（食品科学专业论文）海绵中甲壳素相关微生物的研究.pdf

t ；： 一， i 一一、 嬲炒l 一 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：壅丝生至壹苤担挫趁鱼型宝 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的 规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 易) ，保密期至莎的9 年夕月日为止。 学生签名： 蛔堕导师签名：缝! 莎卵名年汐月e l 旷 - ? 哆 鬈 夕 摘要 摘要 海绵体内聚集了大量种类不同的海洋微生物，研究表明，海绵微生物是海绵 活性物质生物合成的参与者和直接合成者。论文以繁茂膜海绵中分离的甲壳素酶 为研究对象，开展了高产甲壳素酶菌株的筛选、产酶菌株的初步鉴定、发酵条件 的优化、甲壳素酶学性质等方面的研究。 以甲壳素作为唯一碳源和氮源的培养基进行富集培养，从繁茂膜海绵中初步 分离了1 0 8 株甲壳素酶产生菌；其中有1 2 株细菌产生的透明圈比较明显。 将1 2 株细菌与对照菌株h 3 进行对比，测量各菌株的菌落直径( d ) 和其周围 透明圈直径( d ) ，以d d 值以及d 值作为一个评价产甲壳素酶能力高低的标准 进行复筛，再通过酶活力比较，筛选出1 株高酶活力的优良菌株h 7 ，酶活力为 0 5 4 u m l 。 对筛选出的菌株h 7 进行了系统分析鉴定，通过1 6 sr d n a 同源序列分析和 系统发育树分析，鉴定菌株h 7 为p s e u d o a l t e r o m o n a s 属。该菌属于变形菌门 ( p r o t e o b a c t e r i a ) ，丫一变形菌纲( g a m m a p r o t e o b a c t e r i a ) ，交替单胞菌目 ( a l t e r o m o n a d a l e s ) ，交替单胞菌科( a l t e r o m o n a d a c e a e ) ，假交替单胞菌属 ( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) ，和p g a n g h w e n s i sl d q 0 11 6 1 4 相似性达到9 8 。 通过测定反应体系中新产生的还原糖量的多少确定了酶活力的测定方法；进 一步测定了h 7 菌株的生长曲线，得出菌株发酵7 6 h 时酶活力最高，酶活力为 0 5 9 u m l 。 通过单因素实验确定了氮源、培养温度、底物浓度、起始p h 、装瓶量对菌 株产酶量的影响。通过正交实验，确定h 7 菌株产酶的最佳条件是：培养温度3 7 ，起始p h 为7 0 ，底物浓度为0 1 ，装瓶量1 2 5 m l 。经优化后菌株h 7 的酶活 力由原来的0 5 9 u m l 提高至0 6 9 u m l ，其中影响最大的是生长温度，其次是底 物浓度，再次之是装瓶量，p h 影响最小。 通过温度、p h 对酶活性的影响确定了酶最适作用温度为3 5 ( 2 ，最适p h 6 0 ， 属于酸性甲壳素酶，在p h 5 5 7 o 的条件下具有较高酶活。 关键字：交替假单胞菌，繁茂膜海绵，甲壳素，甲壳素酶，1 3 - 1 ，4 - n 一乙酰氨基 葡萄糖 i a b s t r a c t m a t l i n es p o n g e sc o n t a i nl a r g ea m o u n to fv a r i o u sb a c t e r i aa n ds o m ee v i d e n c e ss h o wt h a t m a r i n es p o n g e sa s s o c i a t e db a c t e r i aa r ea tl e a s ti n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e s i so fs o m ea c t i v e p r o d u c t sd e r i v e df r o mm a r i n es p o n g e s i nt h i st h e s i s ，t h ec h i t i n a s ea s s o c i a t e dw i t hm a r i n e s p o n g eh y m e n i a c i d o np e r l e v ew a si n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s e a r c ha sf o l l o w i n g ：b i o a c t i v e d a n di d e n t i f i e dh i g hy i e l do fc h i t i n a s e ，o