（食品科学专业论文）抗人轮状病毒卵黄免疫球蛋白的制备及性质研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名查蛊样 、j 酗盼引汐 时间： 蜘f 年f 月，。同 日钢。瑚c 茸6 司，调 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 查旦铭 一 i j 妒 时删：伽6 年f 月f 。f 时叭溯6 年月f 口同 沈刖农业大学硕士论文 摘要 卵黄免疫球蛋白( i 咖u n o g l o b u i i ny 0 1 k ，i g y ) ，又称鸡卵黄免疫球蛋白，是产蛋鸡 经免疫刺激后，机体产生免疫反应，在卵黄成熟期由血液中i g g 被选择性地转移到卵黄 中形成的( l o e k e nm r c ta l ，1 9 8 3 ) ，它与抗体具有相似的结构及相应的活性。i g y 与哺乳 类动物血清抗体相比具有许多优点：如不激活哺乳动物的补体系统，不与细菌或哺乳动 物细胞的受体结合，不活化样品中内源性的补体系统，不与类风湿性因子( r f ) 结合 从而避免假阳性结果( a l a r s s o ne ta l ，1 9 9 1 ) 等等，在免疫诊断学领域有着重要的作用。 此外，特异性i g y 还具有抗菌、抗病毒和抗外毒素等多种活性，因此口服特异性i g y ， 可有效地作用于病原体，以达到消化道感染性疾病的防治的目的，尤其对不能产生主动 免疫应答的个体：如新生儿或有获得性免疫缺乏症的儿童以及由于化学治疗、营养失调、 老年化引起免疫功能下降的老年人等具有一定的保护作用( j f i c h 协l ie ta 1 ，1 9 9 3 ) ，因此， i g y 作为一种食品中的功能因子具有广阔的应用前景。 为推动我国功能性食品的发展，本论文以自制的人轮状病毒油乳灭活疫苗为抗原对 产蛋鸡进行人工免疫，对特异性i g y 的产生规律及性质进行了系统的研究，得出结论如 下： 1 以人一w a 株轮状病毒作为抗原，制作油乳灭活疫苗。将所研制的疫苗按油乳疫苗 的相关标准进行物理稳定性及安全性检验，结果表明该疫苗具有良好的稳定性及安全 性。 2 用该疫苗对产蛋鸡以不同剂量( 0 8 1 0 4 t c i d 、1 6 1 0 4 t c i d 、2 4 l0 4 t c i d ) 分别进行翅下皮下、胸部肌肉免疫。免疫程序为初免一次，加强免疫两次，每次免疫时 间间隔均为7 天。从初免第二天开始收集鸡蛋，用水稀释与硫酸铵两步沉淀相结合的方 法提取i g y ，并用间接e l i s a 跟踪检测鸡卵黄免疫球蛋白( i g y ) 活性，结果显示：翅下 皮下免疫组在初免后的第l l 天( o d 4 5 0 = 0 2 8 6 ) 开始出现特异性i g y ，胸部肌肉免疫组在 摘要 初免后的第1 3 天( o d 4 5 0 = 0 3 8 0 ) 出现。免疫部位对特异性i g y 活性变化几乎没有影响， 免疫剂量对特异性延y 活性的影响较为明显，o 8 1 0 4 t c i d m l 剂量免疫所得i g y 效价明显 低于1 6 1 0 4 t c i d m l 和2 4 1 0 4 t c i d m i 蒯量免疫的卵黄抗体效价。特异性i g y 变化规 律：一免后卵黄抗体活性有微弱的升高，一次加强免后活性上升明显，二次加强免后， 在两个月的时候特异性i g y 活性达到峰值( 0 d 4 5 0 = 1 6 7 ) ，而且维持在较高的活性水平 近两个月之后开始下降。 3 s d s p a g e 电泳检测i g y 的理化性质结果表明：在低于7 5 条件下，抗h r v i g y 性质稳定，在声h 1 0 的情况下容易发生变性，而在中性和弱碱性环境中有较好 的稳定性：胃蛋白酶、胰蛋白酶对抗h r v i g y 的稳定性均具有不利的影响，水解时间越 长影响越明显。 4 间接e l i s a 检测i g y 的生物活性结果显示：在低于7 5 时，i g y 的活性比较稳定， 但随着温度的上升，活性迅速下降。i “在弱碱性、中性和弱酸性条件下都有较高的活 性保留率，如i g y 在p h 4 o - 9 o 的环境中，4 h 后，仍保留5 0 以上的活性。当p h 4 o 时，胃 蛋白酶( 1 5 u 咖l ) 对i g y 活性的影响较小，但当p h 2 o 时，经胃蛋白酶作用1 h 后其残留活 性小于1 0 。i g y 对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的敏感性较p h 2 0 胃蛋白酶要弱得多，处理 6 小时后活性保留率仍为6 0 左右。果糖、葡萄糖、乳糖、糊精均对抗h r v i g y 都具有一 定的保护作用。 