（食品科学专业论文）环丙沙星单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立.pdf

摘要 环丙沙星( c p f x ) 属于氟喹诺酮类广谱高效抗菌药物，它是继诺氟沙星之后获美国f d a 批准在美国上市的第二个喹诺酮类药物，对革兰氏阴性杆菌有很强的杀伤力，能抑制细菌 d n a 螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，且药物吸收迅速、生物利用度高、体 内分布广泛，与其他抗生素无交叉耐药反应，已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染 药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长。但是由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日 本及我国均制定了在组织中的最高残留限量，因此环丙沙星的残留检测已成为一个必检项 目。本研究合成了环丙沙星人工抗原，通过免疫兔子获得免疫脾脏，利用杂交瘤技术获得高 特异性的抗环丙沙星的单克隆抗体，优化了e l i s a 检测条件，初步建立了环丙沙星e l i s a 检测技术。其主要研究结果如下： 1 人工抗原的合成及鉴定 采用n 一羟基琥珀酰亚胺活性酯( n h s ) 法合成了两种环丙沙星人工抗原，即作为免疫抗原 的环丙沙星- b s a ( c p f x b s a ) 和作为包被抗原环丙沙星一o v a ( c p f x 一0 v a ) 。通过紫外扫描、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶渗透色谱的检测结果表明人工抗原合成成功，依据紫外扫描数据 计算出c p f x - b s a 中环丙沙星与b s a 的偶联率为l 。8 9 ：1 。用考马斯蓝法对合成抗原中蛋白质的 含量进行测定，得到免疫抗原中蛋白质的浓度是1 5 9 m g m l ，包被抗原中蛋白质的浓度是 6 1 1 m g m l 。 2 免疫脾脏和多克隆抗体的获得 用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔，免疫方法为背部皮下五点注射和静脉注射的方 法。免疫五次后，获得了高效价的环丙沙星多克隆抗血清，筛选出血清效价最高的1 8 2 7 号 兔子的脾脏供细胞融合用，经测定1 8 2 7 号抗血清的效价达到1 2 8 0 0 0 。 3 兔单克隆抗体的制备 取1 8 2 7 号兔子脾脏细胞与处于对数生长期的2 4 0 e 进行细胞融合，以5 0 的p e g 为融 合剂，h a t 作为选择性培养基，铺于4 0 块9 6 孔板中。利用间接e l i s a 法筛选出阳性孔1 3 8 个。将阳性孔细胞分装于2 4 孔细胞培养板培养一周，运片j 间接e l i s a 法筛选出双阳性孔 3 6 个，再用间接竞争e l i s a 法从双阳性孔中筛选出亲和力高，生产状态良好的l - 4 a ，l 一1 2 h ， 2 6 b ，2 1 2 a ，2 1 2 b 五个编号的细胞进入亚克隆，四周质采用间接e l i s a 法、间接竞争e l i s a i i 法最后筛选出亲和力最好的2 - 6 b h 进行扩大培养，生产单克隆抗体。 4 优化了e l i s a 检测条件。探明了2 - 6 b - h 免疫学性质 通过一系列条件优化，最终确定e l i s a 检测方法如下：包被原1 6 0 0 倍稀释，1 0 0 u l 每 孔，4 c 包被1 2 h ：p b s t 洗涤四次；5 甘氨酸封闭2 h ：小分子与2 5 0 0 倍稀释一抗分别按 6 0 u l + 4 0 u l 比例加入，3 7 c 孵育l h ；5 0 0 0 倍二抗，1 0 0 u l 每孔，3 7 反应1 h ；显色底物配 方：1 榴0 2 9 l + 0 0 2 过氧化氢。5 0 u l 每孔，显色1 5 m i n ：2 m o l l 硫酸，5 0 u l 每孔终止， 0 0 4 5 0 读数。 单抗2 6 b h 上清对环丙沙星有很高的亲和性，条件优化后。当环丙沙星浓度达到 0 0 9 5 n g m l 即可产生1 0 抑制率，而当浓度在1 4 1 n g m l 时即可产生5 0 的抑制率，通过 抑制率曲线线性拟合后的方程：y - - 0 0 2 9 3 x - 1 3 1 5 9 ，检测范闸在0 1 9 - 1 0 n g m l 之间，最低检 测限是0 0 9 5 n g m l 。同时2 - 6 b - h 上清对环丙沙星具有较高的特异性，除了和其他喹诺酮类 小分子有较低交叉率，对恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、培罗沙星的交叉反应 率分别为2 8 8 ，1 3 1 ，1 1 ，2 2 6 ，2 0 4 。和其他抗生素以及磺胺类药物均无交叉反 应。 5 建立了e l i s a 样品检测方法 应用外标法对间接e l i s a 法测定样品的准确度进行试验，结果得出，在牛奶中添加 0 4 n g m l ，2 n g m l ，4 n g m l 的平均回收率在6 3 0 2 - 8 4 6 之间，变异系数在6 2 6 1 2 2 之间。