p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n da n a l y s e dt h e c h i t i n a s e t h r o u g ha c c u m u l a t i o nc u l t u r eo nm e d i u mw h i c hc h i t i na st h eo n l yc a r b o na n dn i t r o g e n s o u r c e , 10 8c h i t i n a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i a ls t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mh y m e n i a c i d o np e r l e v e a n dt h et r a n s p a r e n tc i r c l ew a so b v i o u sf r o m1 2c h i t i n a s e p r o d u c i n gb a c t e r i a ls t r a i n s c o m p a r i n gw i t ht h ec o n t r a s tg r a i n1 - 1 3 ，c o l o n ya n dt r a n s p a r e n tc i r c l e d i a m e t e rw e r e m e a s u r e d i - 1 7w a so b t a i n e df r o m1 2s t r a i n sb yr e p e a ti s o l a t e da c c o r d i n gt ot h ev a l u eo fd d a n ddw h i c hw e r ee v a l u a t i o ns t a n d a r do fc h i t i n a s ea c t i v i t y ，a n db yc o m p a r i n gw i t he n z y m i c a c t i v i t y , o n es t r a i nw h i c hp r o d u c e dh i g hy i e l do fc h i t i n a s ew a so b t a i n e d ，t h ea c t i v i t yo ft h e c h i t i n a s ew a s0 5 4 i i ， b yt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so f t h em o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r ea n db yt h ec o m p a r i s o no fi t s w h o l es e q u e n c eo f16 sr d n a , t h es t r a i nh 7w a sm a i n l ys t u d i e da n di d e n t i f i e da s p r o t e r b a c t e d a , g a m m a p r o t e o b a c t e r i a ， a l t e r o m o n a d a l e s ，a l t e r o m o n a d a c e a e ， p s e u d o a l t e r o m a o n s t h es i m i l a r i t yi s9 8 w i t hp g a n g h w e n s i s _ d q o l l 6 1 4 t h ea s s a ym e t h o do fc h i t i n a s ea c t i v i t yw a sd e f i n i t e db ym e a s u r i n gy i e l do fr e d u c i n g s u g a rw h i c hw a sf r e s hp r o d u c e di nr e a c t i o ns y s t e m t h em a x i m u ma m o u n to fc h i t i a n s ew a s p r o d u c e db ym s t r a i na f t e rs e v e n t ys i xh o u rf e r m e n t a t i o n t h ea c t i v i t yo ft h ec h i t i n a s ew a s o 5 9 i i ， t h ee f f e c to fn i t r o g e ns o u r c e ，c