l i ，s h i g e l t o s i s ， s a l m o n e l l a t h eg r o w t hc u r v eo fn i n ep r o b i o t i c sw e r et e s t e db ym o n i t o r i n go d 6 2 0o ff e r m e n t a t i v e f l u i d ，t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a ts o m es t r a i n sh a ds t r o n ga b i l i t yt op r o d u c i n ga c i di n c l u d i n gl a c i d o p h i l u sp b la n da 8 7 8 b i f i d o b a c t e r i ap b aa n di n f , t h ef o l l o w i n gw e r ee n t e r o c o c c u sm 1 p b 2 ，a 3 0 ，a 31 b u tf o u re n t e r o c o c c u sg r e wq u i c k l ya n dh a d n td e l a y i n gp e r i o d ，t h ef i n a l p e r i o do f l o g a r i t h mg r o w i n g o f a l l t e s t e ds t r a i n s w e r e l 2 h o u r f o r 上a c i d o p h i l u s p b la n d a 8 7 8 2 4h o u rf o rb i f i d o b a c t e r i ap b aa n di n f ；8 - 1 0h o u rf o re n t e r o c o c c u sm l ，p b 2 ，a 3 0 ，a 3 1a n d b a c i l l u sa b t i c i s m 2 t h e g r o w t hi n h i b i t i o no f e s c h e r i c h i ac o l ls h i g e l l o s 垃s a l m o n e l lb yt h ef e r m e n t e dl i q u o r o fe i g h t p r o b i o t i c s b a c t e r i aw a st e s t e d t h er e s u l t s s u g g e s t e d t h a tt h e g r o w t h o ft h r e e e n t e r p a t h o g e n sw e r es t r o n g l yi n h i b i t e db y 三a c i d o p h i l u sp b ia n da 8 7 8 ，曰莎d o b a c t e r i ap b a a n di n f t h ed i a m e t e ro fi n h i b i t i o nz o n ew a sc l e a r b u tt h e r ew e r ed i f i e r e n ta b i l l r yo f p r o b i o t i c so ni n h i b i t i n gt h r e ee n t e r p a t h o g e n s t h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s m so f p b l ，a 8 7 8 , p b a ， i n fw e r es o m eo r g a n i ca c i d sa n da n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c ei nf e r m e n t e dl i q u o r 三a c i d o p h i l u ss t r a i n sp b l ，a 8 7 8m i x e dw i t he n t e r o c o c c u ss t r a i n sm 1 ，p b 2 ，a 3 0 ，a 3 l r e s p e c t i v e l yi nt h er a t i oo f 1 ：1i nt h em r sc u l t u r e s c o - c u l t u r a la n ds i n g l el i q u o ri n h i b i t i o nt o t h e e n t e r p a t h o g e n s w e r et e s t e di nt h et e r m i n a lf e r m e n t a t i o n t