（食品科学专业论文）海藻糖和透明质酸对生物分子和微生物的保护及其作用机制.pdf

摘要 海藻糖是一种非还原性双糖，具有独特的抗冷冻、抗干燥脱水的生物活性，因此近年来成为 世界各国科学家研究的热点。透明质酸( 姒) 是广泛存在于动物各种组织细胞问质中的直链多 聚糖。本课题对海藻糖和h a 单独使用以及两者复配对生物分子和微生物的保护及其作用机制进 行探讨，为海藻糖和h a 作为生物产品保护剂的应用提供理论依据。 考察了海藻糖、h a 以及两者复配对模型蛋白质胰激肽原酶( p k a s e ) 的保护及其作用机制。 在冷藏、反复冻融、冷冻干燥，真空干燥和4 5 、7 个周的贮存过程中，海藻糖对p k a s e 活性 的稳定作用比较显著，h a 单独应用的效果较差，但两者复配后保护作用高于两者单独使用。 对p k a s e 酰胺i 带二阶导数红外光谱的研究发现，冻干和4 5 贮存期间p k a s e 二级结构改变， 海藻糖及其与h a 复配有利于保持p k a s e 的天然结构。冻干后，海藻糖的- o h 与p k a s e 的极性基 团产生氢键相互作用，代替p k a s e 极性基团周围失去的结合水，从而稳定蛋白质二级结构。h a 不能与干态蛋白质形成氢键连接。因而保护作用最差海藻糖和h a 复配对冻干p k a s e 的保护作 用最佳因为两者具有互补性t 冻干过程中海藻糖与p k a s e 形成稳定的氢键作用；加入h a 提高 了体系的玻璃化温度( t g ) 以脂质体为模型，探讨了海藻糖、h a 以及两者复配对膜脂双层冻干的保护及其作用机制 海藻糖、h a 及两者复配能抑制冻干引起的脂质体内药物泄漏和粒径增大，其中h a 的作用较差， 两者复配作用高于海藻糖和h a 单独使用。膜融合和药物泄漏与脂质体的死具有相关性。冻干 后，海藻糖的- o h 与磷脂的p 0 2 - 产生氢键相互作用，以代替失去的结合水。h a 不能与磷脂的 p ( 产产生氢键相互作用。海藻糖和h a 复配可以充分发挥两者的互补作用，即海藻糖的“水替代” 作用与h a 的“玻璃态”作用有机结合，因此保护效果最佳。 海藻糖、h a 及其复配对长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌干态细胞的保护作用显著优于液体状态。 冻千造成菌体细胞生理性损伤，使其再水化后培养过程中具有较长的迟滞期，海藻糖和h a 复配 作为保护剂可以降低这种生理性损伤。通过正交试验筛选出两种菌的最佳冻干保护剂配方，相应 的冻干存活率分别为长双歧杆菌8 7 6 、嗜酸乳杆菌5 5 2 。冻干损坏微生物细胞膜和敏感蛋 白质。海藻糖、h a 以及两者复配通过稳定细胞膜物理性质和蛋白质二级结构从而实现对菌体细 胞的保护作用。通过扫描电镜照片可以看出，无保护剂组冻干再水化后细胞裂解、内容物泄漏， 以海藻糖和h a 复配为保护剂组细胞饱满、形态完整。 探讨了空气悬浮法制备长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的最佳工艺条件，在此条件 下制各的微胶囊具有良好的耐酸性和肠溶性。微胶囊包囊产率5 6 4 9 ，包囊效率8 7 4 5 。通过 扫描电镜发现微胶囊表面覆盖着一层光滑平整的囊膜，粒径大小基本在4 0 0 - 5 0 0 邺1 在恒温3 7 、相对湿度6 0 , - 6 5 条件下贮存3 个月后，加保护剂的微胶囊菌体存活率高于1 0 ，且远远高 于冻干菌粉和无保护剂微胶囊组。 关键词：海藻糖，透明质酸，生物分子，微生物，保护作用 a b s t r a c t t r e h a l o s ei san o n - r e d u c i n gd i s a c c h a r i d ew i t hp a r t i c u l a rb i o l o g i c a la c t i v i t yo f p r e s e r v i n gb i o m o l e c u l e s d u r i n gf r e e z i n ga n dd e h y d r a t i o n r e s e a r c hi sf o c u s e d0 1 1i t sr o l er e c e n t l y h y a l u r o n i ca c i do a ) i sa k i n do fp o l y s a c c h a r i d ew i t hl i n e a rc h a i ne x i s t i n gi ni n t e r c e l l u l m s u b s t a n c eo fa n i m a l s t h ep r o t e c t i v e e f f e c t sa n dm e