检测范围在0 7 6 n g m l 一4 0 n g m l ，其最低检测限达到o 3 8n g m l 。而在尿液中，通过 以尿液为基质建立的标准曲线对5 n g m l ，1 0 n g m l ，5 0 n g m l ，i 0 0 n g m l 的实际样品检测 结果表明，其回收率在8 3 3 4 - 1 1 8 8 之间，变异系数介于4 5 1 - 1 7 1 2 ，最低检测限为 1 r i g m e 。数据显示本实验建立的方法完全满足e i i s a 检测试剂盒要求。 综上所述， 本论文通过杂交瘤技术，制各出了环丙沙星兔单克隆抗体，这一结果在国 内外均未见报道。此外，试验结果表明，基于该兔单抗的环丙沙星e l is a 方法的检测范阐 可达0 1 9 1 0 n g m l ，最低检测限达0 0 9 5 n g m l ，特别在牛奶中检测比目前市售的几种环丙 沙星或喹诺酮类检测试剂盒的具有更低的检测限，因此具有潜在的经济价值。 关键词：环丙沙星，氟喹诺酮类，人工抗原，兔单克隆抗体，e l t s a i i l a b s t r a c t t h ec i p r o f l o x a c i nb e l o n g st ot h ef l u o r o q u i n o l o n e ( f q n s ) g r o u p a st h es e c o n da n t i b a c t e r i a l a g e n to ft h ef q n sg r o u pt h a tw a sp e r m e a t e dt os a l e ，i tc a ne f f i c i e n t l yd a m a g et h eb a c t e r i ao f g r a m - p o s i t i vt h r o u g hi n h i b i t i n gt h ed n ah e l i c a s e i th a st h ea d v a n t a g e so fb r o a d - s p e c t r u mo f a n t i b a c t e r i a , h i g he f f i c i e n c e ，l o wt o x i n ，h i g h l yu s a g ea n db r o a d l ys p r e a di nt h eb o d y s oi tw a s a p p l i e dw i d e l ye s p e c i a l l yi nt h ec l i n i co fa n i m a l s b u tf o r i t sl a t e n ts e r i o u sa d v e r s ea n dc a n c e r c a u s i n ge f f e c ta n dd r u g - r e s i s t a n te f f e c t ，t h ee u ，j a p a na n dc h i n a h a dm a d et h em a x i m u mr e s i d u e s l i m i to ft h ec i p r o f l o x a c i ni nt h et i s s u eo fa n i m a l s c i p r o f l o x a c i nd e t e c t i n gi nt i s s u e sh a sb e c o m ea n e c e s s a r yc o n t e n t i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w es y n t h e s i z e d t h ei m m u n o g e no fc i p r o f l o x a c i n ， i m m u n i z e dr a b b i t sa n do b t a i n e di m m u n i z e ds p l e e no fr a b b i t h y b r i d o m at e c h n o l o g yw a su s e dt o p r o d u c ear a b b i tm o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tt h er a c t o p a m i n e w e o p t i m i z e dt h ee l i s aa n d e s t a b l i s h e de l i s af a s td e t e c t i o np r o c e s sa n de l i s ak i tf o rc i p r o f l o x a c i n t h er e s u l t so ft h i s s t u d yw e r er e p o r t e db e l o w ： 1 s y n t h e s i sa n di d e n t