h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a t a c i d o p h i l u sp b i g r e w w e l lw i t he n t e r o c o c c u ss t r a i n sm i ，p b 2 ，a 3 0 ，a 3 1 a n dh a de f f e c t i v e i n h i b i t i o no nt h ep a t h o g e n s t h eb e s tc o m b i n a t i o nw e r el a c i d o p h i 如sp b lw i t he n t e r o c o c c u s m i ，a 3 0 la c i d o p h i l u s a 8 7 8 9 r e w n o t w e l l w i t h e n t e r o c o c c u ss t r a i n s m l ，p b 2 ，a 3 0 ，a 3 1 t h e g r o w t hi n h i b i t i o no f e n t e r p a t h o g e n sw a sl o w e rt h a nl a c i d o p h i l u sp b l o nt h eb a s eo f l u a c i d o p h i l u ss t r a i n sp b lm i x e d w i t he n t e r o c o c c u ss t r a i n sm 1 ，p b 2 ，a 3 0 。a 3 l ，b i f i d o b a c t e r i a p b aa n dl n fw e r ea d d e dj nt h ec u l t u r e t h er e s u l t ss u g g e s t e dp b aa n di n fw e r e1 i m i t e do nt h e c o c u l t u r e s i t si n d i c a t e dt h a tp b aa n dl n f g r e wb a d l yw i t ho t h e rp r o b i o t i c si nv i t r o e a c hm i c ew e r eg i v e n0 5 m lf e r m e n t a t i v e1 i q u o ro fp r o b i o t i c ss t r a i n sp b l + a 3 0 p b a ， p b l ，m l ，p b i + m 1 p b i + a 3 0f o ro n em o n t 1 t h ec h a n g eo fi m m u n eo r g a n si n d e xa n d c y t o k i n ei nt h es e r u mw e r et e s t e d 1 h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tp b l + a 3 0 ，p b l ，p b l + m l ，p b a c a l l i m p r o v e d t h e g r o w t h o f s p l e e ns i g n i f i c a n t l y w i t ht h e s p l e e n i n d e xe n h a n c e d 2 3 4 ，2 9 ，3 6 6 2 3 6 ( p o 0 1 ) a m o u n t so f i l - 2i nt h es e r u mo f m i c eo f g r o u p so f p b a 、 p b l 、a 3 0 ，p b l + m l w e r ea l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p s ( p 0 0 5 ) t h eg r o u p so f p b a , p b lc a ni n d u c e da m o u n to fi l 一6j nt h es e r u mm o r et h a nc o n t r o lg r o u p s f p 0 0 1 ) a l l p r o b i o t i c c a n i m p r o v e d a m o u n to f1 n f - a ( p 0 0 1 ) t h e r ew e r en od i f f e f e n c ei n p r o b i o t i c s ( p 0 0 1 ) p b l + m 1 ，p b l + a 3 0i n d u c e dm o r ea m o u n tt n f a w e r e1 1 7 n g m la n d 1 1 4 n g m lr e s p e c t i v e ly