c h a n i s m so ft r e h a l o s e h aa n dt h e i rc o 血b i n 撕o no nb i o m o l o c u l e sa n dm i c r o b e sw e f e i n v e s t i g a t e d t h ei n v e s t i g a t i o nw i l lo f f e rt h e o r e t i c a lb a s ef o ra p p l i c a t i o no ft i e h a l o s ea n dh aa s p r o t c c t a n t s t h ep l d l b 嘶v ee f f e c t sa n d m e c h a n i s m so f t r e b a l o s e , h a a n d t h e i r c o m b i n a t i o n 0 1 1 t h es t a b i l i z a t i o n o f a m o d e lp r o t e i n , p a n c r e a t i c k i n i n o g e n a s e0 k a s e ) w e r ea i n i n e 正d u r i n gr e f r i g e r a t i o n , r e p e a t e d f r e e z e - t h a w i n g ，f r e e z e - d r y i n g 。v a c o n m - d r y i n ga n d7w e e k so fs t o r a g ea t4 5 ，t h es t a b i l i z a t i o no f t r e h a l o s e0 1 1p k a g ea c t i v i t yw a gs i g n m c a n t , a n dh aa l o n ew a gl e s s - e f f e c f i v e h o w e v e r , as t r o n g e r i r o t e c t i n no fa c t i v i t yi nf r e e z e - d r i e dp k m ew a go b t a i n e dw h e n t r e h a l o s ea n dh au s e dt o g e t h e rt h a n e a c ha g e n tu s e d9 1 0 l l s , t h ea w , o n dd e r i v a t i v ei n f r a r e ds p e c t r ao fp k a s ei n 曲曙a m d eir e g i o n 啊啪 m e a s u r e d i tw a gf o u n dt h a tt h e r ew e r es e v e r a la l t e r a t i o n si nt h es e c o n d a r yg l r u c t u r o fp k a g ed u r i n g f r e e z e - d r y i n ga n ds t o r a g e 砒4 5 r e l a t i v et ot h a to ft h en a t i v e a q u e o t t sp r o t m t r e h a l o s ea n dt h e c o m b i n a t i o no f u c h a l o s ca n dh ap r e s e r v e dt h ei n mn a t i v e - l i k es e c o n d a r ys m 】c - m r eo f p k a s et h a nt h a t o f p k a s ed r i e da l o n eo ri np l s e l l c eo f h a t h e r ei sh n a _ c b f t w e e n - o hg r o u p so f t r e h a l o s ea n d t h ep o l hg r o u p so f p k a s ea f t e rl y o p h i l i z a t i o n , w h i c hi sf o r m e dv i ah y d r o g e nb o n d i n g t r e h a l o s et a k e s p l a c eo ft h em i s s m gb o u n dw a t e rs u r r o u n d i n gt h ep o l a rg r o