（有机化学专业论文）聚集体的状态对蛋白质晶体生长的影响.pdf

独创声嗡 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的磷究工作及取褥的 砑究成聚。据我所知，除了文中特剿蕊以标注和敷谢的地方岁 ，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其饿添要特别声鹱的，本栏可燮) 或其她教霄枫穆戆学位城涯书镬贯过的材 料。与我一同工作的同恣对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：勃璁 导师酶划善 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂楚有关保留、使用学位论文的规定，有权保 整算囱匿客有关部门或枧梅送交论文黪复印件葶珏磁纛，允许论文被套阅和谨溺。 本人授权j 燮可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数精库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 簸密居遥鲻本授毂书) 学位论文作者撩名：螫玲 签字鏊鬻：2 0 0 竽夸月西目 l 杰 导师豁字：及i 虿 签字霾期：2 。冬争胃蟮毯 鹾 ，分叉 ；山 函客痨鼹丈学鞭圭学经谂文 摘要 寻找蛋白质晶体生长的优化条件直是晶体生长工作者的目标，但是不同的 蛋白震有羞不髑靛生长条 串，缀难掇遵某穗完全适应予骚弯蛋自爱豹晶体生长条 俸激及辫辩鑫傣麓否生长鹣稼漆。辫予辫繇磊落琵否生长豹骚究篦较多霞髓绝大 多数集中在对成核后期的研究上，很少有对成核前期研究的报道。而成核前溶液 中蛋白质形成的聚集体的状态( 包括聚集体的大小，形虢，甚至于构象等) 的变 化会直接影响蒯成核的情况。这是出于，在蛋白质成核葡如现的聚集体一般显现 蹬无痔豹蒙祭状态，嚣形藏豹鑫投苏庾鑫镩生长孛囊联涎聚集薅，罄是蛋巍矮分 子有序堆积丽成。西此，对无序聚蒸体状态的变化进行研究，有助于分析霄序浆 集体的出现条件并由此提供蛋白质鹧体生长的合适条件。 溶液中聚熊体的状态一般包括聚集体的大小和聚集体大小的分布两类参数。 越二类参数在照傣生长熬过程的变 七媾援、它们对龋馋生长数影嫡蟪况如何以 及它镌和溶液瓣溢度、浓度之阉静联系如俺等是本工佟磷究的重点。主袋摹i 雳 光散射( d l s ) 和原子力显微镜( a f m ) 对刀豆蛋白a 溶液的聚集体进行研究。 分别研究了在殛自质晶体成核和生长阶段蛋白质溶液中聚集体的变化，以殿聚 集体的变化与妪体生长过程之间的内在联系。通过对比结晶和不结晶条件下聚 集谇懿交讫麓癸，隧及聚集露狻态筑交诧与蛋自震滚滚豹浓度、湿度露时阗瓣 关系，获得了溶液中聚集体的状态分别与晶体能否生长之间的联系，探讨了聚集 体大小和分散腹，对晶体生长的影响程度哪个更大。 在刀豆蛋囱和沉淀剂溶液混合后- - , j , 时，我们用动态光散射仪测量了不同浓 菠( 0 0 6 一l 。6 m g m 1 ) 帮不曩温度( 1 5 、2 0 。c 、2 54 c ) 下刀豆蛋自a 漆液中聚 集体大小的变佬。每个样品重复测豢至少l o 次，缭暴髑n y q l s 方法分辑，敝平 均值。我们用定浓度的刀豆蛋白a 溶液加入沉淀剂0 7 m g m ln a c l 溶液，在结 晶和不结晶条件下做了连续六天的原予力显微镜实验，可结晶条件下刀豆骚臼a 的浓度为1 ，t m g m l ，不可结鑫条 牛下刃豆蛋白a 韵浓液为0 2 m g m 1 。实验时， 蛋自囊溶液与漉淀麓溶滚等体积潺舍。实验湛凄2 0 。c ，瀵度为5 0 - 6 0 ，在麓片 上吸附的时间为7 m i n 。 通过d l s 实验我们发现：在1 5 。c 时，随着刀豆蛋白溶液浓度的增大，溶液 中的聚集体大小出1 2 0 r a n 逐渐减小，当浓度增大到0 7 9 m g m l 后，聚集体大小 山东师范大学硕士学位论文 保持在7 4 n m 左右不再变化。在2 0 时，随着刀豆蛋白溶液浓度的增大，溶液中 的聚集体大小由1 1 l n m 逐渐减小，当浓度增大到0 a 5 m g m l 后，聚集体大小保 持在7 4 n m 左右不再变化。同样在2 5 。0 时，随着刀豆蛋白溶液中浓度的增大，溶 液中的聚集体大小由1 0 6 n m 逐渐减小，当浓度增大到o 8 4 m g m l 后，聚集体大 小保持在7 4 n m 左右。而在非晶体生长条件下，2 0 时随着浓度的增大聚集体的 变化是杂乱无章的。由此可见，在刀豆蛋白晶体的适宜生长条件下，在生长溶液 中，刀豆蛋白a 溶液中的聚集体在成核阶段前随着溶液浓度的增大而减小，直至 平均聚集体的大小不再变化，此时溶液中聚集体大部分都是第一类聚集体的形式 存在。非生长溶液中，随着浓度的增大，蛋白质溶液中聚集体大小的变化是杂乱 无章的。此外，通过对相应条件下聚集体的分散度对比分析发现，随溶液浓度的增 加，分散度呈现由单分散转变为多分散的趋势，并且多分散度增长至一定大小后 不再随浓度的变化而变化，而且其变化的转折点与聚集体大小变化的转折点相一 致。刀豆蛋白的这一分散度的变化趋势和我们以前研究过的溶菌酶的变化趋势是 不相同的。 