关键词：人轮状病毒，油乳灭活疫苗，鸡卵黄免疫球蛋白，酶联免疫吸附法 2 沈阳农业大学硕士论文 a b s t r a c t i m m u n o g l o b u l i ny o l k ( i g y ) ，o rn 锄e dc h i c k e ny o l ka n t i b o d y o r i g i n a t e df 而mp a r to f s p e c i f i ci g gw h i c ha r es e l e c t e da i l dt r a n s f e r r e df r o mt 1 1 eb l o o dt oe g gy o l ko fi i r l r n u n i z e d h e l l si i l 1 em a t u r ep e r i o do fi t se g gy o l k ( l o e k e nm re ta l ，1 9 8 3 ) a 1 1 di ti ss i n l i l a rt o a m i b o d yi ns 仃u 曲l r ea n da c t i v i 吼c o m p a r e d 、v i mm 猢a l i a ns e m ma n t i b o d i e s ，i g yi s s u p e r i o r ，f o ri n s t a n c e ，n o ta c t i v a t em a m m a l i a i lc o m p l e m e n ts y s t e m ；n o tc o m b i n e 谢t h r e c 印t o r so fb a c t e r i a l so rm 觚吼a l i a nc e l l s ；n o ta c t i v a t ee n d o g e n o u sc o m p l e m e n ts y s t e mi n s a m p k s ；n o ti n t e r a c t 、v i 血r h e u m a t o i df a c t o r s ( a l a r s s o ne ta l ，1 9 9 1 ) a n ds oo i l s oi tp l a y s a r ii m p o r t a mr o l ei nt l l ef i e l do f i m m l l i l o d i a g n o s t i c s i na d d i t i o i l ，m es p e c m ci g y h a sa b i i i t y o fa n t i - b a c t e r i a ，“m sa 1 1 dt o x o i d ，s ot a k e no r a l l y ，i tc a i ld i r c c t l ye l i m i n a t ep a t h o g e n s 柚d e 币c i e n t l yp r e v e n ta l l dc u r c 洫f c c t i o u sd i s e a s e so fe m e r o n e s p e c i a l l yt oac e n a i ne x t e n t ，i t p o s s e sp r o t e c t i o nf o ri n d i v i d u a l sl o s ta c t i v ei m m u n er e s p o n s e ，s u c ha si n f h t so rc h i l d r e n 、v i ma q u i r e di m m l l l l o d e f i c i e n c ys y n d r o m ea i l da g e dp e o p l e ，w h o s ei l i n u n e 血n c t i o n 掣删l yw e a k e n sd l l et 0c h e m i s t r ym e r a p y 姒l 雠t i o nm a l a d j u s n e n t 舡l ds e n e s c e n c e h e n c e ，a sak i n do f 血n c t i o n a la g e n ta d d e dt of o o d ，i g yh a sa v e r ye x t e n s i v e 印p l i c a t i o n i np r a c t i c e ( j f i c h t a j ie ta l ，l9 9 3 ) i no r d e rt op r o m o t et 1 1 ed e v e l o p m e n to ff o u n c t i o n a lf o o di nc h i n a ，t h es t u d yo nt 1 1 e p r o p e r t i e so fs p e c i f i ci g yg e n e r a l i e df 如mh e n si i 衄u n j z c db yt h eo i l - e m u l s i o ni n a c t i v a t e d v a c c i n ea g a i n s th r vp r o d u c e di no u rl a b ，i sc a r r i e d0 u t ，a i l dt l l em a i nc o n c l u s i o n sa r e s h o w e dh e r e 1 a 舳rt e s t e da c c o r d i n gt ot l l ec