（食品科学专业论文）透性化细胞海藻糖合酶合成海藻糖的研究.pdf

薛璐 摘要 2 0 0 1 年6 月 摘 要 海藻糖是功能性低聚糖， 具有非还原性，保湿性， 热酸稳定性， 抗冻结、 干燥 性 等特性。 而且它对生物大分子和生物体组织有着非 特异性的 保护作用。 海藻糖在 分子生物学、 医学、 食品工业、 化妆品工业、 农业等领域有着广阔的应用前景。 但 是海藻搪制取上的困 难限制了它的广泛应用。 本课题立足于以 一种微生物酶 海 藻糖合酶来合成海藻糖， 筛选出 产酶菌株并研究其培养特性， 然后对制取透性化细 胞海藻搪合酶及其性质，以及制取海藻糖的工艺进行了系统的研究。 本课题首先比 较了八株能产生海藻糖的微生物的产海藻糖合酶的能力， 确定恶 单胞杆菌 h 7 6为产酶菌株，并对其培养特性进行了 研究。恶奥假单胞杆菌的 最 佳培 养塞配方 为麦芽 糖3 % , 葡萄糖 3 % , 蛋白 脉2 % , 醉 母粉。 .7 % , m g s o , . 7 h 2 0 0 .2 % , 其最佳发 酵工艺 条件为: 发醉温度3 0 c ， 发酵p h 7 .2 , 5 0 0 m 三 角瓶 装液 11 l 0 0 m l ,发醉终点5 2 h r s e 研究比 较了多种有机溶剂及表面活性剂渗透恶臭假单胞杆菌细胞的 方法， 确定 2 % 甲 苯 + 0 .5 % o p - 1 0 0在3 5 c 渗透细胞0 .5 h r 所得的 透性化 细胞海硫 箱合酶活 力最 高， 达原 细胞的1 1 7 .8 倍. 将透性化细胞酶低 温速冻， 真空 冷冻干澡 后， 细 胞 酶的 活力又有所提高 ( 约2 . 6 倍) ， 且易于保存。 对这种透性化细胞海藻籍合酶的 性质系统研究的结果为: ( 1 ) 在底物麦芽糖浓 度为 1 0 %， 反应液p h 7 . 0 ， 反应时间为 i o h r s 条件下，细胞陇的最适反应温度为3 5 ， 在3 0 . 4 0 c 范 围内 租定: ( 2 ) 该透性化细胞海藻 糖合醉的 最 适p h在7 .0 7 .8 之 间 ， 在p h 6 .6 - 7 .8 范 围 内 最 稳 定 : ( 3 ) m g 2 + 及k + 对 该 细 胞 醉 有 明 显 激 活 作 用， n a 稍 有 激 活 作 用 ， c a t , b a t + 对 该 酶 稍 有 抑 制 作 用， 而zn2 + ， m n 2 . 及c u = 十 则 可 强 烈 地抑制酶活力; ( 4 ) 透性化细胞海藻精合酶的底物特异性极强， 只能 将麦芽 精转化 为海藻糖，同时具有徽弱的水解作用，生成少t的菊萄箱， 而对其它枪类均不起作 用: ( 5 ) 透性化细胞海藻糖合酶在冷冻或冷藏条件下保存1 个月， 醉活力稍有下降， 但在室温下保存酶活力会有较大的损失。 本课题对用麦芽糖转化生成海藻糖的工艺条件进行了系统的 研究。 首先研究了 麦芽 糖浓度、反应时间与反应温度等因素对海藻籍产率的影响。结果表明: 麦芽精 浓度对海藻糖产率影响较小:随反应时间的延长， 海藻精的产率逐渐增加: 反应时 间过长， 海旅糖的产率会因海燕糖合酶的弱水解作用而下降。反应温度越商， 反应 初始速度越快， 而末期速度则越慢。经正交试验设计得到以 麦芽籍溶液为底物生产 海 藻 糖的 工 艺 条 件为 : 反 应 温 度3 0 0 g , 反 应p h 7 .0 ， 反 应时 间2 4 h r s ， 透 性 化 细 胞 海 藻 糖 合 酶 的 用 t 为3 7 5 u / g 麦 芽 糖 。 犷 一 关健词:恶奥假单胞杆菌 海藻糖合酶透性化细胞酶法合成 硕士学位论文透性化细胞海藻糖合酵合成海藻糖的研究 东北农业大学 s t u d i e s o n f o r m a t i o n o f t r e h a l o s e b y t r e h a l o s e s y n t h a s e i n p e r me a b i l i z e d ce l l s abs tract t r e h a l o s e i s a n a t u r a l f u n c t i o n a l d i s a c c h a r i d e . i t i s n o n - r e d u c i n g a n d s t a b i l i z e d t o h e