（食品科学专业论文）热处理对大豆分离蛋白结构及功能特性的影响.pdf

摘要 摘要 热处理对大豆分离蛋白结构及功能特性的影响 学科、专业：食品科学 入学时间：2 0 0 7 9 硕士研究生姓名：郭凤仙 答辩时间：2 0 0 9 6 1 3 指导教师：陈洁教授 授予学位时间：2 0 0 9 6 热处理是种常用的蛋白改性手段，同时也是食品加工过程中不可避免的工艺流 程。关于热处理对大豆分离蛋白结构及功能影响的研究已有很多报道，但还存在很多争 议，特别是在功能特性方面。因此，本论文主要探讨了加热程度以及加热方式对大豆分 离蛋白结构及功能特性的影响，以期为s p i 的合理应用和生产工艺的优化提供借鉴。 论文重点探讨了热处理方式、加热时间和温度以及热处理时的蛋白浓度对热处理 后大豆分离蛋白的结构及功能的影响。热处理方式采用常压保温、超高温瞬时加热( 1 3 5 ，5 s ) 以及喷雾干燥( 8 5 ) 三种方式；常压加热温度分别为8 0 、9 0 、1 0 0 ，加热 时间分别为1 5 、3 0 、6 0 、1 0 0 和1 8 0 m i n ；在分别考察了不同浓度下蛋白质聚集程度的基 础上，选择了两种具有不同聚集特征的蛋白质浓度2 和5 ( w v ) ，进一步考察蛋白质在 不同浓度下对于热处理的承受能力。大豆蛋白结构特征的表征采用了d s c 、分子量分布、 溶液中的粒径分布、表面疏水性、蛋白质的巯基、羰基及自由氨基的含量。大豆分离蛋 白功能特性主要考察了溶解性、乳化活性和起泡特性。 研究结果显示，热处理后的大豆分离蛋白结构特征随热处理温度和蛋白浓度的不 同有很大差异。经不同方式热处理后，s p i 的疏水性都显著提高。从分子量分布和粒径 分布的结果看，采用不同方式热处理后蛋白发生了明显的聚集和分解，且热处理温度以 及蛋白浓度越高，聚集现象越严重。g p c 及自由氨基测定结果显示，热处理蛋白浓度越 低，分解现象越严重。羰基的研究显示热聚集会降低s p i 的氧化速度。 热处理温度、时间以及作用方式对于不同浓度大豆分离蛋白的功能特性也有不同 的影响。2 的大豆分离蛋白8 0 热处理后，除乳化稳定性有所下降外，其它功能特性没 有显著性变化；在9 0 和1 0 0 条件下热处理，蛋白的乳化活性显著下降，但起泡特性得 到一定得改善。5 的s p i 经热处理后乳化活性、泡沫稳定性和溶解性都得到显著改善。 相对超高温处理，喷雾干燥对大豆分离蛋白的性能影响较小。喷雾干燥造成了轻微的蛋 白聚集现象，导致溶解性的下降，而超高温处理造成蛋白的聚集和解离现象严重，造成 乳化活性的下降，但溶解性和起泡性都得到一定的改善。 热处理对大豆分离蛋白结构上的影响与其功能特性的变化有着一定的相关性。将聚 集度、疏水性、羰基以及巯基含量与其功能性质进行相关性分析，结果显示可溶性聚集 体的形成是影响s p i 功能特性的主要原因。热处理强度不同，形成的聚集体含量以及聚 集体分子的大小不同，造成s p i 的功能特性上有较大差异。s p i 在低浓度下热处理形成 的聚集体分子较小，有利于起泡性的改善。高浓度热处理形成的聚集体含量升高，分子 较大，s p i 乳化活性以及泡沫稳定性得到改善，但起泡性下降。 关键词：大豆分离蛋白( s p i ) ，热处理，结构特征，功能特性 a b s t r a c t a b s t r a c t h e a tt r e a t m e n tw a sw i d e l ya p p l i e di nf o o di n d u s t r ya sap r o t e i nm o d i f i c a t i o nm e a n sa s w e l la sa l li n e v i t a b l ep r o c e s sd u r i n gp r o d u c t i o n t h ee f f e c to fh e a tt r e a t m e n to ns t r u c t u r a la n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o fs o yp r o t e i ni s o l a t e ( s p i ) h a sb e e nw i d e l ys t u d i e db ym a n y i n v e s t i g a t o r s h o w e v e r ，s o m er e s u l t sw e r ed i f f e r e n tf r o me a c ho t h e r s o ，af u r t h e rs t u d yo n t h i sp r o j e c tw o u l db eh e l p f u lf o rt h eo p t i m i z a t i o no fp r o d u c tp r o c e s s i n ga n dt h ep r o p e r a p p l i c a t i o no fs p i i nt h i sp a p e r , w em a i n l yi n v e s t i g a t e dt h ei n