基于成核后的生长阶段中聚集体的大小较大，相互作用较强，我们还采用了 a f m 研究了随着生长过程的进行，刀豆蛋白溶液中聚集体的状态变化情况。通过 a f m 观察的所得图片进行分析我们发现，在结晶条件下，随保存时间的增加( 1 6 天1 ，直径大小在1 0 2 0 r m a 区间的聚集体所占总聚集体数目的百分数呈降低趋势， 而在非结晶条件下，这一比例呈上升趋势。说明晶体生长过程中，生长基元直 呈现消耗状态。 基于以上实验结果，我们得到的结论如下：刀豆蛋白的晶体生长过程中，在成 核阶段，溶液中主要的聚集体的大小会减小至第一类聚集体的大小，相应地，聚集 体也呈现多分散分布情况。聚集体的大小和分散度二者对于晶体生长的影响是完 全不同的，前者起决定性作用，后者则不起作用。溶液温度的变化对成核阶段的影 响在一定程度上可以通过改变溶液达到过饱和时的浓度来体现，但其对溶液中聚 集体的变化趋势没有本质上的影响，即改变温度时，聚集体随蛋白质浓度变化的 趋势基本不变，只是改变了聚集体达到稳定大小时的蛋白质溶液浓度的大小。在 刀豆蛋白a 的晶体生长阶段，聚集体的大小也和晶体的生长密切相关。在晶体 生长条件下，大小和生长基元一致的聚集体所占聚集体总数的比例随生长时间的 山东师范大学硕士学位论文 增加而逐渐降低；市在非结晶条件下，此比例随生长时间的增加而增大。 关键词：动态光散射，原子力显微镜，聚集体，刀豆蛋白a ，晶体生长 分类号：0 6 2 9 7 3 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t i ti st h ea i mo ft h ec r y s t a lg r o w t hr e s e a r c h e r st of m dt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o no f p r o t e i nc r y s t a lg r o w t h b e c a u s ed i f f e r e n tp r o t e i n sh a v et h e i ro w ng r o w t hc o n d i t i o n s ，i t i sn e c e s s a r yt og i v eac r i t e r i o no fp r o t e i nc r y s t a lg r o w t h t h e r ea r el i t t l es t u d i e so f t h e s ec r i t e r i o n s ，a n dm o s to ft h es t u d i e sh a v em a i n l yf o c u s e do nt h ep o s tp r o c e s so f n u c l e a t i o np r o c e s s t h ec h a n g eo fp r o t e i na g g r e g a t e ss t a t e ( i n c l u d i n gt h es i z e ，t h e m o r p h o l o g ya n dt h es t r u c t u r e ) i nt h ef o r ep r o c e s so f n u c l e a t i o no f p r o t e i ns o l u t i o nc a n d i r e c t l yi n f l u e n c et h e n u c l e a t i o np r o c e s s t h ea g g r e g a t e sa p p e a r e db e f o r ep r o t e i n n u c l e a t i o np r o c e s si sm a s s f r a c t a l ，w h i l et h e ya r eo r d e r e da f t e rn u c l e a t i o np r o c e s s s o ， i ti s i m p o r t a n tt os t u d yt h ea g g r e g a t e sb e f o r e a n da f t e rn u c l e a t i o np r o c e s sa n d d e t e r m i n et h ec r y s t a lg r o w t hc o n d i t i o nb yt h es t a t eo fa g g r e g a t e s i nt h i sd i s s e r t a t i o na g g r e g a t e si np r o t e i ns o l u t i o nh a v eb e e ns t u d i e db yd y n a m i c 1 i 出ts c a t t e r i n ga n da t o mf o r c em i c r o s c o p e c o n c a n a v a l i na h a sb e e nc h o s e nt ob ea m o d e lp r o t e i n t h ec h a n g eo fs t a t eo fa g g r e g