（食品科学专业论文）荷叶黄酮的提取、纯化、结构鉴定及其生物活性研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 摘要 本文以荷叶为原料，研究了荷叶中总黄酮化合物的提取与纯化工艺。运用化学 分析、色谱、光谱及质谱等仪器分析技术和方法，对荷叶中黄酮化合物的结构及其 生物活性进行了初步研究。主要研究结果如下： 1 荷叶黄酮提取工艺条件的优化 本试验考察了提取液、浓度、时间、温度和料液比五个单因素对荷叶总黄酮提 取率的影响，采用三元二次旋转正交组合设计进行试验，建立了提取温度、提取时 间、提取料液比提取工艺参数间的数学模型，方程为 y = 6 7 0 3 + 2 6 8 x 1 + 0 1 6 x 2 + 2 9 4 x 3 2 0 6 x l x 2 0 4 3 x l x 3 + 0 4 1 x 2 x 3 4 7 4 x l z - 4 3 3 x _ 4 9 3 x 3 z ， 经计算机模拟寻优确定了用t w e e n 8 0 助提的最佳工艺条件：提取液为1 t w e e n 8 0 ， 浸提温度7 4 8 - 7 6 5 、浸提时间3 8 - - 一4 3 m i n 、料液比l ：2 5 - - - 1 ：2 8 。可得最高提取 率为5 9 5 。 2 荷叶黄酮纯化方法的研究 比较5 种大孔吸附树脂对荷叶黄酮静态吸附和解吸附能力，并对x a d l 6 型树 脂的动态吸附特性进行了研究。x a d l 6 型树脂最佳纯化工艺参数为：上样液浓度 1 1 m g m l ，流速为1 b v h 时，洗脱剂为5 0 的乙醇溶液，流速为2 b v h 进行洗脱， 洗脱峰对称性好。采用重结晶的方法进一步纯化荷叶黄酮，其纯度达9 2 。 3 荷叶黄酮的结构初步研究 采用紫外、红外、质谱、高效液相色谱、气相色谱等分析手段，对荷叶黄酮化 合物进行结构分析，推测该化合物结构为异鼠李素3 伊葡萄糖苷。 4 荷叶黄酮生物活性研究 ( 1 ) 荷叶黄酮体外抗氧化活性研究 分别运用邻苯三酚一鲁米诺、c u s 0 4 p h e n - v c h 2 0 2 和双氧水鲁米诺化学发光体 系测定了荷叶黄酮对超氧阴离子、体外双氧水、羟基自由基的清除作用，采用 c u s 0 4 p h e n - v c h 2 0 2 d n a 体系测定了荷叶黄酮对体外d n a 损伤的保护作用。实 验结果表明荷叶黄酮具有较好的体外清除活性氧和d n a 损伤的保护作用。 荷叶黄酮提取、纯化、结构鉴定及生物活性研究 采用比色法检测了荷叶黄酮对动物组织体外抗氧化作用的影响，结果表明荷叶 黄酮能够有效地清除羟自由基，抑制由羟自由基引起的脂质过氧化、保护生物膜， 减少红细胞溶血，减轻肝线粒体肿胀程度，提示具有很强的抗氧化能力。 ( 2 ) 荷叶黄酮对胰脂肪酶、口靛粉酶活性的影响 研究了荷叶黄酮的浓度、作用时间、酶剂量等对猪胰脂肪酶、以靛粉酶活性的 影响。结果表明：( a ) 荷叶黄酮抑制猪胰脂肪酶活性是通过间接改变底物乳化来阻 碍底物酶结合达到抑制作用，呈非竞争性抑制；( b ) 荷叶黄酮对a 淀粉酶活性有 抑制作用，且荷叶黄酮粗提物对淀粉酶活性抑制作用大于精制黄酮，提示荷叶黄酮 对淀粉酶的抑制作用可能是物质问的协同作用。 关键词：荷叶；黄酮；提取工艺；分离纯化；结构鉴定；生物活性 i i 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 s t u d yo nt h es e i a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ， s t r u c t u ra i 。i d e n t i f i c a t i o na n db i o a c t i t i e s o ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a f a b s t r a c t t h et e c h n o l o g i e so ft h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h et o t a lf l a v o n o i d sf r o ml o t u s l e a fw e r es t u d i e di nt h i st h e s i s t h ec h e m i c a l ，s p e c t r a l ，c h r o m a t o g r a p h i ca n dm a s s s p e c t r o g r a p h i ca n a l y s i sw e r eu s e dt or e s e a r c ht h es t r u c t u r ea n db i o a c t i v i t i e so ff l a v o n o i d s i nl o t u sl e a f