（食品科学专业论文）物理场辅助提取啤酒废酵母中的蛋白质与核酸.pdf

摘要 摘要 本论文研究了高压脉冲电场( h i g hv o l t a g ep u l s e de l e c t r cf i e l d ，简称p e f ) 、超声 波、自溶以及高压脉冲电场与超声波、自溶协同，5 种破壁啤酒酵母细胞提取细胞中 蛋白质与核酸的工艺。旨在寻找一条蛋白质与核酸提取率较高，细胞壁破碎程度小， 后续处理便捷的工业化生产工艺。本文讨论了上述5 种不同方法对啤酒酵母中蛋自质 与核酸提取率的影响，并研究不同处理方法下啤酒酵母细胞形态的变化。最后建立了 啤酒酵母蛋白质与核酸的生产工艺，并对产品性质进行了分析。 首先研究了啤酒废酵母的预处理工艺，将啤酒酵母悬浮在2 5 。c 、p h 6 5 的环境中， 以降低啤酒酵母细胞的凝聚性，从而使得破壁处理过程中酵母细胞受力均匀，确保各 种工艺顺利进行。 在上述预处理的基础上，本文深入探讨了高压脉冲电场、超声波、自溶以及高压 脉冲电场分别与超声波、自溶结合提取啤酒废酵母中的蛋白质和核酸的工艺。结果表 明，高压脉冲电场( 脉宽2 1 a s 、场强3 0 0 0 k v c m 、频率6 6 7 p p s 、电导率a0 1 5 s m 、 处理时间7 2 0 9 s ) 与细胞自溶( 温度5 0 、p h 6 5 、3 0 9 l n a c l 、自溶6 h ) 协同提取 啤酒废酵母中蛋白质与核酸的方法，所得到的蛋白质与核酸提取率最高，分别为 7 7 5 9 和8 8 1 9 。 通过电镜观察处理前后细胞形态的变化，结果表明，经高压脉冲电场、高压脉冲 电场与超声波技术结合和高压脉冲电场与自溶结合处理后的酵母细胞细胞壁破损程 度较小，细胞表面有皱缩现象，但基本形态较完整。 本论文研究结果表明，p e f 与酵母细胞自溶技术相结合的方法不仅蛋白质与核酸 的提取率较高，而且提取后剩余物质的形态比较完整，细胞壁碎片较少，后续处理简 单。 在蛋白质与核酸提取率的基础上，建立了啤酒酵母蛋自质与核酸的制备工艺： 配置l o o g & 酵母悬浮液，经高压脉冲电场和自溶法处理后，搅拌以加速细胞内 蛋白质与核酸的溶出，再经超滤脱去处理液中部分盐和着色物质，等电点沉淀分离蛋 白质和核酸，透析，喷雾干燥，制得成品。 关键词：啤酒废酵母高压脉冲电场超声波自溶蛋白质核酸 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sp a p e r5m e t h o d sw e r ea p p l i e df o re x t r a c t i n gp r o t e i na n dn u c l e i ca c i df r o m b r e w e r sy e a s tc e l l s ，t h e yw e r ep u l s e de l e c t r i cf i e l d s ( p e f ) ，u l t r a s o u n d ，a u t o l y s i s ，a n dt w o n e wm e t h o d s ，o n ew a sc o m p o s e do fp e fa n da u t o l y s i st r e a t m e n t ，a n dt h eo t h e ri s c o m b i n a t i o nt r e a t m e n to fp e fa n da u t o l y s i st e c h n o l o g y c o m p a r a t i v es t u d yo ft h e s ef i v e m e t h o d sw a sc a r d e do u tt of i n dam e t h o dw i t hd i s t i n c ta d v a n t a g e s ，s u c ha sh i g he x t r a c t i o n o fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i d ，n op o l l u t i o nf o rt h ee n v i r o n m e n ta n de a s i l ys e t - u pt oa n i n d u s t f i a lp r o c e s s f i r s t l y , p r e t r e a t m e n tp r o c e s so fw a s t eb r w e r sy e a s tw a st op r e v e n t s o l u t i o n h e t e r g e n a t ec a u s e db yy e a s tc e l ls e d i m e n t a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e ny e a s tc e l l s u s p e n t i n gi nw a t e r ( 2 5 ，p h 6 5 ) ，c e l lf l o o c u l a t