i f i c a t i o no fi m m u n o g e n s u s i n gt h em e t h o do fn h se s t e r w es y n t h e s i z e di m m u n o g e n s ( c p f x - b s a ) a n dc o a t i n g a n t i g e n t ( c p f x - o v a ) o fc i p r o f l o x a c i n t h e f i n a l c o m p o u n d sw e r e i d e n t i f i e db yu v s p e c t r o p h o t o m e t e r , s d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s a n d g e l p e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h e i m m u n o g e n sw e r es y n t h e s i z e ds u c c e s s f u l l y t h ec o u p l i n gr a t i oo fc i p r o f l o x a c i na n db s aw a s 1 8 9 ：1 t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o no fc p f x b s aa n dc p f x - o v aw e r ed e t e r m i n e d t ob e 15 9 m g m la n d6 11m g m lt h r o u g hb r a d f o r dp r o t e i na s s a y 2 p r o d u c t i o no fp o l y c l o n a la n t i b o d i e s n z wr a b b i t sw e r ei m m u n i z e db yc p f x b s a t h es u b c u t a n e o u sa n dv e n o u si n j e c t i o n m e t h o d sw e r eu s e d a n t i s e r aw i t hh i i g ht i t e r sw e r eo b t a i n e da t = t e rf i v et i m e si m m u n i z a t i o n n o 18 2 7r a b b i th a st h eh i i g h e s tt i t e r sa n di t ss p l e e nw a ss c r e e n do u tf o rf u s i n g t h ew o r k i n g c o n c e n t f a l i o n so f n o 18 2 7r a b b i ta n t i - s e r aw e r e1 ：1 2 8 x1 0 5 3 p r o d u c t i o no fr a b m a b s p l e n o c y t e sf r o mn o 。18 2 7r a b b i tw e r ef u s e dw i t h2 4 0 ec e l l su s i n g5 0 p e g f u s i o n c e l l s i v w e r ep l a t e di n t oat o t a lo f4 09 6 一w e l lc u l t u r ep l a t e s h a ts e l e c t i o nm e d i u mw a su s e d 13 8p o s i t i v e c l o n e sw e f es e l e c t e db yi n d i r e c te l i s a t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r er a i s e di nt h e2 4 - w e l lc u l t u r e p l a t e sf o raw e e k t h e nu s i n gi n d i r e c te l i s aa n dc o m p e t i t i v ei n d i r e c te l i s a 1 - 4 a ，1 12 h ， 2 - 6 b ，2 - 1 2 a ，2 1 2 bc l o n e sw e r es e l e c t e da f t e rt h es u b c l o n e t h ef i v es e l e c t e dc l o n e sw e r er a i s e d b yt h em e t h e o dm e n t i o n e da b o v ea n db yt h es a m es e l e c t i n gm e t h o d s ，f i n a l l yt h e2 6 b