a t a n d a c i d . i t a l s o c a n p r o t e c t b i o l o g i c m o l e c u l e ， s u c h a s d n a a n d p r o t e i n . s o t r e h a l o s e c o u l d b e w i d e l y u s e d i n f o o d s t u ff , p h a r m a c e u t i c a l s , c o s m e t i c , a n d a g r i c u l t u r e . t r e h a l o s e s u s e s a r e r e s tr i c t e d d u e t o t h e d i ff i c u l t y i n p r o d u c i n g it . t h i s s t u d y m a i n l y d i s c u s s e d t h e s y n t h e s i s o f t r e h a l o s e b y a m i c r o b i a l e n z y m e , tr e h a l o s e s y n t h a s e t h e b e s t s tr a i n w h i c h p r o d u c i n g tr e h a l o s e s y n t h a s e , p s e u d o m o n a s p u t i d a h 7 6 , w a s s e l e c t e d f r o m e i g h t s tr a i n s . i t s f e r m e n t a t i o n m e d i u m a n d c o n d it i o n w e r e i n v e s t i g a t e d . t h e f o r m u l a o f c u lt u r e m e d i u m w a s o p t i m i z e d a s : m a l t o s e 3 % , g l u c o s e 3 % , p e p t o n e 2 % , y e a s t e x tr a c t i o n 0 .7 % , mg s o 4 . 7 h 2 0 0 .2 % . t h e o p t i m u m c u l t u r e c o n d i t i o n s w e r e : t e n p e r a t u r e 3 0 c , p h 7 .2 , c a p a c i t y 1 0 0 m p e r 5 0 0 m l tr i a n g u l a r b o t t l e a n d t i m e 5 2 h r s . t h e p e r m e a b i l i z a t i o n o f p s e u d o m o n a s p u t i d a c e l l s i n r e l a t i o n t o tr e h a l o s e s y n t h a s e a c t i v i t y w a s s t u d i e d u s i n g d i ff e r e n t o r g a n i c s o l v e n t s a n d d e t e r g e n t s . t h e p e r f o r m a n c e o f t h e s e s o l v e n t s w a s d e p e n d e n t o n t h e i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e , t i m e , a n d t h e c o n c e n tr a t i o n o f c e l l s . ma x im u m e n z y m e a c t i v i t y w a s a c h i e v e d w i t h 2 % t o l u e n e a n d 0 . 5 % o p - 1 0 0 , a t 3 5 c 0 . 