t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 o p t i m i z a t i o nf o re x t r a c t i o np r o c e s so ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a v f e f f e c t so fe x t r a c t i o ns o l v e n t ，t h es u r f a c t a n tc o n c e n t r a t i o n ，t i m e ，t e m p e r a t u r ea n ds o l i d s o l v e n tr a t i oo ne x t r a c t i o n y i e l d so ff l a v o n o i d sf r o ml o t u sl e a fw e r ed e t e r m i n e d i n d i v i d u a l l y t 1 1 eq u a d r a t i cr e g r e s s i o nr o t a t i o n a lc o m b i n a t i o nd e s i g nw i t ht h r e ef a c t o r sw a s u s e dt oo p t i m i z et h ee x t r a c tp r o c e s sa n dt h ee x t r a c t i o nr a t eo ff l a v o n o i d sf r o ml o t u sl e a f w a sc h o s e na st h e e v a l u a t i n g i n d e x t h e e q u a t i o n w a s y = 6 7 0 3 + 2 6 8 x 1 + 0 1 6 x 2 + 2 9 4 x 3 - 2 0 6 x l x 2 0 4 3 x l x 3 + 0 4 1 x 2 韵- 4 7 4 x l z - 4 3 3 x 2 2 - 4 9 3 x 3 z , a f t e r o p t i m i z i n gt h ec o m b i n a t i o nd i f f e r e n tf a c t o r sb yc o m p u t e r , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m u me x t r a c t i o np a r a m e t e r sw e r e ：t e m p e r a t u r e ( 7 4 8 - - 6 5 ) ，t i m e ( 3 8 - - - 4 3 m i n ) a n d p r o p o r t i o no f m a t e r i a la n dl i q u i d ( 1 ：2 5 - 1 ：2 8 ) t h eg a i nr a t i ow a s5 9 5 2 s t u d yo nm e t h o d sf o rp u r i f i c a t i o no ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a f f i v et y p e so fm a c r o p o r o u sr e s i nw e r ec o m p a r e di nt h e i ra b i l i t yo fa d s o r b i n ga n d d e s o r b i n gf l a v o n o i d si nl o t u sl e a f t h ed y n a m i ca b s o r b i n gb e h a v i o ro fx a d 16r e s i nw a s o b s e r v e d t i 坨o p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h ee l u t i o ns o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n 1 1 m g m l ，t h ef l o wr a t eo f a b s o r p t i o ns o l u t i o n1 b v h , ， 5 0 e t h a n o la se l u e n t ，f l o wr a t e i n2 b v h , t h ee l u t i o np e a kw a ss y m m e t r i c a li nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h ef l a v o n o i d si n l o t u sl e a fw