hc l o n e w e r ed e t e r m i n e dt ob et h eb e s tc e l lt op r o d u c et h em o n o e i o n a la n t i b o d ya g a i n s tt h ec i p r o f l o x a c i n 4 o p t i m i z a t i o no fe l i s as c r e e n i n gp r o c e s sa n dd e t e r m i n a t i o no ft h ei m m u n o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i co fr a b m a b a r e ro p t i m i z i n gt h es c r e e n i n gp r o c e s so fe l i s a f i n a l l y , w eo b t a i n e dt h eb e s t r e a c t i o n c o n d i t i o n sw e r e ：9 6e l i s ap l a t ec o a t e db yc p f x o v aw a si n c u b a t e da t4 cf o r12 h ，t h e c p f x o v aw a sd i l u t e df o r16 0 0t i m e w a s h e df o r4t i m e sb yp b s t b l o c k e db y5 g l y c i n ef o r2 h o u r sa t3 7 1 2 t h ep r i m a r ya n t i b o d yw a si n c u b a t e da t3 7 0 cf o r6 0 m i n ，t h es e c o n da n t i b o d yw a s i n c u b a t e da t3 7 。cf o r6 0 r a i n ，a n dc o l o rw a sd e v e l o p e da n di n c u b a t e da t3 7 cf o r15 m i n t m ba n d h 2 0 2w e r ee s s e n t i a lt ot h es e n s i t i v i t yo fe l i s ap r o c e s s t h eb e s tt m b a n dh 2 0 2c o n c e n t r a t i o n w e r e0 2 9 lt m b + 0 。0 2 h 2 0 2 t h es u p e m a t a n t so f2 - 6 b - hh a dg o o da f f i n i t i e st oc i p r o f l o x a c i n t h ec o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n c u r v e ss h o w e dt h a tt h ei c 5 0a n di c l ow a s1 41n g m la n d0 0 9 6n g m lr e s p e c t i v e l y t h es t a n d a r d c u r v eo f2 - 6 b hw a se s t a b l i s h e db yi n h i b i t i o n i n d i r e c te l i s a t h ec a l i b r a t i o n s q u r ei s y - - - 0 0 2 9 3 x - 1 3 1 5 9 t h ed e t e c t i n gr a n g e i s o 1 9 1 0 n g m la n dt h e l o w e s td e t e c t i n gl i m i ti s 0 0 9 5 n g m l i nt h es a m et i m e ，t h es u p e m a t a n t so f2 6 b ha l s oh a dg o o ds p e c i f i c i t y t ot h e c i p r o f l o x a c i n b e s i d e st h el i t t l ec r o s s - r e a c t i v i t yr a t ew i t he n r o f l o x a c i n ，o f l o x a c i n ，n o f f i o x a c i t t , f l e r o x a c i n ，t h es u p e r n a t a n t sh a dn oc r o s s r e a c t i v i t yw i t ha n o t h e ra n t i b i o t i c s 5 p r o d u c t i o no fe l i s ak i t v e r a c i t ye x p e r i m e n t so fi n d i r e