（食品科学专业论文）胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的研究.pdf

胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的研究 食品科学专业 研究生王立晖指导教师袁永俊 摘要 牛乳中含有大量的蛋白质，其含量约为牛乳的3 3 3 5 ，主要有酪蛋白、 乳白蛋白、乳球蛋白和一些具有重要生理功能的酶类，其中酪蛋白占7 8 8 。 酪蛋白中含有人体必需的8 种氨基酸，是一种全价蛋白质( p e r 值为2 5 ) ， 能够为生物体生长发育提供必需的氨基酸。除了营养功能外，其在动物消化道 中经蛋白酶分解产生的肽段的潜在生物学活性己受到广泛重视。人们把酪蛋白 用蛋白酶水解后，分离得到的许多生物活性物质称为生物活性肽。按照其功能 分为：阿片肽、降血压肽、抗血栓肽、免疫促进肽、促进矿物离子吸收肽、抗 菌肽等许多种类。 在各种生物活性肽中，研究最多的是阿片肽，其分为内源性阿片肽和外源性 阿片肽两大类型。内源性阿片肽是存在于人体脑、神经末梢的吗啡样物质，它 们能在体内合成，并作为激素和神经递质与体内的肌6 、k 受体相互作用， 简称内啡肽；外源性阿片肽是存在于外源性食物中，其阿片活性同吗啡一样能被 纳洛酮所逆转，简称外啡肽。酪啡肽就是从酪蛋白受蛋白酶作用后产生出来的最 具有代表性的外啡肽。酪啡肽通常都是从b 酪蛋白得到所以也称b 一酪啡肽。 自从1 9 7 9 年b r a n t l 等人首先从酪蛋白的水解产物中分离到酪啡肽一7 ， 对于酪啡肽的制备、分离、纯化等各个方面均有广泛的研究并且取得不少成果。 但是国内对于酪啡肽的研究基本停留在结构和功能的层次上，只有南京农业大 学张源淑等人对于酪啡肽的制备工艺进行了初步的探讨，本试验的主要内容就 是在以往文献报道基础上重点详细的研究胃蛋白酶酶解酪蛋白制备酪啡肽的 工艺过程。 本次试验主要由三个部分组成。第一部分，酪啡肽生成最佳水解条件的 确立。首先通过单因素试验研究了底物浓度，酶浓度，温度和p h 对水解的影 响，并依据水解度的差异，选取了单因素最佳条件。而后选取四因素三水平正 交试验设计对最佳酶解进行进一步探讨，并根据试验结果结合实际因素得出最 佳试验条件。得到最佳条件后，继续研究水解时间与水解度的关系，以水解时 间0 5 h 一3 5 h 为限制备样品一组7 个。 第二部分，柱层析条件的确立与样品的分离。本部分首先根据试验目标 产物的特点，结合凝胶介质的性质选择交联葡聚糖凝胶作为分离介质。选择均 一胃蛋白酶酶解样品对于紫外检测波长，洗脱缓冲液，柱层高度，洗脱流速等 因素进行比较，对分离图谱进行分析并确立各因素最佳选择。在此优化条件下 将标准品上柱，用缓冲液以稳定的速度进行洗脱，根据适当的洗脱体积测出其吸 光度，绘制标准曲线。随后对前一部试验制备的水解样品进行分离，根据标准 曲线判断洗脱峰的分子量，并以此为依据进行目标洗脱峰的收集。 第三部分，酪啡肽的检测。试验首先进行了色谱条件探索，包括分离柱， 流动相的选择以及柱温柱压，流速，检测波长和灵敏度的选择，在建立标准分 析方法基础上使用色谱外标法对前面所制备的样品进行检测，对照标准品保留 时间和峰面积，分析检测结果，并定量计算b 一酪啡肽一7 的产量。 关键词：b 一酪啡肽一7 ；胃蛋白酶；水解：交联葡聚糖凝胶； 反相高效液相色谱 a b s t r a c t m i l ki n c l u d e st h em a s s i v ep r o t e i n ，i t sc o n t e n ta p p r o x i m a t e l yf o r3 3 3 5 o f a l lm i l k m a i n l yh a v et h ec a s e i n ，l a c t a l b u m i n ，l a c t o g l o b u l i na n ds o m ee n z y m ec l a s s h a st h ei m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n c a s e i na c c o u n tf o r8 8 c a s e i ni n c l u d e st h ee i g h tc l a s sa m i n o a c i dh u m a nb o d ye s s e n t i a ld i s ht op l a n t ， i so n ek i n do ff u l lr a t ep r o t e i n ( t h ep e rv a l u ei s2 5 ) , c a np r o v i d et h ee s s e n t i a l a m i n oa c i df o rt h eo r g a n i s mg r o w t h b e s i d e st h en u t r i t i o nf u n c t i o n ，i t sp e p t i d e s e c t i o nl a t e n t e d b i o l o g ya c t i v e n e s sw h i c hp r o d u c e sa f t e rt h ep r o t e i n a s e d e c o m p o s i t i o nh a sr e c e i v e di nt h ea n i m a ld i g e s t i v et r a c tw i d e l yt a k e s w eh a v et h i s k i n dt h eb i o l o g i c a lf u n c t i b na n dt h ep h y s i o l o g l 。