i o nr e d u c e d ，a n ds o l u t i o nh o m o g e n a t e g r e a t l yr a i s e d b a s eo np r e t r e a t m e n ta b o v e ，t h ee f f i c e n c yo fa f o r e m e n t i o n e d5m e t h o d so nt h e e x t r a c t i o no fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i df r o mb r e w e r sy e a s tc e l l sw e r ei n v e s t i g a t e d 1 1 1 ed a t a d e m o n s t r a t e dt h a te a c he x t r a c t i o nm o t h o dh a ds i g n i f i c a n te f f e c to ne x t r a c t i o no fp r o t e i n a n dn u c l e i ca c i d ，e s p e c i a l l yt h en e wm i l dm e t h o do fc o m b i n a t i o nt r e a t m e n to fp e fa n d a u t o l y s i st e c h n o l o g y s y n e r g i s t i ce f f e c t so fp e f ( 2 9 s ，3 0 0 0 k v c m ，6 6 7 p p s ，0 15 s r n , 7 2 0 眇) a n da u t o l y s i st r e a t m e n t ( 3 0 9 l n a c i ，5 0 ，p h 6 5 ，6 h ) a c h i e v e dt h eg r e a s t e d e x t r a c t i o no fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i d ，w h i c hw e r e7 7 5 9a n d8 8 19 ，r e s p e c t i v e l y s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) s h o w e d 也a ty e a s tc e l lt r e a t e db yc o m b i n e d t e c h n o l o g i e so fp e fa n da u t o l y s i sc a l lr e m a i ni n t e g r i t y ，a n dt h ec e l lw a l ln e a r l yr e m a i n e d i n t a c t t h em e c h a n i c a ls t r e n g t ho ft h ey e a s tc e l lw a l ld e c r e a s e dw i t l lt h er e m o v a lo ft h e p r o t e i n s ，w h i c hc a u s e dt h ey e a s tc e l lw a l l sc r i m p l ea n de a s yt ob ed i s r u p t e d a ni n d u s t r yp r o c e s sa b o u te x t r a c t i o no fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i dw a se s t a b l i s h e d ： o n eg r a mb r e w e r sy e a s tw a ss u s p e n d e di nt e nm i l l i l i t e rw a t e r , t r e a t m e n to fp e fa n d a u t o l y s i s ，t h e ns t i r r e d ( 4 0 0 r m i n ，i n t e r m i t t e n ts t i r r i n g ) f o ra c c e l e r a t i n g i n t r a c e l l u a r s u b s t a n c e sr e l e a s e df r o mw a s t eb r e w e r sy e a s t t h e nt h ep r o c e s sw a sf o l l o w e db y u l t r a f i l t r a t i o nw i t hm w c o5 0 0 d am e m b r a n e ，a n ds e p a r a t i o no fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i