c te l i s aa s s a ys h o w e dr e c o v e r yr a t e so f m i l ks a m p l e sw i t h 0 4 n g m l ，2 n g m l ，4 n g , m lw e r e b e t w e e n6 3 0 2 - 8 4 6 t h er s dw e r eb e t w e e n6 2 6 , - 1 2 - 2 t h ed e t e c t i n gr a n g ei s0 7 6 n g m l - 4 0 n g m la n dt h ed e t e c t i n gl i m i ti s0 3 8 n g g t h e s er e s u l t s s h o w e dt h ee l i s aa s s a yh a dg o o da c c u r a c y a ni n d i r e c te l l s ak i tw a sp r o d u c e di nt h i sp a p e r v k e y w o r d s ：c i p r o f l o x a c i n , f l u o r o q u i n o l o n e s ( f q n s ) ，i m m u n o g e n s ，r a b m a b ，e l i s a 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月 日 签字日期：年月日 致谢 论文即将完成，心中倍感欣慰，两年的研究生生活一晃而过，回首过往，心潮澎湃，感 激之情油然而生。 首先，我要感谢我的导师郑晓冬教授，您渊博的学识，精深的学术造诣以及严谨的工作 作风，让我耳濡目染，深受教育，本论文从选题、方案设计、实验开展乃至最终能顺利完成， 这些无不渗透着您的心血和汗水，而生活中您更是给予了我极大的帮助，这让我卸下了不少 重担，使我能够轻松的完成学业，在此谨向您表示最崇高的敬意和最衷心的感谢! 谢谢您两 年来孜孜不倦的教诲，谢谢您两年来无微不至的关怀与帮助。 同时还要感谢华安公司的黄云坚老师，宜康公司谭兴梅老师，丁海老师。您们给我提供 了强大的技术支持，谢谢你们。 感谢食品系何国庆教授、尹源明副教授、朱家进副教授、王友永副教授、李铎教授、冯 凤琴副教授、刘闽年老师，感谢生工食品学院的所有老师，您们丰富的知识拓宽了我的学术 见识。感谢食品楼5 0 6 的余挺博士后、王一非博士、姜峰博士、刘娜博士、殷赞博士、刘霞 博士、邹慧熙博士、王慧丽博士、王艺熹硕士、张嘉硕士、李小玲学士，你们的帮助对我非 常重要， 这里还要重点感谢我的爱人傅小伟，是你把家庭重担一肩扛，承担着本应由我担当的 责任，这两年的苦累辛酸你独自忍受，没有你默默以及公开的支持，我恐怕是走不到现在， 谢谢你。 最后将深深的敬意献给父母，你们赋予我生命，让我有机会领略世界的五彩缤纷，在 我身处逆境时你们不断给我精神鼓励，物质支持，你们的爱是如此无私，这些将成为我宝贵 的精神财富，不断激励我前行。 时值5 1 2 汶川大地震给四川人民带来巨大灾难，同胞罹难，举国同殇之时，在此愿逝 者安息，生者坚强，愿祖国平安，中国脊梁永远挺拔。 黄斌 2 0 0 8 年5 月 浙江大学硕士论文绪论 第一章绪论帚一早z 百了匕 1 1 氟喹诺酮类药物简介 1 1 1 氟喹诺酮类的结构和类型 氟喹诺酮类( f l u o r o q u j n o l o n e s ，f q n s 或f q s ) 药物是1 9 7 4 年问世的一类全合成抗感 染药物，其共同特点是在化学结构7 位上连以哌嗪环、6 位处引入了氟原子，结构见图 卜l 。氟喹诺酮类药物属第三代喹诺酮类抗菌药，它们的作用机制是选择性抑制细菌d n a 回 旋酶和拓扑异构酶，导致细菌d n a 不能正常合成和修复，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性杆 菌、衣原体、支原体以及结核分枝杆菌具有广谱抗菌作用。该类药物的抗菌谱明显比第一、 二代扩大，抗菌活性也显著增强，不良反应也较小，注射液、口服制剂、外用的滴眼液和滴 耳液等多种剂型，广泛用于临床抗感染治疗。 0 0 h 图卜1 氟喹诺酮类药物结构通式 f i g 1 1t h eg e n e r a l g r a p h i cf o r m u l ao ff l u o r o q u i n o l o n e s r 1 烃基r 2 一哌嗪衍生物x - 一c 或n r 1 - h y d r o c a r b o n y lr 2 - - d e r i v a t eo fp i p e r a z i d i n ex to rn f q n s 的主要产品有恩诺沙星( e n r o f l o x a c i n ) 、环丙沙星( c i p r o f l o x a c i n ) 、氧氟沙星 ( o f l o x a c i n ) 、诺氟沙星( n o r f l o x a c i n ，氟哌酸) 、洛美沙星( l o m e f l o x a c i n ) 、盐酸沙拉沙星 ( s a r - - a f l o x a c i nh y d r o c h l o r i d e ) 、甲磺酸达氟沙星( d a n o f l o x a c i nm e s y l a t e ) 、培氟沙星 ( p e f l o x a c i n ) 、依诺沙星( e n o x a c i n ) 、氟罗沙星( f l e r o x a c i n ) 、马波沙星( m a r b o f l o x a - - c i n ) 、奥比沙星( o r b i f l o x a c i n ) 和盐酸二氟沙星( d i f l o x a c i nh y d r o c h l o r i d e ) 等。