c a la c t i o np e p t i d ea r ec a l l e dt h e b i o l o g i c a la c t i q i t i v ep e p t i d e s d i v i d e si n t oa c c o r d i n gt oi t sf u n c t i o n ：o p i o i d p e p t i d e ，f a l l st h eb l o o dp r e s s u r ep e p t i d e ，t h ea n t i t h r o m b u sp e p f i d e ，t h ei m m u n i t y p r o m o t i o np e p t i d e ，t h ep r o m o t i o nm i n e r a l i o na b s o r p t i o np e p t i d e ，t h ea n t i b a c t e r i a l p e p t i d ea n ds oo nm a n yt y p e s i ne a c hb i o l o g i c a la c t i v i t yp e p t i d e s ，o p i o i dp e p t i d ei ss t u d i e sm o s t l y ，d i v i d e s i n t ot h ee n d o g e n eo p i o i dp e p t i d ea n dt h ee x t r a n e o u ss o u r c eo p i o i dp e p t i d et w ob i g t y p e s t h ee n d o g e n eo p i o i dp e p t i d ei se x i s t st ot h eh u m a nb o d yb r a i n ，t h en e r v e e n d i n gm o r p h i n et y p em a t t e r ，t h e yc a ni nv i v os y n t h e s i sa n dh a n do v e rt h en a t u r e a n dt h en e r v e ，d ，ka c c e p t o rm u t u a l l ya f f e c t ，i na b b r e v i a t i o nt h ee n d o g e n eo p i o i d p e p t i d e ；t h ee x t r a n e o u ss o u r c eo p i o i dp e p t i d ei se x i s t si ne x t r a n e o u ss o u r c ef o o d ， i t so p i o i da c t i v e n e s se q u a l l yc a nr e v e r s ew i t ht h em o r p h i n e b yt h en a t r i u ml u o a l k o n e ，i na b b r e v i a t i o ne x t r a n e o u ss o u r c eo p i o i dp e p t i d e b - c a s o m o r p h i n - 7i s p r o d u c e da f t e rt h ec a s e i nb yp r o t e i n a s ei st h er e p r e s e n t a t i v ee x t r a n e o u ss o u r c e o p i o i dp e p t i d e c a s o m o r p h i nu s u a l l y i sf r o mb - c a s e i na l s oc a l l sb - c m 一7 s i n c eb r a n t lf i r s ts e p a r a t e sf r o mt h ec a s e i nh y d r o l y s a t et o6 - c a s o m o r p h i n 一7 i n1 9 7 9 ，r e g a r d i n gb - c a s o m o r p h i n - 7 sp r e p a r a t i o n ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d