u l t u r et e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e , i n i t i a lp h , q u a n t i t yo fi n c u b a t e d i nf l a s ko np r o d u c i n ge n z y m ew e r ed e f i n i t e db ys i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t t h eo p t i m f lc o n d i t i o n sw e r ed e f i n i t e db yo r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t ：c u l t u r e t e m p e r a t u r e3 7 c ，i n i t i a lp h 7 0 ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e0 1 ( w v ) ，q u a n t i t yo fi n c u b a t e d i nf l a s k1 2 5 m l o ns u c hac o n d i t i o n , t h ec h i t i n a s ea c t i v i t y , t h ea c t i v i t yo ft h ec h i t i n a s eo ft h e s t r a i nw a sr e a c h e da b o v e0 6 9 u m lf r o mo 5 9 u m l t h em a x i m a le f f e c ti st e m p e r a t u r e t h e n i sc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ，n e x ti sq u a n t i t yo fi n c u b a t e di nf l a s k , p hi st h em i n i m u m t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ei s3 5 。c ，p h 6 0 i tb e l o n gt oa c i d i cc h i t i n a s ew h i c hh a sh i g h e r a c t i v i t yi np h 5 5 7 0 k e yw o r d s ：p s e u d o a i t e r o m o n a s ：h y m e n i a c i d o np e r i e v o ；o h i t i n ：c h i n t i n a s o ：b 一1 。排a c e t y l g i u c o s a m i f l o ii 目录 目录 第一章文献综述1 1 1 海绵微生物及其研究进展1 1 1 1 海绵微生物种类的多样性1 1 1 2 海绵相关微生物研究方法2 1 2 甲壳素酶产生菌的研究概况2 1 2 1 甲壳素酶产生菌的研究历史与现状2 1 2 2 甲壳素酶产生菌的应用4 1 3 微生物甲壳素酶的研究进展5 1 3 1 甲壳素酶分类6 1 3 2 微生物甲壳素酶的特点8 1 3 3 微生物甲壳素酶的酶学性质一9 1 3 4 微生物甲壳素酶的基因表达调控1 0 1 3 5 微生物甲壳素酶的分子生物学研究和展望1 0 1 4 本课题研究的意义1 l 1 5 本课题研究的主要内容1 2 第二章材料与方法1 3 2 1 材料1 3 2 1 1 实验用繁茂膜海绵1 3 2 1 2 菌种与试剂1 3 2 1 3 仪器设备1 4 2 2 方法1 5 2 2 1 胶体甲壳素的配制1 5 2 2 2 培养基制备1 5 2 2 3d n s 试剂1 5 2 2 4 缓冲液配制1 6 2 2 5d n a 的提取以及电泳检测所需试剂的配制1 6 i v 目录 2 2 6p c r 反应所需试剂1 6 2 2 7 甲壳素酶产生菌的筛选1 7 2 2 8 甲壳素酶h 7 的1 6 sr d n a 序列分析机系统发育分析鉴定菌株1 8 2 2 9 发酵条件的优化2 1 2 2 1 0 四因素三水平正交试验2 2 2 2 1 l 甲壳素酶理化性质的初步研究2 3 第三章结果与讨论2 4 3 1 甲壳素酶产生菌的筛选2 4 3 1 1 富集培养和初筛结果2 4 3 1 2 复筛结果2 4 3 1 3n _ 乙酰氨基葡萄糖标准曲线绘制2 6 3 1 4 酶活力比较结果2 8 3 2 细菌的1 6 sr d n ap c r 扩增及电泳结果2 8 3 3p c r 扩增产物序列测定及分析2 9 3 4 发酵条件研究31 3 4 1h 7 菌株在培养基中的生长曲线3 