d w i t hi s o e l e c t r i c f o c u sa tp h 4 2a n dp h 2 5a n dd e s a l i n a t i o nw i t hm w c o5 0 0 d ad i a l y s i s m e m b r a n e f i n a l l y , p r o t e i na n dn u c l e i ca c i dp r o d u c t sw e r ep r e p a r e db ys p r a yd e s i c c a t i o n k e yw o r d s ：w a s t eb r e w e r sy e a s t ，p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ，u l t r a s o u n d ，a u t o l y s i s ，p r o t e i n , n u c l e i ca c i d i i 独创性芦萌 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 弱寸闺 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：闳导师签名： 日 期： 第一章结讫 第一章绪论 1 1 啤酒废酵母介绍 啤酒废酵母是在啤酒生产过程中，经主发酵和后发酵酿造工序所产生的泥状酵母， 又被称为啤酒酵母泥。啤酒酵母泥由啤酒、酵母细胞、蛋白质凝固物及其他一些杂质组 成。啤酒厂每年可产生大量的酵母泥，其中2 3 为主发酵酵母，这部分酵母质量好，杂 质少，是发酵的主要利用部分。剩下1 3 为后发酵酵母，质量比较差，活性比较低，在 贮酒过程中，与其他杂质共同沉淀于贮酒罐底部，一般情况下，这部分酵母被作为废品 排放掉或作为饲料以低廉的价格卖给禽畜场。 啤酒酵母由碳、氢、氧、氮和一些矿物质元素组成。啤酒酵母营养丰富，每克干酵 母中含蛋白质4 8 - - - 6 0 、碳水化合物3 0 3 5 、核酸4 5 1 1 3 、灰分7 、脂 肪1 5 、谷胱甘肽0 4 和5 7 的水分含量【j 。此外，还含有丰富维生素、纤维、 矿物质等营养成分。 啤酒酵母细胞内含有1 8 种氨基酸，其中8 种人体必需氨基酸含量及其组成比例接 近联合国粮农组织( f a o ) 推荐的理想氨基酸的比例，啤酒酵母中缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的含量比理想蛋白相应氨基酸含量还要高，蛋氨酸 与色氨酸与理想蛋白的含量相似，因此啤酒酵母中氨基酸具有重要的药理作用。并且啤 酒酵母中含量丰富的赖氨酸在谷物中却较为缺乏，这为人体摄取赖氨酸提供了一条重要 的途径。 啤酒酵母含丰富的碳水化合物，酵母多糖占干啤酒酵母的2 5 - - 3 0 ，其中主要是 葡聚糖和甘露聚糖。葡聚糖又分碱溶性和碱不溶性，其中碱不溶性酵母葡聚糖是一种十 分有效的免疫细胞活性促进剂，具有促进和激活人体免疫力、抗肿瘤、抗辐射等作用p j ， 是一种良好的生物效应调节剂( b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r s ，b r m ) 。甘露聚糖可以防 止病源菌在肠道里定殖，促进有益微生物群增殖，减少肠道疾病，也可以作为免疫刺激 因子，提高人体免疫力 6 , 7 1 。 啤酒酵母中富含b 族维生素( b 2 、b 6 、b 1 2 等) 、麦甾醇、烟酸、叶酸、泛酸、肌 醇等生理活性物质，还含有磷、铁、钙、钠、钾、镁等矿物质【8 ，9 】。其中麦甾醇和硒是人 体所必需的物质，麦甾醇受紫外线照射后会转化为维生素d ，而维生素d 对骨骼的形成 极为重要；硒是人体内不可缺少的微量元素之一，可以保护心脏，当食物中缺乏硒时， 会引起心血管病、克山病等疾病，这两种物质在其他食物中含量比较低，但在啤酒酵母 中却含量丰富。f a d 、a t p 、c o a 、维生素b 1 2 等作为维生素和辅酶可用于治疗代谢疾 病。除了上述成分外，啤酒酵母中尚含有谷胱甘肽、甘露聚糖、葡聚糖和海藻糖等成分， 谷胱甘肽是体内氧化还原的重要因子，有改善肝功能的作用。甘露聚糖、葡聚糖等作为 膳食纤维具有良好的应用价值。另外，啤酒酵母本身是一个活细胞体，细胞内含有新陈 代谢的完整酶系，可以用来开发多种有价值的生化物质。 酵母废酵母产量可观，一般每生产1 0 0 千升啤酒，约产生啤酒酵母泥1 5 2 5 吨。 = 再_ 喜：苟= 雩汪皈 同时，酵母泥生物耗氧量和化学耗氧量在1 0 0 ，0 0 0 p p m 以上，产生极大的污染，约占啤 酒厂总污染的1 3 。因此，若能回收啤酒酵母并加以开发利用，不但能开拓酵母市场， 增加经济效益，而且可以大大减轻环境污染，保护生态平衡，使啤酒工业成为绿色工业。 1 2 啤酒废酵母的利用价值与利用现状 近年来，我国啤酒工业发展迅速，根据2 0 0 8 年中国啤酒市场调查与投资咨询研究 报告显示【l o 】，我国啤酒产量已连续4 年保持世界第一，是世界上啤酒市场增长最快的地 区之一。