s oo ne a c ha s p e c th a sw i d e s p r e a do nr e s e a c ha n dy i e l d sm a n yr e s u l t s b u td o m e s t i c b a s i c a l l yp a u s e sr e g a r d i n gb - c a s o m o r p h i n 一7r e s e a r c ho nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o n l e v e l ，o n l yz h a n gy u a n s h uo fn a n j i n ga g r i c u l t u r a lc o l l e g eh a sc a r r i e do nt h e p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o nr e g a r d i n gg - c a s o m o r p h i n - 7p r e p a r a t i o nc r a f t t h i s e x p e r i m e n tm a i nc o n t e n tw a si nt h ef o r m e rl i t e r a t u r er e p o r tf o u n d a t i o nt h ek e y d e t a i l e dr e s e a r c ho np r e p a r a t i o nm e t h o do f6 - c a s o m o r p h i n - 7m a d eo fc a s e i n w i t hp e p s i n t h i se x p e r i m e n tm a i n l yi sc o m p o s e db yt h r e ep a r t s t h ef i r s tp a r t ，t h eb e s t h y d r o l _ i s i sc o n d i t i o ne s t a b l i s h m e n to fb - c a s o m o r p h i n 7p r o d u c t i o n f i r s t l y t h r o u g hs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t a ls t u d ys u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，e n z y m ed e n s i t y ， t e m p e r a t u r ea n dp ht oh y d r o l i s i si n f l u e n c e ，a n db a s e do n t h ed i f f e r e n c ed h s e l e c t e dt h es i n g l ef a c t o ro p t i m u mc o n d i t i o n a f t e r w a r d rs e l e c t sf o u rf a c t o r st h r e e h o r i z o n t a lo r t h o g o n a l se x p e r i m e n t sd e s i g nt o c a r r yo nt o t h eb e s te n z y m o l y s i s f u r t h e rd i s c u s s e s ，a n do b t a i n st h eb e s tt e s tc o n d i t i o na c c o r d i n gt ot h et e s tr e s u l t u n i o na c t u a lf a c t o r a f t e ro b t a i n st h eo p t i m u mc o n d i t i o n , c o n t i n u e ss t u d i e st h e h y d r o l i s i st i m ew i t hr e l a t i o n so fd h i sl i m i t e dt oh y d r o l i s i st i m e0 5 h 一3 5 h s e p a r a t e l yp r e p a r e ss a m p l eg r o u po fs e v e n t h es e c o n dp a r t ，t h ee s t a b l i s h m e n tc o n d i t i o no fs e p h a d e xa n ds e p a r a t i o no f s a m p l e t h i sp a r t f i r s ta c t sa c c o r d i n gt ot h en e e do fe x p e r i m e n t stt oc h