（发酵工程专业论文）志贺氏菌elisa快速检测技术研究.pdf

志贺氏菌快速检测技术研究 摘要 f m冲志贺氏菌 eli 先溯砚 中 国 生 触 炜 u 品 规爵免疫 家 mr j m 青 ， s a 央衷 或 砌!啦术朴 平 丸 首 ， 然局面士 吸 收试验、 饱不 喻 醚仓 定 、 离 子 交 换层 析、 标记 坑 体 、 最局断i l a靶以 、 灵 敏 性 实 验 和 稳 定 性实 验。 结 果 表明 ， 通业断饰罐如晰嵌卜离子 交 阴 昙 沂丹标 i e n亢 体 可 以 桂 廊 1 一 定 范 围内 的 细 菌。 本 实 验生 产 ;的 讨 济 !盒灵 敏 度 为1 扩 泞 / m 1 ， 特 异 性 为9 5 %敏感 性 残奇 鳍 拓 面 丈 e l i s a 质 剑蛛哦疗i c v ( c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n ) 为 2 .5 % , 小 于1 5 % 志贺氏菌 f l i s a赫咱湘难刻俊划请快 速、 7 自 涌 、 灵 敏、 可 靠 、 生内 成 材邸淤狱点o 妙卜 ， 在 本 研 l t mg 上 ， 还可 以 进 弓钟 大 实 验， 寻 找勤子 的、 更 有 效 的兔空刹斟吩离 纯 化 的 方 法， 为 训 济 临r以叫性沪漠 定蜘 出 。 关键词:志贺氏菌e l i s a醛联免疫吸附试验 快速检测 分离 纯化 t h e s t u d y o n e l i s a me t h o d f o rd e t e c t i o n o f s h i g e l l a ab s t r a c t t h i s r e s e a r c h w a s m a i n l y a b o u t e l i s a f as t d e t e c t i o n t e c h n i q u e f o r t h e s h i g e l l a in r a w m i l k , i n t h i s p a p e r ， v a r i e t i e s o f a n t i s e n n n s u s e d i n t h e w h o l e e x p e r i m e n t h a d b e e n g o tt e n fr o m t h e i mm u n i z e d r a b b i t s ， a c c o r d i n g t o c h i n e s e b io l o g i c a l r u l e s . a n t i s e r u m w as s e p a r a t e d a n d p u r i f i e d妙 t h e a b s o r b i n g e x p e r i m e n t , a m m o n i u m s u l f a t e p re c i p i t a t i o n , i o n c h r o m a t o g r a p h , m a k e a n t i b o d y . l as t l y , w e a s s a y e d t h e a n t ib o d y b y s e n s i t i v e n e s s e x p e r i m e n t , s e n s i t i v i ty e x p e r i m e n t a n d s t a b i l i ty e x p e r i m e n t . t h e f o l l o w i n g s w e r e t h e r e s u l t s : f i r s t l y , t h e a n t i b o d y w as p u r i f i e d b y t h e a b s o r b in g e x p e r im e n t , a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n , i o n c h r o m a t o g r a p h . a ft e r t h a t ,t h e b a c t e r i a i n a c e r t a i n l i m it c o u l d b e c h e c k e d o u t . t h e s e n s i t iv ity o f t h e k it w as 1 ora l, p e c u li a r w as 9 5 % , s e n s it iv e n e s s w a s 9 0 % . t h e k i t h a d p as s e d e l i s a q u a l i t y c o n t ro l p r o c e d u r e . t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n w as 2 . 