a sf u r t h e rp u r i f i e db yr e c r y s t a l l i z a t i o na n dt h ep u r i t yw a s9 2 3 p r e l i m i n a r ys t u d yo nt h es t r u c t u r eo ff l a v o n o i d si ni o t u sl e a f t h es t r u c t u r eo ff l a v o n o i d si al o t u sl e a fw e r ec h a r a c t e r i z e d b yu v v i s n i r ，h p l c e s i m s ，h p l ca n dg cr e s p e c t i v e l y t h es t r u c t u r ew a se s t i m a t e da s i s o r h a m n e t i n 3 o 1 3 d g l u c o s i d e 4 b i o a c t i v i t i e so ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a f ( 1 ) a n t i o x i d a t i o na c t i v i t yo ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a fi nv i t r o e f f e c t so ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a fo nr e m o v a lo fs u p e r o x i d ea n i o n , h y d r o x i d er a d i c a l a n dh 2 0 2w a sd e t e r m i n e db yp y r o g a l l o l - l u m i n o ls y s t e m ，c u s 0 4 - p h e n - v c - h 2 0 2s y s t e m a n dl u m i n o l h 2 0 2s y s t e m sr e s p e c t i v e l y t h ee f f e c to fp r e v e n t i n gd n ad a m a g eb y f l a v o n o i d si nl o t u sl e a fw a sd e t e r m i n e db yc h s 0 4 一p h e n - v c - h 2 0 2 一d n ac h e m i l u m i n e s c e n e e ss y s t e m 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tf l a v o n o i d si nl o t u sl e a fp o s s e s s e dah i g h s c a v e n g i n gp o t e n c yo nr o sa n dp r e v e n t i n gd n ad a m a g ei nd i f f e r e n ts y s t e m s i l l 荷叶黄酮提取、纯化、结构鉴定及生物活性研究 e f f e c t so ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a fo na n t i o x i d a t i o no fz o o g e n i ct i s s u ei nv i t r ow e r e d e t e r m i n e db yc h r o m a t o m e t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf l a v o n o i d si nl o t u sl e a fc o u l d e l i m i n a t e o he f f e c t i v e l y ，i n h i b i tl i p i dp e r o x i d a t i o ni n d u c e db y o h ，p r o t e c tt h e b i o m e m b r a n e ，r e d u c er b ch e m o l y s i sa n dl i g h t e nt h ed e g r e eo fl i v e rm i t o c h o n d r i a s w e l l i n g t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t f l a v o n o i d si nl o t u sl e a fp o s s