（食品科学专业论文）绿豆黄酮提取方法及功能性的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：秀曦舷 时问：- 膨占年稠坯日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：范冀牧次薮时间：仉妒莎年6 月仔日 导师签名： 李够留 时间： 妒”g 年占月f ? 日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本试验对绿豆皮中的黄酮类物质进行提取、分离和纯化，建立了最佳提取与纯化工 艺，并对其进行抗氧化性研究。 选用乙醇作为本次试验的提取溶剂，采用超声波法对绿豆皮中总黄酮进行了提取， 确定了绿豆皮中黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度为6 0 ，提取时间为9 0 m i n ，料液比 为l ：2 0 ，提取温度为7 0 。 采用柱层析法纯化绿豆黄酮类化合物，以大孔吸附树脂h p d 一4 8 0 为绿豆黄酮的分离 树脂，采用吸附流速为l m l m i n ，吸附原液浓度为0 6 5 m g m l ，洗脱剂选择7 0 乙醇溶液， 洗脱剂用量为3 b v ( 树脂床体积) 。在此条件下得到的洗脱液经真空干燥，得到绿豆黄酮 的黄褐色粉末。经鉴定产品中黄酮的纯度可达7 0 一8 0 以上，而粗提物中黄酮的纯度为 2 3 0 1 。 对绿豆黄酮类化合物的抗氧化性质的研究结果表明：绿豆黄酮对猪油具有较强的抗 氧化作用，当提取物添加量为o 2 时即可明显抑制猪油的氧化，其抗氧化效果最佳，明 显优于o 0 2 的阴t 。绿豆黄酮与抗坏血酸c ) 、维生素e e ) 的协同效应，能够提高其 抗氧化能力。绿豆黄酮对自由基d p p h 和0 h 均有良好的清除能力，且随着黄酮溶液 浓度逐渐增大其清除能力逐渐增强，而且明显高于人工合成的抗氧化剂b h t 。 关键词：绿豆皮：黄酮；提取；纯化：抗氧化 a b s t r a c t a b s t r a c t f l a v o n o i d sa sak i n do fc o m p o u n dc o n s i s t si nn a t u r ea 1 1 da 】m o s te v e 呻l 卸tc o n s t a i n sf l a v o n o i 出ni s r e m a r k a b l el i p i da n t i o x i d a l l ta n da c t i v eo x y g e n i cc l e 锄e ra t l dc a l lb ea p p l e di nf o o di n d u s “y 锄dm e d i c i n e i n d u s t r y t h ee m m c 竹o n ，s e p a r a t i o n ，d e t e m l i n a t i o na 1 1 dm ea n t j o x o d a t j v ep m p e r t i e so f n a v o n o i d si nm u n gb e a n w e r es t u d i e d ni sa i m e dc h i e 们ya td e v e l o p i n ga l l du t i l i z i n gm 蚰gb e a n r e s o u r c e ，a n de l u c i d a 幽gt h e p h 蝴a c 0 1 0 9 i c a la c t i v i t yo fi t sn a v o n o i d sc o m p o u n d st og i v es o m es c i e n t m cm e s s a g e f i r s t ，e x t r a c td ff l a v o n o i d si nm 批增6 鲫hw a sf i l t e f e dw i me t h a n 0 1b e i n gd i s p o s e dw i t hs u p e m i cw a v e t h eo p t i m 啪c 叩d i o no fe x 虹a c t i o nw a so b t a j n e d ：6 0 e t l 卸o l ，s o l i d ，l i q u i d 豫t i ol ：2 0 ，s u p e m i cw a v e t r e a t m e n tl a s t e df o r9 0m i nu n d e r 7 0 t e m p e r a t 哪 t h e nt h ep u r i 6 c a t i o no fc r u d ef l a v o n o i d sw a ss t i i d i e d ，柚dt h eo p t i m u mp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sw e r e c o n c l u d e dt h a tt h em a c r o p o r o u sa b s o r p t i o nr e s i nh p h 一4 8 0w a ss e l e c t e da se x c l u s i v es e p a r 8 t i o nr c s i no f n “o n o i d s ，t l l ee l u t i o ns 0 1 v e n tw a s7 0 e m a n 0 1 ，a l l dt 1 1 ev o l u m eo fe l u t i o ns 0 1 v e n tw a s3 b v ( r e s i nb e d v o l u m e ，i 怊a b b r e v i a t i o ni sb v ) ，t 1 1 ec o n t e n tp e r c e i 】t a g eo fc r u d e = 1 a v o n o i d sw a 5a b o u t2 0 ，b yp u r 主f i e do f h p h - 4 8 0r e s i nm ec o n t e mo fn a v o n o i d sw a sr a l s e dt og r e a te x t e m f i n a l ly ，锄蛀o x i d a t i o ne x p e r h e n ts h o w e d 日a v o n o i d so f m u n gb e a l lh a da n t i o x i d a t i v ea b i l i t yt oi a r d 锄d t h a tt h ea c t i v i t yw 髂i nd i r e c t 】yp r o p o r t i 帆t 0 伽eu s a g eo f 咖a c t s ；w h e ni 忸a d d i n g 锄o u mw a so 2 n a v o n o i d s a n t i o x i d a t i v ca c t i v i t yw a sb e t t e rt l l a n0 0 2 b ht i th a st l l eb e s ta n t i o x i d a n ta c t i v i t yv c 觚d v es h o w e ds y n e 曙i s t i ce 疗b c t si na n t i o x i d a t i v ea c t i v j t j e sw n he x n t so fm u n gb e 锄i nf 把e r a d i c a i r e a c t i o n e x p e r i m e n t s t 1 1 en a v o n o i d s o f坍g6 阳h a ss h o w n s 订o n gs c a v e n g i n ga b i l i 哆 o n d p p h a n d o h ；i na d d i t i o n ，t h es c a v e n g i n ga b i j j t yi n c r e a s e dw i t hi n c r e 晒i n gc o n c e n t m t i o n k e yw o r d s ：m u n gb e a n ，f l a v o n o i d s ，e x t r a c t ，p u r i n c a t i o n ，a 且t i o x i d a t j o n 2 沈阳农业大学硕士学位论文 前言 随着现代物质文明的提高与社会经济的发展，人们的饮食意识在不断发生变化，饮 食健康的消费意识在不断加强。众所周知，含有天然活性成分的保健食品成为现代人追 逐的目标，其中黄酮类化合物以纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点日益受到人 们的关注。黄酮类化合物是一类低分子量的广泛存分布于植物界的天然植物成分，为植 物多酚类的代谢物，大多有颜色。从植物系统学的角度，植物体产生黄酮的能力与植物 体木质化性质相关。因此黄酮类化合物主要分布在维管束植物中，而在其它较低等的植 物类群中分布较少。其中大多集中于被子植物中，如豆科、蔷薇科等，在这些植物中此 类化合物的类型最全，结构最复杂，含量也最高。根据国内外有关报道，绿豆中含有丰 富的生物活性成分，利用中草妁成分化学检测方法对其绿露中的生物活性成分进行检 测，初步证实绿豆皮中含有黄酮类化合物、鞣质、皂甙、生物碱、蒽醌类化台物等具有 生物活性的化学成分，从而进一步证实绿最的食疗保健功能主要来自种皮。 1 黄酮类化合物的概述 1 1 黄酮类化台物的分布与来源 黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物数量之多列天然酚性化合物之 首，大多具有颜色。黄酮类化合物在植物体内大部分与糖成苷，一部分以苷元形式存在。 黄酮类化合物多存在于高等植物与羊齿类植物中。苔类中含自的黄酮类化合物为数不 多，而藻类、微生物、细菌中没有发现黄酮类化台物。 黄酮类化合物广泛存在于植物的所有部分，包括根、茎、心材、树皮、叶、花、果 实中，在植物叶中大部分黄酮类化合物一般是以苷的形式存在，而在很多个种的叶子角 质中明显存在有微量的配基。黄酮类化合物大多存在于一些有色植物中，如在松树皮提 取物、绿茶提取物、银杏叶提取物、红花提取物中都发现黄酮类化合物的存在。 我们日常摄取的食物中亦含有黄酮类化台物，下列食物中的含量较为丰富：芹菜、 清苋菜、韭菜、洋葱、茶叶、番茄、蜂蜜、苹果、葡萄、荞麦叶、柑橘和柠檬、樱桃、 青椒、可可、红葡萄酒等。值得注意的是大量的黄酮类化合物部是由饮料进入人体。茶、 咖啡、可可、果酒( 尤其是红葡萄滔) 和啤酒，甚至醋都是重要的黄酮类化合物来源( 刘 成海，游海2 0 0 3 ) 。 