u p so fp k a s e t h e r e f o r e ，t h e , n d r y s t r u c t m eo fp k a s ei ss t a b i l i z e d t h e r ei sn oi n t e r a c t i o nb e t w e e nh aa n dp k a s e ，t h e r e f o r e ，h ai sl e s s a c t i v ei np r e s e r v i n gn a t i v ep r o t c i j lt r e h a l o s ea n dh ao f f e rc o m p l e m e n t a r y 讲q 币w h e nt h et w o t y p e so fa d d i t i v e sa l eu s e dt o g e t h e r t r e h a l o s ep r e s e r v e sp k a s en a t i v es u u c t u r eb yh y d r o g e nb o n d i t l g a d d i t i o no fh ai n c r e a s e st h eg l a s s - t r a n s i t i o nt e m p e r a t u r e ( 坳o fp k a s ef o r m u l a t i o ni np r e s e n c eo f t r e h a l o s e t h e p r o t e c t i v ee f f e c t sa n d m e c h a n i s m s o f l r e h a l o s ea n d h a a n d t h e i r c o m b i n a t i o n o n t h es t a b i l i z a t i o n o f am o d e lm e m b r a n el i p i db i l a y e r , l i p o s o m e s ，w e l fi n v e s t i g a t e d d r u gl e a k a g ea n dd i a m e t e ri n c r e a s i n g i n d u c e db yl y o p h i l i z a t i o nw e r ei n h i b i t e db yi r e h a l o s e ，h aa n dt h e i rc o m b i n a t i o n t h ec a p a c i t yo fh a a l o n et op r o t e c tl i p o s o m c sw a gl o w , h o w e v e r , t h ec o m b i n a t i o no f h e h a l o s ea n dh aw a g 日，僻e f f e c t i v e t h a nt h et w oa d d i t i v e su s e da l o n e t h e r ei sad i r e c tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nl i p o s o m e sf u s i o n , d r u gl e a k a g e a n dt h e 强o f d r yl i p o s o m e s t h e r ei si n t e r a c t i o nb e t w 缸e h a l o s ea n dp h o s p h o l i p i da f t e rl y o p h i l i z a t i ( m t h i si n t e r a c t i o ni sf o r m e db e t w e e n - o hg r o u p si nt r e h a l o s ea n dp o g r o u p so fp h o s p h o l i p i db y h y d r o g e nb o n d i n g t r c h a l o s et a k e sp l a c eo f t h em i s s i n gb o u n dw a t e ra r o o n dp h o s p h o l i p i d t h e r ei sn o d i r e c ti n t e r a c t i o nb e t w e e nh aa n dp h o s p h o l i p i d l y o p h i l i z e dt o g e t h e