a t e si nc o nas o l u t i o nd u r i n gb o t ht h e n u c l e a t i o n p r o c e s s a n dp r o t e i n c r y s t a lg r o w t hh a s b e e ns t u d i e du n d e rb o t h c r y s t a l l i z a b l e c o n d i t i o na n dn o n c r y s t a l l i z a b l ec o n d i t i o nm o r e o v e r , t h er e l a t i o n b e t w e e nt h ec h a n g eo ft h es t a t eo fa g g r e g a t e sa n dt h e c o na c o n c e n t r a t i o n ， t e m p e r a t u r eo f p r o t e i ns o l u t i o nh a v eb e e ns t u d i e d w eh a v es t u d i e dt h ec h a n g eo fa g g r e g a t e so fc o n c a n a v a l i nai ns o l u t i o nb yd l s lh o u ra f t e rt h ec r y s t a lg r o w t hs t a r t i n g t h ec o n c e n t r a t i o n so fc o nau s e di nt h e t e m p e r a t u r ea r ef r o m0 0 6 m g m lt o1 6 m g m 1 d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ，15 。c ，2 0 ， 2 5 h a v eb e e nu s e d e v e r ? , s a m p l eh a sb e e nr e p e a t e d l ym e a s u r e da tl e a s tt e nt i m e s t h er e s u l th a sb e e na n n y z e db yn n l sa n dt h e nt h em e a nd i a m e t e ro fa g g r e g a t e sh a s b e e no b t a i n e dt a k i n gt h ea v e r a g e t h ep r e c i p i t a t i o ns o l u t i o nw a s0 7 m g m ln a c i s o l u t i o n a f t e rd l se x p e r i m e n t s ! t h ec o n c a n a v a l i nas o l u t i o n w i t hc e r t a i n c o n c e n t r a t i o nw a st r a n s f o r m e dt os i l i c o nw a v ee v e r yd a yd u r i n gt h ec r y s t a lg r o w t h p r o c e s s a n dw e r eo b s e r v e d b y a f mu n d e r c r y s t a l l i z a b l e c o n d i t i o na n d n o n c r y s t a l l i z a b l e c o n d i t i o n t h ec r y s t a l l i z a b l ec o n d i t i o na n dn o n c r y s t a l l i z a b l e c o n d i t i o na r e ：c o nac o n c e n t r a t i o n1 im g m la n d0 2 m g m l ，r e s p e c t i v e l y t h ep r o t e i n 4 山东师范大学硕士学位论文 s o l u t i o f f 甜l dp r e c i p i t a t i o ns o l u t i o nw e r em i x e dt h es a m ev o l u m e d u r i n ga l lt h ea f m e x p e r i m e n t st h et e m p e r a t u r ei s2 0 。