1 2 黄酮类化合物的基本结构与分类 在1 9 5 2 年以前，黄酮类化台物( f 1 a v n n o i d s ) 主要指基本母核为2 一苯基色原酮的 一系列化合物。由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。在黄酮类化合物 分子结构内具有碱性氧原子，能与酸形成锑盐，所以过去也曾把黄酮类化合物称作为黄 碱紊类化合物。日前黄酮类化台物足泛指两个苯环( a 与b ) 通过三个碳原子相互联结 而成的一系列化合物，具有c 6 c 3 - c 6 基本构型。 i 叮成的一系列化合物，具有c 6 - c 3 c 6 基本构型。 3 前言 黄酮类化合物在植物体内的形成，许多试验证明，是由葡萄糖分别经莽草酸路线和 乙酸一丙二酸路线生成对羟基桂皮酸和三分子乙酸，合成了查耳酮，然后再衍变为各类 黄酮。 根据三碳链的氧化程度，b 环( 苯基) 连接的位黉( 2 或3 位) 以及三碳链是否与b 环构成环状结构等特点，将主要的天然黄酮类化合物分为黄酮( f l a v o n e s ) 、黄酮醇 ( f l a v o n 0 1 ) 、黄烷醇( f l a v a n 0 1 ) 、二氢黄酮( f l a v a n o n e s ) 、二氢黄酮醇( f l a v o n o n 0 1 ) 、 异黄酮( i s o f e a v o n e s ) 、查耳酮( c h a l c o n e s ) 、花色素( a n t h o c y a n i n s ) 等，主要结构 类型见表1 。 天然黄酮类多为表1 中基本母体的衍生物，常见的取代基有0 h 、一o c h 3 及异戊烯基 等。多以苷类形式存在。由于糖的种类不同，连接位置不同，苷元不同，可形成各种各 样的黄酮苷( 肖崇厚，1 9 9 7 ) 。 表1 黄酮类化合物苷元的化学结构 t a b l e lc h e m i c a is t n 】c t u r e so f f i a v o n o d sa 西y c o n e s 1 3 1 形态 黄酮类化合物多数为结晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末。 1 3 2 颜色 在一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查耳酮为黄至橙黄色，而 二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因在分子结构中不存在交叉共轭体系，故不呈黄色， 几乎为无色。花色素所显的颜色，随p h 不同而改变，一般p h 8 5 显蓝色，p h 不同可能促进结构产生可逆变化。 1 3 3 旋光性 二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、二氢异黄酮及其衍生物、紫檀素、鱼藤酮由于分 子内含有不对称碳原子，因此具有旋光性。其余黄酮苷元，无旋光性。黄酮苷类由于在 结构中引入了糖的分子，故有旋光性，且多为左旋。 1 3 4 溶解度 一般黄酮苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂及 稀碱液中，花色苷水溶性较大。黄酮类化合物的羟基被糖苷化后，水溶性增加，脂溶性 降低，一般易溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶及稀碱溶液中，而难溶或不溶于苯、乙醚、 氯仿、石油醚等有机溶剂中。糖链越长，则水溶性越大( 姚新生，1 9 8 8 ) 。 1 3 5 酸碱性 黄酮类化合物因分子具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶中。同时其 分子中y 一吡喃酮环上的卜氧原子，因有未共用电子对，故表现出微弱的碱性，可与强 无机酸、生成锌盐，该镝! 盐极不稳定，加水后即分解( 姚新生，1 9 8 8 ) 。 1 3 6 显色反应 黄酮类化合物的颜色反应主要是利用分子中的酚羟基及y 一吡喃酮环上的性质。 1 4 黄酮类化合物的生理功能 黄酮类化合物在植物中分布范围广、种类多，多数具有显著生理药理活性主要表现 在以下几个方面： 1 4 1 抗氧化及抗自由基作用 自由基与人的病理( 心脏病、糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿等) 、生理( 衰 老) 有密切关系( a i p o t a p o v i c he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。大多数自由基的氧化性很强，在生理 和生物化学中，极少量的自由基就可能对人体健康造成很大的损害。黄酮类化合物则能 够清除体内自由基，对防止疾病以及人的健康有积极的意义( c h h p e t e re ta 1 ，1 9 9 6 ； m j b e r m n l d e z s o t oe ta 1 ，2 0 0 4 ；赵继红等，2 0 0 1 ) 。 1 4 2 对心血管系统的作用 黄酮类化合物对心血管疾病的预防和治疗主要是基于对低密度脂蛋白l d l 氧化的防 止作用( a s m e y e re ta 1 ，1 9 9 8 ；张德权等，1 9 9 9 ) 。 ( 1 ) 对血压的影响 黄酮类化合物具有扩张血管，防止低密度脂蛋白( l d l ) 氧化作用( l h y a oe ta l ， 2 0 0 4 ) ，并对主动脉内皮细胞腺苷脱氨酶有抑制作用，所以可以用于防止由高血压引起 的头痛、头晕、耳鸣等症，尤以缓解头痛疗效尤为显著。 ( 2 ) 对心肌的作用 黄酮类化合物具有变时性调节心肌收缩的作用，改善心肌舒张功能、对抗垂体后叶 前言 索引起心肌缺血、缩小因结扎冠状动脉而引起的心肌梗塞、提高机体在常压与低压下的 耐缺氧能力、对抗各种因子造成的心律失常，因此可用于治疗心律失常、心绞痛、心肌 梗塞等症。 ( 3 ) 抑制血小板凝集作用 黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用( 唐传 核等，2 0 0 2 ) 。此外黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯酸代谢，使内壁的胶原或 胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动脉粥样硬 化。 14 3 抗肿瘤、抗癌作用 黄酮类化合物主要通过3 个途径达到抗癌、防癌作用，即抗自由基作用、直接抑制 癌细胞生长和对抗致癌因子( m l i uc ta l ，2 0 0 2 ；s y w h ge ta l ，2 0 0 0 ) 。致癌因子使体内 产生自由基，并以自由基的形式富集于脂质细胞膜的周围，引起脂质过氧化，破坏细胞 的d n a 而致癌，黄酮类化合物是自由基猝灭剂和抗氧化剂，能有效阻止脂质过氧化引起 的细胞破坏，起到抗癌、防癌的作用。 1 4 4 抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒作用 生物类黄酮具有抗炎、抗过敏作用，抗炎机制可能在于其抑制了前列腺素( p g ) 生物 合成过程中的脂氧化酶( l 0 x ) ，抗过敏机制可能不在于其改善靶器官和细胞的反应性，也 不在于其竞争靶细胞受体从而拮抗生物活性物质，而可能在于其抑制抗原的结合或在抑 制介质释放等环节上产生效应，临床上常用生物类黄酮药物治疗脓肿、溃疡和过敏等 症。 黄酮类化合物还具有抑菌、抗病毒作用( 彭芳，1 9 9 8 ：r p u u p p o n e n p i m i a e ta l ，2 0 0 5 ) 。 如银杏叶黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚等均有抑菌和抗病毒作用。 1 。4 5 雌激素作用 黄酮类化合物具有雌性激素的兴奋和抑制双重效应。兴奋机制在于生物黄酮类化合 物与雌激素受体的亲和性，雌激素样作用强度与亲和力强度相一致；抑制机制可能除了 与雌激索受体有关外，还与子宫组织中的一种过氧化酶( 该酶浓度随雌激素的加入而升 高) 有关，它直接抑制了多种酶活性。此外，黄酮类化合物与生长因子一样有促进生长的 作用，它通过控制促性腺激素的释放或促性腺作用，阻碍雌激素代谢，提高雌激素活性 等途径加快子宫的生长( 张德权等，1 9 9 9 ) 。 1 4 6 降血糖作用 黄酮类化合物可以治疗糖尿病及其并发症( n f f e d o s o v ae ta 1 ，2 0 0 4 ； m s b a l a s u b a s h i n ie ta l ，2 0 0 3 ) 。糖尿病患者一方面因胰岛分泌胰岛素失调引起血糖升高， 另一方面高血糖又引起多元醇代谢通路异常亢进导致糖尿病并发症，醛糖还原酶在多醇 代谢途径中是一关键酶，它使多种醛还原，引发糖尿病并发症。生物类黄酮能够促进胰 沈阳农业大学硕士学位论文 岛b 细胞的恢复，降低血糖和血清胆固醇，改善糖耐量，同时它还能够抑制醛糖还原酶， 起到预防治疗糖尿病的作用( 孙丰雷，2 0 0 3 ) 。 1 4 7 其它 黄酮类化合物还具有止咳、祛痰、镇痛、泻下、解痉、提高记忆力等作用，但在临 床上多把它作为防治与毛细血管脆性和渗透性有关疾病的补充药物，配以维生素c 而起 作用。 1 5 黄酮类化合物的应用 “天然活性成分”在医药、保健品和化妆品领域被视为安全、健康和有效的代名词。 黄酮类化合物在治疗和预防心脑血管疾病方面的显著功效，以及其抗自由基的功能，使 其成为全球开发课题之一，其产品应用广泛，涉及药品、保健品和化妆品。例如，含2 4 黄酮的银杏制剂，对脑功能障碍、智力功能衰退、冠心病、心绞痛、脑血管疾病等均有 良好的疗效( 高锦明等，1 9 9 5 ) 。此外从葡萄籽中提取的总黄酮“碧萝藏”在欧洲行销 应用2 5 年之久，被美国f d a 认可为食用黄酮类保健品，报告的保健作用相当广泛，内用 称之为“类维生素”或抗自由基营养素，外用称之为“皮肤维生素”。在欧洲“碧萝藏” 作为保健药，在美国被视为保健食品( 龚盛昭，2 0 0 2 ) 。对沙棘黄酮资源的开发，也取 得了重要进展。科学家已由食用转向以生化研究为基础的医用研究，用沙棘总黄酮开发 的“心达康片”是治疗心绞痛、预防动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑血栓的理想天然药物， 对治疗心绞痛总有效率达9 7 1 ，同时将沙棘黄酮应用于宇航食品，作为特殊的“日餐 必须添加剂”。目前，含沙棘黄酮的产品已有饮料、果酒、果酱、罐头、沙棘汁、冷冻 食品以及一系列护肤品等( 朱万靖等，2 0 0 0 ) 。 