o r r e l a t i v ec r i t e r a ，山er e s u l t ss h o w e dt h ep h y s i c a l s 乜b i l i t ya n ds a f 妇o f o i l e m u l s i o ni n a c t i v a t e dv a c c i n ei sw a r r a m e d 2 t h r e ed i 仃e r c n tv a c c i n ed o s e ，o 8 1 0 4 t c i d ，1 6 1 0 4t c i da n d2 4 1 0 4 t c i dw e r e i m m u i l i z e dv i ah y p o d e n i l i c e c t i o no fi n s i d ew i n gs k i na n dc h e s tm u s c l ei n j e c t i o n ， r e s p e c t i v e l y aw e e kl a t e r ，b o o s t i n gw i me q l l a la m o u i l tv a c c i n ei ne v e r y7d a y si n t e r v a lf o r 2t i m e sa tt h es a n l ei m m u l l i 臻t i o ns i t c s e g g sw e r ec o l l e c t e d 晌m2 n dd a ya r e rn r s t i m m u n i z a t i o n ，a n ds p e c i f i ci g yw a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e db ym e t h o d so fw a t e rd i l u t i o n a n d ( n h 4 ) 2 s 0 4p r e c i p i 诅t i o na i l d i t sa c t i v 时w a sd e t e c t e db yi n d i r e c te l i s a r e s u l t s s h o w e dt h a t ，i nt h eg r 0 1 】po fi m m u i l i z i n gi n s i d es k j no f 、v i n 舀s p e c i f i ci g ya n t i b o d yw a s f i r s td e t e c t l 强f b me g gy o l ko nt i l e1 1 t i ld a y ；i nt l l e o t l l e r 掣o u p ，o nt h e 1 3 ld a y 3 a b s t r a c t i m m u n j z a t i o ns i t e sa f r e c t e df e wo na n t i b o d ya c t i v i 吼w h i l ei m m u r i i z a t i o nd o s ed i d r e m a r k a b l y 1 h ei g yt i t e rg e n e 删司b yt l l ed o s eo f o 8 l o 叶c i d m lw a so b v i o u s l yl o 、v c r m a i lt l l a to f b yt h ed o s eo f1 6 1 0 叶c i d ，m la n d2 4 1 0 4 t c i d m l 1 1 1 ei g ya c t i v i t y 印p e a r e dac e r t a i nv a r i a l l c er e g u l a r i t yt h a ta c t i v i t yi n c r e a s es l i t l ya r e rf i r s ti m m u n i z a t i o n ， m e n 协t l ya f t e rf i r s tb o o s t i n ga i l dr c a c h e dp e a kv a l u e ( o d 4 5 0 = 1 6 7 ) o n2 n dm o n t l l 啦c r l a s tb o o s 血1 9 ，a 1 1 dk e p ta tt h eh i g hl e v dn e 州yf o r2m o 丑t 1 1 3 t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fi g yw e r ca n a l i z e d b ys d s p a g e r e s u l t s s h o w e di g ya g a i n s th r vw e r es t a b i l i t ya t7 5 b u tp r o n et od e n a t u r ea tp h 1 0 o ，h o w e v e r ，i t ss t a b i l i t yw a s9 0 0 du n d e