l 3 4 2 不同氮源对产酶的影响3 2 3 4 3 不同温度对产酶的影响3 3 3 4 4 不同起始p h 值对产酶的影响3 4 3 4 5 不同胶体甲壳素浓度对产酶的影响3 4 3 4 6 不同装瓶量对产酶的影响3 5 3 4 7 细菌产甲壳素酶的正交试验3 6 3 5 甲壳素酶理化性质的初步研究3 8 3 5 1 温度对甲壳素酶酶活性的影响3 8 3 5 2 p h 对甲壳素酶酶活性的影响3 8 第四章结论与展望4 0 4 1 结论4 0 4 2 展望4 0 参考文献4 2 致谢4 8 v 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 海绵微生物及其研究进展 海洋占地球表面积的7 1 ，蕴藏着极为丰富的生物资源。在动物种类方面，在已知 的3 3 个动物门中，海洋中有3 2 个，其中有1 5 种是海洋所独有的( n o r s e ，1 9 9 5 ) i s 。 海绵( m a r i n es p o n g e ) 属于动物界多孔动物门( p o r i f e r a ) ，是一大类低等多细胞海洋动 物，约占海洋物种总量的1 1 5 ，是海洋中除珊瑚外的第二大生物量，全世界约有1 00 0 0 1 50 0 0 种。海绵是一种原始的无脊椎动物，生活在海洋中的岩石上，只有极少数分布在 淡水中。海绵属于底栖滤食性动物，其体表有很多细小的管道，海水通过这些管道流经 体内，海绵就以海水中的微生物和其他有机碎片作为食物来源。海绵的滤水系统非常发 达，据1 9 7 7 年v o g e l l 口1 报导，有一种海绵，每1 千克的体重在一昼夜可过滤2 40 0 0 升 的海水。在海绵滤食的过程中，许多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海绵体内 保留，这样在海绵体内和体表就富集了大量的微生物。近些年，随着研究方法的发展和 研究内容的深入，科学家从海绵中发现了越来越多的微生物，并从某些微生物的代谢产 物中发现了许多活性物质，其中有些活性物质过去曾被认为是海绵本身产生的。海绵微 生物( m a r i n es p o n g em i c r o o r g a n i s m s ) 的定义是比较广泛的，所有的自海绵组织中分离 得到的微生物都可以定义为海绵相关微生物( m a r l n es p o n g ea s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s m s ) ， 包括偶然出现在海绵体内的微生物，海绵中胶层( m e s o h y l ) 内的微生物，永久性生存 在海绵细胞内部的微生物。另外一个比较严格的定义是海绵共生微生物( m a r i n es p o n g e s y m b i o n t s ) ，是指生存在特定的海绵宿主内的微生物，它们与海绵息息相关，存在共生 关系n 1 。如未特别指出，下文所指的都是海绵相关微生物。 1 1 1 海绵微生物种类的多样性 海绵中的微生物是多种多样的，包括古细菌、异氧细菌、蓝细菌、绿藻、红藻、鞭 毛虫、硅藻、真菌等。至今为止，从海绵中分离得到了许多种异氧细菌。例如从海绵 t e d a n i a 忉捃中分离得到了一种微球藻h 1 ，从海绵s u b e r e ac r e b a 中分离得到了一种假单 第一章文献综述 胞菌等等嗍。除此之外，从海绵中也从分离得到了一些自养的微生物，例如能够进行光 合作用的藻类等。1 9 8 4 年，p r i c e 从海绵s i g m a d o c i as y m b i o t i c a 中分离并培养了红藻 c e r a t o d i c t y o ns p o n g i o s u m 恤1 。h i n d e 等在1 9 9 4 年从海绵d y s i d e ah e r b a c e a 中分离到蓝细 菌o s c i l l a t o r i a s o n g e l i a e 并对其成功的进行了培养口3 。从一种宿主海绵可以分离出很多微 生物，例如海绵t h e o n e l l as w i n h o e i 在同一季节中分离微生物包括细菌、蓝细菌、真菌 等订1 ；一种秽海绵的异养细菌包括b a c i l l u ss p ，m i c r o c o c c u ss p ，v i b r i os p ， p s e u d o a l t e r n m o n a ss p 等等嘲。 1 1 2 海绵相关微生物研究方法 分离纯化海洋微生物的方法很多，但所有方法都有其优缺点或一定的局限性。稀释 平板法是分离纯化海洋微生物最常用的一种方法，能够从样品中得到较多属、种的海洋 微生物。