2 0 0 7 年啤酒产量为3 9 3 1 7 3 万千升，同比增长1 4 7 。目前我国啤酒行业正处 在整合阶段的中后期，啤酒产量今后还有继续稳步增长的趋势。按平均每生产10 0 干升 啤酒就可得到含水分7 5 - - 8 0 的啤酒酵母泥1 5 吨计算t n , 1 2 ，仅2 0 0 7 年就可得到的啤 酒酵母泥约为5 8 9 8 万吨。传统的啤酒酵母泥的处理方法是将其焚烧或作为废水排放 1 3 , 1 4 】。这种处理方式对环境造成了极大污染，而且还浪费了大量的蛋白质源和核酸源。 因此，合理利用废酵母，既可以为啤酒厂创造良好的经济效益，也有利于保护生态环境。 在大力提倡发展循环经济的今天，啤酒废酵母的回收利用，具有更重大的现实意义。 1 2 1 啤酒废酵母在食品工业中应用 啤酒酵母营养丰富，因而在食品行业具有广阔的应用前景。利用啤酒废酵母可以生 产富含氨基酸、多肽、呈味核苷酸、维生素和多种微量元素的食品和食品添加剂。它们 滋味鲜美，营养丰富，是当今市场较流行的集调味、营养功能为一体的天然食品。 1 2 1 1 生产营养酱油 近年来酱油生产的主要蛋白质原料豆粕的价格持续上升，很多企业为了降低生 产成本都在极力开发新的蛋白质源。而啤酒废酵母就是一种营养丰富、价格低廉的蛋白 质原料，在我国酱油生产中具有重要的应用价值。利用啤酒废酵母生产营养酱油的方法 有两种：一种是利用废酵母自溶液和豆粕按一定比例发酵而成；另一种是将废酵母自溶 液和不同鲜味剂调配而成。 齐齐哈尔明月集团有限公司【1 5 】采用酵母自溶的方法，用啤酒废酵母生产营养酱油， 向啤酒废酵母中加适量温和1 4 1 5 食盐，升温至5 0 ，保温2 4 - 3 6 h ，7 0 - 8 0 下杀菌3 0 m i n ，冷却制得的酱油，口味鲜美、营养丰富，是一种理想的营养强化食品， 适合工业化生产。陈云口q 利用酵母水解技术与传统酿造工艺相结合的方法生产高级营养 酱油，8 1 5 的酵母，按1 ：l 加3 0 9 l 的n a c l 溶液，p h 6 2 - - 6 6 ，4 8 水解6 h ，缓 慢升温至5 2 - - 5 3 ，加2 0 略木瓜蛋白酶，静置，清液加1 5 - - - 1 6 的食盐，再按要 求加入苯甲酸钠以及酱色，生产出的酱油卫生质量指标符合国家有关标准，营养丰富、 味道鲜美、香气浓郁。而且生产成本低，投资少，可节省大量粮食。 1 2 。1 2 生产食用酵母蛋白质 随着世界人口的快速增加，蛋白质的缺乏已经日益明显，而啤酒废酵母中的蛋白质 含量约占干酵母的5 0 左右是蛋白质的较好来源。 孙凌雪【1 7 】以啤酒生产中的废酵母为原料，研究啤酒废酵母生产蛋白营养粉的加工工 2 票一甓篝： 艺，透过加温自溶提取其黄养成分，经喷雾于燥后制成乳黄色蛋自粉来，无异昧。所得 产品蛋白质含量高，应用在食品加工中可强化食品的营养成分，增强食品的保水性，使 食品的风味浓郁，是一种新型的食品强化剂。目前，蛋白营养粉已经广泛添加于面包、 饼干、香肠等各类食品中。 1 2 1 3 生产酵母精 利用啤酒废酵母生产酵母精，以食用酵母为原料，利用现代生物技术将酵母菌体内 的蛋白质和核酸类物质进行降解，进一步精制得到酵母精。酵母精是种天然的高级调 睬晶，这种调味晶是继味精( m s g 、水解蛋自( 肼p 、托谨) 和呈味核苷酸( h g ) 之后的第4 代调味料。酵母精营养丰富，含有肽类化合物及人体所需的8 种氨基酸以及 多种核营酸和糖分等营养物质，不含胆固醇和饱和脂肪酸，具有保健作用可辅助医疗l 潮。 酵母精的制备主要有两种方法：一是通过自溶；二是先将酵母灭活，褥9 1 - ) j n 酶降解f 1 9 1 。 陈洁等【2 0 1 利用麦芽根核酸酶，经均质、嬲溶等工艺制得酵母精。李祥等2 1 1 以啤酒废 酵母为原料，经啻溶制得酵母精。曾凡坤等斛将1 0 0 9 l 酵母悬浮液予3 5 m p a 均质二次， 5 5 、p h 5 5 自溶4 h ，添加0 8 木瓜蛋白酶( 以酵母于重计) 自溶2 8 h ，制得酵母精。 1 2 1 4 剃备功能搓饮料 酵母精各组分具有比转移因子更强的活性，将超滤液和截留液配制成功能饮料，饮 料淡黄色，清亮，无沉淀、无酵母睬，滋味甜美潞】。浙江工业大学莉用啤酒废酵母及酵 母内源酶系获得核糖核酸( r n a ) 、各种核苷酸及其衍生物，用以制备核酸营养口服液。 1 2 1 5 其他 利用啤酒酵母作培养基的主要成份，加入双岐因子，经发酵生产双歧酵母保健食显。 利用啤酒酵母取代可可粉，并用之加工巧克力和可可饮料，结果表明，其效果与天然可 可粉类同。 重。2 。2 啤酒废酵母在童勃裁药工监中的应用 目前，啤酒废酵母在生物制药行业中主要用于药用干酵母、核酸及其衍生物、果糖 二磷酸钠、谷胱营肽、辅酶a 、b 族维生素等产最的生产和开发。 1 2 2 1 制取药用干酵母 药用于酵母己成功用于医疗预防，其药理作用是帮助消化，提供蛋自质、维生素等 营养成分。目前国内的生产工艺为：酵母泥一洗涤一脱苦一过滤一喷雾干燥一酵母粉调 配一成品。 1 2 2 2 提取核酸、核苷酸。核苷类物质 核酸和核苷类药物具有扩张末端血管，增加血红蛋自浓度，增加红血球数、自血球 数，减轻浮肿和抗病毒等作用。核糖核酸在医学上可作为生产治疗癌症、脑震荡、肝炎、 带状疱疹、冠心瘸、瘸毒性疾病药物的原料澎l 。