5 %, s m a l l e r t h a n l 5 %.t h e r e aso n i s th a t e l i s a t e c h n o l o g y h a v e m o r e a d v a n t a g e s u c h as f as t e r ， m o r e a c c u r a t e， m o r e s e n s it i v e , m o r e r e l i a b l e， c h e a p e r p r o d u c t i o n c o s t t h a n r e l a t i v e o t h e r t e c h n o l o g y . o n t h e b a s e o f t h e s e w o r k s , m o r e r e s e a r c h o n s h i g e l l a c a n b e c a r r i e d o u t i n f u t u re . mo r e e ff i c i e n t m e t h o d s t o i m m u n i z e r a b b i t s , s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n me t h o d s a r e a l s o b e i n g t r i e d s o t h a t a m e t h o d w h i c h s u i t s f o r l a r g e - s c a l e p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t b o x c a n b e e s t a b l i s h e d a t l a s t k e y w o r d s : s h i g e l l a e l i s a e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f as t me as u r e s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n me t h o d s 天津商学院硕士研究生毕业论文 前 言 第一章前言 1 . 1引言 1 9 9 8 年我国政府开始提倡中学生” 每日一杯牛奶” 的生活习惯之后， 我国奶制 品的销售盘就一路飘升不止。 与此同时， 我国政府己 经宜布将奶制品产业列为未 来十年中， 中国农业的优先发展产业之一。 从1 9 8 0 年到 2 0 0 0 年， 我国奶类总产量 增长了 7 .7 倍， 年平均递增率为1 1 .6 %. 2 0 0 0 年我国鲜奶产量1 0 8 2 万吨， 比前一年 增长3 4 %。 但目 前中国牛奶生产总量和人均消费量，却远远低于发达国家。 ， 近年国内奶业的高成长性和巨大的市场需求， 一时掩盖奶业企业规模小、 技术落 后、 生产效率低下的现实。 为改变现状， 近年国家调整了 农业产业政策， 牛奶产 业被列为国家重点扶持项目， 1 6 家乳品企业被列为国家农业产业化龙头企业。 由 九部委局联手推动的” 国家学生饮用奶计划” 开始实施， 极大地刺激了奶业市场的 发展。 但是能够达到现代标准的农场在国内只是凤毛麟角， 中国奶源存在多处硬 伤， 国家标准过低、 检测不严、 奶源不足、 分布不均等现象正在制约中国奶业的 健康发展。 现在中国奶源模式多为“ 公司+ 农户” ， 8 0 %以 上的奶牛由 农民 饲养， 规模 小、生产水平低、卫生设备不足，大多数牛奶达不到一级标准，细菌总数普遍 过高。中国畜产品加工研究会名誉会长、东北农业大学博士生导师骆承库说: 目 前农户饲养的奶牛占 全国奶牛总存栏数的8 0 %， 仍处在缺技术、 分散、小规 模、手工挤奶的生产状态。奶源二次污染，主要来自 手工挤奶方式。一是卫生 条件差。 如果奶头清洗不净， 容器等卫生条件又欠佳，就会使原料奶直接受到 污染。二是没有冷藏设备，牛奶由手挤到小桶，再由小桶到大桶，大桶到奶车， 期间多个环节使原料奶直接暴露在空气中， 在常温下存放时间较长， 从而使微 生物大最繁殖，造成奶源品质在第一时间内己 变差、变坏。 与中国 相类似的澳大利亚， 据澳大利亚墨尔本大学孟尼. 艾尔博士说， 在 澳大利亚，奶源的模式虽也是“ 公司+农户， ， 但对原奶控制非常严格。首先奶 牛必须获得健康标识，同时饲养者必须对饲料是否含有化学物质和转基因物质 作出声明。 在收购上，8 0 %的牧场主在收购站3 0 公里以内， 确保3 , 5 小时内将 牛奶送到收购站，降至4 摄氏度保存。此外，对收取的每一批牛奶都要采取快 速的细菌总数测定法进行抽样检测。 如果奶农每1 0 天有一次被检牛奶细菌含量 天津商学院硕士研究生毕业论文 前 言 第一章前言 1 . 1引言 1 9 9 8 年我国政府开始提倡中学生” 每日一杯牛奶” 的生活习惯之后， 我国奶制 品的销售盘就一路飘升不止。 与此同时， 我国政府己 经宜布将奶制品产业列为未 来十年中， 中国农业的优先发展产业之一。 从1 9 8 0 年到 2 0 0 0 年， 我国奶类总产量 增长了 7 .7 倍， 年平均递增率为1 1 .6 %. 2 0 0 0 年我国鲜奶产量1 0 8 2 万吨， 比前一年 增长3 4 %。 但目 前中国牛奶生产总量和人均消费量，却远远低于发达国家。 ， 近年国内奶业的高成长性和巨大的市场需求， 一时掩盖奶业企业规模小、 技术落 后、 生产效率低下的现实。 为改变现状， 近年国家调整了 农业产业政策， 牛奶产 业被列为国家重点扶持项目， 1 6 家乳品企业被列为国家农业产业化龙头企业。 由 九部委局联手推动的” 国家学生饮用奶计划” 开始实施， 极大地刺激了奶业市场的 发展。 但是能够达到现代标准的农场在国内只是凤毛麟角， 中国奶源存在多处硬 伤， 国家标准过低、 检测不严、 奶源不足、 分布不均等现象正在制约中国奶业的 健康发展。 现在中国奶源模式多为“ 公司+ 农户” ， 8 0 %以 上的奶牛由 农民 饲养， 规模 小、生产水平低、卫生设备不足，大多数牛奶达不到一级标准，细菌总数普遍 过高。中国畜产品加工研究会名誉会长、东北农业大学博士生导师骆承库说: 目 前农户饲养的奶牛占 全国奶牛总存栏数的8 0 %， 仍处在缺技术、 分散、小规 模、手工挤奶的生产状态。奶源二次污染，主要来自 手工挤奶方式。一是卫生 条件差。 如果奶头清洗不净， 容器等卫生条件又欠佳，就会使原料奶直接受到 污染。二是没有冷藏设备，牛奶由手挤到小桶，再由小桶到大桶，大桶到奶车， 期间多个环节使原料奶直接暴露在空气中， 在常温下存放时间较长， 从而使微 生物大最繁殖，造成奶源品质在第一时间内己 变差、变坏。 与中国 相类似的澳大利亚， 据澳大利亚墨尔本大学孟尼. 艾尔博士说， 在 澳大利亚，奶源的模式虽也是“ 公司+农户， ， 但对原奶控制非常严格。首先奶 牛必须获得健康标识，同时饲养者必须对饲料是否含有化学物质和转基因物质 作出声明。 在收购上，8 0 %的牧场主在收购站3 0 公里以内， 确保3 , 5 小时内将 牛奶送到收购站，降至4 摄氏度保存。此外，对收取的每一批牛奶都要采取快 速的细菌总数测定法进行抽样检测。 如果奶农每1 0 天有一次被检牛奶细菌含量 天津商学院硕士研究生毕业论文前言 过高， 就会受到处罚; 如果一年内处罚超过1 2 次， 奶农将被停止再向工厂供应 牛奶。 很显然在短时间内 我国还很难出 现美国 那种几万头奶牛的农场， 目 前在国内 这种 “ 公司+ 农户”的运作模式还将长期存在。 所以加强对原料奶的检测显的尤 为重要。 虽然在自 然食品中一般不带或很少带志贺氏 菌， 但是由于志贺氏菌的感染可 引起痢疾，且志贺氏菌引起感染所需的菌数量极低，有时1 0 个菌即可引起感染。 目 前从食品中检出志贺氏菌多采用培养法， 由于费时较多( 3 -5 天) ， 不适应食品 卫生监测和检验工作需要，因此研究一个既快速又灵敏的检验方法很有必要。 1 . 2 志贺氏 菌的简 介 1 . 2 . 1 志贺氏菌的生物学形态 志贺氏 菌属( s h i g e l l a )的细菌( 通称痢疾杆菌) ， 是细菌性痢疾的病原菌。 临床上能引起痢疾症状的病原生物很多， 有志贺氏菌、 沙门氏菌、 变形杆菌、 大 肠杆菌等， 还有阿米巴原虫、 鞭毛虫、以 及病毒等均可引起人类痢疾， 其中以 志 贺氏菌引 起的细菌性痢疾最为常见。 人类对痢疾杆菌有很高的易感性。 在幼儿可 引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 志贺氏 菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别， 为革兰氏阴性杆菌， 长 约 2 - 3 u m， 宽0 . 5 - 0 . 7 u m 。不形成芽胞，无英膜.无鞭毛，有菌毛。 d n a的g + c 为4 9 - 5 3 克分子%( t m 法) c rz 7需氧或兼性厌氧; 营养要求不高， 能在普通培养基 上生长， 最适温度为3 7 1c ,最适p h 为6 . 4 - 7 . 8 . 3 7 培养 1 8 - 2 4 小时后菌落呈 圆形、 微凸、 光滑湿润、 无色、 半透明、 边缘整齐， 直径约2 n m， 宋内氏 菌菌落 一般较大， 较不透明， 并常出 现扁平的粗糙型菌落。 在液体培养荃中呈均匀浑浊 生 长， 无菌 膜形 成 (3 1福氏 志 贺氏 菌 菌 落中 等大 小， 圆 形 灰 色， 稍凸 起， 不 溶血 a 1 本菌属都能分解荀萄糖产酸不产气， 大多不分解乳糖， 无动力。 仅宋内氏 菌迟 缓发酵乳糖。氧化酶、蔗糖、肌醉、卫矛醉、鼠李糖、本胶糖、腺酶、v 一 p 试 验、 构椽酸盐、苯丙氨酸脱氨酶、 赖氨酸脱按酶、鸟氨酸脱狡酶、精氨酸、明胶 均为阴 性;硝酸盐 还原 ， 甲 基红、 甘 露醉、 靛 基 质 均为 阳 性5 ) 1 . 2 . 2 志贺氏 菌的分类 天津商学院硕士研究生毕业论文前言 过高， 就会受到处罚; 如果一年内处罚超过1 2 次， 奶农将被停止再向工厂供应 牛奶。 很显然在短时间内 我国还很难出 现美国 那种几万头奶牛的农场， 目 前在国内 这种 “ 公司+ 农户”的运作模式还将长期存在。 所以加强对原料奶的检测显的尤 为重要。 虽然在自 然食品中一般不带或很少带志贺氏 菌， 但是由于志贺氏菌的感染可 引起痢疾，且志贺氏菌引起感染所需的菌数量极低，有时1 0 个菌即可引起感染。 目 前从食品中检出志贺氏菌多采用培养法， 由于费时较多( 3 -5 天) ， 不适应食品 卫生监测和检验工作需要，因此研究一个既快速又灵敏的检验方法很有必要。 1 . 2 志贺氏 菌的简 介 1 . 