其中恩 诺沙星、盐酸沙拉沙星、甲磺酸达氟沙星、盐酸二氟沙星为兽类专用药，其结构如图1 2 。 另外，我国农业部批准用于动物的还有环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛关沙星和培氟沙 星1 。 1 浙江大学硕士论文绪论 0 瓣觏堰 f0 0 h h o 粤诺涉鑫 q o 翎2 f 溯 萎吃抄星二蟹移墨 抄杖掺怒 c t 4 锫薨抄基 氧薷沙盛 船蘸诊缝 图1 - 2 兽医专用f o s 药物的化学结构式 f i g 1 2c h e m i c a ls t r u c t u r a lf o r m u l ao ff l u o r o q u i n 0 1 0 n e sf o rv e t e r i n a r i a n 1 1 2 氟喹诺酮类的理化性质 f q n s 均为白色或淡黄色结品性粉末，个别遇光后变色，能溶丁稀酸和稀碱水溶液中， 在甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等一般有机溶剂中溶解度都不太好，有的几乎不溶。其盐能溶于 水，碱性盐溶解度比酸性盐大。这类药物还具有结构稳定的特点，原粉无论是长时间室温存 放或是在强烈光照、高温或高湿条件下，一般均表现极其良好的稳定性个别品种遇光后颜 色逐渐变深，但几乎不影响药效。因此，许多品种的原粉在一般条件下存放，可保证至少3 年质量不受影响【l i 】。另外，这类药物的亲脂性程度直接影响药物对细胞的穿透力，即决定 其的抗菌活性。一般而言，取代的烃基越长亲脂性越高，例如恩诺沙星、培氟沙星、麻保沙 星、奥比沙星等脂溶性较高，其穿透力也较强，即抗菌能力也强。 2 浙江大学硕士论文 绪论 f q n s 结构中均含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基、羧基、杂原子等生色基团或助色 基团组成的共轭体系，在紫外区具有强的特征吸收，其紫外光谱有两个吸收峰2 4 0 - 一3 0 0 n m ( = 3 1 0 4 4 1 0 4 ) ；3 3 0 - - 3 5 0 n m ( = l l o 2 1 0 4 ) 。其紫外吸收受不同介质或介质p h 的影响，并且最大吸收值受溶剂极性的影响。此外，f q n s 自身具有荧光性质，e x = 2 8 0 一 3 3 0 h m ，e m = 4 1 0 - - , 4 3 0 n m 。作为酸碱两性化合物，f q n s 在偏酸性介质中荧光较强而稳定。 徐子刚【1 2 1 等对环丙沙星( c p l x ) 荧光特性进行了研究，结果表明在p h 2 3 时，其荧光最强， 在此范围内荧光强度变化很小。但在p h 8 时几乎不发荧光，p h 环丙沙 星 诺氟沙星 依诺沙星 氧氟沙星，其中以培氟沙星和环丙沙星口服制剂最常见。 此外，氟喹诺酮类药物均具有光毒性，各种氟喹诺酮类光敏反应发生率不同。以氟罗 沙星、洛美沙星的相对光毒性频率较高，其次是培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星和氧氟沙星。 经研究证明光毒性的产生可能是由于药物对光不稳定，经紫外光照射，药物的结构变化或分 解所致，或由于该产物产生了氧游离基而导致光毒性。氟喹诺酮类引起皮肤光敏毒性与药物 剂量密切相关，与年龄关系不大n 引。 1 2 1 2 毒性作用 药物及药物残留多引起食用者产生远期毒性作用及潜在“三致”( 致癌、致畸、致突变) 作用。动物若一次摄入残留物的量过大，会出现急性中毒反应。但在动物组织中药物残留水 平一般很低，仅少数能发生急性中毒，绝大多数药物残留通常产生慢性、蓄积毒性作用。尤 其在动物体的药物注射部位和一些靶器官( 如肝、肺) 常含有高浓度的药物残留，人食用后出 现中毒的几率将大大增加。 f q s 类药物对消化系统的毒性作用的主要症状为：恶心、呕吐、腹泻、上腹不适、腹痛、 食欲减少等国外资料统计，其发生率为2 1 1 。产生消化系统不良反应的药物排列顺序为 环丙沙星 诺氟沙星 氟诺沙星 培氟沙星 氟罗沙星 依诺沙星，且剂量愈大，不良反应 发生率愈高，最严重的病例是上消化道出血。 用f q s 类药物后导致的中枢神经系统症状为：头痛、头昏、眩晕、失眠、嗜唾焦虑、抑 郁、神经过敏等，严重时可致精神异常，此类不良反应发生率为1 7 。有资料报道氟喹诺酮 类药物对神经系统的有害药物反应与基础病如脑组织病理损害、肾功能不全有关，与非甾体 类药( 阿斯匹林除外) 并用时更易发生。