啤酒酵母中含有丰富的核糖核酸( r n a ) ， 3 ? 二幕专堂硕士堂7 堂仑t 主要存在于细胞质内。提取的核酸可降解生成核苷酸，核苷酸又可脱去磷酸根生成核苷。 因此可以利用啤酒酵母作为提取核酸、核苷酸、核苷的原料。 1 2 2 3 制取超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶( s o d ) 是一种重要的氧自由基清除剂，能抗衰老，提高人体免疫 力。随着人们对s o d 认识的加深，作为功能性基料的s o d 在食品、医药、化妆品等行 业的运用越来越广泛。啤酒酵母细胞中含有十分丰富的s o d 2 5 1 ，是廉价而稳定的s o d 源，若能把啤酒废酵母作为重要的s o d 生产原料之一，将克服目前从动物血液中提取 的s o d 不稳定的问题，是一条利国利民的好途径 2 6 1 。 1 2 2 4 生产1 。6 二磷酸果糖 果糖二磷酸钠( f d p ) 是人体代谢中的一种活性生物物质，可作为恢复和改善细胞 代谢的分子水平药物，对休克、急性心肌梗塞和心肌缺血等症状具有良好的疗效，是临 床上广泛应用的心血管特效药，使用啤酒废酵母生产f d p 具有一定的社会和经济价值。 1 2 2 5 提取谷胱苷肽 谷胱甘肽中还原态( g s h ) 具有生理活性。g s h 具有清除自由基、解毒、促进铁质 吸收和d n a 生物合成、维持红细胞膜的完整和细胞的正常生长速度及提高细胞免疫等 生理功能口7 2 羽，对肺纤维化、肝癌、卵巢癌、艾滋病的治疗也是有益的联合用药【2 9 3 1 1 。 目前国内外生产谷胱甘肽的生产方法主要有生物提取法、发酵法、吸附层析柱法、化学 合成法及酶法【3 2 】等。 1 2 2 6 提取碱不溶性葡聚糖 啤酒酵母葡聚糖包括碱不溶性、碱溶性、酸溶性三种。其中具有活性形式的葡聚糖 主要是碱不溶性葡聚糖，它有良好的免疫调节活性，可增强宿主对细菌、病毒、真菌及 寄生虫的感染与肿瘤的抵抗能力，在加强机体抗辐射和促进伤口愈合等方面有显著的作 用【3 3 , 3 4 1 。目前国内外对酵母葡聚糖的提取方法主要有酸法提取、碱法提取、酸碱综合法 及有机溶剂提取法等。 1 2 2 7 从酵母细胞中提取凝血质 酵母细胞中含有大量的凝血质，凝血质通过凝血酶的作用使人体或动物血浆内可溶 性的纤维蛋白元转变成不可溶的纤维蛋白，而凝血。从酵母中提取凝血质的工艺简便， 安全性高，是凝血药品的理想资源【3 5 1 。 1 2 3 啤酒废酵母在饲料行业中的应用 1 2 3 1 生产蛋白饲料添加剂 目前啤酒废酵母的主要利用途径是将啤酒废酵母直接作为饲料使用，以啤酒糟为主 要原料，采用曲霉和酵母混合的发酵技术，使微生物体内的各种酶系协同作用。首先是 曲霉将啤酒糟中禽畜不易消化吸收的成分转化成单糖和各种氨基酸，然后酵母菌利用以 4 里二兰丝笙 上酾糖类和氨垂酸合成雷养价值鬲、适口性好的蛋白饲料。从而大幅度提高啤酒糟的蛋 白质含量，降低粗纤维含量，这种方法改善了啤酒糟的品质，增加了饲料的利用率和消 化率。其粗蛋白的质量分数为6 3 ( 是未发酵啤酒糟的2 倍) ，粗纤维质量分数为8 7 2 ( 低于未发酵啤酒糟的1 2 ) ，还富含多种消化酶、维生素及钙、磷，大大提高了啤酒 糟的饲用价值，同时也可以减少环境污染。 1 2 3 2 生产混合饲料 将酵母泥、糖化废麦糟、过酒后的废硅藻土分别压滤、干燥，再加入制麦所得废麦 根进行混合粉碎，用其作为配制混合饲料的蛋白源，产品广泛适用于畜牧、河虾、鱼蟹 养殖等行业。一个年产1 2 万吨啤酒或1 6 万吨麦芽的啤酒厂，每年可生产8 0 0 吨混合饲 料，可创产值1 1 2 0 万元年，获利润5 0 0 万元以上。江南大学开发完成了利用啤酒废酵 母生产氨基酸和小肽，进而合成微量元素络合物，既有效地开发利用了蛋自质资源，改 善了环境，又降低了产品生产成本，为产业化创造了条件。解决了目前在饲料，预混料 中普遍使用硫酸盐，氧化物等无机盐作为微量元素添加剂的缺陷。 1 3 国内外啤酒废酵母中活性物质的提取 1 3 1 蛋白质及氨基氮的提取 啤酒酵母中蛋白质和氨基酸的提取主要采用自溶法、酶解法、自溶法一酶解法。陈 廷登等运用3 种方法( 即自溶6 4h ；自溶2 4 h ，再加蛋白质分解酶水解4 0 h ；添 加诱剂自溶2 4 h 后，再添加蛋白质分解酶水解4 0 h ) 进行啤酒酵母细胞蛋白质的提取， 经比较第三种方法蛋白质提取率最高达到8 9 0 3 1 3 6 。廖鲜艳【3 7 1 利用j l j 口酶处理提取蛋 白质在反应温度4 5 下，反应时间3 2 h ，p h ( 6 5 7 0 ) ，加酶量2 0 u g 干酵母，蛋白 质提取率达8 7 2 4 。贾冬舒1 3 剐利用啤酒废酵母提取分离饲料蛋白质营养源，采用4 种 酶和化学处理等三大类l o 多条工艺路线，得到的蛋白质含量达7 0 6 7 。张晓吲3 9 】利用 外源酶( p 葡聚糖酶1 5 - - - 2 0u g ( 以酵母计) ) 和自溶结合技术提取啤酒酵母蛋白，在自 溶温度5 4 ，p h 6 8 ，自溶时间1 2 h 酵母粗蛋白提取率达到7 6 1 4 ，加盐自溶条件下达 到8 4 5 l 。 