r t r e h a l o s ea n dh ao f f e r c o m p l e m e n t a r yp r o p e r t i e sw h e nt h et w ot y p e so f a d d i t i v e sa r eu s e dt o g e t h e r t h ec o m b i n a t i o no f w a t e r t h ep r o t e c t i v ee f f e c t so f i r e l ! a l o s e ，h aa n dt h e i rc o m b i n a t i o no n 血yc e l l so f b i f i t d o b a c t e r i u ml o n g u m a n dl a c t o b a c i l l u 5a c i d o p h i l u se x c e e d e dt ow h i c hi na q u e o u s $ t 3 1 e p h y s i o l o g i c a ld a m a g et oc e l l sw a s e a u s e dd u r i n gl y o p h i l i z a t i o n ，w h i c hp r o l o n g e dt h el a gp h a s ed u r i n gc u l t u r ep r o c e s sa f t e rr e h y d r a t i o n , a n dt h i sd a m a g ew c d e c r e a s e db yt h ec o m b i n a l i o no ft r e h a l o s ea n dh 丸t h eo p t i m a lp r o t e e t a n t s m a t c h e so fl y o p h i l i z e dc e l l sw c i i 。c h o s e nv i ao r t h o g o n a lt e s t s a c c o r d i n gt ot h e s em a t c h e s ，t h es u r v i v a l r a t ew a s8 7 6 t ob i f i t d o b a e t e r i u ml o n g u ma n d5 5 2 t ol a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s l y o p h i l i z a t i o n r e s u l t e di nd a m a g et on 冀n i ea n dt h es e n s i t i v ep r o t e i mo fc e l l s p h y s i c a lp r o p e r t i e so fm e m b r a n e a n ds e e o d a t y $ 1 1 1 1 c t u r co fs e n s i t i v ep r o t e i n sw e r ep r e s e r v e db yi a - e h a l o s e ，h aa n dt h e i rc o m b i n a t i o n a c c o r d i n gt o $ e mp h o t o s ，d i s r u p t i o na n dc o n t e n t sl e a k a g eo c c u r r e dt oc e l l sl y o p h i l i z e dw i t h o u t p t o t e e t a n t s , a n dt h ea d d i t i o no ft h ec o m b i n a t i o no fi r e h a i o s ea n dh ap r e s e r v e dt h es a t i a t i o n a n d i n t e g r i t yo f c e l l s t h o o p t i m a lc o n d i t i o n s o fp l t p a r i n gm i c r o c a p s u l e s c o n t a i n i n gb i f l t d o b a e t e r i u ml o n g u m a n d t a e t o b a e i l l u sa e i d o p h i l u av i aa i rs u s p e n s i o nv l e l * oi n v e s t i g a t e d b a c