e s s e dr e m a r k a b l e a n t i o x i d a t i o na c t i v i t i e s ( 2 ) e f f e c t so ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a fo na c t i v i t i e so fa m y l a s ea n dl i p a s ei nv i t r o e f f e c t so ft h ef l a v o n o i d sc o n c e n t r a t i o n ，a c t i o nt i m ea n dd o s a g eo fe 1 1 z y m eo n a c t i v i t i e so fa m y l a s ea n dl i p a s ew e r ed e t e r m i n e db yc h o m a t o m e t r y t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ：( a ) f l a v o n o i d si nl o t u sl e a fb l o c k e dt h ee n z y m e - 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- 胺四乙酸 f l l f l a v o n o i d si nl o t u sl e a f荷叶黄酮 g a l g a l a c t o s e半乳糖 g c g a sc h r o m a t o g r a p h y气相色谱 g i c g l u c o s e葡萄糖 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 h p l c e s i - h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - 高效液相色谱一电喷雾电 m s e l e c t r o s p m yi o n i z a t i o n - m a s ss p e c t r o m e t r y 离质谱联用 h s c c c h i g hs p e e d c o u n t e rc u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y高速逆流层析 i ri n f r a r e d红外线( 的) m d a n m r n o p b s r b c r h a r o s r s d s a s s o d t l c m a l o n d i a l d e h y d e n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r u m n i t r i eo x i d e p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e r e db l o o dc e l l s r h a m i l o s e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r a l i t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s t a t i s t i c a la n a l y s i ss y s t e m s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 丙二醛 核磁共振波谱 一氧化氮 磷酸缓冲液 红细胞 鼠李糖 活性氧 相对标准偏差 统计分析系统 超氧化物歧化酶 薄层色谱层析 u vu l t r a v i o l e t 紫外线( 的) v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年月曰 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究t - 作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 獭雌各与韬 帅：一年绷几日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：逸诱 导师签名：弓铤多许 签名日期：2 。，以年朔 肚日签名日期：乙r 少缉幽乡月么日 华十表学2 8 瞒酬十毕业硷立 第一章前言 荷叶( 1 0 t u s l e a d 足睡莲科植物莲( n e l u m b o n u c i f e r a g a e r m ) 的叶片r 包括叶 片、r 柄或称荷梗和荷蒂或称荷鼻( 即叶片与叶柄相接的部分) ( 刘嵩，2 0 0 6 ) 。中 国荷叶资源丰富。