还有利用高压脉冲电场处理啤酒酵母细胞，释放蛋白质及分解产物氨基酸。当实验 条件在2 5 、4 0k v c m 电场强度和6 0 个脉冲数时，酵母细胞蛋白质溶出量最大达到7 0 左右，约为未用高压脉冲电场处理的2 倍【4 0 1 。 1 3 2 核糖核酸的提取 目前国内外关于从啤酒酵母中提取r n a 的研究较多，方法各异。有酚法、酶法、 自溶法、氨法、稀碱法、浓盐法、高压均质等【3 2 1 。其中浓盐法和稀碱法广泛应用于工业 化生产。哈尔滨啤酒有限公司，用浓盐法提取啤酒废酵母中的r n a ，向啤酒废酵母中 加酵母体积1 0 0 9 l 的盐，9 5 提取4 h ，干燥所得产品得率可达7 0 ，纯度达9 0 以上 1 4 1 。王晓丽【4 9 】发现利用浓盐法破壁后，再添加4 0 u g 绝干酵母中性蛋白酶降解蛋白质， 制得r n a 粗品得率 7 5 。另外采用高压均质破壁循环两次，盐浓度5 ，9 5 下加热 5 江南大学预堂位论文 强，与离温盐法结合，r n a 净得率最高达6 8 4 朱俊东l 鸵】研究利用高温浓盐和均质 法提取啤酒酵母中核酸，在盐浓度8 ，温度为1 2 1 ，加热时间为3 0 m i n ，r n a 提取 率最高，为5 0 0 3 。高压均质法提取啤酒酵母r n a 的工艺中，以均质压力为7 0 m p a ， 均质次数为3 次时，r n a 的提取率最高达到6 6 7 1 。 1 3 3b 一葡聚糖的提取 从啤酒酵母中提取p 葡聚糖主要是应用热的酸碱处理法、酶法、酶一碱法。李花霞 等【4 3 】将新鲜啤酒废酵母经自溶、酶解( 木瓜蛋白酶，p h 7 0 ，5 5 4 c ) 、超声等工艺最后得 到乳自色成品，其中葡聚糖含量为9 1 9 1 。李祥等刚以熟碱法从啤酒废酵母中提取傍 ( 1 , 3 ) 葡聚糖，最终p 。( 1 ，3 ) 葡聚糖提取率为4 3 1 0 。张开诚f 4 4 j 对酶酸碱法和超声 波法提取碱不溶性葡聚糖嚣种方法进行了耽较，以酶酸碱法制得的碱不溶缝葡聚糖褥 率达15 9 6 ，超声波法制得的碱不溶性葡聚糖得率可达3 0 ，5 0 。 薹。3 。4 海藻耱酌提取 从啤酒废酵母中提取海藻糖，在乙醇浓度为6 0 ( v v ) ，提取温度为8 0 - a ：i 条件 下，海藻糖的提墩率可达9 1 。7 1 ，经活性炭脱色，阴阳离子交换除杂，浓缩、结晶、 干燥等工艺后，制成的海藻糖成品纯度为9 6 8 5 h 5 1 。 1 3 。5 酵母精的提取 目前主要有四种典型的制各方法，包括自溶法、质壁分离法、碱水解法及酶水解法。 其中酶水解法是近年来开发成功的一种新的酵母精生产方式。其主要工艺是利用一些能 生成p 一葡聚糖酶和蛋白酶( 最好还有5 一磷酸二酯酶) 等酶系的菌株，先培养分解菌使 其产酶，然后将培养液加入到已加热灭活的酵母中，利用外加酶分解酵母细胞，采用这 种工艺生产酵母耩，得率可达至i | 9 0 以上。 1 3 6 谷胱瞽肽的提取 利用啤酒废酵母发酵法生产谷胱甘肽，此方法生产谷胱甘肽具有培养基无需灭菌和 设备利用率高的优点【4 6 , 4 7 】。潘飞等1 4 8 】用对羟基苯甲酸酯法提取啤酒废酵母中的谷胱甘 肽，上清液中谷胱甘肽( g s h ) 含量达9 6 7 l i n g 1 0 0 m l ，平均破壁率为6 6 8 。邱雁临 等1 4 9 j 用吸附层析柱法提取谷胱甘肽，废酵母抽提液p h 值7 0 ，以质量分数为3 0 9 l 壳聚 糖醋酸溶液作吸附荆，过( 6 x 6 0 0 m m ) 层析柱，p h 4 4 的磷酸盐缓冲液作洗脱剩，分 离纯化得到还原型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽的平均回收率为7 9 。5 5 。 重。3 7 叶酸的提取 利用透析法从啤酒废酵母中提取叶酸，以p h 7 6 磷酸缓冲溶液做提取剂，可从1 2 9 啤酒废酵母中提取捌8 5 熠时酸。以雄7 。5 磷酸盐缓冲液为提取荆，同样的方法可从1 8 豫 啤酒废酵母提取1 4 m g 叶酸。后者叶酸的提取率提高了9 8 1 5 0 】。 s 二三连重。二辑鞋j 垮酊是取 吴思方等1 5 1 1 以异丙醇做提取剂从啤酒废酵母中提取s o d ，用微量邻苯三酚自氧化 法吲测定s o d 活性。粗酶提取液酶活力回收率达7 3 ，纯化倍数达9 6 倍，s o d 酶比 活达3 0 4 87 u r a g 。 1 4 啤酒酵母细胞的破壁方法 啤酒酵母( s a e c h a r o m y c e sc e r e v i s i a c ) 是种单细胞微生物，细胞呈圆形或卵圆形。 啤酒酵母细胞的细胞壁占细胞质量的2 0 3 0 ，由4 0 左右的葡聚糖、4 0 z 牛右的h 露聚糖、8 的蛋白质、7 的类脂、3 的无机物、2 的己糖胺和壳多糖组成酵母细 胞的细胞壁具有典型的三明精结构外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间夹有蛋白 质分子层5 4 l ( 见图i - i ) 。啤酒酵母细胞膜为活性细胞质膜，具有半渗透性，构成物 质主要为类脂、磷脂、蛋白质、淄醇等。 