t e r i a 协州i nt h en f i e r o e a p s u l e s s u r v i v e d i n a r t i f i c i a lg a s t r i c j u i c ea n dc o l l a p s e de a s i l y i n a t t i t i c i a i i n t e s t i n a l j t t i e e t h e l 】a e k y i e l d o f t h e m i e r o e a l u l e si s5 6 4 9 a n dt h ep a c ke f f i c i e n c yi s8 7 4 5 a c c o r d i n g t os e m p h o t o s , t h es u r f a c eo f n l cm i e r o c a p s u l e si sc o v e r e dw i t hm a o o t hf i l m t h ep a r t i c l ed i a m e t e r sm i , t w e c l l l4 0 0 5 0 0p 札 s t m , i v a lr a t eo f b a c t e r i ai nt h em i e r o c a p s u l e si np r o f p r o t e e t a n 乜a t t e rs t o r e d3m o n t h sa t3 7 a n dr i - i6 0 - - 6 5 伽o v 日1 0 w h i c hw h i g h e rt h a nt h a to fl y o p h i l i z e dp o w d e ra n dt h e m i e r o e a p s u l e si na b s e n c eo f p r o t e e t a n t s k e yw o r d s ：t h e h a l o s e , h y a l u r o n i ea e i c kb i o m o l e e u l e s , m i c r o b e s ，p r o t l 妞i o n i l l 图表清单 一插图清单 图1 1液晶相磷脂双层脱水后转变为凝胶相再水化后导致膜泄漏3 图1 2h a 的网状结构4 图1 3 a ，a 一型海藻糖构象式4 图1 - 4海藻糖对膜脂双层在干燥状态的稳定机制示意图7 图1 - 5非晶态聚合物的温度形变曲线8 图1 - 6优先排阻使蛋白质稳定示意图9 图2 1冷藏过程中糖对p k a s e 溶液稳定性的影响2 1 图2 2 反复冻融过程中糖对p k a s e 活性保护作用r o b 0 0 00 0 0 2 1 图2 3 冻干过程中搪对p k a s e 活性保护作用2 2 图2 - 4真空干燥过程中糖对p k a s e 活性保护作用2 2 图2 5海藻糖与p k a s e 质量比对p k a s e 冻干稳定性的影响2 3 图2 6冻干p k a s e 于4 5 贮存期间活性变化2 4 图3 1冻干p k a s e 酰胺i 带二阶导数光谱3 0 图3 2糖o h 平面弯曲变形红外光谱3 7 图3 3冻干再水化后p i h s e 的c d 光谱3 9 图4 1糖对冻干脂质体药物保存率的影响4 5 图4 2海藻糖和h a 用量对药物保存率的影响4 6 图4 3冻千前后不同糖存在时脂质体粒径4 6 图4 4保温温度对再水化后脂质体平均粒径与药物保存率的影响4 7 图4 5 磷脂p o “不对称伸展红外谱图4 9 图4 6 糖o h 平面弯曲变形红外谱图5 0 图5 1冻融过程中长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌存活率5 7 图5 2冻融前后长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌产酸力变化5 8 图5 3冻干长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌存活率5 8 图5 4 长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌冻干前后生长曲线、酸度曲线和p h 曲线6 1 图6 1冻干再水化后菌液中蛋白质与核酸吸光度6 7 图6 2o n p 标准曲线6 7 图6 3冻干菌体a t p a s e 活性保存率6 8 图6 - 4 冻干长双歧杆菌扫描电镜照片6 9 图6 - 5 菌体蛋白质酰胺i 带二阶导数光谱7 0 图6 - 6菌体细胞膜脂p o 。