t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp r o b i o t i ch a dp r o m o t i n ge f f e c t st ot h e i m m u n i t yo f m i c e la c i d o p h i l u ss t r a i n sp b l ，a 8 7 8m i x e dw i t he n t e r o c o c c u ss t r a i n sm 1 ，p b 2 ，a 3 0 ，a 3 1 t h e a m o u n t so fc h o l e s t e r o ir e m o v e df r o mg r o w t hm e d i u mw e r et e s e da f t e ra n a e r o b i c a li n c u b a t i o n a t3 7 t h ea m o u n to f c h o l e s t e r o la s s i m i l a t e dh i g h e r4 0 b vp b l + m 1 ，p b i + p b 2a 8 7 8 + a 3 0 ， a 8 7 8 + a 3 1 t h er e s u l t i n d i e a t e d t h a t p b l m i x e d w i t h m l 。p b 2a n d a 8 7 8 m i x e d w i t h a 3 0 。a 3 1 c a na s s i m i l a t ec h o l e s t e r o ie f f e c t i v e l y a n dt h es i n g l es t r a i n sp b1 、a 8 7 8 、a 3 0 、a 31a l s oc a n a s s i m i l a t ec h o l e s t e r o le f f e c t i v e l y m a s t e rc a n d i d a t e ：z h a n g y i n g - c h u nm a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gl a n - w e i k e y w o r d p r o b i o t i cb a c t e r i a ；f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ；s y m b i o s i s ；e f f e c t so f i n h i b i t i o n ； i m m u n e f u n c t i o n ； a s s i m i l a t ec h o l e s t e r 0 1 - m - 1 刖罱 益生菌是通过改善宿主肠道微生物群的平衡而发挥作用的活性微生物制剂。它可以改 善肠道菌群结构，抑制病原菌，消除致癌鼠子，提高机体免疫力，降低胆固醇。因此，益 生菌作为一个新领域，在食品中应用欲加广泛，除应用于发酵乳制品外，也正逐步被应用 于开发各种功能性食品，如果汁、糖果、冰淇淋、冷冻酸奶等( d o b r o g o s z ，1 9 9 4 ：o r e g o r ， 1 9 9 9 ) ，对于人类的营养和健康具有重要的意义。 1 1 益生菌的概述 1 1 1 益生菌的定义 益生菌的现代定义最早在1 9 6 5 年被( l i l l i y ，s t i l t w e l l ) 阐述为“由一种微生物分泌刺 激另一种微生物生长的物质”。f u l l e r 在( 1 9 8 9 1 9 9 1 ) 经过大量的研究工作最后益生菌定 义为“益生菌是以活菌形式提供补充，通过促进肠道内微生物的平衡对宿主产生有益影响”。 1 9 9 4 年，在德国h e r b o m 召开的益生菌研讨会又对其进行了修订的。定义为：“益生菌是 活菌和( 或死菌) 包括组分和产物的微生物制剂，供口服或者经由其他粘膜途径投入，旨 在粘膜表面处改善微生物和酶的平衡或刺激特异性和非特异性免疫机制”。1 9 9 8 年 ( g u a r m e r ) 提出了更精练的定义；“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。经 过对益生菌不断的研究，益生菌的含义也不断完善，益生菌株也不断增加，益生菌功能也 不断得到证实和承认。 1 1 2 益生菌研究的理论基础 1 2 1 1 动物微生态理论概述 微生态学即微观生态学，是“研究正常微生物群与其宿主间相互关系的生命科学分支 “( 康白，1 9 8 8 ) 。而动物微生态则是“研究动物体内微观环境中的正常微生物及其宿主相 互关系的微生态学分支”( 刘国华，2 0 0 0 ) 。般认为，动物微生态学包括4 个方面的内容， 即动物微生态平衡理论、动物微生态失调理论、动物微生态营养和动物微生态防治理论。 