5 h r . t h e e x p r e s s i o n o f i n tr a c e l l u l a r tr e h a l o s e s y n t h a s e a c t i v i t y w a s i n c r e a s e d 1 1 7 .8 - f o l d w i t h r e s p e c t t o u n tr e a t e d c e l l s . a ft e r fr e e z e - d ry i n g , i t s a c t i v i t y i n c r e a s e d 2 . 6 - f o l d mo r e， t h e p r o p e rt i e s o f tr e h a l o s e s y n t h a s e i n t h e p e r m e a b i l i z e d c e l l s w e r e i n v e s t i g a t e d s y s t e m a t i c a l l y . t h e e n z y m e e x h i b i t e d a n o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f 3 5 c ，a n d a n o p t im u m p h o f 7 .0 - 7 .8 . t h e e n z y m e w a s s ta b le a t 3 0 - 4 0 c , p h 6 .6 - 7 .8 . t h e a c t iv it y o f tr e h a lo s e s y n th a s e w a s in c r e a s e d b y a d d it io n o f m g 2 , k a n d n a , b u t w a s in h ib ite d b y z n 2 , m n 2 , c u 2 , c a , b e . t h e e n z y m e c a t a ly z e d t h e c o n v e r s io n o f m a lt o s e in t o t r e h a l o s e b y i n tr a m o l e c u l a r u a n s g l u c o s y l a t i o n , a n d i t c a n s l i g h t l y h y d r o l y z e m a lt o s e i n t o g l u c o s e , b u t it w a s i n a c t i v e o n o t h e r s a c c h a r i e d s . s t a b i l i t y o f t h e e n z y m e s y s t e m r e m a i n e d p r a c t i c a l l y u n a lt e r e d d u r i n g r e f r i g e r a t i o n f o r u p t o i m o n t h . 薛璐英 文 摘 要 2 0 0 1 年 6月 t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n f o r p r o d u c t i o n o f t r e h a l o s e b y t r e h a l o s e s y n t h a s e w e r e d e t a i l e d s t u d i e d . t h e e ff e c t s o f t h e m a l t o s e c o n c e n t r a t i o n s , i n c u b a t i o n t i m e a n d t e m p e r a t u r e w e r e s t u d i e d a b o v e a l l . t h e m a l t o s e c o n c e n t r a t i o n h a s l i tt l e i n fl u e n c e o n t h e y i e l d . a t t