全国除青海、西藏外，各地均有分布，主要分布在长江，黄河和 珠江等三大流域( 韩学俭，2 0 0 5 ) 。 荷叶自古以来就是一种药食两州的植物，在民间有着非常广泛的应用( 姜兴俊， 1 9 9 7 ) 。历代医学专著以及现代临床埘其食疗作用均有记载或验证。本草再新 谓 其。清凉解暑，止渴生肆，治泻痢，解火热”。本草纲口 谓其“生发元气t 裨助 脾胃，涩精浊，敞癖血消肿痛，发痘癌”。传统医学认为，荷n r 苦平t 肝、脾、 胃，具有清解暑热、升发清阳、凉血止血的作川。孔伯华医集 中记载9 8 9 医案， 使用倚叶者就达2 6 0 案，使用率达2 6 3 。蒲辅周医案 中记载1 2 0 医案，使用 荷叶者1 7 案，使川率遮1 4 2 0 ( 张蕾，2 0 0 7 ) a 现代分析研究发现荷叶除了含有普通植物所共有的碳水化台物、脂质、蛋自质、 单宁等常规化学成分外，还富含多种活性成分，如荷叶碱，原荷a l 碱，亚类罂粟碱， n _ 去甲基荷叶碱及丰富的莲甙，槲皮素及异槲皮素等黄酮类化合物( 李志诚等t 衙叶黄酮提取、纯化、结构搭定及生物活性研究 1 9 9 6 ) 。现代药理研究证明荷叶黄酮具有降脂减肥、抗自由基、抗氧化、抑菌、抗 病毒等作用( 刘淑萍等，2 0 0 4 ) 。在1 9 9 1 年1 1 月中华人民共和国卫生部的卫监发 第( 1 9 9 1 ) 号文件中，荷叶被列入第批“既是食品又是药品”的名单之中。 因此提取纯化资源丰富、价廉易得、具有显著功效的荷叶黄酮成为近来对荷叶 研究、利用的热点。 1 荷叶黄酮的研究概况 1 1 荷叶黄酮的化学研究 黄酮类化合物是色原烷或色原酮的衍生物。目前泛指由两个芳香环a 和b 通 过中央三碳链相互作用连接而成的一系列化合物，其基本骨架具有c 6 c 3 c 6 的特 点( 如图1 1 ) ，它们常以游离态或与糖结合成甙的形式存在。荷叶中的黄酮类化合 物即属于甙类( 陈海光等，2 0 0 1 ) 。荷叶中黄酮类化合物主要是荷叶苷，其次是槲 皮素、异槲皮素等( n a g a r a j a nse ta l ，1 9 6 6 ) ，且槲皮素多以结合苷的形式存在( 邬 晓鸥和熊英，2 0 0 4 ) 。研究还显示荷叶中的黄酮类含有酚羟基( 聂波等，2 0 0 3 ) 。 3 7 6 8 l 4 5 0 图1 1 黄酮类化合物的基本母核 f i g 1 1b a s i cs t r u c t u r eo ff l a v o n e e l e g a m i 等( 2 0 0 3 ) 用高效液相色谱从荷叶中分离出n y m p h o l i d e a 、n y m p h o l i d e b 和m y r i c e t i n - 3 一o - ( 6 ”一p c o u m a r o y l ) g l u c o s i d e 三种黄酮类物质。y o s h i k ik a s h i w a d a ( 2 0 0 5 ) 等从荷叶中分离鉴定了5 个黄酮化合物：槲皮素b d - 口t t 喃葡萄糖苷，槲 皮素3 o 移d 吡喃木糖基( 1 - - - 2 ) p d 吡喃半乳糖苷，芦丁，异槲皮素，金丝桃苷。 f f l 娜( 2 0 0 5 ) 从荷叶的乙醇水提取物中首次分离获得紫云英苷( a s t r a g a l i n ) 。 张赞彬、戴妙妙等( 2 0 0 6 ) 结合薄层层析( t l c ) 和颜色反应，采用高速逆流色谱 ( h s c c c ) 分离得到的两种化合物均为黄酮醇类化合物，分别为槲皮素3 丙酯和 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 山奈酚。王玲玲等( 2 0 0 8 ) 分离鉴定了8 个黄酮类化合物，其中异鼠李素、槲皮素 一b d 吡喃木糖( 1 2 ) 一b - d 吡哺葡萄糖苷、柯伊利素- 7 - o - 1 3 - d 葡萄糖苷为首次从 荷叶中分离得到。 1 2 荷叶黄酮的提取分离 游离的黄酮类化合物一般难溶于水，而黄酮甙一般易溶于热水，两者都能溶于 甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。荷叶中黄酮类物质主要以甙类的形式存在，其 中主要是糖甙形式，游离甙元含量较低。故荷叶黄酮既可用热水提取，亦可用醇提 取。 1 2 1 热水提取法 荷叶黄酮的提取方法最早是热水提取法，提取将原料投入沸水中以破坏酶的活 性，该法适宜提取极性较大的苷元。陈海光等( 2 0 0 3 ) 以水为溶剂提取荷叶中的黄酮 类化合物在实验所得的较佳提取条件下，荷叶黄酮的提取得率达1 5 7 。 1 2 2 乙醇水溶液提取法 乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇( 如9 0 9 5 ) 适于提取 苷元，6 0 左右的醇适用于提取苷类。提取次数一般是2 4 次，可用渗漉法、回流法、 冷浸法( 李苑和张敏，1 9 9 9 ) 。