首先称取一定重量的海洋生物样品，把样品切成小块，在匀浆器中研磨制成匀 浆，然后吸取匀浆液，以1 0 倍稀释法进行稀释，涂布于平板的培养基表面；2 8 恒温 培养一定时间( 海洋细菌2 一- - 4 d ，海洋真菌5 7 d ，海洋放线菌7 1 4 d ) ；挑取平皿上单 菌落，显微镜下观察是否是纯菌落，对纯菌落保存在斜面上以备进一步实验研究用，非 纯菌落可以用稀释平板法或平板划线法分纯瞪1 。 1 2 甲壳素酶产生菌的研究概况 1 2 1 甲壳素酶产生菌的研究历史与现状 甲壳素酶的研究起源于上个世纪初对微生物的研究。1 9 0 5 年，b e n e c k e u 叫首次分 离和研究了能够利用甲壳素作为营养物质的微生物，定名为几丁芽抱杆菌( b a c i l l u s c h i t i u o w o u s ) ，但并没有关于甲壳素酶活性方面的直接证据。1 9 2 1 年，f o l p m e r s u u 发现 了分解甲壳素的细菌和放线菌在含有甲壳素的琼脂上形成透明圈，从而证明了这些培养 物内有水溶性的甲壳素酶的存在。之后，不断有科学家报道有关甲壳素酶的研究。1 9 2 9 年k a r r e r 和h o f m a n 【1 2 1 用蜗牛酶将8 5 的甲壳素转化为n 一乙酰氨基葡萄糖，极大地推动了 甲壳素结构单位的研究。1 9 3 1 年，g r a s m a n n 和r u b e n b a u e r 发现曲霉( a s p e r g i l l u s ) 的提取 物能把甲壳素水解成碘可检测出来的还原物质。1 9 3 8 年，z e c h m e i s r e r u 3 1 等证明杏胚乳中 含有葡萄糖苷酶( 1 3 - g l u c o s i d a s e ) 、半乳糖苷酶( 1 3 - g a l a c t o s i d a s e ) 和甲壳素酶( c h i t i n a s e ) ， 2 第一章 文献综述 并证明甲壳素酶系中含有壳二糖酶( c h i t o b i a s e ) 。同年，z o b e l l 和r i n t e n b e r g n 钔对海洋里 的分解甲壳素的细菌试验表明，分解甲壳素的细菌和从土壤中分离出的放线菌能产生胞 外甲壳素酶。此后人们又相继从多种微生物( 包括细菌、放线菌、真菌) 、多种植物和动 物中分离到了甲壳素酶，并对甲壳素酶的理化特性及生物学特性进行了深入研究。1 9 5 4 年，r e y n o l d s m l 从链霉菌( s t r i p t o m y c e ss p ) 中提取了胞外甲壳素酶，分析了产酶条件 和酶解产物。1 9 6 4 年，p o w i n g 阳等研究了大豆等豆科植物种子中的甲壳素酶，采用硫酸 铵盐析、透析，d e a e 纤维素柱方法进行纯化。之后，随着产酶的生物不断发现，分离纯 化的手段不断发展，酶的理化性质也日渐透彻。研究方法又开始转向对其功能的研究。 1 9 3 8 年，b o i l e r 等n 卵研究了乙烯诱导大豆叶片产甲壳素酶，并提出了酶通过分解皮镰孢 菌( f u s a r i u ms o l a n i f s p p h a s e o l i ) 细胞壁中的甲壳素抑制其生长的可能性。1 9 8 8 年，m a u e h 等啪1 采用纸片法比较了豌豆组织中的甲壳素酶对1 8 种真菌的抑制作用。8 0 年代以后，由 于分子生物学技术的迅速发展，甲壳素酶的研究也跨入了分子生物学时代。1 9 8 6 年，美 国科学家j o n e s 把经过e c o r i 部分酶切后的s t r i p t o m y c e sm a r c $ c e n $ 染色体d n a ( 2 0 3 0 k b ) 插入到载体p l a f a l 中，构建了甲壳素酶基因文库，同年，b r o g l i e 以菜豆n u r n a 为模板， 经反转录得到菜豆e d n a ，并进而构建菜豆e d n a 基因文库，杂交的方法获得了菜豆甲壳素 酶基因。1 9 9 0 年，英国科学家向双子叶植物导入了细菌的甲壳素酶基因，培育成功了表 达该酶的转基因植物，可抑制病原真菌的侵袭，并对植物线虫、昆虫和其他一些病原生 物也具有抗性。目前，已获得的转基因植物包括豌豆口、菜豆陋2 3 1 、大麦嗌矗钔、大蒜吼2 引、 水稻也9 3 仉3 川、白杨b 2 3 3 1 和花生b 帕，这些研究现已申请专利啪1 。 据不完全统计，至今已发现约5 0 个属近1 0 0 中甲壳素酶产生菌口副。它们包括细菌 ( s e r r a t i am a r c e s c e n s 、s 1 i q u e f a c i e n sb a c i l l u sm e g a t e r i u m 、e n t e r o b a c t e r l i q u e f a c i e n s 、 c h r o m o b a c t e r i u ms p ) 、真菌( a s e p e r g i l l u sf u m i g at u s 、p e n i c i l l i u ml i l a c i n u m 、m u c o r s u b t i l i s s i m u s 和t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、放线菌( s t r e p t o m y c e ss p 、s g r i s e u s 、s p l i c a t u s ) 。 