h e b e g i n n i n g o f r e a c t i o n , t h e l o n g e r t h e t i m e , a n d t h e h i g h e r t h e t e m p e r a t u r e , t h e m o r e t r e h a l o s e . t h e o p t i u m c o n d i t i o n s o f r e a c t i o n w e r e g a i n e d w i t h o rt h o g o n a l e x p e r i m e n t d e s i g n : t e m p e r a t u r e 3 0 0 c , p h 7 . 0 , t i m e 2 4 h r s , t h e a m o u n t o f e n z y m e 3 7 5 u / g m a lt o s e . ma s t e r c a n d i d a t e : xu e l u ma j o r : f o o d s c i e n c e t u t o r : v i c e p r o f . ma y i n g k e y wo r d s : p s e u d o m o n a s p u t i d a t r e h a l o s e s y n t h a s e p e r m e a b i l i z e d c e l l s y n t h e s i s b y e n z y m e t r e h a l o s e 硕士学位论文 透性化细胞海藻糖合酶合成海藻糖的研究 东北农业大学 1前言 新型食品添加海藻糖是一种极好的千燥剂和保鲜剂， 也是一种新型功能性低聚 糖。目 前国际上将其生产技术及应用开发作为热点来研究。 1 . 1海藻糖的结构 海 藻糖 ( t r e h a l o s e ) 是 一 种二 糖， 其分子 式为c 12 h z 2 0 6 。 海藻糖由 两分 子 葡萄 糖经a - 1 . 1 键缩合形成，它的这种结构赋予了它非还原性。 海藻糖的分子构象式 与 h a w o r t h 式如图 1 所示。 海 藻 糖分 子 的 h a w o r t h 式 日 o h , 州( 海藻掩的分子构象式 图1 海藻糖的结构 f i g u r e 1 s t r u c t u r e o f t r e h a l o s e 海藻搪按糖的连结方式存在三种异构体:。 一 a 型，即 海藻糖;。 一 日 型， 即新 海藻 糖 ( n e o t r e h a lo s e ) ; 及s 一 s 型， 即 异 海藻 糖 藻糖天然存在， 它可以写成。 - d - 毗喃葡糖基 一 ( i s o t r e h a l o s e ) 。己 确认a 一 。 型海 ( 1 - - 1 )a - d - 毗喃葡糖昔。 1 .2海藻糖的分布 海藻糖最初于1 8 3 2 年由 威格尔斯首先从黑麦的麦角菌中分离得到。1 8 5 8 年， 贝尔妥洛特又从茎虫的茧蜜中 分离出 该糖。 在我国， 由于它可以 从海藻中分离得到， 因此称之为海藻糖。 在自 然界中 ， 海藻糖以 游离状态作为贮藏糖类而广泛存在于动物、 植物及徽生 物中，如蘑菇、 醉母、 海藻、 地衣、 虾类及昆虫、 包括卵、 蛹、 幼虫中，甚至人的 肾 脏 中 都 含 有 该 糖 d l 遭 乳一一 n -9 一一一 一， 分 2 0 0 1 忿 a 1 . 3海藻糖的物理化学性质 1 . 3 . 1稳定性及呈色性 海藻 糖 对 热 和 酸 都 非 常 稳 定， 是 天 然双 糖中 最 稳定 的 糖( 见图2 ) . 由 于 它 不 具有还原性， 因 此即 使与氨荃 酸、 蛋白 质等混 合加热也不会 产生美拉德 反 应引 起着 色等变化。 海藻糖几乎不被一般的酶所分解，只能被海藻糖酶 ( t r e h a la s e , e c 3 .2 . 1 .2 8 )特异性的水解为两分子葡萄糖。 今海燕枪 . 门卜. 蔗箱 10080 济曰八曰 匕d 球僻阳椒 1 2 3 4 5 6 p h 圈2 海旅 箱的 的 d h 粗定 性 f i g u r e 2 t h e s t a b i l i t y o f t r e h a l o s e u n d e r d i f f e r e n t p h 1 .3 .2溶 解性、 甜度 及渗 透压 海藻糖易溶于水、 热乙 醉、 不溶于乙 醚。 