李彩侠等( 2 0 0 6 ) 获得了乙醇提取荷叶黄酮的优化工 艺条件，测得的在最优化验证试验中，提取率为2 7 ，提高了黄酮的浸提率。 1 2 3 物理辅助提取法 朱燕超和陶文沂( 2 0 0 7 ) 考察了超声提取的乙醇浓度、超声时间、超声功率、液 固比对荷叶黄酮提取率的影响，黄酮得率可达1 4 4 9m g g ，电镜显示，超声对荷叶组 织产生了明显的破碎作用。张蕾等( 2 0 0 7 ) 以经过超微粉碎后的荷叶为原料，研究了 超微粉碎技术和超声波提取对荷叶中黄酮类物质提取率的影响。荷叶超微粉碎粒度 d 5 0 为7 2 5 p m ，超声波功率为2 0 0 w ，提取液乙醇的浓度为7 0 ，料液比为1 ：2 0 ，提 取时间为9 mi n ，在该条件下荷叶黄酮的提取率最高，为5 3 5 。经过对照实验，超微 粉碎和超声波处理更有利于荷叶中黄酮类成分的溶出。赵骏等( 2 0 0 5 ) 将超声法、乙 醇回流法与微波法进行了对比，料液比为1 ：25 ，超声处理4 0 mi n 的黄酮苷收率为 9 2 ，用6 0 乙醇回流2h ，料液比为1 ：3 0 时黄酮苷收率为9 7 4 。微波法最佳工艺所 荷叶黄酮提取、纯化、结构鉴定及生物活性研究 得黄酮苷的收率为1 0 6 8 。说明微波在一定程度上可以提高荷叶黄酮的提取率。 1 2 4 大孔树脂吸附分离法 荷叶黄酮的分离纯化方法应用最为广泛的是大孔树脂法。大孔树脂是近l o 年来发 展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，具有物化稳定性高、吸附选择性好、不受无 机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省 费用等优点，广泛应用于物质的分离纯化。蔡为荣( 2 0 0 2 ) 经过筛选，采用d a l 0 1 树脂可使荷叶黄酮得到较好的分离纯化，经减压浓缩真空干燥得总收率3 7 3 ，黄酮 含量8 0 2 的荷叶黄酮干粉。 1 2 5 高速逆流色谱分离法 高速逆流层析( h i g hs p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称h s c c c ) 是近 些年出现的一种高效快速的无载体液一液分配层析法，它利用聚四氟乙烯( p t f e ) 螺 旋管行星式运动而产生一种特殊的流体动力学现象，使不相溶的两相溶剂在螺旋管内 高速运动，充分混合和逆流传递，使样品中各组分由于分配系数的差异而得到有效 的分离( 陈四平等，2 0 0 2 ) 。李彩侠等( 2 0 0 6 ) 结合薄层层析( t l c ) 和颜色反应， 对各分离组分跟随鉴定，比较三种方法对荷叶黄酮的纯化作用，其中高速逆流色谱 ( h s c c c ) 分离效果最好。s e p h a d e xl h 2 0 柱层析分离效果次之，硅胶柱层析分离效 果最差；荷叶提取物经高速逆流色谱分离纯化，可以得到两种黄酮醇类单体。 1 2 6 其他提取分离技术 其他提取分离技术还有超临界流体萃取法( s u p e r e r i t i e a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 、 分子蒸馏( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ，m d ) 技术、双水相萃取技术( a q u e o u st w op h a s e e x t r a c t i o n ，a t p e ) 、超滤法( u l t r a f i l t r a t i o n ，u f ) 等新的提取分离技术( 郭雪峰和岳 永德，2 0 0 7 ) ，但这些技术应用于荷叶黄酮类成分提取分离的研究报道较少，还有待 于相关学者进一步的深入研究探讨。 1 3 荷叶黄酮的测定方法 目前用于荷叶总黄酮含量的检测的方法主要有两种：比色法和高效液相色谱法。 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 1 3 1 比色法 比色法测定总黄酮的原理：黄酮类化合物与铝离子在碱性与亚硝酸根存在条件下 形成黄酮的铝络合物，生产稳定的黄色。在一定范围内黄色的深浅与黄酮含量呈一定 的比例关系，以芦丁( 对照品) 作标准，于最大吸收波长处比色定量测定( 杨洋等， 2 0 0 4 ) 。陈郑镔等( 2 0 0 4 ) 采用聚酰胺吸附硝酸铝显色法，以芦丁为标样，在5 1 0n n l 处测总黄酮含量分别测得小蓬草根、茎、叶中的黄酮类含量分别为0 7 7 3 、0 3 8 0 、 1 1 8 5 。 1 3 2 高效液相色谱法 由于黄酮类化合物的特点：不易挥发，对热不稳定、有紫外吸收和荧光、分子离 子峰稳定，游离苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有 机溶剂及稀碱液中，黄酮苷极性大，难气化，不稳定，一般易溶于水、甲醇、乙醇等 强极性溶剂，难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂( 陈丛瑾等，2 0 0 7 ) 。