o o s e s e p h a d e xg e l ，a n dc h o i c ep e p s i ne n z y m o l y s i ss a m p l er e g a r d i n gt h el u m i n o s i t y ， b u f f e r ，t h ec o l u m nl e v e la l t i t u d e ，e l u t c sf a c t o ra n ds oo ns p e e do ff l o wc a r r i e so n t h ec o m p a r i s o na n da n a l y z e sf o re s t a b l i s h e st h eb e s t c o n d i t i o nt os e p a r a t i o n u n d e rt h i so p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n ，p u tt h es t a n d a r ds a m p l ec a r r i e so nw i t ht h es t a b l e s p e e de l u t e s ，a c c o r d i n gt os u i t a b l ee l u t e st h ev o l u m et od e t e r m i n et h es t a n d a r d c u r v ea n dc a r r i e so nt h es e p a r a t i o ne x p e r i m e n t a t i o n ，a c c o r d i n gt ot h es t a n d a r d c u r v e j u d g e m e n tt h em o l e c u l a rw e i g h t ，a n dc a l t i e so nt h eg o a lt a k et h eo r d e ra st h e b a s i st oe l u t et h e p e a kt h ec o l l e c t i o n t h et i l 硼p a r t e x a m i n a t i o no fb - c a s o m o r p h i n 一7 t h ee x p e r i m e n th a sf i r s t c a r r i e do nt h ec h r o m a t o g r a p hc o n d i t i o ne x p l o r a t i o n ，i n c l u d i n gt h ec h o i c eo f s e p a r a t i o nc o l u m n ，f l o w sa sw e l la st h ec o l u m nt e m p e r a t u r ec o l u m np r e s s u r e ，t h e s p e e do ff l o w ，t h ee x a m i n a t i o nw a v el e n g t ha n dt h es e n s i t i v i t yc h o i c e ，u s e st h e c h r o m a t o g r a p he x t e r n a ls t a n d a r dl a wi nt h ee s t a b l i s h m e n ts t a n d a r da n a l y s i sm e t h o d f o u n d a t i o nt o p r e p a r et h ed i s h - s a m p l ef o rf r o n tt oc a r r yo nt h ee x a m i n a t i o n c o m p a r i s o n i n g s t a n d a r dr e t e n t i o nt i m ea n dt h ep e a ka r e a ，a n a l y s i se x a m i n a t i o n r e s u l t ，a n dq u a n t i t a t i v ee v a l u a t i o nb - c a s o m o r p h i n - 7 k e yw o r d s ：b - c a s o m o r p h i n 7 ：p e p s i n ；h y d r o l i s i s ；s e p h a d e x ；r p - h p l c 西华大学硕士学位论文第1 页 1 综述 1 1 胃蛋白酶 1 1 1 天冬氨酸蛋白酶简介【1 3 】 天冬氨酸蛋白酶( a s p a r t i cp r o t e a s e s ) 包括胃蛋白酶等作为一个蛋白水 解酶的家族产生于哺乳动物、霉菌和高等植物。这些酶在酸性p h ( 或有时中性) 呈现活性，并且在活性部位具有2 个a s p 。天冬氨酸酶执行各种功能，包括消 化( 胃蛋白酶和凝乳酶) ，溶酶体蛋白的降解( 组织蛋白酶d 和e ) 和调节血 压。