围i - l 啤酒酵母茵细胞结构示意图 f i gi - 1 c o n f i g u r a t i o ns k e t c hm a po f b r e w e r s y e a s tc e l l 酵母细胞壁由复杂的分枝状聚合物相互交联而成，壁厚很难破除，必须借助外力 才能破坏。目前所报道的关于酵母破壁的方法很多，常用破壁技术的研究也鞍为成熟， 根据破碎细胞的方式不同可分为化学法、生物法及物理方法三种，其中化学破壁方法 有：碱破壁法、盐法破壁、有机溶剂法：生物破壁方法有：酶法破壁、自溶破壁( a u t o l y s i s ) 、 复合酶一自溶破壁法；物理破壁方法种类比较多有：高压匀浆法、微波加热法、纳米对 撞机破碎技术、研磨法、挤压式、超声波法、高压脉冲电场另外还有冻溶法和变温法等。 本论文主要介绍高压脉冲破壁、超声波法破壁和酵母自溶破壁及其中两者桐结合的协同 破壁技术。 1 4 1 高压脉冲电场( p e f ) 破壁原理 高压脉冲电场( h i g h - - v o l t a g ep u l s e d e l e c t r cf i e l d ，简称h p e f 和p e f ) 杀苗技术是 一项处于国际研究热点的非热加工高新技术。通过增加细胞膜通透性，减弱细胞膜强度， 虽终导致细胞膜破坏，膜内细胞物质外流，膜外物质渗入。p e f 适合几乎所有可以流动 的物料的杀菌和加工处理，而且投资相对较少，运行费用较低，特别适台大规模工业化 和连续化生产。 高压脉冲电场多用于杀菌、灭酶等领域。利用其作为破壁细胞的方法进行胞内物质 提取是一个新突破，目前这方面的研究很少，且多限于实验室范围内对活酵母的破壁研 江雨大学硕士学位论义 究，提取工艺不完善。高压脉押黾场j 爻木的机理是已经破厂泛接受明“黾穿孔理诧。 所谓“电穿孔 1 7 5 5 】是指在电场脉冲作用下，在细胞膜脂双层上形成微孔，使细胞膜的 通透性和膜电导率增大，细胞膜电位混乱，造成细胞新陈代谢紊乱，细胞的必需生长组 分泄漏，最后导致细胞死亡【l 引。高压脉冲电场破壁方法具有耗能少、处理时间短、效率 高、不易引起蛋白质和核酸变性的优点。因此成为回收细胞内物质的理想途径。韩玉珠 【柏l 、殷永光f 5 q 等人应用高压脉冲电场处理啤酒酵母细胞，使其释放蛋白质及其分解产物 氨基酸。结果表明：高压脉冲电场可以破壁啤酒酵母细胞并释放其中蛋白质与氨基酸， 且在一定范围内随着处理温度增高、电场强度和脉冲数增加啤酒酵母细胞的蛋白质和氨 基酸溶出量增大。 高压脉冲电场法提取细胞内物质的优势在于：生产成本低廉( 用水做提取介质) ； 预处理简单省时：处理过程中产生的热能少；可连续处理，处理批量大：后处理简单方 便，胞内物质释放的同时不会产生细胞碎片，p e f 处理后通过离心就可以很方便地去除 细胞残余物，处理过程没有任何污染；比起化学提取法和酵母自溶法需要的时间短，又 不会像机械破壁法使细胞结构完全破坏，可以更好地保持蛋白质和酶原有的生物活性， 方便后续的处理【5 。 1 4 2 超声波破壁原理 超声波指频率超过人耳可听见的频率范围的声波，其频率一般在2 0 k h z 以上，是一 种弹性机械震动波。超声波破碎细胞的主要机理是空化效应。空化效应指存在于液体中 的微气核空化泡在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学 过程。空化作用一般包括3 个阶段：空化泡的形成、长大和剧烈的崩溃。当盛满液体的 容器通入超声波后，由于液体振动而产生数以万计的微小气泡，即空化泡。这些气泡在 超声波纵向传播形成的负压区生长，而在正压区迅速闭合，从而在交替正负压强下受到 压缩和拉伸。在气泡被压缩直至崩溃的一瞬间，会产生巨大的瞬时压力，一般可高达几 十兆帕至上百兆槲s s , 5 9 1 ，原理如图1 - 2 。 图l - 2 声压作用示意图 f i g 1 - 2p r o c e s s o ro fu l t r a s o u n d 虽然超声过程中能产生极大的热量，但是由于气泡的溃陷速率很大，这种速率与热 量传递的速率相比要快得多。因此，气泡的溃陷和蒸气的压缩在气泡的体积内几乎是绝 热进行i 拘t 6 0 , 6 1 】。所以超声波作为一种冷处理方法具有很大的市场前景。 近年来，有人利用超声技术破碎酵母细胞提取营养物质。利用此过程中产生高达几 千大气压的冲击波和局部高温，使细胞破碎。同时超声波产生的振动作用加强了细胞内 8 墨二量堑丝 鲍蜃笺翟教，i 尹教聂落囊季，可是蓠绍旎五凌厦亩凌菝兹军盈程。 声波法具有效率高、处理时间短、无化学试剂残留等优点。其理论基础是低频超声 的空化作用导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞膜的通透 性，达到使细胞内物质释放的目的。 1 4 3 自溶破壁 自溶破壁是利用酵母菌本身含有的各种酶( 各种蛋白酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维 素酶等) 的综合作用分解细胞壁。自溶一般分为诱导自溶和自然自溶。采用各种物理、 化学或生物学方法处理引起微生物自溶，称为诱导自溶；非人为因素引起的自溶则为自 然自溶。