f l u e n c eo fh e a tt r e a t m e n tb yd i f f e r e n tm e a n s ， t e m p e r a t u r e s ，h e a t i n gt i m e sa n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n so ns t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d f u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fs p i t h r e em e a n sw e r ec h o s e nf o rh e a tt r e a t m e n t s ，i n c l u d i n gh e a t i n s u l a t i o n , s p r a yd r y i n ga n di n s t a n ts u p e rh i g ht e m p e r a t u r es t e r i l i z e r0 - j h d t h ei n s u l a t i o n w a sp e r f o r m e da t8 0 ，9 0a n d1 0 0 1 2f o r l 5 ，3 0 ，6 0 ，1 0 0a n d18 0m i nr e s p e c t i v e l y a f t e rt h e e f f e c to f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n so n p r o t e i na g g r e g a t i o nb e i n gs t u d i e d , t w op r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s ，2 ( w v ) a n d5 ，w i t hd i f f e r e n ta g g r e g a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sw e r ec h o s e nt o s t u d yt h ei n f l u e n c eo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n so nt h eh e a t i n ge n d u r a n c eo fs p i t h es t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c so fh e a tt r e a t e ds p lw e r ec h a r a c t e r i z e db yd e n a t u r a t i o nd e g r e e ，h p l c ，d y n a m i c l i g h ts c a t t e r i n g ，s d s - p a g e ，s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y , f r e es u l f h y d r y lg r o u p sa n dc a r b o n y l g r o u p sw h i l ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e sw e r ee v a l u a t e db ys o l u b i l i t y , f o a m i n ga n de m u l s i f y i n g p r o p e r t i e s ad i f f e r e n ti n f l u e n c eo fh e a tt r e a t m e n t so nt h es t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c so fs p iw a s o b s e r v e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n s t h es u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yo f s p lw a si m p r o v ea f t e rh e a tt r e a t e db yd i f f e r e n tm e a n s t h er e s u l t so fh p l ca n dd y n a m i cl i g h t s c a t t e r i n gs h o w e dt h a td i f f e r e n th e a tt r e a t m e n t sa l lr e s u l t e di nt h ep r o t e i na g g r e