天冬氨酸蛋白酶具有多种底物专一性，但它们通常是断裂2 个疏水氨基酸 之间的肽键。 表1 1 天冬氨酸蛋白酶的某些代表 t a b l e1 - le x z a m p l eo fa s p a r t i cp r o t e a s e s 1 1 2 胃蛋白酶的组成和结构 胃蛋白酶是动物体内主要的消化酶之一，是温和的内切蛋白酶，在水解蛋 白时产物大部分是肽，而不是游离的氨基酸。胃蛋白酶是由无活性的胃蛋白酶 原组成的，包括s i g n a lp e p t i d e ，a c t i v a t i o np e p t i d ea n da c t i v ee n z y m e 。 有学者通过研究发现在纯的胃蛋白酶中，a 一螺旋、b 一折叠、b 一转角及无规 则卷曲等四钟结构的含量分别为2 4 3 8 ，2 9 9 1 ，3 9 2 2 ，6 4 9 。当胃蛋白 酶暴露到( p h 4 ) 的环境中，活性肽展开，允许活性位将其剪断，形成有活 性的能发生接触反应的胃蛋白酶。从结构上看，活性位在分子很深的缝隙中。 胃蛋白酶的专一性主要水解苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，它要 求断裂点两侧的残基都是疏水性氨基酸。r 。或r ：= p h e 、l e u 、t r p 、t y r 以及其 他疏水性残基( 水解速度好) r = p r o ( 不水解) ” 下图为猪的胃蛋白酶的组织模型。 西华大学硕士学位论文第2 页 f i g l 一1w i t e f r a m em o d e lo fp o r c i n ep e p s i n 图1 - 1 猪的胃蛋白酶的组织模型 1 1 3 胃蛋白酶原的激活1 1 川 胃蛋白酶原( p e p s i n o g e n ) 是由胃壁细胞分泌的，相对分子质量为3 8 9 1 0 3 ，由3 9 2 个氨基酸残基组成。在胃酸h + 作用下，低于p h 5 时，酶原自动激 活，从氨基端失去4 4 个氨基酸残基碱性的前体片段后，转变为高度酸性 的，相对分子质量为3 4 6 1 0 3 ，有活性的胃蛋白酶。胃蛋白酶在胃中很酸的 环境中消化蛋白质，最适p h 为2 。胃蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶家族其他成员在 催化部位含2 个天冬氨酸残基，一个是以一c o o h 形式，另一个是一c o o - 形。 式。x 射线晶体结构研究说明，在胃蛋白酶原中已经形成活性部位，在中性p h 下前片段中的6 个l y s 和a r g 的侧链与胃蛋白酶部分中g l u 和a s p 残基的羧基 侧链之间形成盐桥，尤其是前体中的l y s 侧链与活性部位的一对天冬氨酸： a s p 2 1 5 和a s p 3 2 之间的静电相互作用，使得前体片段中的碱性氨基酸将活性 部位堵塞，所以酶原不表现催化活性。当p h 降低时，由于几个羧基质子化， 破坏了前体碎片和胃蛋白酶部分间的肽键，酶原被激活。h + 激活产生的胃蛋白 酶还可以进一步再去激活其他的胃蛋白酶原。 西华大学硕士学位论文第3 页 1 2 酪蛋白 1 2 1 酪蛋白来源 酪蛋白来源于乳。乳是哺乳动物乳腺的分泌产物，是一种十分复杂的生物 液体。乳的营养价值，对人类和动物免疫保护与生长调节中的独特功能，以及 各成分之间的合适比例，是新生哺乳动物最好的营养素。乳脂、乳糖和乳蛋白 构成了乳的基本成份，牛乳中蛋白质含量约为3 3 ，人乳中为1 4 。乳 蛋白的成分相当复杂。在牛乳中，主要的乳蛋白是酪蛋白( c a s e i n ) ，约占总 蛋白的7 8 8 ( 人乳中酪蛋白约占总蛋白的3 2 ) ，酪蛋白有n 、b 、k 、 y 四种，一酪蛋白占酪蛋白总量的2 8 2 ( 占人乳中酪蛋白总量的6 0 ) ， 其次为乳球蛋白( b i a c t o g l o b u i n ，占9 7 ) 。此外还有乳清蛋白( o l a c t a l b u m i n3 6 ) 、白蛋白( 1 - 2 ) 、微量乳铁蛋白( 1 a c t o t r a n s f e r r i n ) 及少量的( 2 1 ) 免疫球蛋白1 3 】。酪蛋白( c a s e i n ) 中含有人体必需的8 种 氨基酸，是一种全价蛋白质( p e r 值为2 5 ) ，能够为生物体生长发育提供必需 的氨基酸。除了营养功能外，其在动物消化道中经蛋白酶分解产生的肽段的潜 在生物学活性已受到广泛重视【5 8 1 。 1 2 2 酪蛋白组成p 9 】 酪蛋白的主要特征是它们具有高含量的磷酸丝氨酰残基和相当多的脯氨 酸。酪蛋白的主要成分是s 1 一酪蛋白、s 2 一酪蛋白、b 酪蛋白和k 一酪 蛋白，其中x 一酪蛋白对于胰蛋白酶的作用不敏感。它们的主要组成见下表【5 9 l 表1 - 2 酪蛋白的主要组成 r a b l e1 - 2c o n s t r u c t i o no fc s s ei n 1 2 3d 一酪蛋白的结构 0 一酪蛋白仅在n 一末端含有一簇磷酸丝氨酰基，c 一末端是非常疏水的。 