c ，t h eh u m i d i t yi s5 0 - 6 0 ，a n dt h ea d s o r p t i o nt i m e o fc o nas o l u t i o no n t ot h es i l i c o nw a v ei s7m i n u t e s t h ef o l l o w i n g sa r eo u re x p e r i m e n tr e s u l t s ：i nt h ec o nac r y s t a lg r o w t hp r o c e s s ， a t1 5d e g r e e ，t h e - s i z eo f t h ea g g r e g a t e so f c o nai ns o l u t i o nd e c r e a s e ds t a r t i n gf r o m 1 2 0 h ma st h ec o nac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d h o w e v e r , a f t e rt h ec o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e dt oo 7 9 m g m l ，t h es i z eo ft h ea g g r e g a t e sc o n s t a n ta l m o s t l ya r o u n d7 4 n m a t 2 0d e g r e e ，t h es i z eo ft h ea g g r e g a t e so fc o nai ns o l u t i o nd e c r e a s e ds t a r t i n gf r o m 11l n ma st h ec o nac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d a f t e rt h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dt o 0 4 5 m g m l ，t h es i z eo f t h ea g g r e g a t e si sc o n s t a n ta l m o s t l ya r o u n d7 4 n m a t2 5d e g r e e ， t h es i z eo ft h ea g g r e g a t e so fc o nai ns o l u t i o nd e c r e a s e ds t a r t i n gf r o m10 6 n ma st h e c o nac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d a f t e rt h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dt oo 8 4 m g m l ，t h e s i z eo ft h ea g g r e g a t e si sc o n s t a n ta l m o s t l ya r o u n d7 4 n m i nt h en o n - g r o w t hs o l u t i o n ， t h ec h a n g eo f t h ea g g r e g a t e ss i z eo f t h ec o n c a n a v a l i nai ns o l u t i o ni sd i s o r d e r l ya st h e c o nac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d i nt h ec o nac r y s t a lg r o w t hp r o c e s s ，t h ep e r c e n t a g eo f t h ea g g r e g a t e s ( s i z ef r o m l 0 2 0 n m ) d e c r e a s e du n d e rt h ec r y s t a l l i z a b l ec o n d i t i o n w h i l e i ti n c r e a s e du n d e rn o n c r y s t a l l i z a b l ec o n d i t i o n a c c o r d i n gt oo u re x p e r i m e n t s ，t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sc a nb ed r a w n ：i nt h e n u c l e a t i o np r o c e s s ，i nt h eg r o w t hs o l u t i o nt h es i z eo ft h ea g g r e g a t e so ft h e c o n c a n a v a l i nai ns o l u t i o nd e c r e a s e da st h ec o nac o n c e n t r a t i o nj n c r e a s e d h o w e v e r , a f t e rt h es i z eo fa g g r e g a t e sd e c r e a s e dt oa r o u n d7 0 n m ，i tk e p tc o n s t a n ta l m o s t l y a r o u