2 . 1 志贺氏菌的生物学形态 志贺氏 菌属( s h i g e l l a )的细菌( 通称痢疾杆菌) ， 是细菌性痢疾的病原菌。 临床上能引起痢疾症状的病原生物很多， 有志贺氏菌、 沙门氏菌、 变形杆菌、 大 肠杆菌等， 还有阿米巴原虫、 鞭毛虫、以 及病毒等均可引起人类痢疾， 其中以 志 贺氏菌引 起的细菌性痢疾最为常见。 人类对痢疾杆菌有很高的易感性。 在幼儿可 引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 志贺氏 菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别， 为革兰氏阴性杆菌， 长 约 2 - 3 u m， 宽0 . 5 - 0 . 7 u m 。不形成芽胞，无英膜.无鞭毛，有菌毛。 d n a的g + c 为4 9 - 5 3 克分子%( t m 法) c rz 7需氧或兼性厌氧; 营养要求不高， 能在普通培养基 上生长， 最适温度为3 7 1c ,最适p h 为6 . 4 - 7 . 8 . 3 7 培养 1 8 - 2 4 小时后菌落呈 圆形、 微凸、 光滑湿润、 无色、 半透明、 边缘整齐， 直径约2 n m， 宋内氏 菌菌落 一般较大， 较不透明， 并常出 现扁平的粗糙型菌落。 在液体培养荃中呈均匀浑浊 生 长， 无菌 膜形 成 (3 1福氏 志 贺氏 菌 菌 落中 等大 小， 圆 形 灰 色， 稍凸 起， 不 溶血 a 1 本菌属都能分解荀萄糖产酸不产气， 大多不分解乳糖， 无动力。 仅宋内氏 菌迟 缓发酵乳糖。氧化酶、蔗糖、肌醉、卫矛醉、鼠李糖、本胶糖、腺酶、v 一 p 试 验、 构椽酸盐、苯丙氨酸脱氨酶、 赖氨酸脱按酶、鸟氨酸脱狡酶、精氨酸、明胶 均为阴 性;硝酸盐 还原 ， 甲 基红、 甘 露醉、 靛 基 质 均为 阳 性5 ) 1 . 2 . 2 志贺氏 菌的分类 夭津商学院硕士研究生毕业论文前言 志贺氏菌属的细菌对甘露醉分 解能力不同，可分为二大组。 a 、不分解甘露醉组:主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分 靛基质阳性 ( 1 , 3 , 4 , 5 , 6 , 9 , 1 0 型)和靛基质阴性 ( 2 , 7 , 8 型) 的志贺氏 痢疾菌。 b 、分解甘露醇组:包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为 迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏 和鲍氏菌。 后者进一步再根据靛基质 产生与否， 分靛基质阳性 ( 福氏菌1 , 2 . 3 , 4 , 5 型和鲍氏菌5 , 7 , 9 , 1 1 , 1 3 , 1 5 型)和靛基质阴性 ( 福氏菌6 型和鲍氏 菌 1 , 2 , 3 , 4 , 6 , 8 , 1 0 , 1 2 , 1 4 ) 二类，( 见表1 - 1 ) 表1 - 1 志贺氏菌属生化反应的分类 f o r m l 一 1 b i o c h e m i c a l r e a c t i o n c l a s s i f y o f s h i g e l l a 表一 志贺氏 菌属生化反应的分类 伯萄糖 ( + ) 甘露醉 ( 一 )甘露醉 ( + ) 志贺氏菌志贺氏菌 ( 1 . 3 , 4 . 5 . 6 . 9 . 1 0 型) ( 2 .? 、8 型) 乳枪 ( 一 ) 靛基质 ( - ) 靛墓质 ( +) 乳糖 ( + ) 靛荃质 ( 一 ) 福氏 菌6 型福氏 菌 ( 1 . 2 , 鲍氏 菌 ( 1 . 2 , 3 , 4 . 5 型) 3 .弓 、6 、8鲍氏菌 1 0 . 1 2 , 1 4 型)1 1 . 宋内氏菌 g 、 型) 1 .2 .3 抗原构造与分型 志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原 ( 0 ) 及表面抗原 ( k ) 组成。主要抗 原有三种. 型特异性抗原: 型多搪抗原为菌体抗原的一种， 是光滑型菌株所含有的重要 抗原.当 菌株变为粗糙型时， 此抗原也常随之消失。各菌型所含的型抗原不同， 可用于区别菌种的型别。 天津商学院硕士研究生毕业论文 前言 群特异性抗原: 为光滑型菌株的次要抗原， 也是菌体抗原的一种。 特异性较 低，常在数种近似的菌内出现。 在福氏菌株中，由于所含群抗原不同， 可将某些 菌型分为多种亚型， 如福氏菌2 型， 根据群抗原不同， 可分成2 a , 2 6 两个亚型。 表面抗原 ( k 抗原) :在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原.不耐热， 加热1 0 0 0c 1 小时即被破坏。具有此种抗原的菌株， 可阻止菌体抗原与相应免疫 血清发生凝集【。 ， 。 根据抗原构造的不同， 按最新国际分类法， 将本属细菌分为四 个群、 4 3 个血清型 ( 包括亚型)17 ) ( 见表1 - 2 ) 0 表 1 一 2志贺氏菌属抗原血清学分类 f o r m l - 2 t h e s e r o l o g i c a l c l a s s i f y o f s h i g e l l a 菌 名血 清 分 类 # 厂 - - - rji i 亚 型 志贺氏菌 ia 1 1 2 口 下 呵习 一甘 贾 一 一是 哪 赞 一 !