g a t i o na n d d i s s o c i a t i o n h i g h e rt e m p e r a t u r ea n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a sa p p l i e d ，m o r er e m a r k a b l e a g g r e g a t i o nw a so b s e r v e d t h er e s u l t so fg p ca n df r e ea m i n og r o u p sd e t e r m i n a t i o ns h o w e d t h a tt h ed i s s o c i a t i o np h e n o m e n o no fh e a t e ds p iw a sm o r eo b v i o u sa tl o wp r o t e i n c o n c e n t r a t i o nt h a nt h a ta t 1 1 i g hp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n a n dt h e r e s u l t so fc a r b o n y l d e t e r m i n a t i o ns u g g e s t e dt h a tt h ea g g r e g a t i o nc o u l dr e d u c et h ev e l o c i t yo fp r o t e i no x i d a t i o n r e s u l t i n gf r o mt h ei n f l u e n c eo ns t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，ad i v e r s ee f f e c to fh e a t t r e a t m e n t so nt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e sw a so b s e r v e d w h e nt r e a t e da tt h ec o n c e n t r a t i o no f2 ， i tw a sf o u n dt h a tt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fs p lw e r ec h a n g e di n s i g n i f i c a n t l ye x c e p tt h e d e c r e a s eo fe m u l s i f ys t a b i l i t y ；a t9 0a n d10 0 ，t h ee m u l s i f y i n gp r o p e r t i e sd e c r e a s e d r e m a r k a b l yw h i l et h ef o a m i n gp r o p e r t i e sw a sl i m i t e di m p r o v e d t h ee m u l s i f y i n gp r o p e r t i e s a n dt h es o l u b i l i t yo fs p lw e r ei m p r o v e ds i g n i f i c a n t l yw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n r e a c h e dt o5 ，a n dt h ef o a m i n gs t a b i l i t yi n c r e a s e dw h i l et h ef o a m i n gc a p a c i t yd e c r e a s e d s p r a yd r y i n gh a dal i m i t e de f f e c to np r o t e i na g g r e g a t i o n ，w h i c hr e s u l t e di nt h ed e c r e a s eo f s o l u b i l i t y , a sw e l la st h eu h tl e a dad r a m a t i cd i s s o c i a t i o no fp r o t e i n s ，r e s u l t i n gi nt h e d e c r e a s eo fe m u l s i f y i n gp r o p e r t ya n dt h ei m p r o v e m e n to fs o l u b i l i t ya n df o a m i n gp r o p e r t y o nt h eb a s i so fw o r kb e f o r e ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nf