不对称伸展红外谱图7 5 图7 - 1微胶囊在人工胃液中的溶出情况8 4 图7 2微胶囊在人工肠液中的溶出情况8 5 x 中国农业大学博卜学位论文 图表清单 图7 - 3微胶囊与菌粉扫描电镜照片8 6 二附表清单 表3 - 1p k a s e 二级结构指认3 0 表3 - 2p k a s e 二级结构含量分布3 5 表3 - 3不同糖存在时冻干p k a s e 体系的砘3 7 表3 - 4再水化p k a s e 中n 螺旋相对含量3 9 表4 i 不同糖存在时冻干脂质体的地4 7 表5 - i正交试验因素水平表5 6 表5 - 2冷藏过程中长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌存活率变化5 6 表5 - 3长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌冻干粉室温贮存期间存活率变化5 9 表5 * 4 t 9 ( 3 1 正交试验方案与结果6 1 表5 - 5正交试验极差分析结果6 2 表6 1 冻干前后长双歧杆菌p - d 半乳糖苷酶泄漏率6 8 表6 - 2菌体蛋白质二级结构指认7 0 表6 - 3长双歧杆菌菌体蛋白质二级结构含量分布7 3 表6 - 4不同糖的您7 5 表7 - 1正交试验因素水平表8 l 表7 2 l 9 ( 3 3 ) 正交试验方案与结果8 3 表7 - 3正交试验极差分析结果8 4 表7 - 4菌粉与微胶囊在人工胃液中的存活率8 4 表7 - 5微胶囊在人工肠液中的崩解性8 5 表7 6 3 7 贮存期内活菌数变化8 6 x i 缩略词 p k a s e 胰激肽原酶 h a 透明质酸 f t - i r 利用傅里叶变换红外光谱 d s c 差式扫描量热法 c d 圆二：色谱 死玻璃化温度 t m 相变温度 p o p c 1 棕榈酰- 2 油酰磷脂酰胆碱 a d m 阿霉素 a t r 衰减全反射法 d p p c 二棕榈酰磷脂酰胆碱 p c 磷脂酰胆碱 b l 长双歧杆菌 l a 嗜酸乳杆菌 m r s 乳酸菌培养基 o n p g 邻硝基苯廿d 毗喃半乳糖苷 o n p 邻硝基苯 s e p h a d e xg 一5 0 葡聚糖凝胶g 一5 0 a t p a s e a t pa # t r i s 三羟甲基氨基甲烷 s e m 扫描电镜 d e p 邻苯二甲酸二乙酯 相对分子质量 i r 红外光谱 0 平均残基摩尔椭圆度 一l 吸光度 c i c c 中国工业微生物菌种保藏中心 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名。芴五军 时间：出加7 年g 月s 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 吾步五- 牟 时间：a ，。7 年5 月笤日 导师签名： 翻 时间：年月日 第一章绪论 1 1 真空冷冻干燥及其对生物分子和微生物的影响 1 1 1 真空冷冻干燥技术 真空冷冻干燥( 简称冻干) 是将含水物质先冻结成固态，而后在真空条件下使其中的水分从 固态宣接升华至气态而被除去的一种干燥方法冻干过程分为三步，即预冻结、升华干燥( 或称 第一千燥阶段) 和解析干燥( 或称第二干燥阶段) 。 应用冻干技术生产生物来源产品具有以下显著的优点：整个过程在低温下进行，能够保持生 物产品原有的活性，因此对于许多热敏性物质特别适用，如蛋白质、微生物等不会变性或失活； 抑制微生物生长和酶的作用：干燥后制品的体积和形状变化小，有利于保持其原有结构；干燥后 的制品疏松多孔，呈海绵状，复水性好；干燥在真空条件下进行，保护易氧化物质，保存期长。 冷冻干燥为生物活性物质( 如活性蛋白质) 、微生物提供了有效的制备方法。但冷冻干燥过程仍 不可避免地对某些生物成分产生破坏 1 1 2 冻干对生物分子和微生物的损伤 冻干过程对生物分子和微生物的损伤包括冷冻损伤和干燥损伤( h s u , 1 9 9 1 ) 1 1 2 1 冷冻对生物分子和微生物的损伤 冷冻损伤发生在预冻结过程中，预冻结是将溶液中的自由水固化。冻结对细胞破坏的主要原 因是溶质损伤和机械损伤( t h a m m a v o n g s ，1 9 9 6 ) 溶质损伤效应是由于水的冻结使细胞间隙的液体逐渐浓缩，电解质浓度逐步升高，p h 值改 变。细胞内的蛋白质对电解质变化极为敏感，尤其是在高浓度的电解质存在时。会引起蛋白质变 性。丧失其功能，增加了细胞死亡的可能性( 孟涛，2 0 0 3 ) 。此外，细胞内电解质浓度增加还会导 致细胞脱水死亡。间隙液体浓度越高，对细胞的破坏就越严重。 机械损伤效应是细胞内外冰晶生长而产生的机械应力引起的( 陈声明1 9 9 6 ) 。制品冻结速度 的快慢是影响其质量的重要因素，根据冷冻速率的高低。