动物微生态理论认为，动物及体内寄生的微生物相互作用，相互影响：在环境因素的影响 下动物与微生物保持动态的平衡；在动物与环境的关系中，正常微生物群中的原籍菌对动 物有益，外籍菌则有害。两者又可以转化；正常微生物群的组成存在种属和个体的特异性： 特定的环境条件可造成动物微生态失调，使生态系统丧失功能；动物与微生物群之间存在 共生关系，互相提供营养等生存条件( 刘国华，2 0 0 0 ) ，这些理论是当前益生菌研究的理论 基础。 1 2 i 2 益生菌基本理论概述 益生菌被摄入动物体肠道后，在复杂的微生态环境中与近4 0 0 种正常菌群汇合，显现 出牺生、偏生、竞争或吞噬等复杂的关系，改变生物体内的微生物群落，促进宿主动物的 东北农业大学工学硕士学位论文 健康。但是，与抗生素相比，益生菌的作用机理在理论上进展还很小，目前主要有3 种学 说：优势种群学说：菌群屏障学说：生物夺氧学说。( 杜震宇，2 0 0 2 ) 1 1 3 益生菌在肠道中的分布 人的消化道包括空腔、胃十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠；其中胃、十二指肠含 菌量很少，绝大多数存在于直肠中。整个胃中的菌落计数低于1 0 5 ，g ( 内容物) ，这是由于 胃内的高酸度决定的。而小肠的菌量则从每毫升内容物1 0 4 个增加到回盲部的1 0 6 1 07 个， 限制小肠内细菌生长的主要因素是肠内容物的排空速度及胆汁和胰液的分泌。直肠是一个 密集的微生态系统，通常有几百种细菌，典型菌量为( 1 0 ”1 0 ”) 据，大部分为严格厌氧 菌。双歧杆菌属、拟杆菌属、厌氧链球菌等在直肠中占绝对优势菌数可达1 0 ”1 0 “个幢； 乳酸杆菌、大肠杆菌、某些链球菌在直肠部的菌数大约为1 07 1 0 8 个幢韦荣氏苗、产气夹 膜梭菌在直肠内降低至1 0 3 卟- g 。( 金世林，1 9 9 9 ；陈朝晖，2 0 0 0 ) 。 表l 一1 胃肠道中益生菌的分布 t a b l e l - lt h ec o l o n i z e dr e g i o no f p r o b i o t i ci nt h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t 部位菌体种类菌体浓度部位菌体种类菌体浓度 ( c f u m l )( c f u m l ) 胃 s t r e p t o c o c c u s 1 0 1 1 0 2 结肠b a c t e r i o d e s 1 0 1 01 0 “ l a c t o b a c i l l u s一e u b a c t e r i u m1 0 1 0 十二指场，与胃相似 1 0 2 1 0 4c l o s t r i d i u m1 0 1 0 空肠 p e p t o c o c c u s 10 1 0 回肠b a c t e r i o d e s1 0 吒1 0 8b i f i d o b a c t e r i u m1 0 9 1 0 1 0 c l o s t r i d i u m f u s o b a t t e d u m1 0 1 0 1 0 s t r e p t o c o c c i s t r e d t o c o c c u s1 0 1 0 1 0 ” la c t o b a c i l l u s 注：本表源自m a t i k a m i k e l s a a r , 1 9 9 8 1 2 益生菌国内外研究动态 1 2 1 益生菌株的研究状况 早在2 0 世纪初，诺贝尔获得者，俄国科学家e l i tm e t c h n i k o f f ( 1 9 8 8 ) 就提出了保加利 亚乳杆菌和嗜热链球菌的益生效果，时至今日，益生菌的研究领域已经得到了拓宽，研究 最多的有乳酸杆菌属( l a e t o b a e i i l u s ) 和双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 。另外还有鲍拉迪酵 母( s a c c h a r o m y c e sb o u l a r d i i ) 、肠球菌( e n t e r o c o o c c u ss p ) 拟杆菌( b a c t e r o i d e ss p ) 芽孢杆 菌( b a c i l l u ss p ) 。目前利用益生菌株的情况如表1 2 ( 陈有容，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 益生菌应用标准 来源于人体的常居微生物；具有耐受胃酸和肠道胆汁的能力：能够黏附在人的消化 道黏膜细胞上：能够在人的消化到内定植：能够产生抗菌物质；能够影响新陈代谢 - 2 - ( 如胆固醇吸收、乳糖酶的活性、维生素的产生蛋白质的分解) 能够调节免疫应答： 能够在生产加工和保存过程中成活并具有一定数量的活苗；无副作用和安全无害的食品 或药品( c o l l i n s ，g i b s o n1 9 9 9 ) 。 表1 _ 2 典型的益生菌株 1 。