根据起主要作用的自溶酶类及自溶发生的主要部位的不同，又可将自溶过程分 为外自溶型和内自溶型两种。在酵母自溶过程中导致生物大分子降解的酶类主要是蛋白 酶、核酸酶和葡萄糖酶，在特定条件下这些酶原被激活与相应的底物作用，使细胞内的 生物大分子降解，并在细胞内积累，当生物大分子被水解成能通过细胞壁的小分子时， 水解产物则扩散进入胞外介质。随着自溶作用的进行，水解酶类也发生自身消化，水解 活性随之下降，最后趋于零，此时自溶作用也随之结束。酵母细胞自溶就始于细胞膜， 细胞壁成分基本不水解，自溶最后常剩下细胞外壳【2 1 , 6 3 - 6 7 。 1 5 立题意义及研究内容 1 5 1 论文立题意义 随着近年来啤酒工业的迅速发展，啤酒废酵母的开发利用将成为啤酒工业的一个辅 助新兴行业，对促进我国啤酒工业的健康发展、减少环境污染、增加社会效益和经济效 益及丰富人民群众的生活都有很大的意义。 目前提取分离酵母细胞内蛋白质与核酸的方法主要是化学法、机械破壁法和生物 法。但传统的物理破壁法需要消耗较大能量，且产生的热降低了蛋白质和核酸的生物活 性；化学处理法除后续处理工艺繁琐外，激烈的化学反应还易引起蛋白质和核酸变性， 造成营养成分的浪费：而目前广泛采用的生物破壁法，反应时间长、成本高，不利于工 业化生产。所以有必要建立一条简单、节能、节约成本的提取工艺，使得其既能高效保 证蛋白质与核酸提取率又不影响提取物的生物活性。经研究发现高压脉冲电场破壁技术 接近这样一种理想的破壁提取方法。然而单一的方法很难达到预期的效果，因此本实验 试图利用高压脉冲电场技术与其他方法相结合作用啤酒废酵母细胞，进行细胞内物质提 取。通过调节高压脉冲电场的电场参数使啤酒酵母细胞膜发生不可逆穿透，再结合超声 技术和酵母自溶技术进一步提高目的物的提取率。 此外，本课题还具有重要的理论意义。高压脉冲电场作为种非热杀菌方法在国外 已应用于食品体系的消毒和杀菌【6 3 , 6 8 , 6 9 1 及灭酶【7 0 7 1 1 ，其中高压脉冲电场在食品体系灭菌 领域中的应用已经比较成熟。但在细胞提取领域的研究处于起步阶段。本课题通过高压 脉冲电场辅助提取胞内蛋白质与核酸，可以丰富高压脉冲电场技术对细胞电穿孔现象的 的解释，进一步推动该理论的发展。 9 垩里奎兰婴主堂垡笙苎 1 5 2 诒爻兰要研免试客 本论文主要研究一种有效的破壁技术，该技术能在确保啤酒酵母细胞壁不被破碎的 前提下，提取啤酒酵母细胞内蛋白质与核酸并尽量保证蛋白质与核酸的生物活性。具体 研究内容如下： ( 1 )高压脉冲电场法提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸的工艺及理论研究。 ( 2 )超声波处理法提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸的工艺及理论研究。 ( 3 )自溶提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸的工艺及理论研究。 ( 4 )高压脉冲电场法与超声波法结合提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸的工艺及 理论研究。 ( 5 )高压脉冲电场法与酵母自溶法结合提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸的工艺 研究及理论。 ( 6 )建立一条合理的蛋白质与核酸的生产线。 l o 第二幸而五泳讦黾场及术淀取晖酒厦酵母甲蛋白质与核酸 第二罩高压脉冲电场技术提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸 2 1 前言 啤酒酵母具有坚韧的细胞壁和细胞膜，因此在提取啤酒酵母细胞中蛋白质与核酸之 前首先要对细胞进行破壁处理。本章采用一种新型、便捷的破壁提取方法一高压脉冲 电场法( p e f ) 提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸。在电场的作用下，细胞膜内外跨膜电 势增强，致使细胞壁击穿，细胞膜内物质溶出。该方法成本低，预处理简单，处理瞬时， 产生的热能少，可连续处理大批量的原料，后续处理工艺简单( 处理过程中几乎不产生 细胞碎片，而且没有引入化学试剂) ，样品几乎不受污染。 高压脉冲电场辅助提取啤酒酵母细胞中蛋白质和核酸所需时间比化学法和生物法 短，该方法较温和，可以更好地保证提取物的生物活性【5 7 】。 2 2 材料与设备 2 2 1 实验材料 啤酒废酵母购于无锡狮王太湖水啤酒有限公司。 2 2 2 主要试剂 氢氧化钠 乙醇 氯化钠 硫酸钾 硫酸铜 硼酸 碳酸氢钠 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 高氯酸 钨酸钠 钼酸钠 次氯酸消毒液 2 2 3 仪器与设备 a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 江苏爱福特药业保健品公司 o s u 4 l 实验室规模脉冲处理器美国俄亥俄州立大学 江南大学硕士学位论文 k e ：地茸翌k 型垒毒德哥方。绍 t d s l 0 1 2 型两信道数字实时监控示波器