西华大学硕士学位论文第4 页 在所有牛乳蛋白中，b 一酪蛋白是最疏水的，且容易受温度的影响，它的一级 结构见下图【5 9 】 l h a r g - g l u - l e u - g 2 u 。g l u l e a - a s n - v a l - p r o g l y - g i u l l e = v e l - g l u 一5 t s - p - l e u s e r p 曲吖州 u - 2 l g l u - s e r - i e - t h r m r g - i i e - s n - l y s l y s i l e - g l u l y s p h e 一们p 兜稠_ 6 l ” c l u - 6 h ! n - c 1 i 卜 l t h r - g l u a s m l u l e u g l n - k s p l v s l l e 州j s 冲r o p l e - l a g 1 n - t i i r _ 6 i n s e r - l e t 卜v a | - t y r - 6 l 盼d - i p r “l r p r 扩i l p 【h o 卜 5 n - s e r l 删- p r o 七】n 一 翮一i l e - f r o p r o - l e u - t h r g l w t h r - 8 i p r o - v 8 1 叫a 卜v i 卜p ? o p r o - p h e l e e g i n - p r o - g i 旷v e 卜“t t 弓i y v 出。s e t 。蚺s v b 卜n $ - g i u - i 0 1 a i a i i e t - a 1 a - p r o - h 5 一d l i s - l y s - g l u - m e l 一p r o - p h e h p l y p r y r - p r o v a l - g l n - p r o - p h e - t h r 1 2 l g l u f s e r - g i n s p r - l e r t h r l e u - t b r s p v a 】- g l u 一 s n l e u - h i s _ l e p p r o - p r o - l e u - l e u l e u 1 4 l g i r t - s e t l r p - e e t h i s - g i a - p r o m 8 _ c l i l - p r o l e i 冲r r 口_ 铀r - v a l - u e l - p h e - p r o - p r o 6 i n “ 1 6 t s e r t v a l l e u - s e r - l e u - s e r - g l n - s e r l y s - v a l l e e ”p r o _ v 摹l p r o - g l u 。l y s a l a - v a l p t 口- t h i b l p r o 吨l n r g a s p - m e t p r o l l e 吒i n 一 l p p k l e r l e p t y r - g n - g i n p r o _ v a l l - 6 l y - p r o - 2 0 i 2 0 9 v a l 一 r g 吨1 y p r o - p h r p r o - l l e - l l e - v i d o h f 1 9 l 一2m o d c lo rb - - c a s e i n 图1 - 2b 一酪蛋白的一级结构 1 3 酪蛋白生物活性多肽的研究 i 3 1 活 生多肽 多肽是人体重要的生理调节物，在人体中发挥着意想不到的生理功能。多 肽是体现信息的信使，以引起各种各样，不同实效的正性或负性生理活性和生 化反应的调节，多肽可直接作为神经递质，间接地刺激肠道受体激素或酶的分 泌而发挥生理作用。多肽中的神经肽是神经元间重要的化学信使，它可以发挥 神经激素，神经递质和神经调质的作用，在脑功能中具有重要意义。它在脑内 外广泛分布，反映了神经肽生理功能的多样性和复杂性。在体内或体外由酶水 解食品蛋白而产生的具有生物功能或生理作用的肽被称为生物活性肽。人们对 酪蛋白用蛋白酶水解后，分离到许多生物活性物质，我们把这种具有生物功能 和生理作用的肽成为酪蛋白生物活性肽。按照其功能分为：阿片肽、降血压肽、 抗血栓肽、免疫促进肽、促进矿物离子吸收肽、抗菌肽等许多种类。主要的乳 蛋白源生物活性肽及其生物学功能见下表所示【删： 西华大学硕士学位论文第5 页 表卜3 主要的乳蛋白源生物活性肽及其生物学功能 t a b l e1 - 3m a j o rb i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sd e r i v e df r o mm i l ka n dt h e i rf u n c t i o n s 活性肽生物学功能 抗l 割捷( f 1 2 3 ，f r o m as 1 - - c a s e i n ) a c e 抑制肽( 1 2 3 3 4 。