2 3 益生菌的益生作用 1 2 3 1 益生菌黏附和定植机制 粘附是定植的第一步，它能使乳酸菌扩大菌群，避免被肠道分泌的流体和肠道的蠕动 所清除，1 9 8 2 年k l e e m a n 和k l a e n h a m m e r 发现乳酸菌有两种不同的粘附机理：一种是需 要钙的非特异系统，用实验证实了二价钙可提高益生菌对肠道细胞的黏附性。另一种是钙 独立系统，钙独立系统中有两种乳酸菌成分参与了乳酸菌的粘附，一种成分是抗蛋白酶( 与 菌体表面有关) ；另一种是热稳定的胞外蛋白且对蛋白酶敏感，而双歧杆菌又有所不同， 它的粘附借助于细菌表面或双歧杆菌培养物上清液中的类蛋白促粘附因子，这种粘附似乎 是特异性的，通过细丝状的成分粘附于肠道粘膜表面上( r y h a n e n ，1 9 9 6 ) 。c h a u v i e r e ( 1 9 9 2 ) 研究了2 5 株乳杆菌对c a c o 2 细胞的黏附时发现受试的具有黏附的菌株中有3 株具有不 依赖与c 一+ 的性质。c o c o n n i e r ( 1 9 9 2 ) 研究l a e i d o p h i l u sb g 2 f 0 4 ( 人体来源) 对c a c o 2 细胞的黏附性也表明b g 2 f 0 4 的黏附性与c 矿无关，而是涉及到一个促黏附因子和一个胞 壁因子。b v e m e t 0 9 9 3 ) 研究了1 3 株双歧杆菌对体外培养的c a c o 2 细胞的黏附，发现各菌 株见黏附力有明显差异即双歧杆菌的黏附具有种属特异性，其中有5 株双歧杆菌的黏附性 在很大程度上不依赖于c a “，而是由细胞表面的不稳定蛋白样促黏附因子来调节的。这就 说明了益生菌的黏附具有种属特异性。其实益生菌的黏附也具有宿主特异性，o u w e h m d ( 1 9 9 9 ) 观察了4 株双歧杆菌对不同年龄人的肠黏液的黏附力，发现双歧杆菌对老年人和 ，：，。：一，一，一圣型鳖耋坠兰丝耋。一：一。，：，一。 婴儿肠黏液的黏附力明显低于成年人。 1 2 3 2 益生菌对消化道紊乱的调节作用 众多的研究提示益生菌治疗腹泻具有良好效果。r 0 1 f e ( 2 0 0 0 ) 报道了双歧杆菌和乳杆菌 制剂对各种胃肠道疾病的治疗作用，如抗生素相关性腹泻、细菌性腹泻、病毒性腹泻、食 物相关性腹泻等，腹泻是一种常见的l 临床症状，引起腹泻的原因虽多，但整体可分为感染 型和非感染型两大类，而其中感染型腹泻占大多数，约为8 0 。到目前为止有证据证明 的其调节作用的结果如下： ( 1 ) 感染型腹泻 感染型腹泻，主要由志贺菌、沙门菌、艰难梭菌、轮状病毒、致病性大肠杆菌等致病 菌所致。现已知双歧杆菌、乳杆菌对这类疾病的防治疗效可靠。 吸附于人体的嗜酸乳杆菌具有抗菌活性( s a l m i n e n s ，d e i g h t o n ，1 9 9 8 ) ，该菌株能吸附 于分化的肠道细胞上，还可在体外抵抗幽门螺杆菌，杀灭入侵菌( c o c o n n i e r ，l i e v i n ，1 9 9 8 ) 。 k a i l a ( 1 9 9 2 ) 等用干酪乳酸菌发酵奶治疗3 9 例急性轮状病毒感染的婴幼儿胃肠炎，发现血液 中j g a 、l g c 、l g m 分泌细胞增加，病程明显缩短。i s o l a u r i 等( 1 9 9 5 ) 用干酪乳酸菌给5 4 名 婴儿服用，以给轮状病毒疫苗的婴儿组作阳性对照，发现血液中i g a 、i gm 分泌细胞均增 加a i s o l a u r i 对7 4 个4 4 5 个月的孩子分别用乳杆菌gg 和安慰剂治疗腹泻，发酵乳杆菌 g g 治疗组疗程仅为1 4 天，而对照组为2 4 天，当患儿仅由轮状病毒引起的腹泻时疗效更 为明显。a n a n d 等证明，双歧杆菌对沙门氏菌、志贺氏菌、梭状芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、 金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、伤寒杆菌、变形杆菌、埃希氏大肠杆菌、弯曲杆菌有拮抗 作用。g i b s o n ( 1 9 9 4 ) 等报道，双歧杆菌能产生一种未知的广谱抗菌物质，具有抑制沙门 氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌等病原菌的活性。m i c h e l u t t i ( 1 9 9 6 ) 等将6 3 例4a 内的急性腹泻 病几随机分成3 组。第1 组口服lb 菌株死菌制剂；第2 组给予非微生态制剂；第3 组为 lb 菌株死菌制剂+ 抗菌药物。结果显示：第1 组与第2 组相比，临床症状改善迅速，疗 效有显著性差异。s a a v e d r a 等用加有双歧杆菌的酸奶喂养5 5 例5 2 4 月龄的婴幼儿，与标 准配餐组作对照，结果急性腹泻的发病率由8 降为2 。 ( 2 ) 益生菌与胃健康 幽门螺杆菌是慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的重要病因学因素。