因此高效液相 色谱就成了重要的方法而被广泛用于黄酮类化合物的分离和含量测定。 周兰香等( 2 0 0 2 ) 以甲醇0 4 磷酸( 1 ：1 ) 的流动相、检测波长3 6 0 n m 、流速 1 0 m l m i n 、进样量2 0ul 、室温为高效液相色谱的色谱条件，吸取一定量酸水解的浓 缩浸提液与槲皮素对照品溶液各2 0ul 进样，测定荷叶黄酮的含量为1 2 ，平均回收 率为9 8 1 ，r s d = i 1 2 ( n 寻5 ) 。 1 3 3 其他方法应用展望 毛细管电泳法毛细管电泳法具有速度快，选择性高，分离效率高，经济及样品前处理 简单，产、进样体积小，溶剂消耗少和抗污染能力强等优点。毛细管电泳因其电泳迁 移技术的差异可分为区带电泳、等速电泳、等电点电泳、凝胶电泳和电动色谱柱电泳 5 种类型。最普通的分离方式是在溶液中使用单一的缓冲溶液，称之为毛细管区域电 泳( c z e ) 。在黄酮类化合物的分离中，主要采用的方法是c z e 。吴同( 2 0 0 3 ) 在大 豆异黄酮提取液分离分析工作中建立了毛细管电泳技术的定量方法。v a n t t i n e n 等 ( 19 9 9 ) 采用毛细管电泳法对处理过的豆粉和豆腐中大豆黄素及金雀异黄素进行了测 定。 刘志敏等利用超临界流体色谱法( s f e ) 测定银杏叶中的总黄酮类，以苯基为固 定相，二氧化碳乙醇磷酸( 9 0 ：9 9 8 ：0 0 2 ) 为流动相，3 个黄酮甙元获得良好的分离， 然后计算了总黄酮的含量，这种方法定量结果准确，重现性好。王学军等( 2 0 0 5 ) 建立了超临界流体色谱法同时测定银杏叶提取物中槲皮素和芦丁的含量。采用c 1 8 色 5 荷叶黄酮提取、纯化、结构鉴定及生物活性研究 谱柱，流动相为超临界c 0 2 0 0 5 - - - 氟乙酸的乙醇溶液( 1 0 ：1 ) ，检测波长3 6 0 r i m 。槲 皮素和芦丁的平均回收率分别为9 9 2 和1 0 1 3 ，r s d 分别为2 3 和2 8 。 1 4 荷叶黄酮的生理功能 1 4 1 降血脂、减肥作用 如今随着生活水平的提高，人们日摄入脂肪、糖的量较2 0 世纪7 0 、8 0 年代明显 增加，冠心病、高血脂、肥胖症患者不断增加，因而对医药的研究也提出了新的要求， 对降血脂、减肥方面药物研究和开发较以前明显增多。 杜力军( 2 0 0 0 ) 等人以急性高脂血症小鼠为整体模型，观察荷叶水提取物对血清 胆固醇及甘油三脂的影响。研究结果显示t 荷叶黄酮、生物碱部分对急性高脂血症小 鼠的t g 有明显的抑制作用。荷叶黄酮对小鼠高胆固醇表现出明显的抑制作用。荷叶 水提取部分、生物碱部分及黄酮部分对t g 均没有表现出明显的量效关系，且出现大 剂量无效而小剂量有效的现象。体外培养肝细胞合成t c 实验显示t 荷叶黄酮在使肝 细胞内t c 降低的同时又使培养液t c 明显升高。其作用主要表现在促进脂类代谢方 面，对其合成的抑制作用较弱。主要活性部位集中在黄酮上，其次是生物碱。 陶波等( 2 0 0 0 ) 用荷叶水煎剂灌胃高脂血症大鼠，观察其血脂及血液流变学的影 响。结果显示荷叶水煎剂能使高脂血症大鼠的t c 下降2 5 6 哆扣3 9 3 ，t g 下降 1 8 9 0 0 , , , 3 9 2 ，对h d l - c 未见明显影响，但随t c 、t g 的降低，低密度脂蛋白胆固醇 ( l dl c ) 显著下降，同时荷叶水煎剂能降低全血比黏度、红细胞压积( ) ，从而 改善血液浓粘状态。 1 4 2 抑菌作用 荷叶具有抑菌的功能，目前主要进行抑制食品及口腔细菌的研究。 唐裕芳等( 2 0 0 4 ) 用8 0 乙醇荷叶提取液对常见的几种食品微生物进行抑菌活性 研究。结果表明，对各种供试菌种均有抑菌活性。其中对细菌及酵母菌，特别是大肠 杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最为显著，但对米根霉抑制作用较弱。荷叶的乙醇 提取物对大多数供试菌的m i c ( 最低抑菌浓度) 小于或等于8 。实验结果同时表明 荷叶提取物在中、弱碱性条件下抑菌活性最强，并能耐受超高温瞬时的热处理。荷叶 的超临界c 0 2 萃取物( 精油) 对细菌、酵母、霉菌均有定的抑菌活性，m i c 不超过 1 5 6g l 。 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 陈健芬等( 2 0 0 3 ) 对荷叶提取物有效成分进行口腔致病菌的药理筛选实验，得到 了对引起牙龈炎等病状的致病菌有较强抑制作用的荷叶提取物有效成分金丝桃 苷，首次将其应用于牙膏产品中，并申请了国家发明专利，目前荷叶提取物已应用于 牙膏产品中，并建立了其有效成分( 黄酮类化合物) 在牙膏中的定性定量检测方法。 除此之外，荷叶中的黄酮等活性成分还具有抗有丝分裂、抑菌和止痉挛等作用( 纪丽 莲，1 9 9 9 ) 。 