海藻糖在水中的 溶解度随温度变化较 明显 ( 见图3 ) ， 当 沮度低于1 0 0 c时， 溶解度远小于蔗糖， 而当 温度高于8 0 0 c 时 ， 则 大 于 蔗 籍 r 1 .-海成粉 -杏- 蔗箱 700600600400翔200明。 贬侧盆块 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 沮度/ c 图 3海蕊箱的溶解度 f i g u r e 3 t h e s o l u b i l i t y o f t r e h a l o s e 海藻糖甜度为 砂箱的4 5 % ， 食用后口 中不留 后味， 味质爽口 。 其渗透压与砂糖、 麦芽塘等双糖相同. 1 . 3 . 3吸湿性 海藻糖的 无水结晶具有很强的吸湿性， 在相对湿度3 0 % 以 上时能转化成含两分 f ig ( 学位论文透r f 化细胞海藻糖合酶合成海藻糖的研究东北农业人学 子水的结晶， 而含两分子水的海藻糖结品在相对湿度9 0 %以 印寸 不具有吸湿性 ( 见 图4 ) 曰 。因 而海藻 糖既具 有低吸 湿性，又 具有高 保 湿性和 脱水功能， 其 脱水效果 远强 于 乳糖 、麦芽糖。 无水结晶 含水结晶 山川叫洲刹 %到嗅澎 相又 j 湿度/ % 图4海摄糖的吸湿性 f i g u r e 4 h y g r o s c o p i c p r o p e r t y o f t r e h a l o s e 1 . 3 . 4其它性质 海藻糖具有抗腐蚀性， 不生成引 起龋齿的不溶性葡萄糖. if能防止 淀粉老化( 见 图5 ) 和蛋白 质变性 ( 见图 6 ) 。 海藻糖能在小肠内 被消化吸收， 可以 做为营养源。 但若一次性大量摄入海藻糖， 对体内 缺乏海藻 糖分解酶的人来说则会引 起海藻糖不 耐症。不过对海藻糖显示出不耐症的人很少。 丫璐到专 决姗粼御 沪沪 沪沪 尹 沪沪 沪尹 尹 图s防止淀场老化的效果 f i g u r e 5 e f f e c t s o f p r e v e n t i o n s t a r c h f r o m a g i n g 图 防止蛋白 质变性的效果 f i g u r e 6 e f f e c t s o f p r e v e n t i n g pr ot e i n fr o m d e n at vr nti o n 1 .4海藻糖的生物学特性 象其他糖类一样， 海藻糖可以为生物体提供能量。 另外， 在许多细菌中， 海藻 糖川以和rc 链脂肪酸酷化而作为结构物质。 薛璐 前言2 0 0 1 年 6月 海藻糖最引人注意的是其独特的生物学性质: 作为应激代谢产物， 海藻糖具有 抵抗环境冷暖、 干湿变化的作用。 因此海藻糖在冻结、 千燥、 高渗、 辐射等情况下 对生物体膜、膜蛋白、d n a等发挥保护功能，使它们免受环境变化所造成的伤害 3 一 5 。 例如， 在昆 虫体内， 海藻糖是血液中 主要的 糖， 被称作“ 血糖” ， 具有不冻 剂 的效果，随季节的变化，通过调节海藻糖的浓度而获得耐寒性。在酵母和霉菌中， 也发现随细胞中海藻糖含量的增多， 其耐冷冻性、 耐热性与耐干燥性均有上升， 细 胞内 海藻糖含量与 其细胞对逆境的 耐受程 度平行 增减 价6 1 。 蛙类等生物在冬 季的 受冻状态下能生存下来; 生长于沙漠地带的一些植物干燥后处于生理学上的假死状 态， 经补充水分后又能复活等也是由于海藻糖对细胞的保护作用。 而海藻糖的两种 异构体， 新海藻糖和异海藻糖没有这种效果。 海藻糖是一种非特异性保护剂，对生物体都具有一定的 保护作用。资料表明， 海藻糖对分离的膜和完整细胞， 如人眼晶 状体、 胰岛细胞、 小鼠 胚胎等都有保护功 能 18 1 。 经 海藻糖干 燥的 抗体、 血小 板、 酶、 淋巴 细胞等生 物活 性物 质无须冷冻， 复 水后均能恢复活力。 海藻糖产生这种对生物的保护作用的 机理目 前尚 不清楚， 主要有两种说法: 一 种说 法称作“ 水替 代” 假说7 1 ， 认为蛋白 质、 核 酸等生 物体分 子受干 燥失 水时， 海 藻糖能在失水 部位以 氢键形式连接， 制出了与为维持生命所必须的水相似的构造， 顶 替了 水分 子。 