根据 m a r s h a l l ( 1 9 9 4 ) 的研究，益生菌对引起慢性胃炎、胃癌的幽门螺形杆菌具有抑制作用，它能 抑制幽门螺形杆菌的定植及其活性。动物试验和人体试验都表明：益生菌或其代谢产物具 有抑制幽门螺形杆菌的感染。m i d o l e 等研究发现包括两歧双歧杆菌的产酸菌，在乳酸浓度 为5 0 1 5 0 m m o i l 时能对幽门螺杆菌n c j c l l 6 3 7 产生抑制。k a b i r ( 1 9 9 7 ) 将研究l a e t o b a c i l l u s s a l i v a r i u s w b l 0 0 4 对幽门螺杆菌的定植抑制从体外试验推向了动物试验。c o c o n n i e ( 1 9 9 8 ) 在最近的一项研究中发现，l b s c s ( 嗜酸乳杆菌代谢产物) 能抑制幽门螺杆菌尿素酶的活 性，无论是离体或在体内试验中均显示出良好的抗幽门螺杆菌活性。 1 2 3 3 益生菌的抑菌机制 益生菌用于调整胃肠道紊乱上，发挥了很大的作用，研究者也正致力于探讨其机理，特定 - 4 益生菌作用于特定病原菌的机制还需要更多研究，另外不同的益生菌的抑菌机理也不同。 而且同一益生菌对不同的致病菌的抑制程度也不同，现将益生菌可能的抑菌机制归纳如下： ( 1 ) 屏障： 益生菌通过磷脂附着在肠粘膜上，与致病菌竞争附着点，与其他厌氧菌一起共同占据 肠粘膜表面，形成生物学屏障，阻止致病微生物定植和侵入，改变肠道菌相构成并保持动 态平衡，保护肠粘膜。此外，双歧杆菌还产生细胞外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复 杂多糖，由于这是潜在致病菌及其毒素的受体，所以通过这种酶的作用可阻止潜在致病菌 及其毒素对肠粘膜上皮细胞的粘附。 ( 2 ) 抑菌及杀菌作用： 益生菌还发酵食物中糖类，产生大量乳酸及醋酸和过氧化氢，降低肠道的d h 值和氧 化还原电位，抑制致病微生物的生长。乳杆菌和链球菌产生的两种抗菌素l a c t o c o c i n s 和 n i s i n 具有广泛的抑菌谱，而且对于引起食物中毒l i s t e r i a ，c l o s l r i d i u m 和b a c i l l u s 具有抑制 性。目前报道的双歧杆菌产生的细菌素有两种一个是从两歧双歧杆菌中( b b f i d u m ) 代谢 物中分离出的称为“b i f i d i n ”的抗菌物质它可以抑制金色微球菌和金黄色葡萄球菌的生长 繁殖( 罗珍兰，1 9 9 8 ) 。另一种是从长双歧杆菌( b 1 0 n g u m ) 中分离纯化出来的称为“b i f i l o n g ” 的抗菌物质，它对大肠杆菌、沙门氏菌、粪链球菌和金黄色葡萄球菌的生长繁殖有抑制作 用( k a n d ，1 9 8 9 ) 。 ( 3 ) 与有害菌竞争营养物质； 通过体外连续培养的方法可以发现肠道固有菌群与外来菌之间对营养物质的竞争现 象。但在肠道内是否有这种竞争营养的作用并没有直接的实验证据。有人认为，这种竞争 并不起多大作用但是在某种物质如生物素成为有害苗的限制因素时，这种抑菌作用就会 表现出来。 ( 4 ) 生物夺氧学说： 在肠道微生态系中，厌氧菌是优势种群。利用非致病的耗氧微生物暂时在肠道定植， 使局部环境的氧分子浓度降低，氧化还原电势下降，促进厌氧微生物的生长，达到提高定 植抗力，恢复生态平衡的目的。这是好氧和兼性厌氧芽胞杆菌的作用机理之一。但在动物 体内是否存在“生物夺氧”作用，还有待进步研究。 1 2 _ 3 4 益生菌与胃肠免疫的关系 益生菌穿越胃酸屏障后，通过粘附，竞争排斥，占位和产生抑制物，在肠道中保持着 菌群优势，并对肠道局部免疫产生重要的影响。肠道局部免疫系统，又称肠道相关淋巴组 织( g u t a s s o c i a t e d t i s s u e ，g a l t ) 包括肠上皮细胞之间及位于板层的淋巴细胞、淋巴滤泡、 p e y e s 小体及肠系膜淋巴结复合物。根据t a n g a n 和s h a n a h a n 的研究，每米小肠内约有 1 0 个产免疫球蛋白细胞存在，约占人体内产免疫球蛋白细胞的8 0 。因此，肠道内能引 起各种来自不同限制性免疫细胞的免疫学应答。人们已经了解到定植在哺乳动物肠道的共 生菌能够提高循环中的特异的和天然的抗微生物抗体的浓度。 目前所报道的乳酸菌的主要免疫调节作用基本类似，包括激活巨噬细胞、b 淋巴细胞 和n k 细胞，增加肠道中i g a 的产生，增加i l 1 、i l - 2 、i l 6 、i l 5 ，t n f q 等细胞因子 - 5 ，。，童苎圣些奎耋三兰堡：；i 丝篁耋。，：! 。，。：，! ，! 的产生量。 ( 1 ) 益生菌与细胞免疫 乳酸菌的某些菌株：鼠李糖乳杆菌( a t c c 5 3 1 0 3 ) ，植物乳杆菌( v t l l ，乳酸球菌 ( a r h 7 4 ) ，双歧杆菌动物亚种是肿瘤坏死因子t l ( t n f - a ) 和i l 6 的强有力的诱导剂 ( h a i l e r , 1 9 9 9 ) ，有些能刺激i l l o ，i l - 1 ，i l 4 ，i l - 5 的产生，以增强免疫。