n d7 0 r i mi st h es i z eo fe l e m e n t a r yu n i t so fc o na s om o s to fa g g r e g a t e si nt h e s o l u t i o ni se l e m e n t a r yu n i t s i nt h en o n - g r o w t hs o l u t i o n ，t h ec h a n g eo ft h ea g g r e g a t e s s t a t eo ft h ec o n c a n a v a l i nai ns o l u t i o ni sd i s o r d e r l ya st h ec o nac o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d t h ec h a n g eo ft h et e m p e r a t u r ed o e s n ti n f l u e n c ee s s e n t i a l l yt h ea g g r e g a t e s s t a t ei nt h es o l u t i o n ，a n dt h ec h a r g et e n d e n c yh a sn o tb e e nc h a n g e d t e m p e r a t u r eo n l y i n f l u e n c e dt h em i n i m u mc o nac o n c e n t r a t i o na tw h i c ht h ea g g r e g a t e ss t a r t e dt ok e e p c o n s t a n t i nt h ec o nac r y s t a lg r o w t hp r o c e s s ，t h ep e r c e n t a g eo ft h ee l e m e n t a r yu n i t s d e c r e a s e du n d e rt h e c r y s t a l l i z a b l e c o n d i t i o n ，w h i l e i ti n c r e a s e du n d e r n o n c r y s t a l l i z a b l ec o n d i t i o n t h ea g g r e g a t e ss t a t eo fp r o t e i ns o l u t i o ni si m p o r t a n t t o e 山求师范大学硕士举位论文 t h ep r o t e i nc r y s t a l 灯o w t h ，e s p e c i a l l yi n1f l o u ra f t e r t h ec r y s t a lg r o w t hs t a r t i n g 。 k e yw o r d s ：l i g h ts c a t t e r i n g ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , a g g r e g a t e s ，c o n c a n a v a l i na c r y s t a lg r o w t h c a t e g o r yn u m b e r ：0 6 2 9 7 3 6 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究蛋白质晶体生长的意义 微重力科学是近3 0 年来随航天技术的发展而新兴起来的一门学科，它研究 在微重力环境中的物质形态和运动规律。在以开展的一些研究领域，如冶金学、 晶体生长、生物学、流体力学等方面的应用已经证明了微重力的研究价值。我国 于8 0 年代后期开始部署微重力研究，经过数年的努力，目前在国际上已有一席 之地。在微重力条件下研究分散体系( 包括胶体科学) ，近年来在国际上备受 关注 2 川。 随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学 为研究重点的后基因组时代已经拉开了序幕，对科学家提出了更为严峻的挑战。 经过1 0 年多研究，科学家们已经拥有了一张接近完整的人类基因组谱图，蛋白 质将是他们今后的重点研究方向之一。要理解和解释蛋白质生物活性就必须了解 蛋白质分子的三维结构。通常，对于生物大分子( 分子量) 2 0 0 0 0 d a l t o n ) ，可以 通过x 射线衍射了解他们的结构。但是进行x 射线衍射需要有蛋白质的单晶。目 前，在x 射线衍射结晶学中存在的最主要的障碍是得不到相应的蛋白质晶体或者 得到的蛋白质晶体质量不高。因此，研究并解释蛋白质晶体生长过程的机理，显 得尤为重要。 1 1 。1 蛋白质在微重力条件下生长的前景 要了解蛋白质的结构，就必须有高质量的蛋白质晶体。蛋白质晶体生长是一 种非平衡态过程，同样涉及到传热、传质和固液界面的物质交换，其动量和质 量的输运是非均匀且各向异性的，是通过宏观对流和细观扩散实现的，因此重力 是影响这一过程的重要因素。