-一 福 氏 菌 一-一一一一r 一 、 !1 9)l a 一 ， 变 种 4 ; 一 一 一 1!训|创 2 6 , 3 , 6 , x , y 2a.尔 鲍 氏 菌! c 1 1 8 宋内氏菌 厂份- 一 一 - . 一 匡 a 群:也称志贺氏菌群， 有1 2 个血清型。 不发酵甘露醉， 无鸟氨酸脱狡酶， 与其他各群细菌无血清学联系。 b 群:也称福氏菌群，已有 1 1 个血清型 ( 包括亚型和变种) 。最近又发现3 个亚型 ( l c , 4 c , 5 b ) ， ， 。 发酵甘露醇， 无鸟氮酸脱狡酶。 抗原结构较复杂， 各 型间有非特异性凝集凝集。 每一福氏菌型具有二种抗原， 即型特异性抗原和群抗 原， 前者只存在于同型菌株中， 后者有许多种， 存在于福氏各菌型中。 例如福氏 1 6 型除含有1 型特异性抗原外，尚含有4 , 6 群抗原。 c群: 也称鲍氏 菌群， 有 1 8个血清型，分解甘露醉，无鸟氨酸脱梭酶。各 型内无非特异性凝集凝集。 。 群:椒稼宋内氏菌群.仅有一个血清型。分解甘露醉，有鸟氨酸脱狡酶， 天津商学院硕士 研究生毕业论文 前言 致贺氏菌属在外界环境中的生存力， 以宋内氏最强， 福氏菌次之， 志贺氏菌 最弱。一般在潮湿土壤中能存活 3 4天，3 7 水中存活 2 0天，在冰块中可存活 9 6 天， 在粪便内( 室温) 存活1 1 天。日 光直接照射3 0 分钟， 5 6 - 6 0 0c 1 0 分即被 杀死， 对高温和化学消毒剂很敏感， 1 % 石炭酸中1 5 - 3 0 分钟即被杀死， 对氯霉素、 磺胺类、 链霉素敏感， 但近年来国内外研究表明其耐药性日 趋严重。自 从广泛使 用抗菌素以来， 志贺氏菌的耐药菌株不断增加， 给防治工作带来许多困难。 国内 部分地区报道 ( 1 9 7 2 - 1 9 7 4 ) ，志贺氏菌对四环素的耐药率达 7 4 % ,氯霉素 7 3 . 6 - 9 7 % , 链霉素8 4 - 9 8 % 、 合霉素7 5 - 1 0 0 % , 磺胺类9 7 - 1 0 0 % ， 可见国内 对常用 几种抗菌素的耐药率相当高。无论是在革兰氏阳性菌还是在革兰氏阴性菌中 ， 都 广泛存在着染色体外的遗传物质质粒。在病原微生物和环境微生物中， 这 些野生型质粒所携带的遗传物质对其生理过程是非常重要的， 常常是区别于其它 微生 物的 典型特征， 因 此 质粒成为 我们对微生 物研究的 重要内 容 2 0 0 0 年徐 平 等人的研究表明，志贺氏菌的侵袭力是由 质粒控制的，与其外膜蛋白v m a 有关。 ， ， 随后， 钟跃星研究志贺氏 菌的耐药性时发现， 当 将菌株中的质粒消除之后， 菌 株的 耐药谱显著减少， 而质粒未消除者其耐药性没有明显变化 1 2 1 。由 此可见耐 药性产生是与染色体基因突变和 r质粒 ( 亦称 r因子)在同属种间、异属种间 不断相互传递有关。 r质粒为质粒之一种。 是染色体外遗物质， 由双股环状d n a 分子组成， 能自 我自 复制， 携带某些遗传信息， 若与细菌染色体整合在一起， 则 与染色体同步复制。 r质粒在细菌细胞间的传递，主要是通过接合、 转导、 转化 三个途径， 其中接合传递为其重要方式。 r质粒使细菌产生特异酶， 可使抗菌药 物失效，当微量诱导物 ( 少量抗菌药物) 存在时即可产生大量特异酶， 增加细菌 耐药性， 为此， 临床应用抗生素必须足量， 切忌少童或局部使用抗菌药物， 以防 耐 药 菌 株 产 生 网 。 1 . 3 志贺氏 菌检测研究现状 1 .3 . 1 生化法检测志贺氏菌: ( a ) . 常规培养方法: 检查麦康凯琼脂平板， 志贺氏菌的菌落为浅粉红色， 半透明， 将此可疑菌落 接种于下列培养基中:葡萄糖肉汤， t s i 琼脂斜面， 赖氨酸脱梭酶肉汤，动力试 验琼脂和胰陈。置3 5 培养4 8 h ， 但应在2 0 h 进行检查，弃去所有有动力、产 天津商学院硕士 研究生毕业论文 前言 致贺氏菌属在外界环境中的生存力， 以宋内氏最强， 福氏菌次之， 志贺氏菌 最弱。一般在潮湿土壤中能存活 3 4天，3 7 水中存活 2 0天，在冰块中可存活 9 6 天， 在粪便内( 室温) 存活1 1 天。日 光直接照射3 0 分钟， 5 6 - 6 0 0c 1 0 分即被 杀死， 对高温和化学消毒剂很敏感， 1 % 石炭酸中1 5 - 3 0 分钟即被杀死， 对氯霉素、 磺胺类、 链霉素敏感， 但近年来国内外研究表明其耐药性日 趋严重。自 从广泛使 用抗菌素以来， 志贺氏菌的耐药菌株不断增加， 给防治工作带来许多困难。 国内 部分地区报道 ( 1 9 7 2 - 1 9 7 4 ) ，志贺氏菌对四环素的耐药率达 7 4 % ,氯霉素 7 3 . 6 - 9 7 % , 链霉素8 4 - 9 8 % 、 合霉素7 5 - 1 0 0 % , 磺胺类9 7 - 1 0 0 % ， 可见国内 对常用 几种抗菌素的耐药率相当高。无论是在革兰氏阳性菌还是在革兰氏阴性菌中 ， 都 广泛存在着染色体外的遗传物质质粒。