u n c t i o n a lp r o p e r t i e sa n d i l a b s t r a c t s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c sw a ss t u d i e d s o l u b l ea g g r e g a t i o n sh a da ni m p o r t a n te f f e c to nt h e f u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fh e a tt r e a t e ds p i d i f f e r e n tf u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fh e a tt r e a t e ds p l w a so b s e r v e dm a i n l yb e c a u s et h ec o n t e n ta n ds i z eo fa g g r e g a t e sv a r i e dw h e nd i f f e r e n th e a t i n g c o n d i t i o n sa n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a sa p p l i e d w h e nt r e a t e da tl o wp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n ， t h es m a l ls i z ea g g r e g a t e sw a sf o r m e d ，r e s u l t i n gi nt h ei m p r o v e m e n to ff o a m i n gc a p a c i t y w h i l ea th i g hc o n c e n t r a t i o n ，t h ec o n t e n ta n ds i z eo fa g g r e g a t e sw a s i n c r e a s e d ，t h ee m u l s i f y i n g p r o p e r t ya n df o a m i n gs t a b i l i t yw e r ei m p r o v e dw h i l et h ef o a m i n gc a p a c i t yd e c r e a s e d k e y w o r d s ：s o yp r o t e i ni s o l a t e ( s p i ) ，h e a tt r e a t m e n t ，s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：望! 垒鱼 日 期： - , o o , r 6 f f 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：椰l i 1 i 嘲日 期：妒尿6 。修 导师签名： 日 期：零占，侈 l 前言 i 1 立题意义和背景 1 前言 大豆蛋白是大豆中主要的营养成分之一，也是世界优质植物蛋白质之一，其含量占到大豆千基 的4 0 以上，并含有人体所需的8 种必需氨基酸，组成比例平衡，是理想的食用蛋白资源。近年来， 随着大豆蛋白的营养价值及其经济价值研究的广泛深入，大豆蛋白在食品中的应用也越来越广泛。 食品工业中，不仅利用脱脂大豆蛋白粉和全脂大豆蛋白粉制作婴儿食品、代乳粉、饮料、油炸面圈、 面包增自剂、肉肠粘合剂，而且应用大豆组织蛋白，分离蛋白及纤维蛋白等作为肉、乳、蛋、鱼等 动物性食品的部分代用物或全部代用物。特别是大豆分离蛋白在肉制品中的应用，使我国大豆分离 蛋白的年需求量在2 0 0 6 年达到7 万屯以上，而目前我国大豆分离蛋白生产厂家近3 0 多家，年生产 量达5 万多吨位，所以我国的大豆分离蛋白市场发展空间广阔。 目前我国大豆分离蛋白的产量虽然逐年增加，从需求量上看供不应求，但事实上由于产品质毋 与进口产品的差距较大，使得我困的大豆分离蛋白产品在市场上的竞争力不足，产品的发展受到很 大限制。大豆分离蛋白产品质量主要取决于生产工艺，而大豆分离蛋白生产工艺中豆粕脱脂闪蒸， 喷雾干燥，复性过程都涉及到热处理过程，前人研究表明，热处理对大豆分离蛋白结构及功能特性 影响显著。此外，大豆分离蛋白在食品、制药等行业的应用越来越广泛，但多数厂家在产品的应用 中存在一个误区，认为热变性越低的产品质量越好，功能性越高，而事实上根据研究结果看，竺定 程度的热变性可以改善蛋白的某些功能特性，但就这一方面的理论研究还不很完善。由于采用的大 豆分离蛋白原料不同，原始蛋白的性质就存在差异，导致一些研究结论存在不一致性u 机5 2 5 一引。