另 一 种 说 法 称作“ 玻 璃态” 假 说 19 1 ， 认为 细 胞 置 于 冷 冻 或 干 燥的 环 境下时， 海藻糖通过玻璃化转变的趋势导致无定形连续相的形成， 强力地束缚水分 子， 与膜脂质共同 拥有结合水。 不管是哪一种情况， 都有助于膜蛋白 质的亲水性部 分水合， 相互作用， 进而在膜脂质和膜蛋白 质的相互作用方面发挥作用， 从而防止 膜的变性。 1 . 5海藻糖的检测 1 . 5 . 1薄层色谱法 使用薄层色谱法 ( t l c ) 可以 定性的检测海藻糖的存在， 并且可以 将麦芽糖与 海藻糖分离开。 这种方法的精密度相对较差， 但成本相对低一些， 而且可以同时检 测多份样品。 例如， n i s h i m o t o t .及 n a k a n o m . 等人在最初由2 5 0 个菌株中筛选 产 海 藻 糖 合 酶 的 菌 株 时 ， 就 使 用 了 这 种 方 法 p u t 。 其 硅 胶 板 为k i e s e l g e l 6 0 板 ， 溶 剂中 含 n 一 丁醉 一 毗0一 水 ( 7 : 3 : 1 . v / v ) 。 显色剂为含2 0 % 硫酸的甲 醉溶液，并在 1 1 0 0 c 加热1 0 分 钟。 由 于薄层色 谱法的检 测结果很 粗糙， 最 好还是将其与 高效液 相色谱法或气相色谱法结合使用. 1 . 5 . 2气相色谱法 气相色谱法 ( g c )是分析糖类化合物常用的 方法。 n i s h i m o t o t .及n a k a n o m . 等人将待测样品用三甲 氮硅烷处理， 生成挥发性三甲 基硅醚衍生物， 再用气相色谱 分析。 所用检测器为氮火焰离子检测器。 色谱柱为2 % 硅氧烷o v - 1 7 吸附于红色 硕士学位论文透性化细胞海藻褚合醉合成海燕糖的研究 东北农业大学 硅 藻 土 上 (i., , 。 1 . 5 . 3高效液相色谱法 使用高效液相色谱法 ( h p l c ) 检测分析海藻糖是快捷有效的一种方法。 它既可 以 定 性分析 又可以 定t 分析(w . u 1 。 检测时 可使用c 。 柱， 氨荃 柱121 或专用 糖柱。 使 用 c i。 柱时可以用水做流动相，而使用后两种柱则孺用乙腊一水做流动相。使用氮 基柱和专用糖柱进行检测时， 样品中的糖会与柱中固定相发生不可逆的吸附， 使柱 效降低， 并缩短柱的寿命。 而且， 流动相乙睛是一种易挥发的致癌物质， 危害操作 人员 .0 健康。 使用c . 柱和纯水分析糖样品则不 存在以 上问 题， 但它 最大的 缺陷 是 对单糖之间及双糖之间分离较难， 因此对属于同 分异构体的麦芽糖和海藻糖很难分 离。 实际上， 即使氨基柱对这两种糖的分离效果也不是很好。 因而最好使用专用搪 分析柱。 v o e l t e r w . , b a u e r h . 等人曾 使用阴离 子交换 树脂自 行制备色 谱柱，以 纯 水 或甲 醇 一 水 做 流 动 相， 分 离 检 测多 种 双 糖， 取 得了 较 好的 效 果 1 1 3 1 , h p l c 法 分 析 搪 类物质常用示差检测器进行检测。 1 . 5 . 4酶法 检测海藻糖除使用仪器分析方法外， 还可以 使用生化的方法。 海藻糖只能 特异 性的被海藻搪酶分解生成两分子葡萄搪。 利用这一性质， 可用海裁搪酶将海藻搪水 解 后， 用 葡 萄 糖过 氧 化 物酶法 测定 葡 萄 糖的 * 14 . 1 5 ) . 海 藻 精酶的 来 源 是 广 泛的 ， 既 可以 从 兔的 肾 脏 1 5 ) 中 提 取， 也 可以 从 芽 抱杆菌， 醉 母 1 6 1蕊 类 1 17 1等 徽生 物中 提 取。 这种方法的 优点 在于不需要昂贵的分析仪器， 操作简便。 问题在于自 行制备海 藻糖酶会增加研究的工作t，而商品 海藻糖酶的价格又不低。 1 . 6海藻糖的合成 1 . 6 . 1 利用徽生物自 然合成海簇锗 该 方 法 选 用 海 藻 糖 含 f 高 的 真 菌， 如 面 包 醉 母11e . . ， 啤 酒 酵 母， 乳 酸 菌 作 为 提取源， 在一定温度下使用一定溶剂抽提出来， 或用高压处理等从目 标菌中 提取出 来， 然后进行精制。 从醉母中 提取的海藻籍在国外曾 有商品供应， 但由 于制造成本 过高， 价格昂 贵， 竞争性差， 现已 墓本停止生产。 