rt h en e i l t r a la i l df e e b la l k a l i n ec o n d i t i o n ； p e p s i na n d 仃y p 血c a nb o t l la 恐c tt l l es t 曲i l i t yo fi g ya g a i s t 圈va i l dt h et i m ei sl o n g e r ， t h eh y d l o l y s i sw a sm o r eo b v i o u s 4 h l d i r e c te l i s ar e s u l t ss l l o w c d ：t h es t a b i l i t yo fi gyw a sb e t t e ra t7 5 ，w h i l et h e i n l l i l u l l o a c t i v i t e so fi g ym p i d i yd e c r c a s e d a l o n g 谢mt e m p e r a n i r e r a i s i n g t h e i 姗u i l o a c t i v i t e sr e m a i n i n go fi g yi s 场曲r e l a t i v e l y f o re x 锄p l e ，i r 衄u n o a c t i v i t e so fl g y r e s i d e d5 0 a 舭r4h o u r sp i a c e da tp h4 0 - 9 _ o t 1 l ei m m u n o a c t i v i t e so fi g yw a sl i m e a f i b c t e da tp h4 ow i t hi n t 锄c t i n gw i t t lp 印s i n ，b u t 、v a sl e s slo a tp h2 of o r1h o u r t h e h m u n o a c t i v i t e so f 垮yw a sn o ts e n s i t i v ea t p h 7 6i n t e r a c t i n g 、v i t l l 圩y p s i n a 1 1 d c h y m o 衄p s i i lc o m p a r et op e p s m ，a tp h 2 ，0 t h ea c t i v i 移r e m a i n i n go fi g yp l a c e d6h o u r s h 邯a b o m6 0 f m c t o s e ，四u c o s e ，i a c t o s ea i l dd e x t r i n ec a n p r o t e c tt h ei m m u n o a c t i v i t c so f i g y k e yw o r d s ：h r v ，t h eo i l e m i l l s i o ni n a c t i v a t e dv a c c i n e ，i m m u n o g l o b u l i ny o l k ，e l e s a 4 沈阳农业大学硕士论文 第一章前言 鸡卵黄免疫球蛋白( 塘y ) 是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的蛋白，1 9 6 8 年的一次国际会议上决定称之i m m o g l o b u l i n ，简称i g 。它是产蛋鸡受免疫刺激后，机 体产生免疫反应，在卵黄成熟期，血液巾i g g 被选择性地转移到卵黄中的唯一一类免疫 球蛋白( l o e k e nm r e ta l ，1 9 8 3 ) 。g a l t s t e i n 和h e m m e l e r ( 1 9 8 5 年) 指出，在一个月内收集的 鸡蛋提纯i g y 产量比兔i i 清高1 8 倍。由于i g y 的含量高，产量大，可用于替代兔或羊等 动物等动物血清，特异性l g y 具有抗葡、抗病毒和抗外毒素等多种话性。同时，卵黄抗 体与哺乳类动物血清抗体相比还具有许多优点：培y 要比哺乳动物i g g 容易进入不同的抗 体组成系统中，提高对保守抗原产生抗体的可能性，而这种保守抗原是难以使兔产牛抗 体的。此外，鸡i “不激活哺乳动物的补体系统，也不结合到细菌或哺乳动物细胞的受 体上，不会活化样品中内源性的补体系统，也不与类风湿性因子( i 玎) 结合，从而避免 上述假阳性和假阴性结果给免疫学试验带来的干扰( a l a r s s o ne ta l ，1 9 9 1 ) 。 通过口服特异性抗体i g y ，作削于病原体，以达到口腔及消化道感染性疾病的预防 与治疗，尤其对那些不能产生主动应答的个体，如新生儿，有获得性免疫缺乏症的儿童， 以及由于化学治疗、营养失调或老年化引起免疫功能下降的儿童或老人等具有一定的保 护作用( j f i c h t a l i e a 等，1 9 9 3 ) ，在其食品中添加鸡卵黄免疫球蛋白也就显得非常重要， 因而近年来国内外学者对i g y 的研究比较活跃，使之展现出了广阔的应用前景。 