所 以，进一步深入的研究热处理对大豆分离蛋白结构及功能特性的影响以及结构和功能之问的相百关 系，一方面可以为优化蛋白的生产工艺提供理论根据，对大豆分离蛋白在食品工业中的具体应用自 重要指导意义，同时为功能性大豆分离蛋白产品的研发提供新的思路，从而可以进一步拓宽其应用 领域，促进大豆分离蛋白产业的发展，另一方面可以进一步完善这一领域的基础理论研究。 本课题来源于十一五“8 6 3 ”项目“植物源蛋白质性质的生物技术改良”( 2 0 0 6 a a i o z 3 2 5 ) 以及 益海嘉里集团食品技术研究所“植物蛋白质性质研究”项目支持。 1 2热处理对大豆分离蛋白结构和功能影响 热处理是食品加工中不可避免的加工方法，也是最常用的大豆蛋白变性方法。热变性引起蛋白 质亚基的解离，分子结构的展开以及分子内部的疏水基团的暴露，展开的分子发生聚集。热变性往 往会伴随着溶解性的下降刊，从而影响大豆蛋白的凝胶性，乳化性和起泡性等功能特性。热变性也 受p h ，离子强度，加热温度，加热时间，冷却温度以及巯基和二硫键数量的影响。 1 2 1 热处理对大豆分离蛋白结构特征的影响 大豆分离蛋白中两种主要成分为7 s 和l l s 。大豆球蛋白( i i s ) 的结构是由六个亚基组成的六聚 体，每个亚基含有一个酸性多肽链( a ，3 7 4 5k d a ) 和个碱性多肽链( b ，2 2k d a ) ，二者通过 一个二硫键连接形成a b ，其分子量在3 5 0 k d a 左右。s t a s w i c k 和n i e l s e n 惜已经鉴定出七种酸性片 断( a ma l l l ，a 2 ，如，a 4 ，a 。和a e ) ，五种碱性片断( b h ，b 。，b 3 和b 4 ) 。根据序列鉴定，发现有1 t 种亚些， 可以分为两组：组i ：a 。b - “，a t s b z ，a 2 b 。；组i i ：a 3 b 。，a 5 a ，b a 。不同的大豆品种，不同的产地其组分 及其亚基的含量各不相同。b 一伴球蛋白( 7 s ) 是一个三聚体糖蛋白，相对分子质量1 5 0 2 0 0k d a 。 一伴球蛋白主要由三种亚基组成憎。，即a ( 6 7k d a ) ，q 7 ( 7 1k d a ) ，b ( - - - 5 0k d a ) 。这些 亚基的氨基酸序列彼此类似，每个q 和a 亚基在靠近n 一末端均有一个半胱氨酸残基( 一s h ) ，但b 亚 江南大学硕士学位论文一 基没有。在这些亚基中均不存在胱氨酸残摹( 一s s 一) 。 有关热处理对大豆分离蛋白的结构特征影响的研究辛要集中在蛋白分子的热聚集及解离现象 上。1 1 s 嗍引和7 s 引的热变性都受p h ，离子强度，加热温度，加热时间，冷却温度以及巯基或二硫 键的影响。当1 1 s 在1 0 0 。c 下热处理时，大约5 0 的蛋白分子快速形成可溶性聚集体。继续加热，可 溶性聚集体越变越大，最后形成沉淀n 纠引。沉淀中主要成分是碱性多肽链，而酸性多肽链仍然可溶 f lr - t 9 。加入变性剂后，促进了沉淀的生成。1 w a b u c h in 8 。伸1 研究发现当体系中离子强度很低时，热处理 后7 s 解离生成的亚基仍然以亚基形式存在。当i i s 署b 7 s 混合加热时，p 一7 s 亚基和b l l s 多肽链之间发 生交联，从而抑制了碱性多肽链沉淀的形成n 2 2 - 2 3 op t r u c c e l l i 妲蛳3 等人研究发现，在p h 7 和9 时， 大豆蛋白经强热( 9 8 ，3 0 m i n ) 处理后变性聚集，持水性增强，表面疏水性、溶解性下降。但在p h 7 时，低浓度下热处理，其溶解性和表面疏水性都增加。7 s 球蛋白完全变性，而1 1 s 变性程度取决于处 理条件。不同的处理条件其形成的a b l l s ，1 3 - i i s ，b 一7 s 聚集的比例不同。当热处理温度下降至, j 8 5 时，a b - 1 1 s 亚基的含量下降，同时大豆球蛋白的a 、b 两个亚基含量逐渐升高。当p h 增加到9 或l o ， 或者增加蛋白质浓度，加热过程中a b 一1 1 s 亚基聚集增强。添办f l n a z s o s 或者调解p h 至u 9 或1 0 ，有利于1 3 1 l s 之间以及1 3 7 s 、- w 基和b 一1 i s 多肽链之间的聚集。琥珀酰化的伴球蛋白能够增强这种抑制作用心州， 这说明b 一伴球蛋白对球蛋白聚集的抑制作用是非特片性的，这是球蛋白的构象受到伴球蛋白亚基和 球蛋白的碱性亚基之间的通过静电作用的影响的结果。s o r g e n t i n i 他引等人研究了热处理对大豆分离蛋 白的可溶性和不溶性部分的结构和功能的影响。8 06 c 热处理后，7 s 完全变性，1 1 s 部分变性；1 0 0 热处理后，1 1 s 也完全变性，大豆蛋白的浓度越大，热处理后的可溶蛋白所含的b l l s 多肽链，a ， a ，1 3 7 s 亚基越少，而a 一1 i s 多肽和乳清蛋白增多。热变性的可溶性蛋白分子之间的作用的下降 导致了凝胶能力的丧失。同时，分子量降低，分子柔顺性增加，提高了蛋白质的起泡性和泡沫稳定 一眭。 1 2 2 热处理对大豆分离蛋白功能特性的影响 大豆蛋白如今被越来越多的应用在食品体系中，如烘焙食品，饮料等，但其生产工艺条件的不 同和原料豆粕经过的加工工艺的不同对产品的功能特性的影响各不相同。