我们知道在地面上，由于重力的条件，液相中不可 避免地存在着强烈的重力驱动力对流，即通常所说的热对流，热对流对晶体生长 是极为不利的。特殊的太空环境，为生长高质量的蛋白质晶体开辟了新路。空间 的微重力环境成为培养高质量蛋白质晶体的理想之地。这种环境下的蛋白质晶体 生长，也成为最有希望的空间生物技术。自2 0 世纪8 0 年代初期，欧美及日本等 发达国家相继开展了空间蛋白质晶体生长的研究，并投入了越来越多的人力和物 力。利用返回式卫星、航天飞机、和平号空间站等空间飞行器，进行了上百次空 山东师范大学硕士学位论文 间蛋白质结晶实验，微重力条件下的蛋白质晶体生长研究取得重要进展，发展了 一些空间结晶技术，生长出些质量较高的蛋白质晶体，在研究机理上的认识也 有所深化。虽然空间生物实验的成功率有待提高，但是科学家们仍然认为，这是 一种最有希望的空间技术，将为人类了解蛋白质、设计新型药物带来巨大的前景。 太空的实验结果表明：在空间生长的晶体通常要比在地面上生长得到的晶体 大，这样研究者们就可以使用很多方法进行检测，包括x 一射线衍射，电子显微 镜和原子力显微镜等来进行蛋白质、病毒和核酸的三维结构的成像，而这些结构 可以帮助研究者们探索和寻找更为有效的药物和治疗方法，同时也可以对动植物 的基本生长过程有更深入的了解。不过，在空间生长的蛋白质有一部分比地面生 长的蛋白质在质量上没有更多的改进，原因不清。此外，统计结果还表明，在空 间能够生长出比地面质量高的蛋白质晶体的概率为2 0 至3 0 ，也就是说空间实 验的成功率仍然是较低的，所以研究重力条件下的蛋白质晶体生长，进而研究微 重力效应这一课题还有很大的发展空间，是目前较为重要的，也较为热门的一项 研究课题。 目前，我国在这一领域也进行了大量的研究。2 0 0 2 年3 月2 j 日在酒泉卫星 发射中心发射的“神舟三号”上，进行的蛋白质晶体生长实验，采用的是我国研 制的第二代空间蛋白质结晶装置。这种装置能容纳6 0 个蛋白质结晶样品。这次 空间之旅，共有来自国内外8 个研究单位的1 6 种蛋白质搭乘。特别值得一提的 是，在这些蛋白质中，有不少是利用我国的生物资源制备得到的。其中，除个别 模型蛋白质用于检验实验装置和研究方法外，大部分实验对象的目标是为了改善 晶体质量，以便能够测得较精确的蛋白质结构信息。日前，通过试验，随“神舟 三号”飞天的蛋白质结晶样品出晶率高达7 0 以上，并获得了至少4 种质量较 好的蛋白质晶体，同时，着重研究方法技术的结晶实验也取得较满意的结果。此 夕 ，通过对某些蛋白质晶体质量的初步检测，发现至少有两种蛋白质晶体的衍射 能力已超过发表的数据。初步分析表明，微重力可能对不同蛋白质结晶系统产生 不同效果，当然，这还有待于对实验结果进行全面和深入的研究。 1 1 2 目前蛋白质晶体研究的进展 在研究蛋白质生物大分子时，其结构和功能是科研工作中的一大重头戏。但 是面对成千上万的未知生物大分子结构，如何测得其精细的三维结构，如何得到 山东师范大学硕士学位论文 合适于x 射线研究的晶体，是许多科研工作者头痛的事情。因为生物大分子本 身的特殊性，不象小分子那样，容易结晶。尽管生物大分子晶体生长有了很长的 历史，但是到目前为止，大多数实验室进行生物大分子晶体生长时，仍然主要采 取尝试法，很难有一个具有指导意义的晶体生长，特别是对于一个新的蛋白质来 说，进行不断的尝试将是主要的方法，而且有些蛋白质晶体即使能在一定的条件 下长出微晶体来，但是要想长出足够尺寸的晶体并非易事。总之，面对生物大分 子晶体生长的种种特征，很显然，生物大分子到底是如何进行生长，在生长过程 中会出现什么样的生长情况，包括生长方式：缺陷种类等等，。这就要求对晶体 生长的过程要有一个全过程动态的研究。目前对蛋白质晶体生长主要采用光散射 【5 埽口原子力显微镜 6 1 等仪器，还有刚刚发展起来的激光共聚焦显微镜【7 1 等。 1 光散射对蛋白质晶体生长的应用 光散射分为静态光散射( s t a t i cl i g h ts c a t t i n g ，s l c ) 和动态光散射( d y n a m i c l i g h ts c a t t i n g ) i n 种，它们主要是通过测量一定浓度的蛋白质溶液散射的光强来反 映蛋白质晶体生长的情况。在1 9 7 6 年b r o w n 对动态光散射理论和实验做了完整 的描述 8 】，1 9 8 7 年k r a t o c h v i l 对静态光散射做了描述【9 】a 通过测量光散射强度， 获得一些蛋白质的状态参数，如平均分子量m w , 蛋白质的第二维里系数b = 矛口旋 转半径r g 等，通过这些参数描述就能蛋白质晶体的生长情况。最近，用光散射 来研究蛋白质晶体生长主要有以下两个个方面：( 1 ) 蛋白质成核以前的研究，如， 蛋白质聚合体的状态f l “1 3 】、蛋白质和蛋白质的相互作用和蛋白质溶解行为( 就是 在什么浓度下溶液结晶) 1 4 - 1 9 1 ：( 2 ) 对成核和成核以后的研究分析，如蛋白质成 核的临近尺寸大小决定和蛋白质颗粒在溶液中的分布情况等m 2 ”。光散射方法已 经成为研究蛋白质结晶的成熟、有效的方法，为如何优化蛋白质晶体的质量提供 了可靠的依据。 2 原子力显微镜对蛋白质晶体生长的应用 扫描探针显微镜( s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p e ，s p a ) 是一系列使用微探针进 行纳米级微观水平观察物质表面的新型显微镜的统称，其中就包括原子力显微 镜。