发生机制：f q n l 类分子结构中的氟( f ) 原子具有一定 的脂溶性，能透过血液屏障进入脑组织中，使中枢兴奋性增高。当剂量过大或肝肾功能不全者 应用时，药物的消除率下降，血药浓度升高，容易导致药物性高颅压。此外，诺氟沙星、环丙 沙星培氟沙星与氨茶碱合用，分别使氨茶碱的血液浓度增高1 11 、2 3 、2 0 ，极易致神 经精神综合症n 。 4 浙江大学硕士论文绪论 用f q s 类药物后导致的肝肾功能损害：接受f q n l 抗生素治疗的病人有0 9 4 3 肝功 能异常，血浆转氨酶升高，碱性磷酸酯酶升高。f q n l 药物大多是通过肾脏排泄的，对于肾功能 不全患者易引起药物在肾脏受损、少尿和急性肾功能衰竭【1 剖。 用f q s 类药物后导致暂时性血小板减少症，引起凝血功能障碍。应用f q n l 类药物的病 人，有0 5 2 2 出现嗜酸性粒细胞升高，0 1 - - - 0 7 的患者出现白细胞减少。魏桂馨等训 报道l 例呼吸道感染患者用诺氟沙星5d 后发生白细胞减少。有报道f q n l 类药物对生殖系 统有影响。在动物实验中所有药物都会引起朱成年动物关二话组织中软骨损伤、d n a 损害和免 疫功能异常。 1 2 1 3 细菌耐药性增加 滥用抗生素药物导致细菌对很多重要约物产生抗药性1 1 8 】，用于生产食品的动物滥用抗 生素后不仅会导致人摄入该残留药物，也会使动物本身对细菌产生抗药性。欧盟规定：f q s 在动物肌肉、肝脏和肾脏中最大药物残留量为3 0ug k g ( 恩诺沙星和环丙沙星量之和) ，沙拉 沙星和二氟沙星在动物组织中最大药物残留量分别为1 0 - l o o l zg k g 和1 9 0 0 p g k g t 2 们。 随着氟喹诺酮类药物的广泛使用，细菌对该类药物产生耐药性日趋严重，有关研究证 明，f 0 s 耐药性产生的分子机制，即药靶的改变，药物在菌体内蓄积浓度下降及由质粒介导的 耐药等机制，而靶改变，细胞内药物蓄积浓度减少都是由于细菌染色体突变而导致的，并非 以耐药质粒为介导。 氟喹诺酮类是当今唯一能抑制细菌d n a 促旋酶的一类药物，培氟沙星是d n a 促旋酶 的强抑制剂。目前认为耐药性产物属于染色体耐药型，耐药性是由于d n a 促旋酶的基冈突 变和膜通透性改变所致。g y r 基因a 亚单位突变致使药物作用靶位改变，造成耐药。g y r 基 因b 亚单位突变则与减少药物通透性有关。膜通透性改变除g y r b 基因突变外，还存在其他 机制2 。由于这些突变株的耐药性只能遗传给子代而不象以质粒为介导的耐药性可水平 转移给其他细菌。因而速度转移较慢。当新的抗生素应用临床后，对药物的质粒介导耐药性 会迟早出现并不断发展。一旦氟喹诺酮类不同药物之间有交叉耐药性，同时还有能转移耐药 质粒，必将严重地影响疗效。因此为了防止质粒耐药性的产生。应杜绝动物长期给药，也不 要与氯霉素、四环素和某些1 3 内酰胺抗生素联合应用。对氟喹诺酮类耐药的菌株对氨基甙 类抗生素仍然敏感，因此与氨基甙类交替使用，可减少耐药性产生心邑2 3 一引。 5 浙江大学硕士论文绪论 1 2 2 残留氟喹诺酮类药物的监控 f q n s 广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗。但是，随着f q n s 在食品动物中 的广泛应用，其残留问题已引起广泛的关注。f q n s 残留不但对人体有直接的危害。如中枢 神经系统( c n s ) 、循环系统、消化系统、泌尿系统、呼吸系统的不良反应、皮肤过敏反应及 光敏反应、软骨毒性、生殖毒性、跟腱炎等”1 。更为严重的是动物性食品中较低浓度的药 物残留通过食物链向人类传播，容易诱导人类致病菌对其耐药性的增强，从而不利于该类药 物在人类疾病的治疗。同时，耐药菌株传递所带来的危害性，使新开发的f q n s 类药品的 市场周期大大缩短，并且已发现某些f q n s 具有潜在致癌性。因此，f q n s 在动物性食品中 的残留及耐药性问题业已引起重视。 1 9 7 3 年，欧共体己决定禁用喹诺酮类药物作饲料添加剂；欧盟关于食品动物及其产品中 允许使用，但定有最高残留限量的兽药( b 类) 包括喹诺酮类药。欧盟规定恩诺沙星的最大 残留限量( m r l ) 在猪、牛、家禽中肾脏、肝脏、肌肉均为3 0ug k g ( 这是将恩诺沙星和其主 要代谢物环丙沙星和在一起计算的) ；欧盟在1 9 9 9 年3 月4 日公布了5 0 8 1 1 9 9 9 号法规，对4 种药物( 达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星) m r l 作了规定f 2 6 l 。 世界卫生组织( w h o ) 推荐的恩诺沙星m r l 为4 0ug k g - f a o w h o 食品添加剂联合专 家委员会( j c e f a ) 铝i 定了达氟沙星在牛、猪、禽的m r l - 牛、家禽的肝、肾4 0 0ug k g ，肌 肉2 0 0ug k g ，脂肪及鸡的皮肤t 0 0ug k g ，猪肾脏2 0 0 弘g k g ，肌肉、脂肪1 0 0pg k g ，肝 脏5 0 ug k g t 2 7 1 。 从1 9 9 7 年8 月2 0 日起，美国禁止将f q n s 作为非限制性药物使用。