商业大豆分离蛋白在被作 为一种功能性添加剂使用前，为了节省时间，往往通过检测其氮溶指数或蛋白质分散指数来指示其 功能特性的优劣心7 1 。因此，溶解性被认为是制约大豆分离蛋白功能特性的重要因素，具有高的溶解 性是获得好的功能特性，如起泡性，乳化性，凝胶性的前提。 热处理对大豆分离蛋白溶解性的影响一直是这一领域研究的热点之一。通常认为一种蛋白经历 的热处理越少它的溶解性就越好，但经过多年的研究已经证实这是一种误导。大豆分离蛋白在不同 的浓度、p h 条件下经不同的温度及时问热处理，其溶解性的变化各不相同。s o r g e n t i n i 嵋引等人研究发 现，在p h 8 0 时，经8 0 和1 0 0 ，3 0 m i n 热处理，其溶解性随着大豆分离蛋白浓度( 5 1 5 ) 的 增加而降低，但降低趋势趋缓；相同浓度下，1 0 0 比8 0 的溶解性低。而s a i o h 2 9 1 研究发现， 热 处理温度由1 0 0 升高到1 0 5 过程中，大豆分离蛋白的溶解性开始快速降低，当温度从1 0 5 升离剑 1 5 0 ，大豆分离蛋白的溶解性开始缓慢升高，随着处理温度的进一步升高( 1 5 0 1 7 0 ) ，其溶解性 快速升高。f e n ga n dx i o n g 训也报道1 0 的大豆分离蛋白在9 0 和9 5 下分别热处理3 m i n ，具溶解 性显著下降。而p e t r u c c e l l ia n da n o n 心副也报道1 0 的s p i 在9 8 热处理5 m i n 或3 0 m i n ，其溶解性损 失很大，但4 的s p i 在8 0 或9 2 c 热处理6 或1 2 m i n 后，溶解性没有显著性变化。由此可见，大豆 分离蛋白的溶解性受温度的影响很大，总体上，浓度越高，处理时间越长，越容易造成溶解性的损 失，但在较高温度下热处理，如s a i o l 2 卜2 9 1 报道，有利于溶解性的改善。 乳化活性是指油和水混合在一起形成乳状液的性能，包括乳化性和乳化稳定性两个方面。乳化 性是指蛋白质在促进油水混合时，单位质量的蛋白质( g ) 能够稳定的油水界面的面积( m 2 ) 。乳化稳定 性是指蛋白质维持油水混合不分离的乳化特性对外界条件的抗应变能力。大豆分离蛋白属于典型 2 前言 的氨基酸型表面活性剂。大豆分离蛋白乳化活性在许多产品中都有重要作用，如咖啡乳、沙拉酱、 柠檬蛋黄酱、冰点，碎肉。影响大豆分离蛋白的乳化活性的外部因素有ph 、离子强度和温度等。 就热处理方面，研究表明不同蛋白浓度和热处理温度对其乳化性的影响有很大差别。h u r o n 引曾报 道当温度升高到5 0 时，大豆分离蛋白的乳化能力降低。p e t r u c c e l l i 拉钔发现，4 的浓度8 0 或9 2 。cf 短时间热处理后，大豆分离蛋白的乳化活性得到很好的改善，但浓度升高到1 0 ，在9 8 。c 热处理3 0 m i n 后，乳化活性下降。 起泡性简单理解是指蛋白质成膜生成气泡这一现象，其原理和乳化性类似，都是反应蛋白质界 面活性的重要指标。要形成气泡，首先应使蛋白质充分溶解，使到达气液界面的蛋白质浓度提高。 界面上的高浓度的蛋白变性伸展，多肽链之间相互作用成膜，降低了界面的表面张力。同时由于大 豆蛋白的部分肽链问( 包括分子内和分子间) 的相互作用，形成了一个二维保护网络，使界面膜得 以加强，这样就促进了泡沫的形成与稳定b 孙。 蛋白质起泡性取决于以下两个方面的能力，即蛋白质迁移至界面的速率和其在界面上快速重排 形成稳定膜的能力。所以，蛋白起泡性的好坏主要是f n 蛋白分子自身的结构特性所决定的。凡影响 蛋白质结构特征的因素也一定会影响到起泡性，如p h 值、温度、离子强度及与其它食品组分相互 作用n 卜3 5 1 。k e s h u n h 6 1 报道称将大豆分离蛋白加热到7 5 8 5 c n j 以提高蛋白的起泡特性。s o r g e n t i n i 1 2 引 研究发现，当蛋白浓度为5 时，在8 0 热处理3 0 r a i n 后，s p i 起泡性略有改善。高浓度( 8 ) 下， 8 0 ( 2 热处理3 0 m i n 后，起泡性和泡沫稳定性都受到一定破坏，而在1 0 0 ( 2 处理相同口、j 问，起泡性和 泡沫稳定性又都有显著改善。 。 通常大豆分离蛋白的起泡作用主要应用于高级糕点上的装饰及冰淇淋和啤酒中。 1 3 现有研究存在的问题 现有的有关大豆分离蛋白热处理方面的研究虽然从功能性质方面以及结构特性方面有较为深入 的研究，但在还存在一些不足。首先，由于不同大豆蛋白生产商使用原料和提取工艺不同，造成大 豆蛋白的变性程度不同，蛋白的结构及功能特性的处在一定差异，所以导致一些有关大豆分离蛋白 热处理的研究结论存在不一致性。例如在肉制品中的应用，m a t u l i s 哺7 j 报道，在f r a n k f u r t e r 香肠中采 用3 大豆分离蛋白替代肉蛋白可以使肌肉凝胶的硬度上升；c h i n m 等人报道，在b o l o g n a 香肠中采 用2 2 大豆蛋白，替代肉蛋白不会影响肌肉凝胶强度；然而，m c c o r d 等人训则报道，大豆分离蛋 白会削弱肌肉蛋白的凝胶强度。