目前全世界每年死于腹泻的患者达5 0 0 1 0 0 0 万，其中大部分是婴幼儿患者。人轮 状病毒是新牛婴幼儿肠道感染病引起呕吐腹泻的最主要原因之一，据统计在世界范围内 轮状病毒每年可造成4 5 “5 万5 岁儿童死亡。所以对于抗人轮状病毒卵黄免疫球蛋白( 抗 h r v i g y ) 的研究无论在食品领域还是在医药领域均具有十分重要的理论和实践意义。 1 1 轮状病毒概况 轮状病毒( r o t a v i r u s ，r v ) 属于呼肠孤病毒科( r e o v i f i d a e ) ，轮状病毒属( r o t a i r i l s ) ，是 轮状病毒( r o t a v i r u s ，r v ) 属于呼肠孤病毒科( r e o v i r i d a e ) ，轮状病毒属( r d t a v i m s ) ，是 前言 引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的重要病原。1 9 6 8 年美国的m e b u s 首次从犊牛 粪便中分离到轮状病毒，1 9 7 3 年澳大利亚学者b i s h o p 在胃肠炎患者的十二指肠超薄片 中发现人轮状病毒，随后在欧美、澳洲、新西兰等各国亦有犊牛、幼驹、绵羊、兔及禽 类等多种动物的轮状病毒感染。1 9 7 9 年，我国庞其方等首次在腹泻病儿粪便中检测到 轮状病毒，以后又在仔猪、犊牛、羔羊等多种动物粪便中分离到轮状病毒( 于恩庶等， 1 9 9 6 ) 。目前，轮状病毒感染引发的腹泻已遍及全世界，对人类健康构成严重危害。 1 1 1r v 病原特性 1 1 1 1 病毒粒子的结构 完整的r v 粒子呈球形，无囊膜，双层二十面体对称，病毒粒子直径约6 5 7 5 m 。 外观里车轮状：病毒的中央为r v 芯髓，是一电子致密的六角形核心：核心周围存在一 个由6 0 个表面钉状物( 约1 0 衄长的球状末端结构) 组成的电子透明层，表面钉状物 由此向外呈辐射状排列构成内衣壳；外层是由光滑薄膜构成的外衣壳，厚约为2 0 衄。 以病毒芯髓为毂( 1 l u b ) ，以呈辐射状的内衣壳为轮辐( s p i k e ) ，以外衣壳为辋( t a c k l e ) ，构成 r v 特征性的车轮状结构( s t a 皿a r d l me t a l ，1 9 7 7 ) 。在粪样和细胞培养物中病毒粒子以不 同形式存在：具有双层衣壳的光滑型( s 型) 双层颗粒、没有外农壳的粗糙型( r 型) 单壳颗 粒( 无感染性) 、通过电镜负染还可以见到无衣壳的核心( 殷震等，1 9 9 7 ；庞听等，2 0 0 0 ) ， 只有双层衣壳的病毒粒子具有感染性。目前公认的r v 超微结构模型是p r a s a d 等用图像 处理电子显微摄像技术发现的三维结构模型。此模型认为成熟的病毒粒子为t = 1 3 的2 0 面体对称，外衣壳由7 8 0 个v p 7 蛋白分子和6 0 个由v p 4 二聚体形成的纤突( s p r i k e ) 组 成，内衣壳由2 6 0 个v p 6 分子三聚体组成，排成t = 1 3 的晶格状( p r a s a db ve ta l ，1 9 8 8 ) 。 最里面的芯髓由v p l 、v p 2 、v p 3 和1 1 个d s r n a 片断及与其结合的非结构蛋白组成。 r v 的结构模式图见图1 ，晶格模式图见图2 。 6 沈阳农业大学硕士论文 图1 成熟轮状病毒粒子结构模式图 f 嘻im o d do f r v sp e l l c f ( 疗0 ms t n a r d ) 圈2 轮状病毒晶格结构模式图 f i 舀2m 0 d e f0 f r v sp c l l c t ( 厅o ms t n a r d ) 1 1 1 2 轮状病毒的培养特性 r v 很难适应细胞培养生长，需经胰蛋白酶等蛋白水解酶处理后才能适应细胞，且 维持液中不加血清。主要原因在于轮状病毒表面v p 4 能抑制病毒在细胞上生长，但v p 4 对胰酶敏感，用胰酶处理病毒后将v p 4 裂解为v p 5 ( 6 0 k d a ) 和v p 8 ( 2 8k d a ) ，暴露出与 细胞受体相结合的位点，增强病毒的生长繁殖能力m r u g g 嘶e ta l ，1 9 9 1 ) 。r v 除a 群 外，其他群的许多毒株迄今未能适应细胞培养，分离成功率为4 0 7 0 ，因此只能通 过易感动物来分离和增殖病毒。r v 的分离培养最初多采用原代细胞，后来改用敏感细 胞系恒河猴胚肾传代细胞m a l 0 4 或非洲绿猴肾细胞m a r c 1 4 5 ，且已先后成功地分离到 适应于细胞培养的多种动物轮状病毒细胞株。常用的细胞系还有人肝细胞系h e p g 2 、 人克隆细胞c a c o 一2 、原代非洲绿猴l 弩细胞系a g m k 和非洲绿猴肾细胞系c v l ( 殷震等， 1 9 9 7 ) 。1 9 8 2 年国内首次分离到水牛轮状病毒，以后相继发现猪、犬、羊、奶牛、兔以 及鸡轮状病毒。 1 2 i g y 概况 1 2 1i g y 分子结构特点 鸡i g y 分子量为1 8 0 k d a ，由两条重链和两条轻链通过二硫键连接在一起，呈“y ， 型，其中重链约6 7 k d ，i g y 的重链含4 个不变区( 哺乳动物i g g 为3 个) 。