自从1 9 8 6 年b i n n i n g 等人首次用原子力显微镜( a f m ) 在溶液中得到固体 材料表面的高分辨率的图像以来【2 “，a f m 这一技术得到了广泛的应用。随后， 在19 9 2 年d u r b i n 等人首次对在母液存在下对溶菌酶晶体表面台阶生长情况进 9 山东师范大学硕士学位论文 行了报道f 2 9 】，从而使得a f m 开始进入到了蛋白质晶体的研究领域，为研究蛋白 质晶体生长机理提供了又一重要的工具。利用原子力显微镜不仅可得到单张图 片，还可以在有母液存在下得到一系列的图片，并由此来描述在蛋白质晶体生长 过程中在晶体表面所发生的一系列的连续的变化。由于原子力显微镜能用于实时 原位地对样品进行观察，同时其具有高精度，可到n m 级的高分辨率，因此能得 到许多有关生物大分子晶体表面的微观参数，为解释许多微观的现象提供了宝贵 的资料。 在过去二十年中，世界上分别有几个实验室在用a f m 主要从事有关晶体生 长的实验工作，他们是；m a l k i n 等人在实验室进行t h a u m a t i n 结晶研究3 0 ；单斜 的c a n a v a l i n 晶体生长是由l a n d 等人报道的；a p o f e f f i t i n 是由k v e k i l o v 等人进 行研究的 3 2 】，在k o m a t s u 和l i 等人的实验室里进行了l y s o z y m e 晶体的研究。 另外，在m c p h e r s o n 的实验室里作了很多有关蛋白质晶体生长的a f m 研究，包 括生物大分子晶体生长中的杂质影响、生长缺陷结构问题及控制晶体生长的机理 的有关问题，对于分子量较大的病毒还可以直接看到单个分子的排列和尺寸大小 等等，并取得了很大的进展。 3 4 - 3 8 1 abc 一 de 山东师范大学硕士学位论文 豳豳圈 abc def 1 2 研究聚集体对研究蛋白质生长的意义 寻找蛋白质晶体生长的优化条件一直是晶体生长工作者的目标，但是生长蛋 白质晶体在某种程度上是“科学+ 经验”的工作，不同的蛋白质有着不同的生长 条件，很难提出某种完全适应于所有蛋白质的晶体生长条件以及判断晶体能否生 长的标准。对于判断晶体能否生长的研究比较少而且绝大多数集中在对成核后期 的研究上，很少有对成核前期研究的报道 3 9 - 4 4 】。目前，对于溶菌酶这一最常用的 模型蛋白也鲜有对成核前聚集体的研究【3 9 。4 “。k o i c h 研究了溶菌酶结晶过程的初 始阶段，并且提出在溶菌酶的晶体生长过程中，形成三维立体结构或者聚集体即 第一类聚集体后并不能立即开始生长晶体，而需要一个诱导期，才能形成生长基 元即第二类聚集体，然后开始生长晶体口9 。也有从动力学上研究了溶菌酶结晶 的初始阶段和生长阶段的聚集体【4 ”。成核前溶液中蛋白质形成的聚集体的状态 ( 包括聚集体的大小，形貌，甚至于构象等) 的变化会直接影响到成核的情况。 这是由于，在蛋白质成核前出现的聚集体一般呈现出无序的聚集状态 ( m a s s f r a c t a lc l u s t e r s ) ，而形成的晶核以及晶体生长中出现的聚集体，都是蛋白 质分子有序堆积而成。因此，对无序聚集体状态的变化进行研究，有助于分析有 序聚集体的出现条件并由此提供蛋白质晶体生长的合适条件。另外，聚集体状态 的变化与蛋白质与沉淀剂相互作用的结果是密切相关的，故研究聚集体状态的变 山东师范大学硕士学位论文 化还有助于了解沉淀剂是如何与蛋白质分子发生相互作用的。这对于在未知的蛋 白质晶体生长过程中选择合适的沉淀剂十分有益。 本文利用光散射和原子力显微镜对蛋白质溶液的聚集体进行研究。以刀豆蛋 白a 作为模型蛋白。分别研究了在蛋白质晶体成核和生长阶段，蛋白质溶液中聚 集体的变化。主要研究的是诱导期之前的聚集体状态，即加入沉淀剂后一个小时 内聚集体的状态变化；和诱导期之后的聚集体状态，即加入沉淀剂后卜6 天后溶 液中聚集体的变化。以及聚集体的变化对成核和生长阶段的影响。并且对于结晶 和不结晶条件下聚集体的变化做了对比，研究了聚集体变化的原因。得出了聚集 体状态的变化与蛋白质溶液的浓度、温度和时间的关系。 山东师范大学硕士学位论文 第二章蛋白质晶体的生长 2 1 蛋白质晶体生长的方法 蛋白质结晶通常是将蛋白质溶解于含有沉淀剂的溶解中，并且溶解里需要有 一定的p h 值的缓冲溶液。在某些情况下，还需要加入一些其他物质，比如抗菌 剂等等。蛋白质结晶时通常是将上述溶液通过一定的方法形成过饱和。形成过饱 和的方法一般是：改变沉淀剂的浓度、晶体结晶的温度和缓冲溶液的p h 值。目 前，大多数蛋白质结晶是基于改变沉淀剂的浓度来形成过饱和的。改变沉淀剂的 浓度可以有四种方法：( 1 ) 气相扩散方法：( 2 ) 液液扩散法；( 3 ) 渗析法( 4 ) 批量法。在很多文献中可以看到采用上述四种方法结晶蛋白质4 5 4 9 】 其中，最常用的气相扩散方法，批量法、平衡渗析法和品种嫁接或重复接种 法等。 1 ) 气相扩散方法 气相扩散法，尤其是悬滴法是蛋白质晶体生长中最常用的一种方法。它第一 次出现是在结晶t r n a 实验中5 “。