甲壳素酶产生菌可以产生胞内酶和胞外酶，少数细菌( 如约氏纤维粘细菌) 和真菌( 高 大毛霉菌和构巢曲霉) 是产生胞内酶的菌b 利，绝大部分是产生胞外酶的菌。产生胞外酶 的菌很容易从富含甲壳素的环境中分离得到，也是目前研究和应用较多的微生物。 第一章文献综述 1 2 2 甲壳素酶产生菌的应用 1 2 2 1 生物防治上的应用 甲壳素酶产生菌应用于生物防治主要由两条途径：一是自然甲壳素酶产生菌的开发 利用；二是产甲壳素酶工程菌的利用。 由于几丁酶产生菌对病原真菌所特有的拮抗作用，产甲壳素酶生防菌对病原真菌具 有较好的生防效果。甲壳素酶产生菌类生防菌的筛选、应用有很多成功的实例。这与该 类病原所处的环境和病原形态解剖学特征有关。以丝核菌为例，由于该病原菌属土壤习 居病原菌，因此对于甲壳素酶产生菌保持长时间的接触，况且其菌丝体尖端的甲壳素是 裸露的，因此对于甲壳素酶产生菌当然就表现得更为敏感，生物防治效果也就更加明显 瞌引。目前，在国外有许多的生防菌进入市场。 随着生物工程和生物技术的迅速发展，产甲壳素酶工程菌的研究早已突破纯生物学 研究技术的范畴而逐步扩展到包括生物防治在内的很多应用研究领域。利用产甲壳素酶 工程菌来进行植物病原真菌的防治，具有周期短、易于研究、便于生产等优点，因而引 起了人们的普遍重视。进入2 0 世纪8 0 年代，随着分子生物学的蓬勃发展，使甲壳素酶 产生菌的研究上升到基因工程水平。通过科研工作者们不懈的努力，利用分子生物学技 术手段获得的产甲壳素酶工程菌株已有不少范例，并且成功地应用于病虫害生物防治。 1 9 8 4 年s h a p i r a 把甲壳素酶基因从粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) 克隆到大肠杆菌 ( e c o l i ) 后，其酶提取液对病原真菌有较好的拮抗作用口训。1 9 8 8 年s u s l o w 和j o n e 将 来自s e r r a t i am a r c e s c e n s 的两个甲壳素酶基因c l l i a 和c h i b 嵌入大肠杆菌，随后又嵌入 p s e u d o m o n a sf l u o r e s c a n s 和p p u t o d a 获得了4 株高产甲壳素酶的工程菌1 ；1 9 9 4 年k o b y 通过接合作用将携带有甲壳素酶基因的转座子t n 7 导入荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c a n s ) ，温室试验显示生物工程菌株对棉花立枯病的防效最高可达8 2 h 。王益民 等m 1 选用甲壳素酶高产菌s e r r a 打am a r c e s c e n s 为供体菌，克隆了含甲壳素酶基因长度为 3 8 k b 的d n a 片断，以p k p 。穿梭质粒为载体，电击法导入枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l u s ) 并获得表达，实验表明，工程菌与对照相比，对水稻纹枯病有更强烈的抑制作 用，在人工接种条件下，转化子对棉利枯的防效优于原始菌株。此外，c h e t m l 于1 9 9 3 年利用原生质体融合技术将甲壳素酶产生菌t r i c h o d e r m ah a r z i a r m mt 9 5 l y s 一和t 1 2 i - i i s 一菌 株融合，选育出比亲本菌株生物防治效果更好、抗菌谱更广、竞争力更强的新菌系，并 以f - s t o p 的商品名称登记注册，相似的方法和思路，避免了许多自然筛选和拮抗测验 4 第一章文献综述 中的无效劳动，从而使生防研究目标更加明确，成功的机会也更多了。另一方面也为我 们解决已有生防菌的效果不高、稳定性不强、不能病虫兼治等问题提供了新思路和新手 段。可以相信，产甲壳素酶工程菌的构建和成功应用将给未来的病虫害生物防治带来更 广阔的发展前景。 1 2 2 2 发酵生产甲壳素酶及几丁寡糖 甲壳素酶和几丁寡糖在农业、化工、食品、医学等领域的应用己被广泛的报道。尽 管能用酸解等化学方法降解壳聚糖和甲壳素制备几丁寡糖，但化学方法反应条件难以控 制，并且有提纯困难，成本高的缺陷，其应用前景有限。而生物降解法则条件温和，容 易控制，并避免了几丁寡糖的破坏倒。同时，生物降解法还具有节能、高效、不污染 环境的优点m 1 。