其中i l 6 和t n f q 是被激活的巨噬细胞分泌的两种重要的细胞因子，在参与集体的炎症反应和防御感染、介 导抗肿瘤和调节机体免疫机能中发挥重要的作用( t h o m a s ，1 9 8 9 ) 。许多研究结果显示： 乳酸菌能干预细胞免疫，乳酸菌、双歧杆菌能阻断许多微生物的入侵和粘附( o u w e h a n d ， 1 9 9 8 ) 。 干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞功能，刺激人体产生免疫应答。还通过 巨噬细胞和t 细胞、n k 细胞活性的增强来增强人体的免疫；巨噬细胞、n k 细胞、t 细胞 的活化。有益于增强周围血管和局部淋巴结中淋巴细胞的免疫，t 辅助细胞、n k 细胞的 增加，可使抑制性t 细胞减少。双歧杆菌通过刺激小鼠的巨噬细胞产生一些免疫活性因子 而间接发挥抑瘤作用，在体内外对i l 一6 和t n f - a 的生成有明显的促进作用，对s ，8 0 荷瘤小鼠 均有明显的抑瘤作用( 张宝元，2 0 0 1 ) 。酸奶生产中广泛应用的s t h e r m o p h i l u s 和l b u l g a r i c u s 被证明具有显著的系统免疫调节活性和肠道调节活性( m a r i n ，1 9 9 8 ) 。用1 0 9 嗜酸乳杆菌 给小鼠灌胃8 h 后取其腹膜巨噬细胞培养，所产生的i n f - y 数量明显上升( t e i a r i a - s i m o n ， 1 9 9 9 ) 。一些研究表明，热杀死的b i f i d o b a c r e i u m 、l b u l g a r i c i s 和s t h e r m o p h o u s 的各菌株 均表现出激活巨噬细胞因子的能力。m a d n ( 1 9 9 8 ) 用一个巨噬细胞系和一个t 辅助细胞 系研究4 株酸奶中用的嗜热链球菌( s t h e r m o p h o u s ) 对细胞素的产生的效果，并与保加利 亚乳杆菌( l b u l g a r i c u s ) 、青春双歧杆菌( b a d o l e s c e n t i s ) 和两歧双歧杆菌( b b i f i d u m ) 相 比较，结果发现热灭活的s t h e r m o p h o u s 对肿瘤坏死因子t n f d ，白细胞介素i l 2 、i l 6 、 i l 5 都有影响，所有菌都诱导巨噬细胞中i l - 6 产生量显著增加，尤以s t h e r m o p h o u s l 3 3 活 性最强。4 株s t h e r m o p h o u s 对t n f a 的诱导作用也很强。当用三组乳酸菌细胞和脂多糖 共同刺激巨噬细胞时也能在一定程度上增加t n f t l 和i l 6 的产量。至今为止的理论倾向 于认为，细胞壁是乳酸菌免疫激活作用的主要活性成分( s e k i n e ，1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) 益生菌与体液免疫 口服乳酸菌或双歧杆菌能刺激人体产生非特异性免疫。乳酸菌能刺激机体产s i g a 的 细胞增殖，从而使得s l g a 水平上升，可促使系统对轮状病毒产生免疫应答，中和毒素， 缓解轮状病毒引起的腹泻、急性肠胃炎、厌食、遗传性过敏皮肤炎、c r o h n s 等病的症状。 y a s u i 等发现口服短双歧杆菌可激活小鼠体液免疫系统，提高抗轮状病毒l e a 或抗流感病 毒i g g 产生，乳酸双歧杆菌能增强小鼠对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌0 1 5 7 ：h 7 感染的 抵抗力，特异性l g a 抗体升高( 蓝景刚，2 0 0 2 ) 。高桥毅( 1 9 9 2 ) 等用长双歧杆菌和嗜酸 乳杆菌饲喂b a l b c 小白鼠，每隔l 砣周采血测定血清中的特异性抗体，结果表明，空腹 乳酸菌6 7 周后血清中的抗体效价显著上升，说明乳酸菌具有刺激机体产生特异性抗体的 作用。总之，乳酸菌及其产物的作用与佐剂相似，具体地说就是诱导干扰素产生，促进细 胞分裂、体液及细胞免疫，对肠粘膜有非特异的免疫刺激作用，能促进肠粘膜细胞分泌l e a ， l e a 的主要作用是抑制细菌对肠粘膜的粘附，并通过它对细菌的凝集作用有利于促进病原 - 6 - 前言 菌从体内排出。s i m o n e 等将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵的酸乳，添加到饲料中，饲 喂小白鼠，然后给小自鼠口服鼠伤寒沙门氏菌使其感染，在不同时期分别计数各脏器中的 伤寒杆菌活菌数。结果发现，饲喂乳酸菌发酵酸奶的小自鼠，在感染后第4 天，肝和脾脏 中的鼠伤寒杆菌活菌数，比不饲喂酸奶的对照组显著减少，而且，饲喂酸奶组小