又如p e t r u c c e l l i 幢引报道1 0 的大豆分离蛋白9 8 热处理5 m i n 或 3 0 r a i n ，其起泡性没有显著性的改善，而s o r g e n t i n i 幢副研究发现8 和1 1 的大豆分离蛋白1 0 0 热处 理3 0 m i n 后起泡性和泡沫稳定性都有显著提高。所以有关热处理对大豆分离蛋白影响的基础理论需 要做更深入的研究。其次在研究内容上，大多数研究只局限在短时间热处理( 3 0 m i n ) 的研究上， 有关长时间热处理的报道很少。而在食品体系的具体应用中产品往往需要长时间热处理，如盐水火 腿的蒸煮要在7 8 - 8 5 下蒸煮3 5 h o 。因此，作者认为进一步深入的研究热处理过程，特别是长时 问热处理对大豆分离蛋白结构及功能的影响很有必要。 1 4 本论文研究内容、研究目标和拟解决的关键问题 本课题主要想通过研究热处理对大豆分离蛋白结构及功能的影响，获得有利于改善大豆分离蛋 白不同功能特性的热处理条件，为s p i 在不同食品体系中的应用提供参考，同u 、j 也为蛋白生产工艺的 优化提供借鉴。拟解决的关键问题是在蛋白结构及功能方面的相互关系上有所突破。 主要研究内容如下： 1 研究热处理对大豆分离蛋白结构的影响； 2 研究热处理对大豆分离蛋白功能特性的影响； 3 江南大学硕十学位论文 3 超高温和喷雾干燥对大弓分离蛋白性能的影响； 4 探讨热处理过程中大豆分离蛋白结构与功能性的相互关系。 2 1 实验材料及设备 2 1 1 实验材料 2 实验材料与方法 原料豆( 台湾2 9 2 ) 5 ，5 二硫代双( 2 一硝基苯甲酸) ( d t n b ) 三硝基苯磺酸( t n b s ) 卜苯胺基- 8 - 萘磺酸( u q s ) 金龙鱼大豆色拉油 s d s ，其它试剂 2 1 2 实验设备 机械搅拌器 u v 一2 8 0 0 h 型紫外可见分光光度计 磁力搅拌器 6 5 0 6 0 型荧光分光光度计 d e l t a3 2 0 型酸度计 j z 7 1 1 4 型粉碎机 a v a n t ij 一2 6x p 茬葑速离心机 h h 一4 数显恒温水浴锅 h p l c n a n oz s 动态光散射仪 p t _ 2 0 c 一管板式组合式超高温杀菌机 q z 一5 高速离心喷雾干燥机 p y r i si 差式扫描量热仪( d s c ) t 1 8b a s i c 高速乳化均质机 2 2 实验方法 2 2 1 大豆分离蛋白的制备 开源市宏大种子有限公司生产 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 食用级，上海嘉里粮油工业有限公司 a r ，国药集团化学试剂有限公司 广州仪科实验仪器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 广州仪科实验仪器有限公司 日本日立公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 上海朝阳微电机厂 美国b e c 删洲公司 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司 日本岛津公司 英图马尔文公司， 日本p o w e r p o i n ti n t e r u a t i o n a l 无锡锡山林洲干燥机厂 英国p e r k i ne l m e r 公司 英国i k a 公司 大豆分离蛋白的提取方法主要参考f e n ga n dx i o n g 川，有所改变。 大豆去皮碾成碎成粉( 6 0 日) ，正己烷乙醇溶液9 ：l ( v v ) 脱脂：料液比：1 ：3 ( w v ) ，室温搅 拌3 0 m i n ，浸提2 次。脱脂豆粉与水l ：1 0 ( w v ) 室温下搅l h ，八层纱布过滤，滤液用2 n 的n a o h 调p h 到 8 0 0 ，室温下搅拌2 h ，1 5 9 0 0 x g 离，l , 2 5 m i n 。取上清液用2 n 的h c i 溶液调p h 4 5 ，3 3 0 0 g 离一巴, 1 5 m i n ， 得到沉淀复溶液调到中性，微量凯氏定氮测定其浓度l j n h o 0 3 叠氮钠4 c 保藏，蛋白纯度为9 2 6 。 2 3 1 大豆分离蛋白的热处理 大豆分离蛋白储液经1 2 0 0 0 x g ，4 离心1 5 m i n ，取上清液用l o w r y 法n 2 1 测定其浓度，用超纯水 4 ! 壅丝塾型皇查鎏 用超纯水调节到所需浓度，用i m o l lh c i 调节p h i l 7 0 各取1 5 0 m l 上述蛋白液分别在8 0 、9 0 和1 0 0 条件下处理1 5 、3 0 、6 0 、i 0 0 和1 8 0 m i n ( 温度升高到测定温度时开始计时) ，取出后立即浸入冰浴冷 却。 2 2 2 变性程度的测定 应用差示扫描量热仪测定蛋白质的变性温度，参考m o l i n ao r t i z h 3 1 方法，浓度为2 0 的蛋白溶液 经热处理后冰浴冷却，精确称取一定量的样品密封于铝盒内，变温速度为l o c m i n ，温度范围为 2 0 一1 2 0 ，用一空的密封铝盒作为对照，所有样品至少两个重复。 