轻链约2 2 k d 。 7 其沉降系数为7 8 s 。等电点接近于5 2 ，含氮量为1 48 。 i g y 不同于i g g ，i g y 没有铰链区，在c v l 和c v 2 以及c v 2 和c v 3 有一个“转换区”， 此区含有脯氨酸和甘氨酸残基( 如图3 、4 ) 。这些区使k y 分子具有一定的灵活性。i g y 的c v 2 可能“浓缩”形成了i g g 的铰链区。i g y 的c v 3 和c v 4 与k g 的c v 3 和c v 4 紧 密相关( gw w a m e ta l ，1 9 9 6 ，y s a i l d o e ta l ，1 9 9 5 ) 。s l l i m i z u 等比较了鸡的i g y 与兔的i g g 的结构发现，在i g g 中v l 和c l 之间有一链内二硫键，它稳定了轻链的结构，而在i g y 中没有此二硫键。鸡k y 在c v 2 和c v 3 连接中有两个附加的半胱氨酸残基- 半胱氨酸3 3 1 和3 3 8 。因为在i g y 中没有自由的巯基，因此这些半胱氨酸可能参与了重链内的二硫键 的连接。兔i g g 仅在c v 2 区有一糖基化位点，i g y 在c v 3 区可能有另一糖基化位点。 此外，鸡的i g y 与兔的i g g 的二级结构也不同，在k y 中，p 片层较少( m s h i m 咖等1 9 9 2 ) 。 圈3 i g g 分子结构示意图 f i g 3s k c t c ho f k gm 0 1 e c u l es 订u c t 吣 图4 i g y 分子结构示意圈 4s k e t c ho f l g ym o i e c u | es t n 王c t u r e 1 2 2i g y 的物理化学性质 i g y 的性质比较稳定，活性保持良好( l a r s s o n a ，k 撕s s o n ，p a aa1 9 9 1 ) 。在室温条 件下，i g y 活性可保持6 个月。4 贮存6 7 年，活性下降仅在5 以内( 钟青萍，杨荣鉴， 熊勇华等，1 9 9 8 ) ，此外i g y 比较耐热、耐酸、耐碱，在p h 4 o l1 0 时稳定，在p h 3 0 下活性迅速下降，p h l 2 o 时活性降低；温度达到6 5 时，i g y 活性仍可保持2 4 h 以上， 7 0 加热9 0 分钟后活性下降。另外i g y 有较大的抗高压性能俄而且能抵抗幼龄动物的 胃酸屏障，可抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化( 钟青萍等，1 9 9 8 ) 。 r 沈阳农业大学硕士论文 1 2 3i g y 国内外研究概况 国际上对于i g y 制备技术的研究始于8 0 年代，日本与加拿大在i g y 的开发方面处于国 际上的领先地位。作为日本政府科学技术厅新技术事业团的重点项目，自8 0 年代末期起， 日本太阳化学公司等开始开展i g y 制备技术的研究，成功地开发了i g y 的工业规模制备技 术，并利用i g y 防治危及婴幼儿生命的轮状病毒( h r v ) 痢疾症、预防蛀牙等病毒性和细菌 性疾病，取得了轰动性成功。美国p r o m e g a 公司己经推出了i g y 的纯化系统，即b g g s t r a c t k y 纯化系统。 i g y 技术研究工作，在我国起步较晚，直到1 9 9 3 年才由轻工部列为重点攻关项目。 近年来，我国的i g y 抗体技术研究单位和公司正逐渐增多，这些说明i g y 的研究与应用被 受国内外重视，但是由于提取、纯化技术发展缓慢，导致我国在特异性i g y 产品的开发 和利用方面的滞后。 1 2 4i g y 分离纯化的研究进展 尽管人们己认识到卵黄是抗体生产的一种重要来源，但作为理想试剂，i g y 尚未广 泛应用于生产实践，部分原因在于从卵黄中分离i g y 存在工艺方面的困难，因此需要研 究有效的方法对i g y 进行分离和纯化( a k i t a em ，l k a i s ，1 9 9 3 ) ，特别需要研究大规模生产 i g y 的技术。近年来，已建立的很多种i g y 的分离纯化方法包括：水稀释法( w d ) 、硫酸 铵沉淀法、聚乙二醇法、葡聚糖硫酸盐法、黄原胶法、冷乙醇分级分离法、水稀释超 滤法等。 1 9 8 1 年，j e n s e n i u s 等提出了葡聚糖硫酸盐法( d s ) ，是用i o 葡聚糖硫酸盐和l m o l l 氯化钙沉淀l g y ，然后用缓冲液溶解，采用1 9 和1 4 硫酸钠二次盐析，得率为 7 5 m 班g y m l 卵黄，纯度为8 7 。 1 9 8 5 年，p o i s o n 等提出了聚乙二醇法( p e g ) 卵黄用4 倍体积缓冲液稀释后，采用3 5 和1 2 p e g 两次沉淀，重新溶解后用一2 0 的5 0 乙醇沉淀，得率为4 9 m g i g y m l 卵黄， 9 前言 纯度为8 7 。 1 9 8 8 年，h a 仕a 等人提出了黄原胶法( ) ( m 叼，系用x a n 有效沉淀去除脂蛋白，再经1 9 和1 4 的硫酸钠二次盐析，得率为7 3 m g i g y m l 卵黄，纯度为8 9 。 