在病原微生物和环境微生物中， 这 些野生型质粒所携带的遗传物质对其生理过程是非常重要的， 常常是区别于其它 微生 物的 典型特征， 因 此 质粒成为 我们对微生 物研究的 重要内 容 2 0 0 0 年徐 平 等人的研究表明，志贺氏菌的侵袭力是由 质粒控制的，与其外膜蛋白v m a 有关。 ， ， 随后， 钟跃星研究志贺氏 菌的耐药性时发现， 当 将菌株中的质粒消除之后， 菌 株的 耐药谱显著减少， 而质粒未消除者其耐药性没有明显变化 1 2 1 。由 此可见耐 药性产生是与染色体基因突变和 r质粒 ( 亦称 r因子)在同属种间、异属种间 不断相互传递有关。 r质粒为质粒之一种。 是染色体外遗物质， 由双股环状d n a 分子组成， 能自 我自 复制， 携带某些遗传信息， 若与细菌染色体整合在一起， 则 与染色体同步复制。 r质粒在细菌细胞间的传递，主要是通过接合、 转导、 转化 三个途径， 其中接合传递为其重要方式。 r质粒使细菌产生特异酶， 可使抗菌药 物失效，当微量诱导物 ( 少量抗菌药物) 存在时即可产生大量特异酶， 增加细菌 耐药性， 为此， 临床应用抗生素必须足量， 切忌少童或局部使用抗菌药物， 以防 耐 药 菌 株 产 生 网 。 1 . 3 志贺氏 菌检测研究现状 1 .3 . 1 生化法检测志贺氏菌: ( a ) . 常规培养方法: 检查麦康凯琼脂平板， 志贺氏菌的菌落为浅粉红色， 半透明， 将此可疑菌落 接种于下列培养基中:葡萄糖肉汤， t s i 琼脂斜面， 赖氨酸脱梭酶肉汤，动力试 验琼脂和胰陈。置3 5 培养4 8 h ， 但应在2 0 h 进行检查，弃去所有有动力、产 天津商学院硕士 研究生毕业论文 前言 致贺氏菌属在外界环境中的生存力， 以宋内氏最强， 福氏菌次之， 志贺氏菌 最弱。一般在潮湿土壤中能存活 3 4天，3 7 水中存活 2 0天，在冰块中可存活 9 6 天， 在粪便内( 室温) 存活1 1 天。日 光直接照射3 0 分钟， 5 6 - 6 0 0c 1 0 分即被 杀死， 对高温和化学消毒剂很敏感， 1 % 石炭酸中1 5 - 3 0 分钟即被杀死， 对氯霉素、 磺胺类、 链霉素敏感， 但近年来国内外研究表明其耐药性日 趋严重。自 从广泛使 用抗菌素以来， 志贺氏菌的耐药菌株不断增加， 给防治工作带来许多困难。 国内 部分地区报道 ( 1 9 7 2 - 1 9 7 4 ) ，志贺氏菌对四环素的耐药率达 7 4 % ,氯霉素 7 3 . 6 - 9 7 % , 链霉素8 4 - 9 8 % 、 合霉素7 5 - 1 0 0 % , 磺胺类9 7 - 1 0 0 % ， 可见国内 对常用 几种抗菌素的耐药率相当高。无论是在革兰氏阳性菌还是在革兰氏阴性菌中 ， 都 广泛存在着染色体外的遗传物质质粒。在病原微生物和环境微生物中， 这 些野生型质粒所携带的遗传物质对其生理过程是非常重要的， 常常是区别于其它 微生 物的 典型特征， 因 此 质粒成为 我们对微生 物研究的 重要内 容 2 0 0 0 年徐 平 等人的研究表明，志贺氏菌的侵袭力是由 质粒控制的，与其外膜蛋白v m a 有关。 ， ， 随后， 钟跃星研究志贺氏 菌的耐药性时发现， 当 将菌株中的质粒消除之后， 菌 株的 耐药谱显著减少， 而质粒未消除者其耐药性没有明显变化 1 2 1 。由 此可见耐 药性产生是与染色体基因突变和 r质粒 ( 亦称 r因子)在同属种间、异属种间 不断相互传递有关。 r质粒为质粒之一种。 是染色体外遗物质， 由双股环状d n a 分子组成， 能自 我自 复制， 携带某些遗传信息， 若与细菌染色体整合在一起， 则 与染色体同步复制。 r质粒在细菌细胞间的传递，主要是通过接合、 转导、 转化 三个途径， 其中接合传递为其重要方式。 r质粒使细菌产生特异酶， 可使抗菌药 物失效，当微量诱导物 ( 少量抗菌药物) 存在时即可产生大量特异酶， 增加细菌 耐药性， 为此， 临床应用抗生素必须足量， 切忌少童或局部使用抗菌药物， 以防 耐 药 菌 株 产 生 网 。 1 . 3 志贺氏 菌检测研究现状 1 .3 . 1 生化法检测志贺氏菌: ( a ) . 常规培养方法: 检查麦康凯琼脂平板， 志贺氏菌的菌落为浅粉红色， 半透明， 将此可疑菌落 接种于下列培养基中:葡萄糖肉汤， t s i 琼脂斜面， 赖氨酸脱梭酶肉汤，动力试 验琼脂和胰陈。置3 5 培养4 8 h ， 但应在2 0 h 进行检查，弃去所有有动力、产 天津商学院硕士 研究生毕业论文前言 h z s 、 产气、 赖氨酸脱狡以 及发酵蔗糖与乳糖的培养物。 关于产生叫噪者， 应弃 去其4 4 增菌物中的阳性培养物。至于4 2 增菌培养中的所有可疑培养物皆 有 可能是阳性或是阴性，因此皆应予保留 ( b )生理学性状: 将初筛反应良好的培养物再接种其他生化试验， 志贺氏菌的特性概述如下分 离:h z s 、尿素酶、葡萄糖、 ( 产气)运动、赖氨酸、脱梭酶、 蔗糖、 侧金盏花 醉、 乳糖 ( 2日)、k c n 、丙二酸盐、 柠檬酸盐、与水杨素皆为阴性:甲基红为 阳性。用抗血清鉴定其血清型或参照表二所列3 2 个血清型的生物学特性进行试 验。其粘液酸盐 ( m u c a t e )和乙酸盐 ( a c e t a t e )的反应是会有所帮助的。在这 些反应中 志贺氏菌一般为阴性， 而不产气的大肠杆菌一般至少在此反 应中的一项 为阳性。 ( c )血清学性状: 将牛肉 浸汁琼脂斜面的2 4 h 培养物混悬于3 m l 0 . 8 5 % 生理盐 水中， 使其浓度相 当于 标准比 浊管第5 号， 在洁净的玻璃平皿上用蜡笔标记9 个3 x l c m 的方块. 按 照以下方案滴加混悬液，抗血清与生理盐水。 表1 - 3 志贺氏 菌血清学鉴定 方块混悬液多价血清生理盐水 a a l b c c l c 2 d a - d 1+ 宙 9马da孟二d6， + 8 . 9 . 夭津商学院硕士研究生毕业论文前言 用接种针搅匀每个方块中的内容物. 注意不要使方块之间互相混乱。 动摇平 皿3 - 4 m i n 以 促进其凝集作用。 并按以 下记取其凝集反应的程度: 0 = 无凝集反应， 1 十 =勉强可察觉的凝集反应，2 + =呈5 0 9 6 清澈的凝集反应，3 + =呈7 5 9 6 清澈的凝 集反应， 4 + = 有可见的絮片状的凝集反应， 混悬液完全清楚清澈透明。 再以 呈现 明显阳性 ( 2 十 、 3 + , 4 + ) 的多价血清所属的单价血清重新检查其混悬液， 如呈阴 性反应， 则将混悬液置蒸锅中加热3 0 m i n 以水解能起干扰作用的英膜抗原。 此时 如与多价血清反应呈阳性， 则再以单价血清检查。 由于这些系推测的血清型， 故 所有可能与所用血清呈阴性反应 闭 。 ( d ) . 另外还有一种方法就是将标本分别接种在沙门氏菌属志贺氏菌属琼脂 ( s s ) , h e rt o e n 肠道菌琼脂( he ) 和伊 红美 兰琼脂( e mb ) 培养基平板上， 3 6 过 夜 培养， 挑出 可 疑菌 落， 分 别转 种克氏 双 搪 ， 取 可 疑 菌 落 做血 清学 鉴定 s 。 1 . 3 . 2 s p a ( s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n a ) 法 s p a 是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分， 它具有同人和多种哺 乳动物工 r g 分子f 。 段结合的能力。 f r o n v a l l 首先将协同凝集反应用于肺炎球菌 的分型。依据结合到s p a 上的志贺氏菌抗体与志贺氏菌产生特异性的凝集反应， 产生可见的凝集颗粒， 从而用于志贺氏菌的 快速检测， 以 满足食品卫生监测和检 验工作的需要， s p a 法测定食品中志贺氏菌的方法: 称取检样，加入g n 增菌液， 3 7 培养 1 8 -2 4 h . 取增菌液滴在载玻片上， 加入s p a 诊断试剂， 混匀后， 轻轻摇动玻璃片， 同时取增菌液2 m l , 煮沸， 加入s p a 诊断试剂， 3 m i n 内 观察凝集反应。 如果呈现凝 集， 则分别与a , b , c , d 群各多价血清做凝集试验，出现凝集反应的再与相应的 单价血清做凝集试验，作出诊断。 s p a 法与常规法比 较， 其检出率无明显差异。当大肠菌群菌量绝对高于志贺 氏菌菌量时， 用s p a 法仍可检出， 而对传统常规法的影响较大， 说明 s p a 法灵敏性 较高。 与传统方法相同， s p a 法也需要将样品 用g n 增菌液增菌， 否则检出率较低。 s p a 法可在2 4 -4 8 h 内出具检测结果， 且检出率高， 可作为一种快速灵敏的检验方 法“ ， 。 1 .3 .3 聚合酶技术 ( p c r )的原理及其发展 ( a ) .p c r技术原理 夭津商学院硕士研究生毕业论文前言 用接种针搅匀每个方块中的内容物. 注意不要使方块之间互相混乱。 动摇平 皿3 - 4 m i n 以 促进其凝集作用。 并按以 下记取其凝集反应的程度: 0 = 无凝集反应， 1 十 =勉强可察觉的凝集反应，2 + =呈5 0 9 6 清澈的凝集反应，3 + =呈7 5 9 6 清澈的凝 集反应， 4 + = 有可见的絮片状的凝集反应， 混悬液完全清楚清澈透明。 再以 呈现 明显阳性 ( 2 十 、 3 + , 4 + ) 的多价血清所属的单价血清重新检查其混悬液， 如呈阴 性反应， 则将混悬液置蒸锅中加热3 0 m i n 以水解能起干扰作用的英膜抗原。 此时 如与多价血清反应呈阳性， 则再以单价血清检查。 由于这些系推测的血清型， 故 所有可能与所用血清呈阴性反应 闭 。 ( d ) . 另外还有一种方法就是将标本分别接种在沙门氏菌属志贺氏菌属琼脂 ( s s ) , h e rt o e n 肠道菌琼脂( he ) 和伊 红美 兰琼脂( e mb ) 培养基平板上， 3 6 过 夜 培养， 挑出 可 疑菌 落， 分 别转 种克氏 双 搪 ， 取 可 疑 菌 落 做血 清学 鉴定 s 。 1 . 3 . 2 s p a ( s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n a ) 法 s p a 是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分， 它具有同人和多种哺 乳动物工 r g 分子f 。 段结合的能力。 f r o n v a l l 首先将协同凝集反应用于肺炎球菌 的分型。