随后，越来越多人采用此方法来生长蛋白质晶 体。 我们可以采用下图( 图2 1 ) 来表示气相扩散的原理。在小液滴中( 一般小 液滴体积为2u l 或更少) ，含有要结晶的生物大分子以及缓冲溶液、沉淀剂和其 他添加剂。在蓄积液中有比小液滴中更高浓度的沉淀剂。小液滴和蓄积液之间的 平衡过程是通过水或有机溶剂的扩散来完成的。直到最后，在两者中蒸气压相等， 此过程才结束。如果发生了水从小液滴往蓄积液转移，那么小液滴的体积会发生 变化，导致液滴中各物质的浓度发生了变化，而对于蒸气压比水高的物质，那么 就会有水从蓄积液往小液滴转移的情况。这两种情况对于悬滴法和坐滴法、三明 治滴法都相同。 ( b ) s i t t i n gd r o p( c ) s a n d w i c hd r o p 1 3 山东师范大学硕士学位论文 图2 1 气相扩散方法培养蛋白质晶体图。其中，( a ) 悬滴法( b ) 坐滴法( c ) 三明治法 气相扩散方法最采用三种沉淀剂。它们是盐，如n a t l 和( n 地) 。s o 。；有机溶 剂，如乙醇和丙酮：还有各种分子量的聚乙烯乙二醇( p e g ) 。在盐和p e g 体系中， 水从蛋白质转移到了沉淀剂溶液中，而在有机溶剂中，有机溶剂从沉淀剂中转移 到了蛋白质溶液中有机溶剂的使用是很有限的，因为有机溶剂可能导致蛋白质 的变性1 5 ”。 2 ) 批量法 批量法是将要结晶的生物大分子和沉淀剂混合在一起，并使最终溶液中的生 物大分子立即达到过饱和状态。对于悬滴法或坐滴法而言，蓄积液的作用和气相 扩散法中不同。它不再起到浓缩悬滴或坐滴溶液的作用，而仅仅起到维持一个恒 定的蒸气压的作用。因为结晶过程是从过饱和开始进行的，形成的核子一般较大。 用批量法很少得到大的晶体，因为蛋白质浓度离亚稳定区很近。图2 2 p r o t e i n1 川 p r e c i p i t a n t1 川 l 到2 2 批量法培养晶体 3 ) 平衡透析法 利用半透膜允许小分子透过而不允许大分子透过的性质，来调节蛋白质溶液 的离子强度或p h 值，使蛋白质溶液慢慢地接近饱和。这种方法的优点是；通过 有控制的扩散，改变结晶的条件，从而慢慢地到达晶核形成点。晶体的生长也是 可以不断的调节，已经产生的沉淀或微晶可通过外部条件的改变重新溶解。这种 方法可以在低离子强度条件下应用传统的盐析方法结晶，它既适用于大批量的结 晶，也可应用于微量的结晶。图2 3 为平衡透析法培养晶体示意图，蛋白质母液 内的条件通过半透膜与外部溶液平衡透析而改变。 山东师范大学硕士学位论文 鬻尉o - r i n g 9 弋l 蒹 d i e d y s l sh u m o r l 幽2 3 透析法培养晶体示意图 4 ) 晶种接种或重复接种 当某种蛋白质在应用各种微量结晶试验后，仅能得到小晶体而得不到足够大 的适应于分析用的晶体时候，就可以试验用接种或重复接种的方法来培养晶体。 这种方法是把已得到的小晶体经选择、清洗后接入到新配置的结晶母液中，作为 晶体生长的晶核，然后采用上面介绍的任何一种晶体培养的方法继续设法使晶种 长大为适用于分析用的大晶体。 晶种的来源：( 1 ) 由微量法得到小晶体( 0 0 1 0 1 r a m ) ，或者由其他方法得 到的更小的微晶；( 2 ) 蔟生的针状的或片状的晶体，经过精心分离、切断、挑选 的单晶片段。晶体的选择，最好在偏光显微镜下进行，这样容易选取外行归整、 无裂纹、又不是孪生的小晶体或晶体片段为晶种。 晶种的转移：选好的晶体，在接种前需要在一定的浓度的沉淀剂缓冲溶液中 清洗，去掉晶种表面附着的晶体碎片和变性的蛋白，并使晶体表面新鲜。沉淀剂 浓度一般略高于原晶体生长时候的浓度，以免在清洗过程中溶液。经多次清洗后 的晶种，借助于玻璃毛细吸管或用l o o p ，小心地转移到新配置的晶体生长母液 中。在转移过程中一定要保证晶种的完整，同时要注意尽可能地减少把清洗晶种 的溶液带八新鲜母液里，防止改变母液的浓度。母液中蛋白质和沉淀剂浓度应根 据原晶体生长时候的条件，经试验决定。一般为蛋白质浓度略略低于原晶种生长 时候的浓度，而沉淀剂浓度略高于原晶种生长时候的浓度。这样即保证晶种移入 后不溶解，又有利于晶种的生长。 晶种的生长：已转移到母液中的晶种，可采用前面介绍的任何一种方法来促 使晶种继续生长增大，如果一次接种后，尚不能达到足够大，可将该晶体再做晶 种，并按上述步骤再清洗，转移生长，如还达不到要求，可再重复，以至获得符 合要求的单晶为止”“。 一田 山东师范大学硕士学位论文 2 2 蛋白质晶体生长的过程 从溶液中生长出晶体，正如象水变成冰一样，是一个相变的过程。从系统组 分可预见的行为来看，这是一个不连续的过程。当两个相之间的能垒被克服以后， 这种相变化就会发生，并且相的变化导致一个能量上讲更为有利的状态。对于生 物大分子晶体来说，相变过程由于蛋白质在溶液里的排列时处于较为不利的能量 状态下的排列而致使其能量上不适，当进入故态时变会使这些得到改善，这是就 会发生蛋白质溶液的相变。 t i m e 图表24 晶体生长过程的能垒图 生物大分子使用三个主要的方法来完成这个相变的过程：1 扰动正常的大分 子与溶液间的关系，包括水分子和水中的离子。2 扰动溶剂结构使大分子外溶剂 壳破坏，从而促进相变过程。3 提高单个大分子间的相互作用的数目和强度，包 括与水和离子的作用。然而，大分子