m u r a k i t 坫1 等利用绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d a ) 发酵生产聚合度5 - - 9 的几丁低聚糖产品。蔡静平m 1 等筛选得到一株产生几丁聚糖酶的假单胞菌( p s e u d o m o n a s s p v u l t 3 9 ) ，并对其作了发酵生产寡糖素的研究。微生物甲壳素酶的发酵生产一般采用 液体深层发酵旧1 。因为微生物甲壳素酶是诱导酶，发酵培养液中必须含有甲壳素酶诱导 物，培养液中添加1 0 - - 一1 5 的甲壳素可获得持续高产的甲壳素酶。尽管目前利用甲壳 素酶产生菌发酵生产甲壳素酶和几丁寡糖的研究还不太多，但甲壳素酶产生菌在自然界 中大量存在，并且随着许多甲壳素酶高产菌株被选育出来，其应用前景将越来越广阔。 1 3 微生物甲壳素酶的研究进展 甲壳素( c h i t i n ) 是由n _ 乙酰- d 一氨基葡萄糖胺以1 3 - 1 ，4 一糖苷键连接而成的直链生物 多聚体，又叫甲壳素或甲壳质。在自然界甲壳素广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原 生动物等生物中，是绝大部分真菌细胞壁的结构物质，占细胞壁干重的4 6 0 ；节肢 动物( 包括虾、蟹和昆虫) 的体表含有大量的甲壳素，占体表干物质的2 5 , - 一8 0 。另外， 甲壳素还是昆虫肠围食的主要结构成分。据研究资料估计自然界中每年生成的甲壳素约 有1 0 9 吨，在所有天然聚合物中储量占第二位，仅次于纤维素嫡0 5 1 1 。1 9 0 5 年，b e n e c k e 首次分离到能够降解甲壳素的微生物，以后，人们相继发现多种微生物和动植物能够降 解甲壳素，原因是这些生物能够产生胞外或胞内甲壳素酶( c h i t i n a s e ) 。由于甲壳素只存 在于低等生物如真菌和昆虫中，虽然在植物体内至今尚未发现有甲壳素存在，但甲壳素 酶却普遍存在于高等植物中，虽然在植物中此酶常与防卫反应的诱导有关。因此，应用 5 第一章文献综述 甲壳素酶防治植物病虫害的研究受到了极大重视。甲壳素是世界上少见的天然阳离子高 分子化合物，其良好的生物相容性和生物降解性，己被广泛应用于纺织、农业、印染、 医药及食品领域。利用真菌和植物病原体中分离制备出的甲壳素酶来分解甲壳素，这种 方法具有特异性，条件温和易控制，有选择地切断特定糖苷键，从而生成特定的寡聚体。 这种方法前景很好，其主要因素取决于所使用的甲壳素酶。基于甲壳素酶在植物病原真 菌的生物防治、制取氨基寡糖素、甲壳素肥料的处理以及抗病转基因植物的构建等方面 具有广泛的应用前景，目前对微生物甲壳素酶的研究已引起人们的极大兴趣。现在，对 甲壳素酶的研究以涉及到酶的分布、特性、系统、诱导、分子生物学、基因工程等方面。 1 3 1 甲壳素酶分类 根据不同的标准，可以将数目众多的甲壳素酶分为不同的几类。 1 3 1 1 根据水解甲壳素的特性分类 完全水解甲壳素需要不同的甲壳素酶共同作用，这些甲壳素酶构成了一个层次不同 的复杂的家族，和水解纤维素的酶系层次基本平行嘞1 。根据水解甲壳素的特性，可以将 甲壳素酶分为外切甲壳素酶( e x o c h i t i n a s e ) 、内切甲壳素酶( e n d o c h i t i n a s e ) 。外切甲壳素 酶从甲壳素的一端开始水解，产物为几丁二糖。内切甲壳素酶在甲壳素的内部切断甲壳 素长链，将甲壳素水解成小的片断。另一种酶，n - 乙酰葡萄糖胺酶 ( n - a e e t y l g l u c o a m i n i d a s e ，e c3 2 1 3 0 ) ，水解甲壳素小片断，特别是几丁二糖，产物为 n _ 乙酰葡萄糖胺啼副。并不是所有的甲壳素酶都能严格地被区分为这两类甲壳素酶，有的 甲壳素酶同时具有外切和内切甲壳素酶的活性。x i ag 在a s p e r g i l l u sf u m i g a t u sy j 一4 0 7 中得到的甲壳素酶即是这样瞰1 。 1 3 1 2 根据来源的不同分类 在细菌、放线菌、真菌、粘菌、原生动物、藻类、高等植物甚至在脊椎动物中都有 甲壳素酶的存在喳副。甲壳素酶在不同的物种中的生物功能有很大的差别。在本身含有甲 壳素作为结构成分的真菌畸6 1 和无脊椎动物畸铂中，甲壳素酶被用于维持生物体内的甲壳素 代谢平衡。本身不含甲壳素的生物生产甲壳素酶的目的因物种而异。在高等植物油1 和脊 椎动物陆们体内，甲壳素没能抵御外来病菌的侵袭；许多病原和寄生微生物分泌甲壳素酶 6 第一章文献综述 以侵袭含甲壳素的生物旧1 ；细菌分泌的甲壳素酶能通过分解甲壳素为细菌提供养分阳。 通常把自然界中的甲壳素酶根据来源分为微生物甲壳素酶、植物甲壳素酶和动物甲壳素 酶。 在微生物中，许多细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒能够产生甲壳素酶。