2 2 3 分子量分布的测定 采用h p l c 来研究分子量分布，使用岛津高效液相系统和t s kg 4 0 0 0 s w x l 凝胶柱和紫外检测器。柱 予的洗脱极限为l o ，分离柱柱效大于2 0 0 0 0 。流动相为5 0 m m o l lp h 7 0 磷酸盐缓冲液，离子强度0 3 m ， 洗脱速率为1m l m i n ，洗脱液在2 8 0n m 处检测，所有的实验都重复两次，取代表性的结果用于讨论。 2 2 4 凝胶电泳 参考l a m e m m i 着i m o r i 州1 等人的实验方法，通过s d s - p a g e 凝胶电泳的方法测定不同反应时问的反 应液在分予组成成分上的差异。电泳仪为p o w e r p a cb a s i c ，采用5 的浓缩胶和1 5 的分离胶，浓缩胶 电流控制在2 0 m a ，分离胶控制在4 0 m a 。用o 2 的考马斯亮兰染色液染色两小时，最后用含4 0 甲醇和 1 0 醋酸的脱色液脱色l o t 、时。 n a t i v e - p a g e 电泳方法参考d a v i s h 6 3 2 及m o r ia n du t s u m h ，分离胶浓度为7 5 ，浓缩胶浓度为3 。 其他实验条件同s d s - p a g e 致。 2 2 5 粒径分布的测定 应用动态光散射仪测定在9 0 。c 恒温过程中大豆分离蛋白粒径分布的变化情况。升温速率i o 。c ：。 m i n ，温度升到9 0 时开始测定，每7 m i n 取一点读数，共保温8 0 m i n 。 2 2 6 疏水性的测定 参考k a t o m 刚等人采用卜苯胺基- 8 - 萘磺酸荧光探针法测定疏水性。将蛋白样品溶解于0 o l m o l l ， p h 7 o h 酸缓冲液中，浓度范围为0 0 5 - 1 0 8 m g m l 取样品液2 m l ，加入2 0ul ，8 m m o l l 的a n s ，震荡， 静置3 分钟。设定激发波长九e x = 3 6 5 n $ ( 狭缝校正5 n m ) ，发射波长入e m = 5 2 0 ( 狭缝校正5 n m ) ，测荧光 强度。以荧光强度对蛋白质浓度作曲线，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。 2 2 7 自由氨基的测定 参考l e r t i t t i k u l 州管人的实验方法，将1 2 5ul 的反应液与2 o m l o 2 m o l lp h 8 2 的磷酸缓冲液 混合，然后) j h l o m l0 0 1 的2 ，4 ，6 一王硝基苯磺酸充分混合后，放至, j 5 0o c 的水浴中加热3 0 分钟( 避光) ， 用2 o m l 的0 1 m 亚硫酸钠终止反应后，室温下放置1 5 分钟。空白是在相同操作下用蒸馏水代替反应液。 采用紫外可见分光光度计在4 2 0 n m 测定吸光值。自f l 氨基含量根据l 一亮氨酸含量的标准曲线来确定。 2 2 8 羰基的测定 参考l e v i n e 啪1 等人测定羰基含量的方法，在1 5 m l 的聚乙烯离心管中，0 2 m l 蛋白质溶液与0 5 m l 的含有l o m m o l l2 ，4 一二硝基苯肼的2m o l lh c i 混合，在3 0 。c 条件下水浴保温l 小时。另取0 2 m l 蛋白质溶液与0 5 m l 的不含有2 ，4 一二硝基苯肼的2 m o l lh c l 混合，在3 0 。c 条件下水浴保温1 4 , 时， 5 江南大学硕士学位论文 作为空白刘1 照。然后在每个离心管中加入0 5 m l4 0 的三氯乙酸，剧烈震荡，摇均匀后静置1 0 分钟， 离心5 分钟( 1 1 0 0 0 x g ) 。弃去上清液，用l m l 的乙醇一乙酸乙酯溶液( 1 ：1 ，v v ) 洗涤沉淀3 次，蛋白 质悬浮于0 6 m l6 m o l l 盐酸胍溶液中，在3 7 。c 水浴保温3 0 分钟。以空白为对照在3 5 0 3 9 0 n m 范围内扫 描。用最大吸光值以消光系数为2 2 0 0 0 ( m o l l ) c m 叫计算每克蛋白质羰基衍生物的微摩尔数。 2 2 9 巯基的测定 巯基的测定使用e l l m a n 试剂法。巯基的测定参考h o s h ia n dy a m a u c h i 畸1 1 的方法。用l m l 蛋白溶液 与含有0 0 5 m l 的0 o i m5 ，5 一二硫代双( 2 - 硝基苯甲酸) ( d t n b ) 的4 m l 磷酸盐缓冲液( o 1 礼p h 8 0 ) 混合，室温( 2 5 。c ) 下静置2 0 m i n 。在4 1 2n m 测定其吸光值。总巯基测定用含6 m 盐酸胍的磷酸盐缓 冲液( 0 1m ，p h 8 0 ) 代替磷酸缓冲液，其他步骤相同。巯基含量用摩尔吸光系数1 3 6 0 0 0m 一1c m l 计算每克蛋白质所含的微摩尔数。 一 2 2 1o 溶解性的