美国联邦法规( 2 1 c f r s 5 3 0 ，4 1 ) 规定禁用的兽药品种( 不能使用于供食用的动物) 也包括f q n s 。瑞士对我 国输瑞禽肉产品首先是检测恩诺沙星残留量，奥索利酸和恩诺沙星在奶、蛋、牛肉的m r l 为l o i lg k g ；澳大利亚和新西兰食品标准法案规定，f q n s 不得检出。日本于2 0 0 3 年7 月 1 日起对进口生鳗鱼及其制品进行氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留检测。并 且将限量控制在方法检测限的5 0i ig k g l 2 引。 我国颁布的首批绿色畜产品论证准则绿色食品兽约使用准则。也取消了 f q n s 在肉用动物上的使用。我国农业部兽药残留专家委员会在参考联合国食品添加剂委员 会( j e c f a ) 及美国联邦法规( c f r ) 和欧共体( e c ) 有关标准的基础上。制定了单诺沙星、 二氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星在动物性食品中m r l 的国家标准【2 9 1 ，见表1 1 。 6 浙江大学硕士论文 绪论 表l - lf q n s 在动物性食品中的最高残留限量( 1 jg k g ) t a b 1 1t h em r l so ff q n si na n i m a ld e r i v e df o o d ( 1 ag k g ) 7 浙江大学硕士论文绪论 1 3 环丙沙星的常用检测方法 1 3 1 环丙沙星简介 环丙沙星( 环丙氟哌酸，e i p r o f l o x a c i n ，c p f x 或c i p ) ，化学名1 环丙基6 氟1 ，4 - 二氢 - 4 - 氧代- 7 ( 1 一哌嗪基) - 3 一喹啉羧酸( 图1 - 3 ) ，分子式c 1 7 h 1 8 f n 3 0 3 ，分子餐3 31 4 。 图1 3 环丙沙星结构图 f i g 1 3t h ec o n f i g u r a t i o no fc i p r o f l o x a c i n 环丙沙星是继诺氟沙星之后获美国f d a 批准在美国上市的第二个喹诺酮类药物，为广 谱高效药，它对g 杆菌的杀伤力特强，对耐药菌引起的严重感染也有效，几乎对所有细菌 的抗菌活性均较诺氟沙星强，是依诺沙星抗菌活性的2 4 倍，是第三代氟喹诺酮类抗菌药 物中抗菌活性较高的一种。该类药物吸收迅速、生物利用度高体内分布广泛，与其他抗生素 无交叉耐药反应，是预防和治疗畜禽细菌性感染及支原体病的有效药物3 ，其m i c 在lu g m l 以下。但环丙沙星作为一种入畜共用药，其残留通过食物链对人体健康危害极大，不 利于该类药物对人类疾病的治疗。从1 9 9 7 年8 月2 0 日起，美国禁j 卜将氟喹诺酮类药物作为 非限制性药物使用，美国联邦法规规定禁用的兽药品种( 不能使用于供食用的动物) ，也包 括氟喹诺酮类，欧盟规定了环丙沙星与恩诺沙星合计最高残留量为3 0l ag k g 。因此必须十分 重视环丙沙星在动物性食品中的残留问题。 为了打击非法使用违禁药物，保护消费者的健康安全，我们除了健全法律法规，建立有 效的监督管理体系外，还需要健全相应的检测方法，建立快速、灵敏、有效的环丙沙星残留 检测方法。 1 3 2 环丙沙星残留检测技术进展 目前用于氟喹诺酮类兽药残留的检测方法主要有：微生物法、液相色谱法、高效液相色 谱法、高效毛细管电泳法、液相色谱质谱联用法、免疫分析法等。 8 浙江大学硕士论文 绪论 微生物法( m i a ) 微生物法利用细菌如大肠杆菌等作为指示菌株进行抗菌药物残留检测的快速筛选方法， 通常的做法是将组织切片或吸附组织液的膜片贴到已涂有敏感菌的琼脂培养皿中，抑制微生 物的生长。但该法的特点是特异性差。1 9 9 8 年o k e r m a n 等报道了利用改良的欧洲四平皿法 ( f o u r - p l a t et e s t ，f p t ) 检测市售肉品中环丙沙星和恩诺沙星的残留【3 2 1 ，但该法的检测限高于 欧盟( e c ) 所规定的m r l s ，不够灵敏，且难以准确定性，仅限丁样品的初筛。c h o i 等报道 了利用e c o l i ( a t c c l 2 8 ) 作为指示菌株检测动物组织中的f q s 残留【3 3 1 ，该法对f q s 具有较高 的特异性，恩诺沙星的检出限为3 5 5 0 p 眺g ，环丙沙星的检出限为3 0 蛾，组织样品中添 加恩诺沙星和环丙沙星的检出限为5 g k g ，阳性率达到1 0 0 。邢应寿等以藤黄微球菌为工 作菌建立了检测肉鸡组织中环丙沙星残留的微生物法，各组织样品中的检出限为2 5 7 5 p g k g t s 4 1 。 液相色谱法( l c ) l c 检测法操作简单，方法灵活，使用水溶液作流动相，是前些年用来检钡g f q n s 残留常 用的方法，它现在几乎已被高效液相色谱取代。p o s y n i a k 等报道了利用l c 法来检测动物组 织中的环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星和沙拉沙星4 种f q s 的残留1 3 5 1 。r o y b a l 报道了牛奶 中沙拉沙星、二氟沙星、