而我国工业生产海燕锗仍主要采 用此法。 另一种方法是利用一定的 墓质培养微生物， 通过徽生物发醉产生海藻枪， 再从 培养液中 提取精制而成。 例如以 正烷烃为碳源培养节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) 的发醉 生 产， 以 砂 箱 和 葡 萄 格 为 蓦 质培 养棒 杆 菌 属( c o r y n e b a c t e ri u m ) 等 氮 荃 酸 发 醉 微生 物 的 发 醉 生 产 ， 以 及 利 用 诺卡 氏 菌 属( n o c a r d i a ) 等 徽 生 物 的 培 养 液 来 制 造 u . ， 。 . 但这种方法转化率不高，提取困难，因而未见工业化大t生产的报道。 1 . 6 . 2采用墓因it组的方法 这种方法已分别在植物和微生物中试验。 例如将能把葡萄锗转换成海藻籍的醉 薛璐前言 2 0 0 1 年 6月 的基因引进产糖的作物中， 使其能在植物体内 制出海藻糖。 己 知很多微生物能产生 海藻糖， 其生物合成涉及两种酶: 海藻糖-6 -磷酸连接酶和海藻糖-6 -磷酸磷酸 酶。 现已 将编码上述这两种酶的基因进行了克隆， 得到了具有这两种酶基因的新微 生 物 ， 正 在 作 进 一 步 的 解 析 研 究 【 。 1 . 6 . 3酶法合成海藻糖 利用酶制剂生产糖类是制糖工业中 较常用的方法。 迄今为止， 已 经研究发 现的、 与合成海藻糖有关的酶或酶系主要有六条途径。 1 .6 . 3 . 1 海藻糖- 6 - 磷酸合成酶和海藻糖一 6 - 磷酸磷酸酷酶 研究表明， 海藻糖在真菌和细菌， 如大肠杆菌， 酿酒酵母中的合成主要是通过 海藻糖 - 6 - 磷酸合成酶 ( tr e h a lo s e - 6 - p h o s p h a t e s y s t h e s a s e , e c 2 .4 . 1 . 1 ) 和海藻 糖一 6 - 磷酸磷 酸酷酶( tr e h a lo s e - 6 - p h o s p h a te p h o p h a t a s e , e c 3 . 1 .3 . 1 2 ) 的 途径。 海藻糖- 6 - ta 酸合成酶的底物专一性强，只能以 海藻糖- 6 - 磷酸为葡萄搪基受体， u d p - g , g d p - g 或a d p - g 为葡萄糖基给体。该系统可用下列反应表达: u d p - g+g - 6 - p t r e - 6 - p十u d p t r e - 6 - p一 海藻糖 +无机磷酸 这种方法需要高能物质o r参与反应，因而在工业生产中是不实际的。 1 .6 . 3 . 2麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶 麦芽糖磷酸化酶( m a lt o s e p h o s p h o ry la s e , e c 2 .4 .1 .8 ) 和海藻糖磷酸化酶 ( tr e h a lo s e p h o s p h o ry l a s e , e c 2 .4 . 1 . 6 4 ) 能 以 麦 芽 糖 为 底 物 合 成 海 藻 糖 12 1 1 。 其中 ， 麦 芽 糖磷酸化酶可由 短乳杆菌得到， 海藻糖磷酸化酶可从变异徽球菌， 毕赤酵母， 细长 眼 虫 藻 及c a t e l la t o s p o r a f e r r u g in e a lu 23 1得 到 。 该 反 应 可 用 下 式 表 示 : 麦芽糖 十磷酸盐 一葡萄糖磷酸 十葡萄糖 一海藻糖 +磷酸盐 该反 应最 适p h 为6 .5 - -7 .0 ， 当 反 应混合物中 含有低浓 度磷 酸时， 反 应速率 会加 快。 1 9 9 8 年5 月，日 本食品 化工公司 报道， 用该酶系 催化麦 芽糖液 底物生 产 海藻 糖水怡已 商业化，该产品为含3 0 % 的海藻糖和5 0 % 的麦芽糖的 液体制品。 1 .6 .3 .3蔗糖磷酸化酶和海藻搪磷酸化酶 蔗 糖磷 酸 化 酶( s u c r o s e p h o s p h o ry l a s e , e c 2 .4 . 1 .7 ) 和 海 藻 糖 磷 酸 化酶能以 蔗 糖 和葡萄搪为 底物， 合成海藻糖。 