微生物细胞的冷冻方式包括“胞内冻结” 和“胞外冻结”前者是指冷冻速率足够高时，细胞内的游离水来不及外渗就在细胞内冻结了 当冷冻速率超过细胞最适的速率时，细胞的存活率将迅速下降，而形成胞内冻结的细胞比例随冷 冻速率的升高而增加。当冷冻速率较低时。细胞内游离水大部分渗透到细胞外而冻结，细胞逐渐 收缩、脱水，这种冻结方式称为。胞外冻结”。胞内冰晶的机械应力，会压碎和刺破细胞膜，导 致细胞内容物泄漏而使微生物死亡。一般冰晶越大，细胞膜越易破裂；冰晶小，对细胞膜的机械 损伤也较小。另外，冰晶的形成导致细胞脱水，使细胞膜磷脂双层转变为六角相等非层状相( c r o w e , 1 9 8 2 ；g o r d o n - k a n n , 1 9 8 4 ) ，s i m o n 提出这种非层状结构在复水时会导致膜蛋白质的分离，并且在 中国农业大学博卜学位论文第一章绪论 恢复至双层相前因不能形成有效的渗透屏障而使细胞内容物泄漏。 预冻对微生物细胞造成生理性损伤的常见现象是使细胞内某些重要蛋白质变性失活，尤其是 具有生物活性的酶蛋白或抑制因子。酶和抑制因子的失活，使微生物细胞正常生理代谢失调，出 现不利物质大量积累，对细胞造成毒害作用；或使必需营养物大量分解，造成细胞“饥饿性”损伤。 轻微的生理损伤可以在恢复生长期修复；严重的生理损伤对微生物是致死性的，直接影响冻干效 果。 1 1 2 2 干燥对生物分子和微生物的损伤 干燥的第一阶段是冰晶的升华，冰晶升华结束后样品中还含有约1 0 - 1 5 的结合水，这些水 分是未被冻结的，通常吸附在干燥物质的毛细管壁或与蛋白质、核酸等分子的极性基团相结合。 当它们达到一定含量，易导致微生物生长繁殖和生物活性物质失活。因此为了提高产品的贮存稳 定性，使微生物达到干燥休眠状态，必须除去大部分结合水，该过程即为解析干燥，干燥对生物 分子和微生物的损伤主要集中在这一阶段。但冻干品的水分含量并不是越低越好( h s u , 1 9 9 1 ； a d a m s ，1 9 9 1 ) ，因为每种活性物质都需要含有合适的水分来保持在贮存过程中性质的稳定，过度 的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。s h a h 等( 1 9 9 8 ) 研究表明，残留水分 对蛋白质活性的恢复影响最大。z a y e d 等( 2 0 0 3 ) 发现，冻干l a c t o b a c i l l u s s a l i v a r i u ss u b s p s a l i v a r i u s 的最佳残余水分含量为2 8 j s 6 。 微生物细胞的干燥损伤，很大程度上是由于膜脂的性质、结构、功能的改变使膜的流动性或 完整性改变，导致膜的功能失调，影响微生物的生命活动去除结合水易导致生物膜融合，相变 和膜侧向相分离。 膜融合：生物膜表面通常结合大量水分子，红外光谱法、x 射线衍射等技术表明这些水分子 通过氢键作用与磷脂的极性基团结合( r d ，1 9 8 6 ) ，在磷脂双层周围形成了一层水化层，水化层 对维持膜结构和功能具有重要意义。与磷脂极性头部结合的水分子被不同程度的极化，因此当两 个脂质双层彼此靠得很近时，会产生排斥作用，防止膜的融合。脱水后磷脂双层相互靠近，导致 膜融合，从而引起内容物泄漏( h a t r a n o u d a k , 1 9 8 1 ) 相交：磷脂每个极性部分约结合1 0 - 1 2 个水分子，约相当于2 0 的水化磷脂双层的重量 除去这些水导致极性部分占据的空间减小，碳氢链密度增加，范德华力增加，结果磷脂的主相变 温度( z - m ) 升高( c r o w e 。1 9 8 7 ) ，例如当t m 为- 5 的水化磷脂脱水后t m 上升至5 5 ( c r o w e 。 1 9 9 4 ) 。因此在室温下脱水过程中，会发生从液晶相至凝胶相的转变( 图1 - 1 ) 。此外，脱水后某 些磷脂还会从液晶相转变为六角i i 相( c r o w e , 1 9 8 2 ；g o r d o n - k a n n , 1 9 8 4 ) ，该相变通常产生于含磷 脂酰乙醇胺较多的细胞膜，如大肠杆菌内膜。两种相变均破坏膜的完整性( c r o w e , 1 9 8 2 ) ，导致 内容物泄漏( c r o w e 。1 9 8 8 ) 侧向相分离：脱水过程中，不同磷脂的7 ，m 不同，如含有1 8 ：1 碳链的磷脂酰胆碱和相应的饱 和磷脂酰胆碱混和时，可观察到两个独立的相变。因此在两种磷脂t m 之间的某一温度下，有的 磷脂处于凝胶相而有的处于液晶相，出现侧向相分离。侧向相分离使膜结合蛋白脱离膜平面，再 水化时膜蛋白随机插入膜中，导致膜蛋白的错位，因此生物膜钙吸收能力和a t p 酶( a t p a s e ) 活 2 中国农业大学博卜学位论文 第一章绪论 性降低( c r o w e 1 9 8 4 ) 8 ：p h 。