1 9 9 2 年，a “t a 提出了水稀释法( w d ) ，用9 倍水稀释卵黄，调p h 5 o 一5 2 ，4 下静置 6 h 。取上清液用1 9 硫酸钠盐析，沉淀物重新溶解后采用酒精沉淀、1 4 硫酸钠盐析或 超滤三种方法中的一种处理。得率9 8 m g i g y ，h l 卵黄，纯度9 4 。a k i t a 比较了上述四种 方法，从产品得率和纯度来看，以水稀释法最好，得率和纯度均较高，生产成本也低， 尤适宜于工业化生产。用硫酸钠盐析处理易造成免疫球蛋白的变性，而用聚乙二醇沉淀 处理则变性可能性要小得多，但聚乙二醇沉淀的得率要较硫酸钠盐析小得多。 1 9 9 3 年，h o r i k o s h i 等提出了冷乙醇分级分离的方法。卵黄用8 倍蒸馏水稀释，l o 静置 后离心，上清液用浓度6 0 的冷乙醇沉淀离心，沉淀用3 0 舢o n a c l 溶解，经过滤后 可除去大部分脂蛋白，然后再用终浓度为3 0 和2 5 的冷乙醇分别沉淀离心，产品纯度 达9 9 以上，此法适宜于大规模制各i g y 。 1 9 9 7 年，杨严俊等提出了水稀释超滤浓缩和离子交换纯化i g y 的方法。卵黄经稀 释后进行分离取上清液经澄清后进行超滤浓缩，浓缩液经微孔过滤、冷冻干燥后得i g y 粗品再经d e a e 纤维素层析可得精制i g y ，其纯度达9 5 以上。k i m 和n a k a i 使用 a m i c o n0 f 系统在n a c l 的存在下直接从w s f 中分离i g y ( i g y 在n a c l 达l ，5 m 即可形 成二聚体) ，效果较好。其后又对照了利用冻融过滤脱脂，使用a m i c o nc e l l 系统膜截留 分子量( m w c o ) 为3 0 0 k d ，1 0 0 k d 和3 0 k d ，h a r p ，a g 系统的m w c 0 均为1 0 0 k d 和k o c h 超滤系统m w c 0 为2 5 0 k d 和3 0 k d 提取i g y ，用高截留分子量膜超滤得二聚体，再冲 洗通过m w c o1 0 0 k d 或3 0 k d 的膜得单体i g y 。a m i c o n 的纯度和回收率为7 4 9 9 和8 0 8 5 ，该法是目前最有效的提取方法。 0 沈阳农业大学硕士论文 1 3 鸡卵黄免疫球蛋白的应用 随着研究的深入，鸡卵黄i g y 目前的应用领域主要包括免疫学诊断、医药及保健品 的研制等三个方面。例如：用于病毒的诊断、特定分子的测定、食品掺假或残留分析以 及用于处理感染性腹泻、防止龋齿等。 自从s c h i e m a n n 等用鼠伤寒沙门氏菌减毒变异株免疫鸡，在卵黄中发现i g y 较长期大 量增高后，对特异性i g y 的研究得到了扩展。例如，用热杀伤性幽门螺旋杆菌( h p ) 经 口服免疫鸡，产生的特异性i g y 用于阻止h p 生长，降低其活力以及氨的产生，同时阻止 血清中抗h p 抗体的产生以减少急性胃炎的发生率：连续服用抗轮状病毒卵黄抗体可用来 预防和治疗轮状病毒引起的儿童腹泻及其他感染，黄雄七等人将i g y 应用于临床治疗婴 幼儿轮状病毒性肠炎，并对治疗效果进行了统计学分析，认为使用l g y 的疗效显著； y b l k e n 等的研究证明，i g y 能有效参与幼龄动物的胃肠道的屏障保护作用，即口服迫y 可 使实验动物获得对相应病原体引起的胃肠道感染性炎症的被动免疫保护作用。另外，目 前有人正在研究用特异性鸡卵黄免疫球蛋白制作成抗蛇毒抗体治疗蛇咬伤的病人，m a y a 等研究表明从卵黄中纯化出来的抗蛇毒免疫球蛋白具有一定的生物活性因而使其具有 临床应用的潜力；由于提纯的i g y 可识别胃肠道癌细胞，近年来i g y 也被应用于生物方法 中进行检测癌细胞和作为分析蛋白特点的生物工具：常山等首次报道用i g y 制备抗真菌 抗体，即用白色念珠菌作为抗原免疫鸡，通过改良水溶法( w d ) 提取卵黄中的i g y ，该法 已获得成功可进一步开发作为白色念珠菌快速诊断的简便试剂；i g y 也可用于抗甲3 型流 感病毒、大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、内毒素等抗体的制备。目前，i g y 抗体主要用于实验室诊 断和研究，由于i g y 在凝胶扩散中不易产生沉淀线，仅应用于el i s a 试验和免疫电泳方 法：c i p o l l a 等用福尔马林使胎儿弯曲菌细胞失活，并以它为抗原免疫产蛋鸡，所得抗体 与荧光素结合，利用荧光免疫试验对胎儿弯曲菌感染有较高的发现率。 八十年代后，随着口服被动免疫的开发日益受消费者关注，i g y 开始被用作功能性 前言 食品成分单独使用或添加到婴儿食品和老年食品中用以提高人体的免疫力，增强对各种 疾病的抵抗能力。而且从卵黄中提取的免疫球蛋白同血清中的相比，对几种病原体有较 好的选择性，最典型的例子就是用于生产仿母乳配制奶粉，通过添加i g y 使配制奶粉与 母乳具有相近的免疫潜力，饮食后能提高婴儿对疾病的免疫力并有利于婴幼儿生长发 育；日本福山大学的科研人员还将抗龋齿病原菌的鸡卵黄免疫球蛋白添加于食品中作预 防龋齿之用。 