我国 学者研究的微生物菌种主要有链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 、球孢白僵菌( b e a u v e r i a b a s s i a n a ) 、蜂房芽孢杆菌( b a c i l l u sa l v e i ) 、黄杆菌( f l a v o b a c t e r l u ms p ) 、淡紫拟 青霉( p a e c i l o m y c e s l i l a c i n u s ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 和溜曲霉( a s p e r g i l u s t a m a r i i ) 虚蜜【髓，“，艏，酣】 寸 o 不同微生物所产生的甲壳素酶的类别和性质不尽相同。微生物甲壳素酶可产生胞内 和胞外甲壳素酶。其中大部分微生物所产生的胞外酶，是目前研究和应用较多的甲壳素 酶。绝大多数微生物产生的甲壳素酶属于内切酶，将甲壳素长链切成小片断。微生物甲 壳素酶适用p h 一般在3 o 1 1 0 ，大部分微生物的甲壳素酶作用最适p h 一般在4 o 6 0 之间，酶稳定p h 范围一般在4 0 - i i 0 之间。大多数微生物甲壳素酶是酸性蛋白， 其等电点一般在3 6 - 8 6 之间。酶作用的最适温度多在5 0 - 6 0 ，温度过高，酶活力 容易丧失。金属离子如a g + 、f 9 3 + 、c u 2 + 、z n 2 + 、r i g + 、s n 2 + 、c 0 2 + 等对微生物甲壳素酶活 力都有不同程度的影响，有的离子能增强活性而有的却具有抑制作用m 3 。微生物甲壳素 酶的分子量范围一般在1 9 k d a 到ll o k d a 之间，来自p y r o c o c c u sk o d a k a r a e n s i s 的胞外外 切甲壳素酶分子量达1 3 5 k d a 哺 。 产甲壳素酶微生物可用于对有壳水生动物废物的生物转换，因而在环境保护中起作 用。产甲壳素酶微生物还被用于农作物病原真菌的生物防治。t r i c h o d e r m ah a r i a r m m 甲 壳素酶研究最多，它对许多病原物尤其土壤真菌的抗性非常好。有些微生物甲壳素酶对 昆虫也有防治效果嘲1 。 1 3 1 3 、根据氨基酸顺序同源性分类 h e n r i s s a t 根据氨基酸顺序同源性将来自3 9 个e c 条目的2 9 1 种多糖水解酶以及与 之相关的酶分为3 5 个家族哺引。其中甲壳素酶和n _ 乙酰六糖胺酶 ( n a c t e y l h e x o s a m i n i d a s e ) 被分入三个家族，第1 8 、1 9 和2 0 家族。1 8 、1 9 家族都是来 自不同来源包括细菌、真菌、昆虫和植物的内切甲壳素酶，其中1 9 家族主要由植物甲 壳素酶组成。来自海洋荧光细菌v i b r i oh a r v e y i 的n 一乙酰六糖胺酶北归为2 0 家族。根据 已知的甲壳素酶顺序，1 8 、1 9 家族被细分为i 、i i 、和v 五类n 0 7 1 1 。1 8 家族包括 7 第一章文献综述 类、v 类，类甲壳素酶主要来自植物和真菌，v 类甲壳素酶主要来自细菌；1 9 家族 包括i 、i i 、和类，来自植物，仅有一个例外来自细菌s g r i s e u sh u t 6 0 3 7 的甲壳 素酶眈1 。 i 、i i 、类甲壳素酶的催化区域和信号肽区高度同源。i 类甲壳素酶的n 端有一 个富含半胱氨酸的区域。对于结合甲壳素酶十分重要；c 端有信号肽，用于进入植物细 胞的液泡。i i 类甲壳素酶缺乏这个富含半胱氨酸的区域和c 端有信号肽区，表明i i 类甲 壳素酶不能结合甲壳素，而是被分泌到非原质体( a p o p l a s t ，包括植物所有细胞壁以及 其中的水分的连接系统) 。i v 类甲壳素酶有富含半胱氨酸的区，但较i 类甲壳素酶的同 源区有缺失。被归入m 类甲壳素酶的是来自植物双功能甲壳素酶( b i f u n c t i o n a lc h i t i n a s e ) ， 它们同时具有甲壳素酶和溶菌酶的活性。然而从假单胞菌p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ak - 1 8 7 中也提纯两个双功能甲壳素酶m 1 。这是个有趣的现象，因为通常来自细菌的甲壳素酶具 有抗真菌的活性，而这两个甲壳素酶具有抗菌的活性，无论是革兰氏阳性菌，还是革兰 氏阴性菌。v 类甲壳素酶有能结合甲壳素的区域，定位或在n 端，或在c 端。作为1 9 家族的甲壳素酶最显著的特点是能改变底物空间构象的催化机制。 1 3 2 微生物甲壳素酶的特点 1 3 2 1 诱导性 大多数微生物只在含有甲壳素等诱导物的培养基中才能产生甲壳素酶，少数微生物 在没有诱导物的情况下也可产生甲壳素酶。甲壳素、脱乙酰甲壳素、部分水解甲壳素均 可以诱导甲壳素酶的产生，但几丁单糖( n