2 黄酮类化合物的提取与精制 2 1 提取方法 2 1 1 水提取法 水提法仅限于提取黄酮苷类物质，在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时 间及煎煮次数等因素。例如：在银杏叶中提取黄酮类化合物，先取晾干的银杏叶，加水 浸泡2 4 h 、大火煮沸3 0 m i n ，文火闷蒸3 0 m i n ，待稍冷倾出上层黄绿液，蒸发、萃取、 过滤即得( 金春雪等，1 9 9 8 ) 。此工艺成本低、安全，适合工业化大生产，但是用水提取 时，提取液中杂质较多( 如无机盐、蛋白质、糖等) ，给进一步分离带来许多麻烦。现 在，已经很少单一使用本法( 中国科学院上海药物研究，1 9 8 3 ) 。 21 2 碱性水或碱性稀醇提取法 黄酮类化合物大多具有酚羟基，可以用碱性水或碱性稀醇浸出，经酸化后得黄酮类 化合物。常用的碱性溶液是稀氢氧化钠和石灰水( 氢氧化钙水溶液) 。氢氧化钠水溶液 的浸出能力高，但杂质较多不利于纯化。石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成 前青 钙盐沉淀，利于浸液纯化，但浸出效果不如氢氧化钠水溶液好，而且有些黄酮类化合物 能与钙结合成不溶性物质，降低浸出率。应该根据不同的原料使用不同的碱性溶液，例 如从菊花中提取黄酮类化合物时，用p h 一1 0 的氢氧化钠溶液浸出效果较好( 丁利君等， 2 0 0 2 ) ；而从槐米中提取芦丁，则用碱性较强的饱和石灰水作溶剂，这样有利于芦丁的 成盐溶解( 曹永刚，1 9 9 3 ) 。 2 1 3 有机溶剂提取法 这是国内外使用最广泛的方法。有机溶剂主要用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚等。 本法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类化合物，对设备要求简单，产品得率高， 但成本较高，杂质含量也较高。常见的可以分为三种方法：冷浸法、渗漉法、回流法。 冷浸法不需加热，但费时较长，效率低；渗漉法由于保持一定的浓度差，所以提取效率 较高，浸液杂质较少，但费时较长，溶剂用量大，操作麻烦；回流法效率较冷浸法和渗 漉法高，速度快，但含受热易破坏的原料不宣用此法，所以应该根据不同原料特点采用 不同方法。例如：从元宝枫叶粉中提取黄酮类化合物用的是冷浸法，用7 0 乙醇提取时， 提取量和黄酮含量都很高，且提取物易浓缩和干燥( 王兰珍等，1 9 9 7 ) ；陈皮苷提取用 乙醇渗漉法，在1 6 倍于样重的5 0 或6 0 的乙醇溶液中提取，效果最佳( 李苑等，1 9 9 9 ) ： 从水飞蓟中提取水蓟宾采用索氏提取法，乙酸乙酯做溶剂，连续回流抽提九次，然后在 甲醇中经多次重结晶可得到水蓟宾纯品( 陈旒荃等，1 9 9 7 ) 。 有机溶剂提取法中最常使用的溶剂是乙醇，在提取过程中，乙醇的浓度对黄酮类化 合物的提取有较大影响，一般认为乙醇的浓度增高有利于黄酮类化合物的提取。但不绝 对，同时跟黄酮类化合物的结构有关，高浓度乙醇适于提取黄酮苷元类物质，低浓度乙 醇适于提取黄酮苷类物质。 2 1 4 微波法 目前，微波技术在人们的生产和生活中的应用越来越广泛，该技术在黄酮类化合物 的提取方面取得了良好的效果，具有操作简便，副产物少，产率高及产物易提纯等优点， 而且具有反应高效性和强选择性等特点。本法多用在药材中有效成分的浸出上，其原理 是利用磁控管所产生的每秒2 4 5 亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、 挤压，这样利于药材中有效成分的浸出；同时在浸出过程中，药材细粉不凝聚、不糊化， 克服了热水法易凝聚易糊化的不足。例如：在雪莲粉末( 1 0 0 目) 中加入蒸馏水，用微 波进行提取( 输出功率为1 2 8 w ) ，使雪莲的利用率大大提高，并节省了资源( 范志刚等， 2 0 0 0 ) 。 2 1 5 超声波法 超声波提取法是应用超声波来强化提取黄酮类化合物，是一种物理破碎过程。超声 波对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用。当超声波振动时能产生并传递强大 的能量，引起媒质质点以大的速度和加速度进入振动状态，使媒质结构发生变化，促使 沈阳农业大学硕士学位论文 有效成分进入溶剂中；同时在液体中还会产生空化作用，即在有相当大的破坏应力作用 下，液体内形成空化泡的现象。在水中当超声波辐射面上的强度达到o 3 w c m 2 时就会 产生空化。根据空化泡的变化，超声空化分为稳态空化和瞬态空化，两种空化现象在液 体中几乎同时存在，且在一定条件下稳态空化可转化成瞬态空化。稳态空化是指声强度 小于1 0 w c m 2 时产生的空化，有规律而缓和。瞬态空化是指声强度大于1 0 w c m 2 时产生的 空化，短暂而剧烈；空化泡在瞬间迅速涨大并破裂，破裂时把吸收的声场能量在极短的 时间和极小的空间内释放出来，形成高温和高压的环境，同时伴随有强大的冲击波和微 声流，从而破坏细胞壁结构，使其在瞬间破裂，植物细胞内的有效成分得以释放、直接 进入溶剂并充分混合，从而提高提出率( 王铮敏，2 0 0 2 ) 。另外，超声波的许多次级效 应如热效应、乳化、扩散、击碎、化学效应、生物效应、凝聚效应等也能加速植物有效 成分在溶剂中的扩散释放，促进植物有效成分充分与溶剂混合，有利于提取。 据报道，用1 9 5 8 k h z 的超声波处理银杏叶，在相同温度、相同时间下提取黄酮苷， 其提出率与常规水浸提法相比大大提高，两者相差2 6 倍左右( 郭国瑞等，2 0 0 1 ) 。