f1 9 4 1 9 9 ，f r o m n ；1 一c a s e i n ，1 7 7 1 8 3 ，f r o m1 3 一c a s e i n ) 免疫调节肽( f 9 2 9 4 ，f r o ma 。1 - - c a s e i n ) 酪磷肽( f 4 3 - 5 8 ，f 5 9 7 9 ，f 6 6 7 4 ，f r o m os l c a s e i n ，f1 - 2 5 ，f r o m1 3s l - c a s e i n ) 细胞生长调节肽 ( f1 6 5 1 9 3 ，f r o mos 1 - - c a s e i n ) 糖基化肽 ( c g p f 1 0 6 1 1 6 f r o mk c a s e i n ) c m p ( f1 0 6 1 6 1 ，f r o mk - c a s e i n ) 凝乳酶抑制肽 ( f 9 9 一1 0 5 ，f r o mk - - c a s e i n ) c a s o x i n ( f 3 3 3 8 ，f r o mk - - c a s e i n ) 1 3 - - c a s o m o p h i n s ( f 6 0 7 0 ，f r o m1 3 c a s e i n ) a - - l a c t o r p h i n ( f5 0 - 5 3 ，f r o md l a c t o g l o b u i nb l a c t o r p h i n 1 3 1 a c t o r p h i nf ( 1 0 2 1 0 5 ，f r o m1 3 - - l a c t o g l o b u l i n ) 1 3 l a c t o t e n s i n ( f1 4 6 - 1 4 9 f r o m1 3 一l a c t o g l o b u l i n ) 抗血小板凝集肽 ( f3 9 4 2 f r o mh u m a nl a c t o t r a n s f e r r i n ) 抗感染 抑制血管收缩，降血压作用 抗感染 免疫刺激作用 促进钙的吸收和利用 细胞生长调节作用 促进胆囊收缩素( c c k ) 的释放，抑制胃 泌系的释放，抑制血小板的凝集 抑制胃酸分泌，兔疫调节作用 抑制凝乳酶活性 阿片活性拮抗肽 抑制胃肠道运动，免疫促进作用 促进胰岛素、生睦激素分泌 阿片样活性 诱导豚鼠回肠收缩 诱导豚鼠回肠收缩 抑制纤维蛋白原的结合、抑制血小板凝集 1 3 2 阿片肽 阿片肽类是最早在酪蛋白酶解产物中被发现的生物活性肽，也是目前研 究最深入的一类，分为内源性阿片肽和外源性阿片肽两大类型。内源性阿片 肽是存在于人体脑、神经末梢的吗啡样作用物质，它们能在体内合成，作为 激素和神经递质与体内的1 1 、6 、k 受体相互作用，其特征是n 末端具脑啡 肽序列( t y rg l y g l y - p h e m e t l e u ) ，具有镇痛、镇静、调节人体情绪、 呼吸、脉搏、体温、消化系统及分泌等作用，如脑啡肽、内啡肽和强啡肽等。 外源性阿片肽是存在于外源性食物中，其阿片活性同吗啡一样能被纳洛 西华大学硕士学位论文第6 页 酮所逆转的物质，它们可刺激胰岛素和消化道生长抑素的分泌、调节动物行 为、促进肠道吸收水分和电解质、调节消化道运动、刺激摄食、抑制呼吸和 调整睡眠模式。 外啡肽具有一些共同的结构特征，它们的氨基末端均具有tyr 残基 ( a 一酪啡肽除外) 而且在第三或第四位上还有其他的芳香族氨基酸如ph e 、tyr 的出现，这种结构特点对于类吗啡活性肽与体内受体位点的结合 非常重要。本文研究的b 一酪啡肽就是外源性阿片肽的一种。具有阿片活力 的内啡肽和乳源外啡肽如下表所示i 印】： 表1 4 具有阿片活力的内啡肽和乳酪啡肽 t a b l e1 - 4e n d o g e n o u so p i o i dp e p f i d e sa n dm i l kp r o l e i n d e d v e dp e p t i d e sw i t ho p i o i d - l i k e 西华大学硕士学位论文第7 页 1 4 酪啡肽的结构特征与生理功能 1 4 1 酪啡肽的发现 酪啡肽的发现同内源性阿片肽的发现几乎是相伴而生的。1 9 7 9 年脑啡肽 的发现轰动了整个科学界，同年b r a n t l 等首先报道豚鼠在饲喂一种酪蛋白酶 解制剂时，其回肠纵行肌毛细血管中存在一种呈阿片肽活性的物质，它是含 有7 个氨基酸残基的寡肽 t y r p r o - p h e p r o g l y p r o 1 1 e ，为b 一酪蛋白第 6 0 6 6 氨基酸残基片段，命名为b 一酪啡肽一7 ( 1 3 一c a s o m o r p h i n 一7 ，b c m 一7 ) ， 它与u 型受体具有良好的亲和力，并呈现出阿片肽类所具有的特征1 6 ”。很 快人工合成了b c m 一7 和它的同系物1 3 一c m 一6 ，0 一c m 5 ，b - c m 一4 ，并证明1 3 c m 一5 ( t y r p r o p h e p r o g l y ) 在豚鼠回肠中具有最强的阿片活性。