依据结合到s p a 上的志贺氏菌抗体与志贺氏菌产生特异性的凝集反应， 产生可见的凝集颗粒， 从而用于志贺氏菌的 快速检测， 以 满足食品卫生监测和检 验工作的需要， s p a 法测定食品中志贺氏菌的方法: 称取检样，加入g n 增菌液， 3 7 培养 1 8 -2 4 h . 取增菌液滴在载玻片上， 加入s p a 诊断试剂， 混匀后， 轻轻摇动玻璃片， 同时取增菌液2 m l , 煮沸， 加入s p a 诊断试剂， 3 m i n 内 观察凝集反应。 如果呈现凝 集， 则分别与a , b , c , d 群各多价血清做凝集试验，出现凝集反应的再与相应的 单价血清做凝集试验，作出诊断。 s p a 法与常规法比 较， 其检出率无明显差异。当大肠菌群菌量绝对高于志贺 氏菌菌量时， 用s p a 法仍可检出， 而对传统常规法的影响较大， 说明 s p a 法灵敏性 较高。 与传统方法相同， s p a 法也需要将样品 用g n 增菌液增菌， 否则检出率较低。 s p a 法可在2 4 -4 8 h 内出具检测结果， 且检出率高， 可作为一种快速灵敏的检验方 法“ ， 。 1 .3 .3 聚合酶技术 ( p c r )的原理及其发展 ( a ) .p c r技术原理 夭津商学院硕士研究生毕业论文前言 用接种针搅匀每个方块中的内容物. 注意不要使方块之间互相混乱。 动摇平 皿3 - 4 m i n 以 促进其凝集作用。 并按以 下记取其凝集反应的程度: 0 = 无凝集反应， 1 十 =勉强可察觉的凝集反应，2 + =呈5 0 9 6 清澈的凝集反应，3 + =呈7 5 9 6 清澈的凝 集反应， 4 + = 有可见的絮片状的凝集反应， 混悬液完全清楚清澈透明。 再以 呈现 明显阳性 ( 2 十 、 3 + , 4 + ) 的多价血清所属的单价血清重新检查其混悬液， 如呈阴 性反应， 则将混悬液置蒸锅中加热3 0 m i n 以水解能起干扰作用的英膜抗原。 此时 如与多价血清反应呈阳性， 则再以单价血清检查。 由于这些系推测的血清型， 故 所有可能与所用血清呈阴性反应 闭 。 ( d ) . 另外还有一种方法就是将标本分别接种在沙门氏菌属志贺氏菌属琼脂 ( s s ) , h e rt o e n 肠道菌琼脂( he ) 和伊 红美 兰琼脂( e mb ) 培养基平板上， 3 6 过 夜 培养， 挑出 可 疑菌 落， 分 别转 种克氏 双 搪 ， 取 可 疑 菌 落 做血 清学 鉴定 s 。 1 . 3 . 2 s p a ( s t a p h y l o c o c c a l p r o t e i n a ) 法 s p a 是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分， 它具有同人和多种哺 乳动物工 r g 分子f 。 段结合的能力。 f r o n v a l l 首先将协同凝集反应用于肺炎球菌 的分型。依据结合到s p a 上的志贺氏菌抗体与志贺氏菌产生特异性的凝集反应， 产生可见的凝集颗粒， 从而用于志贺氏菌的 快速检测， 以 满足食品卫生监测和检 验工作的需要， s p a 法测定食品中志贺氏菌的方法: 称取检样，加入g n 增菌液， 3 7 培养 1 8 -2 4 h . 取增菌液滴在载玻片上， 加入s p a 诊断试剂， 混匀后， 轻轻摇动玻璃片， 同时取增菌液2 m l , 煮沸， 加入s p a 诊断试剂， 3 m i n 内 观察凝集反应。 如果呈现凝 集， 则分别与a , b , c , d 群各多价血清做凝集试验，出现凝集反应的再与相应的 单价血清做凝集试验，作出诊断。 s p a 法与常规法比 较， 其检出率无明显差异。当大肠菌群菌量绝对高于志贺 氏菌菌量时， 用s p a 法仍可检出， 而对传统常规法的影响较大， 说明 s p a 法灵敏性 较高。 与传统方法相同， s p a 法也需要将样品 用g n 增菌液增菌， 否则检出率较低。 s p a 法可在2 4 -4 8 h 内出具检测结果， 且检出率高， 可作为一种快速灵敏的检验方 法“ ， 。 1 .3 .3 聚合酶技术 ( p c r )的原理及其发展 ( a ) .p c r技术原理 夭津商学院硕士研究生毕业论文前言 为提高d n a探针的敏感性， 可先将靶d n a序列扩增， 增加d n a数量， 使 其达到足够的检测量， 若反 应以 动力学为基础， 则能定 量分析。 1 9 8 3 年m i l l u s 和 c e t u s 发明了 最基本的扩增d n a或增加样品中 特殊核昔酸片段数量的方法聚合 酶链反应即p c r法。p c r法建立在三步重复发生反应的基础上。通过热处理 将双股d n a变性裂解成单股d n a : 退火延伸引物至特异性寡核昔酸上; 酶 促延伸引物与 d n a配对，合成模板， 。溶液中核昔酸通过酶聚合成相互补对的 d n a片段，并能重新裂解成单股 d n a ，成为下次p c r复制的模板。因此每次 循环特异性d n a将以双倍量增加。典型扩增经过4 0 次循环能引起 1 0 0 万倍的 扩 增。 在p c r反 应中 引 入t a q 聚合 酶使反 应 得以 半自 动化 和简 便反 应程 序。 用 扩增d n a进行的p c r反应具有无与伦比的优越性。如用同位素标记 两种基因 ( l a c z和 l a m b )的探针做p c r反应检测水源中e .c