从 水芹中提取总黄酮类化合物，用超声波提取，黄酮的浸出率可达9 4 6 ，而用醇提法黄 酮的浸出率仅为7 3 ( 毕立君等，1 9 9 9 ) 。胡静丽( 2 0 0 3 ) 用4 0 的乙醇浸泡杨梅叶片2 4 h 后， 超声波辅助萃取4 5 m i n ，连续提取2 次，黄酮的总浸出率可达9 9 3 0 。刘祥义( 2 0 0 3 ) 从 元宝枫叶中提取总黄酮，用超声波提取1 5 m i n ，黄酮得率为4 7 7 ，是水提法的2 2 倍。 据有关资料介绍，还可用超声波提取沙棘果渣、石榴皮、葛根中的总黄酮( 刘锡建等， 2 0 0 4 ；王选东等，2 0 0 3 ；赵丽娟等，2 0 0 2 ) 。 2 1 6 酶解法 对于一些黄酮类物质由于被细胞壁包围而不易提取的原料可以采用酶解法进行提 取。例如山楂中，部分黄酮类物质被以纤维素为主的细胞壁包围，且这些细胞间有果胶 粘结，因此采用酶解法要比一般方法( 醇提法) 的提取量要高。现将预先干燥并粉碎的 山楂用蒸馏水浸泡，恒温至4 5 后，加入以果胶酶和纤维素酶为主的复合酶液，用 l m o i l “n a o h 调节p h = 4 5 5 ，在4 5 恒温酶解1 5 2 5 h ，然后将酶解溶液回流、提纯。 采用这种方法，使提取量比目前常用的方法提高了2 3 个百分点。此法的提取原理是复 合酶充分破坏了以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞问相连的果胶物质，将山楂中的果 胶完全分解成小分子物质，提取传质阻力减小，使果肉中的黄酮类化合物充分释放出来 ( 王晓等，2 0 0 2 ) 。 2 1 7 超临界萃取法 超临界c 0 2 萃取技术是九十年代国际最新的高科技项目，它是以液态c 0 2 为溶剂进 行提取的，是一种不同于传统黄酮类化合物提取的新工艺，它的提取量与提取温度、提 取压力、c 0 2 消耗量等因素有关。它既有与气体相当的高渗透能力和低的粘度，又具有 与液体相近的密度和对物质优良的溶解能力( a r 句a e ie ta l ，2 0 0 5 ) 。与水蒸气蒸馏和溶 9 前言 剂提取法相比，超临界流体提取是一项具有许多优势的提取技术。该技术的主要特点是 提取量高、产品不含有害物质、无污染( a r 砒i a i l i l ie ta l ，2 0 0 2 ) 。因此，超临界c 0 2 萃取技术项目的启动符合人们回归自然的世界潮流，可以带动相关产业发展，带动我国 化学溶剂法的技术改造，促进行业发展，但是由于超临界提取所需设备价格昂贵生产成 本高，且提取物中烷基酚含量较高，目前，仍不能进行规模化生产。本法在生产银杏黄 酮内脂的技术上取得了较大的突破( 王欣等，2 0 0 0 ) 。 2 1 8 超滤法 本法是以超滤膜两侧的压力差为驱动力，选用不同孔径的膜截流不同分子量物质， 来进行超滤分离提取植物中有效成分的一种方法。它可以有效的除去提取液中蛋白质、 多糖、高分子单宁以及部分原花色素等杂质。它的特点是在常温下进行、除杂效率高、 分析过程中无相变、有效成分理化性质稳定，结果重复性好，准确性高，但同时对超滤 膜的要求也相当高。例如：在用超滤法提取侧柏叶总黄酮时，可以一步就有效的除去脂 溶性叶绿素和悬浮物微粒，简化了分析操作过程，提高了分析效率，提取效果比其它几 种方法好。显示出超滤技术在提取过程中较大的优越性( 薛伟明等，1 9 9 9 ) 。 总之，黄酮类化合物提取的方法很多，每种方法都有它各自的优缺点，要根据提取 物的性质、提取成本、工艺设备等条件来选择最适合的提取工艺，提高黄酮类化合物的 提取量，增大原料的利用效果。 2 2 精制方法 2 2 1 溶剂萃取法 用水或不同浓度的醇提取得到的浸出成分复杂，往往不能直接析出黄酮类化合物， 需尽量蒸去溶剂，使成糖浆状或浓水液。然后用不同极性的溶剂相继萃取，可能使甙与 甙元分离( 或使极性与非极性甙元分离) 。例如先用乙醚自浓水液中萃取甙元，再用乙酸 乙酯反复萃取甙( 肖祟厚，1 9 9 4 ) 。 2 2 2 铅盐沉淀法 在乙醇或甲醇的提取液中加入饱和的中性乙酸铅溶液，可使具有邻二酚羟基或羧基 的黄酮类化合物沉淀析出。如果所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅， 发生的沉淀为杂质，过滤除去。再向滤液中加碱式乙酸铅，可使其它黄酮类化合物沉淀 析出，滤取黄酮类化合物的铅盐沉淀，悬浮于乙醇中，通入h 2 s 进行复分解，滤除硫化 铅沉淀，滤液中可得黄酮类化合物。近年来在用铅盐法不理想的情况下，可用聚乙烯吡 咯烷酮( p v p ) 作沉淀剂，p v p 与酚羟基形成氢键最台适条件是p h 3 5 的1 1 0 甲醇水溶液 ( j b 哈本，1 9 8 3 ) 。 2 2 3 柱色谱法 柱填充剂有聚酰胺、硅胶、氧化铝、萄聚糖凝胶和纤维素粉等，其中以聚酰胺、硅 胶最常用。 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 1 ) 聚酰胺柱色谱 聚酰胺对各种黄酮类化合物有较好的分离效果，且其容量比较大，适合于制备性分 离。 色谱用聚酰胺主要有睛纶6 ( 聚己内酞胺) 、睛纶( 聚己二酞己二胺) 和p v p 等。 ( 2 ) 硅胶柱色谱 在硅胶柱上分离黄酮甙元时，用氯仿一甲醇混合溶剂作移动相；分离甙时，用氯仿 一甲醇一水( 8 0 ：2 0 ：1 ) 或( 6 5 ：2 0 ：2 ) 和( 8 0 ：1 8 ：2 ) 作移动相较好，也可用乙酸乙酯一丙酮一水 ( 2 5 ：5 ：1 ) 作移动相( 肖祟厚，1 9 9 4 ) 。 ( 3 ) 氧化铝柱色谱 氧化铝对黄酮类化合物吸附力强，特别是具有3 一羟基( 或5 一羟基) 、4 一羰基及邻二酚 羟基结构的黄酮类化合物与铝离子络合而被牢牢地吸附在氧化铝上，难以洗脱，所以很 少应用。但当黄酮类化合物分子中没有上述结构，或虽有上述结构但羟基已被甲基化时， 往往也可用氧化铝柱分离。例如葛根中4 种异黄酮的分离( 肖祟厚，1 9 9 4 ) 。 ( 4 ) 葡聚糖凝胶柱色谱 s e p h a d e xg 和s e p h a d e xl h 2 0 两种类型凝胶已成功地应用于分离黄酮类化合物，分 离甙元时主要靠吸附作用，因吸附力豹强弱不同而分离。凝胶对甙元吸附程度大小一般 取决于游离酚羟基的数目多少。分离甙时，主要靠分子筛作用。在洗脱时，一般是按甙 分子量由大到小的顺序洗出柱体( 肖祟厚，1 9 9 4 ) 。 2 2 4 树脂吸附法 吸附是指一种或多种物质分子附着在另一种物质( 一般是固体) 表面的过程。吸 附是界面现象，是被吸附分子在界面上的浓聚。通常人们把活性炭、硅胶、吸附树脂等 比表面相当大的物质成为吸附质。大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材 料，与以往使用的离子交换树脂分离原理不同。它本身具有的吸附性是由于范德华力或 产生氢键的结果。筛选性原理是由其本身多孔性结构所决定的。 2 2 5 薄层层析法 与柱层析一样，对于分离黄酮类化合物所用的吸附剂，主要是硅胶、聚酰胺、纤维 素。一般地说，黄酮类化合物在薄层上吸附力大得多，需极性较大的溶剂洗脱( 刘成海， 2 0 0 3 ) 。 ( 1 ) 硅胶上的分离 用于分离与鉴定弱极性黄酮类化合物较好。高度甲基化或乙基化的黄酮或黄酮醇在 硅胶的薄层上相对要求非极性的溶剂，如甲醇、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮等混合溶剂。 溶剂极性的强弱大多依据在黄酮类化合物中甲基化的程度，极性愈大的黄酮和黄酮醇需 要极性愈大的溶剂( 刘成海，2 0 0 3 ) 。 ( 2 ) 聚酰胺上的分离 前言 使用范围较广，特别适用于分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类。由于聚酰胺对黄酮 类化合物吸附能力较强，因而需要可以破坏其氢键缔合的溶剂来作展开剂。在大多数展 开剂中含有醇、酸或水，常用的展开剂有乙醇一水( 3 ：2 ) 、水一乙醇一甲酸一乙酰丙酮 ( 5 ：1 5 ：l ：0 5 ) 、苯一甲醇一丁酮( 6 0 ：2 0 ：2 0 ) 、丁酮一甲苯一乙酸一甲醇一水( 8 0 ：1 0 ：2 ：5 ：6 ) ( 刘成海，2 0 0 3 ) 。 3 黄酮类化合物的分析方法 目前，有关黄酮类化合物的分析方法在国外没有公开普遍的控制质量标准，一般参 考其它物质中对黄酮类化合物的分析方法，主要有分光光度法、纸色谱法、薄层色谱法 ( t l c ) 、气相色谱法( g c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 等。 3 1 分光光度法 3 1 1 比色法 利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性进行显色，一般用硝酸铝一亚硝酸钠 为显色剂，生成铝螫合物，在分光光度计上测定吸收度计算含量。如柿叶、沙棘果渣中 总黄酮的测定( 石锦芹等，1 9 9 9 ：朱万靖等，2 0 0 1 ) 。 3 1 2 紫外分光光度法 含黄酮类化合物的样品经提取分离后，在紫外分光光度计上测定最大吸收波长处的 吸收度，可计算含量。高红宁等( 2 0 0 4 ) 用大孔树脂a b 一8 精制苦参中氧化苦参碱、苦参 总黄酮，用紫外分光光度法测定苦参总黄酮的含量，取得满意效果。杨红( 2 0 0 4 ) 将益 寿胶囊样品用聚酰胺前处理，采用紫外分光光度法，在2 7 0 n m 处测定吸收度，以淫羊藿 苷为对照测定中淫羊藿总黄酮的含量。边才苗等( 2 0 0 1 ) 用聚酰胺薄层一紫外分光光度 法对中药半枝莲叶片及茎中的黄酮类化合物，进行定量分析。此法简便，准确。 3 1 3 双波长分光光度法 单波长吸光光度法，用于植物试样测定时，由于受大量原花色素、叶绿素存在的底 液干扰，方法的准确度较低，测定结果偏高，且重现性较差，而采用双波长吸光光度法 测定植物体内黄酮含量则可以避免这些问题。采用双波长分光光度法，样品可不经分离， 直接测定k r ( 参比波长) 和k s ( 测定波长) 处的吸收度。程亚倩等( 2 0 0 2 ) 用双波长法 测定了银杏叶、芹菜叶中黄酮的含量；郑敏燕等( 2 0 0 4 ) 测定了油菜花粉中黄酮的含量， 均取得了很好的效果。 3 1 4 三波长分光光度法 鞠兴荣等( 2 0 0 1 ) 用三波长法测定了大豆中大豆异黄酮的含量。此法可有效地消除了 随浓度不同发生的本底漂移、油脂等干扰物质及吸收峰不对称给定量分析造成的影响。 方法简便、灵敏，具有良好的准确性和精密度。 沈阳农业大学硕士学位论文 3 2 色谱法 3 2 1 纸色谱法 纸色谱适合分离检识各种类型的黄酮类化合物，包括苷和苷元。双向纸色谱是检识 植物粗提物中黄酮类化合物存在的最好方法之一。