近年来，日本在口服特异性i g y 抗体防治人轮状病毒( h 啪a n r o t a v i m s ，h r v ) 和 产肠毒素的埃希氏大肠杆菌感染引起的腹泻，龋齿以及养殖鱼和家畜消化道感染等方面 进行了大量的动物喂养实验，证实i g y 的防治效果显著。 此外，i g y 还可用于化妆品领域，将特异性的i g y 添加入化妆品中，可用于某些皮 肤病的防治。 1 4 研究的目的和意义 i g y 有良好的稳定性和生物活性，口服i g y 可以提供被动免疫保护，从而帮助机 体提高防病抗病能力，因此完全可以作为婴幼儿及老年人的具有免疫活性的功能食 品因子。特异性免疫球蛋白i g y 的研制开发，对生产具有生理活性的新一代婴儿配方 奶粉和其它婴儿断乳食品，提高我国婴儿防病能力具有决定性的意义，其市场需求极为 庞大，但由于免疫球蛋白的资源开发一直没有重大进展，目前国内主要以初乳粉代替， 但其产品功能不能满足市场需求，因此，鸡蛋特异性免疫球蛋白的开发，具有极其广阔 的市场前景和显著的经济效益。本课题选用中国儿童易感染的人一w a 株轮状病毒作为抗 原，选择易于传代培养的m a r c 。1 4 5 细胞作为增殖细胞，在国内尚属首例。本课题研制 的高活性抗人轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白( 抗h r v i g y ) ，应用于医药和功能食 品中，用于预防和治疗人体由于人w a 感染轮状病毒而导致的腹泻，可大大降低婴幼儿 因患腹泻而导致的死亡率，同时也可大大降低医疗成本，增加人体抵抗力，增强人民体 1 2 沈阳农业大学硕十论文 质。 发展和实现本课题研究的成果转化和产业化，符合国家产业政策和本地区乃至我国 经济发展的客观要求。该课题的实施，也将大大促进养鸡业、养牛业及其相关产业的综 合发展，带动本地区农牧业产业结构的调整，全面促进本地区农牧业、生物制药业、饲 料加工业、农副产品加工业等行业的和谐发展，适应目前节约型社会的需要，增加农牧 民收入，促进地区经济快速发展。 1 5 研究内容 以m a r c ：1 4 5 细胞增殖培养人轮状病毒，经浓缩、灭活等处理后进行抗人轮状病毒 灭活油乳疫苗的制备，经稳定性和安全性检验合格后对产蛋鸡进行人工免疫，确定最佳 的免疫部位及免疫剂量，并对抗人轮状病毒卵黄免疫球蛋白生物活性及理化性质进行研 究。 沈阳农业大学硕士论文 2 1 试验材料 2 1 1 病毒 第二章材料与方法 本试验选择能引起婴儿腹泻的轮状病毒w a 株( h r v w a ) 为抗原，毒株购自中 国科学院病毒研究所。 2 1 2 传代细胞 非洲绿猴肾细胞m a r c 1 4 5 由东北农业大学动物医学学院微生物实验室提供。 2 1 3 实验动物 本试验用6 4 只1 5 0 日龄产蛋鸡，由鞍山大丰生物有限公司提供。 2 1 4 基本化学试剂 硬脂酸铝、l o 号白油、s p a l l 8 0 、t v 咤e i l 2 0 、甲醛、硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二 氢钠、氯化钠、硫酸、甲醛、硫柳汞钠、氯化钡、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨 水、牛血清白蛋白、t r i s 、h c l 、t 、v e e t l 2 0 、二甲基亚砜、柠檬酸、h 2 0 2 、h 2 s 0 4 、双 甲叉基丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠( s d s ) 、过硫酸铵、甘氨酸、巯基乙醇、溴酚蓝、 考马斯亮蓝r 2 5 0 、甲醇、冰醋酸，以上试剂为国产分析纯。 2 1 5 分子生物学试剂 胃蛋白酶、胰蛋白酶、兔抗鸡辣根过氧化物酶购自北京拜而迪生物科技有限公司； 四甲基联苯胺( t m b ) 购自北京欣科生物技术有限公司；羊抗鼠l g g 荧光抗体购自北京 中杉生物技术公司。 2 1 6 其他实验材料 m i l 6 4 0 培养基购自g i b c 0 公司：胎牛血清购自h y c l o n e 公司；透析膜购自北 京拜尔迪生物技术有限公司；9 6 孔酶标板购自o r a n g e 公司。 2 1 7 仪器设备 p h s - 2 5 型数字式精密p h 计：上海理达仪器厂 恒温磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司 材料与方法 d h g 一9 2 0 3 a 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司 h h 6 数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司 u v - 1 1 0 0 型紫外分光光度计：北京瑞利分析仪器公司 d y y - 5 ( 8 b ) 型电泳仪：北京六一仪器厂 荧光显微镜：z e i s s ( 蔡司) k q 2 5 0 a 型油渣超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司 h i t a c h ih i m a cc r 2 1 g 型高速冷冻离心