随后证 明牛d 一酪蛋白第9 0 9 6 氨基酸残基片段 a r g t y rl e u g l y t y r l e u g l u 也具有阿片活性，并证明人的b 一酪蛋白的第5 1 5 7 氨基酸残基片段 t y r p r o p h e v a g l u p r o i l e 排列顺序与牛的b c m 一7 相似，其阿片活性 比牛b c m 7 低4 5 倍。m e i s e l 等从饲喂牛酪蛋白的微型猪空肠食糜中分离 得到一个阿片肽，称b c m 一11 ，为b 一酪蛋白第6 0 7 0 氨基酸残基片段。 1 4 2 酪啡肽的结构特征 b 一酪啡肽的一级结构与1 3 一酪蛋白上第6 0 个氨基酸到第7 0 个氨基酸残 基相对应。一般来讲，从含3 个氨基酸到含7 个氨基酸的小肽均称为b 一酪啡 肽，7 个以上则称0 一酪啡肽前体。从n 端起的七个氦基酸序列在牛、羊、人 上保守( n 一t y r p r o p h e p r o g 1 y p r o i l e ) 此肽段称为b 一酪 啡肽一7 ( b c m 一7 ) 。研究结果表明：对于所有不同数量氨基酸残基的酪 啡肽，要保持其生物活性，n 一末端t y r p r o p h e 氨基酸结构不能改变， n 端的酪氨酸残基决定阿片活性( 诸如强啡肽、内啡肽、脑啡肽这些阿片 肽的n 端均为酪氨酸残基) 。所有类型的酪啡肽都是b c m 一1 l 的c 一末端丢 掉一或多个氨基酸残基形成的1 1j 。 b - - c m s 可以和b 型阿片受体、6 型阿片受体结合，但与b 型受体亲和 力高于后者。b - - c m s 中b - - c m 5 对b 型受体亲和力最强。蛋白晶体分析表明， p 受体和6 受体的效应基团以相同方位结合b - - c m s 的t y r 位点，b - - c m s 的 p h e 3 作为第二个结合位点，锚定在受体的另一区域。在肠道上皮细胞上未发 现有b 阿片受体( 仅发现有少量6 受体) ，b - - c m s 被吸收后，可通过作用 西华大学硕士学位论文第8 页 于肌层上的受体，发挥阿片样效应。在中枢神经系统，b - - c m s 还能竞争t y r m i f 一1 ( m s h 释放抑制因子衍生物) 的非阿片受体。 1 4 3 酪啡肽的生理功能 ( 1 ) 对内分泌的影响 b 一酪啡肽具有阿片样活性，能够明显提高外周胰岛素和胃泌素的分 泌，对胰高血糖素的分泌也有促进作用，可使饲后血浆中生长激素( g h ) 和胰 岛素生长因子( i g f ) 水平升高。酪啡肽与肠丛阿片受体结合后，可经神经传 导引起垂体内源性阿片肽释放。 胃泌素能促进新生动物胃内酸性环境的建立，促进胃、十二指肠发育， 从而有助于新生动物机能特别是消化吸收系统的全面发育和完善，加速其对 外界环境的适应。一定浓度的b c m 一7 能在消化道腔面独特地促进胃泌素 分泌，因而展示了其在畜牧业生产中作为促进新生动物消化道发育的饲料添 加剂的前景【6 2 1 。 ( 2 ) 对动物采食的影响【1 】【2 】 添加适量b 一酪啡肽可促进动物的采食。酪啡肽对摄食的影响可能与酪 啡肽对胰岛素、生长抑素分泌以及胃肠运动的影响密切相关。动物的摄食行 为与来源于前胃、胃和肠道传感机制的一些传入信号有关，在胃肠道和中枢 神经均存在与摄食相关的前体。可能是因为b 一酪啡肽能与这些受体结合后 经神经传导作用于摄食中枢，从而影响摄食行为。动物的摄食行为与前胃、 胃和肠道传感机制的一些传入信号有关。在胃肠道和中枢神经均存在与摄食 相关的前体。推测可能是因为8 一酪啡肽能与这些受体结合后经神经传导作 用于摄食中枢，从而影响摄食行为( f r o e t s c h e l 等，1 9 9 5 ) 。 ( 3 ) 对胃肠道运动的影响1 1 1 2 1 胃肠运动受中抠与周边神经递质机理作用的调节。且一酪啡肽与其它阿 片受体一样，可以与中枢神经系统和肠肌丛中的阿片受体结合，从而影响胃 肠运动。这种影响主要是延迟胃排空时间，抑制肠道转运消化物。目前大多 数关于b 一酪啡肽与胃肠运动功能的研究都是使用离体器官和组织进行的。 对体内消化物转运与营养利用的研究甚少，其中有代表性的是d a n i e l 等在 1 9 9 0 年做的一次试验，他对体重2 8 9 的小鼠灌胃，发现灌注l o m g 的酪蛋白与 灌注5 m g 的b 一酪啡肽对延迟消化物转运的效果相当，对消化物滞留的影响 西华大学硕士学位论文第9 页 比灌注小麦或纳酷酮( 1 m g k g 体重) 要提高4 0 n 5 0 。一般来说酪蛋白中 6 一酪啡肽一5 的含量在3 1 左右，l o m g 酪蛋白中b 一酪啡肽一5 的量则为 0 3 1 m g ，d a n i e l 的实验得出与5 m gb 一酪啡肽一5 效果相当的结论，可以推 测为酪啡肽前体的活性要更高。 ( 4 ) 镇痛镇静作用 镇痛药是医院临床上最常用的药物之一。然而目前市场上大多镇痛药均 具有成瘾性，能严重损害人的身心健康。此外，近年吸毒也成为一个严重的社 会问题，而要戒除毒隐，其有效方法之一，是应用一种既无成癌性，而镇痛效 果又好的药物。自上个世纪7 0 年代首次在动物脑内提取到内源性镇痛物质脑 啡肽以来，引起了人们对镇痛多肽的极大兴趣。 在体内( 主要脑中) ，d 酪啡肽能够通过与中枢上p 受体高效特异结合而 实现其介导麻醉、呼吸