1 4 3 抗氧化的作用 脂质过氧化反应及其产物对生物机体组织损伤是组织器官损伤的直接原因，这种 损伤在众多疾病的发生和发展中起着重要的作用。 陈海光等( 2 0 0 1 ) 用现代的电子自旋共振法自旋捕集技术研究荷叶提物( l l e ) 对羟基自由基( o h ) 和超氧阴离子自由基( 0 - ) 清除效果。结果显示2 6 9 4 ug 札 的l l e 对次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶体系产生瓯的清除率达6 5 6 ，l l e 浓度大于 8 9 8i tg m l 时可以全部清除由f e n t o n 反应体系产生的o h 。大约4 0i tg m l 的l l e 就可清除瓯。可见荷叶的水提物是一种较好的抗氧化剂，在较低的浓度下即可显 示出非常强的抗氧化能力。 肖华山和赵保路( 1 9 9 6 ) 则应用化学发光法对荷叶提取物对体外氧自由基发生系 统，黄嘌呤黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子及f e n t o n 体系产生的轻自由基和用 过硫酸铵- n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺体系产生的氧自由基的清除作用，同时研究了 荷叶提取物对果蝇寿命的影响。结果发现荷叶提取液对上述系统产生的氧自由基具有 很强的清除能力，并能显著延长雌雄果蝇的寿命。 邓胜国等( 2 0 0 6 ) 根据体外测定荷叶抗氧化实验结果表明，荷叶黄酮具有良好的 清除d p p h 自由基的能力，能有效抑制亚油酸的氧化。有研究结果显示：荷叶黄酮对 高脂血症大鼠有明显抗氧化作用，可以升高血清超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽 过氧化物酶( g s h - p x ) 活力，降低丙二醛( m d a ) ( 胡榴燕，2 0 0 6 ) 。 1 4 4 其它作用 降血糖作用：有实验证明了荷叶提取物可以有效降低小鼠的血糖水平，提高小鼠 糖耐量，荷叶提取物可加强胰岛素的作用并抑制血糖的吸收，这可能与荷叶中含较丰 富的黄酮类化合物有关( p u l o kk e ta l ，1 9 9 7 ) 。 7 荷叶黄酮提取、纯化、结构鉴定及生物活性研究 抗病毒作用( b o u s t i eje ta l ，1 9 9 8 ) 其抗病毒的机理主要是抑制溶酶体h + - a t p 酶、 磷酸酯酶a 2 的脱壳作用，影响病毒转移基因的磷酸化，抑制病毒和r n a 的合成。柏 田良树( 1 9 9 7 ) 分离得到的两种类黄酮糖甙显示具有抗h i v 活性。 抑制n o 的细胞毒作用：氧化氮合酶使内皮细胞与巨噬细胞释放一氧化氮( n o ) ， 以维持血管扩张。但在缺血再灌注损伤时，产生过多n o 与超氧阴离子，n o 与自由 基反应，生成过氧亚硝基，它能直接氧化l d l ，对细胞膜造成不可逆的损伤。研究表 明荷叶黄酮类化合物可以抑制n o 在体内蓄积，抑$ o n o 的细胞毒作用，达到延缓衰老 之目的，并可以抑制与n o 产生有关的慢性疾病( s c u r o l sa n ds i m i o n i p u ，2 0 0 4 ) 。v i c e n t e b a y a r d 等( 2 0 0 7 ) 调查研究发现常食用含有黄酮类的食物可以降低心血管疾病、糖尿 病、癌症和传染病导致的死亡率。还有研究表明黄酮类化合物可以促进与细胞外信号 调节激酶有关的长时性记忆能力，用于治疗有记忆障碍的患者( m a t h e rpe ta l ，2 0 0 6 ) 。 1 5 荷叶提取物的安全性 喻泽兰等( 2 0 0 3 ) 用荷叶水提物最大饱和浓度最大耐受量，给实验组小鼠灌胃以 造成急性毒性模型，对照组灌等量蒸馏水。结果显示在中药毒性分析指标一小毒的7 项指标中，荷叶符合其中5 项指标，荷叶水提物l d 5 0 5 0 0 0 m g k g 。由此可见荷叶水提 物基本无毒。 1 6 荷叶黄酮的开发前景 近年来，植物药以其天然低毒的特点备受青睐，而黄酮类化合物因其具有降脂减 肥、抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗心脑血管疾病、抗辐射等作用( h um i l le ta l ，2 0 0 6 ； a u g u s t i ne ，1 9 9 4 ：w ux e ta l ，1 9 9 5 ) 在世界上掀起了植物药开发的热潮。实验结果 表明荷叶中含有较为丰富的黄酮( 刘嵩，2 0 0 6 ) ，我国荷叶资源丰富，具有发展荷叶 产业的有利条件，其分布广泛，每年约有l 万吨之多，是非常有价偷开发的天然药用 植物资源，以长江三角洲、珠江三角洲、洞庭湖、太湖为主产区，价廉易得，但荷叶 加工业非常落后，仅百吨左右应用于食品、医药生产，剩余大部分荷叶都是作为肥料 烂在荷田里，没有得到有效的利用