检识黄酮类化合物苷元，通常用“醇 性”展开剂；检识苷往往用“水性”展开剂。钦传光等人( 1 9 9 8 ) 用色谱法鉴定了蛇莓 中花色苷的种类。此法比较适合定性分析，定量分析效果较差。 3 2 2 薄层色谱法 薄层色谱法常用于分离和检出植物粗提物中黄酮类化合物。一般采用吸附薄层，吸 附剂大多用硅胶和聚酰胺，硅胶薄层主要用于分离大多数昔元，也可用于分离苷。冯玛 莉等人( 2 0 0 3 ) 用薄层色谱法以甲苯：醋酸乙酯：甲酸( 5 ：2 ：1 ) 为展开剂，在硅胶g f 2 5 4 薄层板上展开，紫外光灯( 2 5 4 n m ) 下检视，检出了沙棘黄酮中所含的主要化台物为槲皮 素和异鼠李素。梁淑芳等人( 2 0 0 3 ) 用此法以十二烷基硫酸钠一正丁醇一正庚烷一水微乳 液为展开剂，利用聚酰胺薄层色谱法使山楂黄酮完全分离。采用薄层色谱法鉴别黄酮类 化合物方法简便，特异性强，重现性好，但定量检测精度不够。 3 2 3 高效液相色谱( h p l c ) 法 它是在经典的液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，并在技术上采用了高压泵、 高效固定相和高灵敏度检测器，具有分离效果好，准确性好，分析速度快及仪器自动化 程度高等特点，尤其适合于挥发性低、热稳定性差、分子量大及离子型化合物的分析， 已广泛用于天然产物的分析。成为中草药、食品化学成分或功能因子的纯度鉴定，含量 测定和质量监控的常用手段。黄酮类物质的 玎? l c 分析常用的色谱柱为反相c 1 8 柱。 ( 1 ) r p h p l c 法 s e l l a p p a i l ( 2 0 0 2 ) 用i 心c 1 8 色谱柱，流动相为水甲醇一甲酸( 7 0 ：2 9 7 ：0 3 ) ，测定了越 橘和黑莓中的黄酮类化合物的成分。m a t s u m o t o ( 2 0 0 1 ) 用z o r b a xs b c 1 r 柱，甲醇、o 5 磷酸为流动相，梯度洗脱，分离测定了黑穗醋栗提取物中四种花色苷的含量和结构。邹 耀洪等( 1 9 9 8 ) 用r _ p c 1 8 柱为固定相，水甲醇甲酸为流动相，蒽为内标，辅之以二级 管阵列紫外检测技术，测定了杨梅叶中五种黄酮类化合物的含量。 ( 2 ) 三维h p l c 法 在h p l c 的基础上，采用光电二级，x 轴为保留时间，y 轴为吸收度，z 轴吸收波长。 这样测定的管阵列，扫描出三维立体图谱结果更准确可信，定量更方便。张莉等( 2 0 0 1 ) 用三维h p l c 法测定了葛根素及阿魏酸的含量。以m e n s i l o d s 3 色谱柱( 1 5 0 m m 4 1 6 m m ，5 u m ) 为固定相，以对羟基苯甲酸为内标，甲醇水醋酸( 3 9 ：5 8 ：3 ) 为流动相，使葛 根素和内标及阿魏酸分离完全。同时以二极管阵列检测器获取2 4 8 1 1 1 n 和3 2 l i l i i l 两个波长 下的数据，并通过三维图观察其紫外吸收定性，由峰形、峰位确定图谱中指标成分吸收 峰，按标准曲线由峰面积计算含量。p i e t t a 在n u c l e o s i l1 0 0 c 1 8 柱上，以 5 h 3 p 0 4 m e o h t h f 梯度洗脱，5 0 m i n 分离1 5 个银杏黄酮化合物，6 个化合物由标准品 对照确定，其他由u v 或可见分光光度计及二级管矩阵检测器确定( 李广等，2 0 0 1 ) 。 ( 3 ) 离子对色谱法( p i c ) 在高效液相色谱的流动相中，添加与样品离子相反电荷的离子，使其与样品进行离 子结合，形成中性状态的离子对，从而改变离子型化合物在两相中的分配系数，增加保 留值，而非离子型化合物的分离系数不受影响，使离子型化合物得以分离，通过紫外检 测定量。向大雄等( 2 0 0 2 ) 用此法测定了心脑安颗粒中葛根素含量；顾洪安等( 2 0 0 3 ) 则测定了百艾洗液中苦参碱的含量均取得了良好的效果。 4 绿豆的研究概况 4 1 概述 绿豆，古称文豆、宫绿、青小豆，为豆科草本植物绿豆的成熟的种子，原产于我国， 栽培历史已有2 千多年。绿豆的营养丰富，且不含有毒微量元素。绿豆的蛋白质比较完 全，包括球蛋白、清蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白，其中以球蛋白为主，特别是苯丙氨酸 和赖氨酸比较多，其中赖氨酸的含量是小米的3 倍。绿豆的组成组成成分见表2 。 表2 绿豆的组成成分( 1 g ) t a b l e 2 c 0 m p o n e n t so f m u n gb e a i l 绿豆不仅可以做粮食，还可以制作成各种可口的食品，更是防病、治病的良药。我 国中医认为，绿豆能补益元气。调和五脏，清热解毒，清暑利水，安精神，去浮气，止 消渴，利肿胀，行十二经脉，解一切毒。常用于治疗暑热烦渴、水肿、泻痢、小便不利、 烦燥闷乱、痈肿、烫伤、解药物中毒。本草用法研究指出：“毒邪内积，凡脏腑经 络皮肤脾胃无一不受毒扰，凡一切痈肿等症，无不用此奏效。”绿豆的外皮称为绿豆衣， 其清热解毒之力，尤胜于豆，特别用于眼病，有明目退翳的作用( 赵守训，1 9 9 7 ) 。 4 沈阳农业大学硕士学位论文 4 2 绿豆黄酮的研究现状 绿豆的的化学成分、生物活性物质和生理功能的研究己为绿豆的开发和利用奠定了 良好和基础。结合绿豆的成分分析，在对绿豆某一方面或某几方面的生理功能进行更加 深入探讨的基础上，提取纯化新的生理活性物质并探索在农业