p h 洲p i d 。咖。曲p o k h e a d 鲫p a n dn o l l l a r h i l l 图1 液量相磷膳双层( ) 脱水后转变为凝胶相( b ) 再水化后导致膜泄曩( c ) f i g1 - 1p l l o s p h o l i p i db i l a y e ri i l1 i q u 硒c v s s 枷p l i 瓣( a ) 幽o w i n gt r a n s i t i o nt og e lp h a s e ( b ) u p o nd c h 姗i 咖a n dm r e h y d r a 6 mc a u s i n g p a c k i n g d e f e c t s m a k i n g t h eg n f f m b r a n l e a k y ( c ) 1 2 常用的冻千保护剂 保护剂的作用是使生物分子或细胞在冻干贮存和复水过程中免于损伤、失活或死亡( c o m , 2 0 0 0 ) 。保护剂种类很多，按其渗透性可分为渗透型和非渗透型两种，渗透型保护剂在溶液中易 结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到了保护的目的。 但其使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同非渗透型保护剂不能进入细 胞，它使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度。从而起到保护作用根据保护剂性 质又可分为以下几类( h u b a l e l 【2 0 0 3 ) ：( 1 ) 氨基酸及其盐：谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸钠、苏 氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸。( 2 ) 糖类：海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、山梨糖、 葡聚糖、b 环糊精、麦芽糊精、麦芽糖等。( 3 ) 多元醇类：木糖醇、甘露醇、肌醇，甘油、乙二醇、 聚乙二醇、侧金盏花醇山梨醇等。( 4 ) 高分子化合物及其分解产物：白蛋白、明胶、黏液蛋白、 蛋白胨、肉膏、酵母膏、可溶性淀粉、糊精、藻酸、果胶、阿拉伯胶，聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基 纤维素钠、藻类。( 5 ) 天然混合物：脱脂乳、血清、脱纤维蛋白血液。( 6 ) 其它：二甲基亚砜、 抗坏血酸、羟胺、氨基脲等。低分子化合物起直接保护作用，高分子化合物防止在冻干过程中细 胞内所发生的氨羰基反应和氧化作用，但一般只起辅助作用。在使用时通常以高、低分子化合物 复配，效果较好。 糖是应用最广泛的冻干保护剂，糖类保护剂中双糖的作用最显著，而海藻糖被证明是双糖中 效果最佳的。大分子糖对生物分子的保护作用似乎不如小分子糖，但有些研究结果却与此相反， 如对菊糖的研究表明，聚合度高于5 5 6 0 的菊糖对碱性磷酸酶的活性保护作用明显高于海藻糖 及低聚合度的菊糖，这说明对于多糖的保护作用不能一概而论。 透明质酸( h y 加o n i c i d 。h a ) 广泛存在于动物各种组织细胞间质中，是由等摩尔的氨基 葡糖和葡糖醛酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖( r a p p o 1 9 5 1 ) 。h a 分子链的长度及相对分 子分质量( ) 是不均一的，尬一般为2 1 0 5 7 1 0 6 ，双糖单位数为约3 0 0 - 1 1 0 0 0 对，属于生物 大分子。对h a 稀溶液进行的光散射研究发现，h a 分子在水溶液中呈单螺旋状态，分子内的氢 3 曰8蹄：。曰跳一躐一 蹰蚰跚跳 中国农业大学博 。学位论文第一章绪论 键使其形成螺旋结构。当达到一定浓度时，h a 分子间具有相互作用，形成双螺旋结构。当h a 浓度更高时由于多种作用力可形成网状结构( f u r l a n , 2 0 0 5 ) ，见图1 - 2 。h a 形成网状结构的特性 赋予其广泛的生理功能及应用开发前景。 h a 为白色絮状或无定形粉末，无臭无味，具有较强的吸湿性，易溶于水，不溶于醇、酮、 乙醚等有机溶剂h a 溶液的浓度或 越大，h a 分子的缠绕程度则越高，黏度越大。h a 溶液 由于含有分子网状结构，可同时具有凝胶的弹性和溶液的黏性这一双重特性。h a 的生理功能： 构成细胞外基质和细胞问质的主要成分；保水、调节渗透压、分子排阻效应及润滑作用；影响细 胞移动、增生，分化及吞噬功能，屏蔽细胞