其中， 蔗糖磷酸化醛可由 从土坡中 分离出的 肠膜样 明串 珠菌 属肠膜样亚 种及葡聚糖亚 种中 提取出 来12 4 1 。 该反 应 可表示 如下: 蔗糖 十无机磷酸盐葡萄搪磷酸 十果糖 葡萄糖磷酸 +葡萄糖海藻糖 十无机磷酸盐 1 .6 . 3 . 4海藻搪酶 能 够特异性水解海藻糖的海藻糖酶可以 通过逆反应， 将两分子葡萄糖缩合成海 藻 糖 。 海 藻 糖 酶 可 以 从 酿 酒 酵 母 ， t o r u la s p o r a d e lb r u e c k ii 116 1, 绿 藻 l o b o s p h a e r a l 及 兔的肾脏中获得。但是这种方法的产率极低，只有 5 % 左右，因而在实际生产中也 是不可行的。 1 :6 .3 .5麦芽寡糖 墓海藻糖合酶与麦芽 寡糖基海藻糖 海藻 糖水 解酶 由 麦芽寡糖荃海藻糖合酶( m a lt o o l ig o s y l t r e h a l o s e s y n t h a s e , m t s a s e ) 与麦芽寡 糖 基 海 藻 糖 海 藻 糖 水 解 酶( m a lt o o l ig o s y l t r e h a lo s e t r e h a lo h y d r o l a s e , m t h a s e ) 构 成 的 酶系来 源于节杆 菌。 这两种酶联 合在一 起循环作用于 底物麦芽寡糖， 每次 从麦芽 寡 糖生成少两个葡萄搪单位的麦芽寡糖及海藻搪， 其中m t s a s e 催化麦芽寡糖还原端 的葡糖基和相邻的 葡糖荃间的。 - 1 , 4 葡糖昔键转化为a - 1 , 1 葡糖昔键，生成麦 芽寡糖基海藻糖，是一种分子内 转糖荃酶， m t h a s e 专一水解麦芽寡糖墓海藻糖的 麦 芽 寡 糖 基 和 海 藻 糖 基 间 的。 - 1 , 4 葡 糖 普 键， 得 到 海 藻 糖 iz s - 2 7 1 图7 所 示 为 m t s a s 。 与m t h a s 。 构成酶系的反应机理。 ， . ，0 - 0-0-0-0-. 安芽低康抽( d p . ) 备 m t s w ” . 0-0-0-0-0一0 低践安井枯若海班拍( d p . ) j m t h u e “ .0-0-0-0 炭芽低班粉 d p , - , ) 0 二0 娜班箱 o: 荀栩份双若 : a - 1 , 4 协.特普健 : 荀 翻 枯 残 若 还 旅 翔 一 a a 甲 1 . 1 荀 钧. 甘招 图7由淀粉通过m t s a s e 和m t h a s e 生成海藻箱的简图 f ig u r e 7 f o r m a t io n o f t e e h a l o s e fr o m s t a r c h 妙m t s a s e a n d m t h a s e 研究表明， 该酶系也可催化直链淀粉生成海藻糖， 且反应不需磷酸盐共存。 以 淀粉为原料使得成本大大降低， 在日 本， 这项研究已 被应用于工业化生产海藻籍中 h s l 。 但是在 工 业性 的 生产上， 还需 配合其它的 淀粉水解酶:。 一 淀粉酶， 异 淀 粉酶， 葡萄糖普转移酶c g t a s e , 葡萄糖淀粉酶， 这样海藻糖的 转化率可达8 5 %以 上。 除节杆菌外， 在微黄短杆菌， 根瘤菌， 水生黄杆菌等多株细菌中都发现了 这两种酶 薛璐前言2 0 0 1 年6 月 的存在。 而且， 存在于节杆菌和根瘤菌中的m t s a s e 和mt h a s 。 的基因已分别在大 肠 杆 菌 中 克 隆 和 序 列 分 析 2 9- 3 2 1 日 本麒麟啤酒公司应用开发中心从温泉中分离得到一种古细菌， 硫矿硫化叶菌 k m 1 ， 也能以 淀 粉为 原料 生产海藻糖，以 此进行的 基因克隆也已 获成功3 3 - 4 2 1 。 古 细 菌中 存在的酶系与来源于节杆菌的m t s a s e 和m t h a s e 作用原理极为相似， 同时由 于该酶系来源于嗜热菌， 因而有着良 好的耐热性， 在7 5 - 8 5 保温6 h r s 仍保留9 0 % 以上的酶活力。当以经普鲁兰淀粉酶作用后的淀粉为底物时，海藻糖的产率达 8 1 . 5 %. 1 . 6 .3 .6海藻糖合酶 ( 1 ) 海藻糖合酶的分布 海藻糖合酶( t r e h a l o s e s y n t h a s e ) 是近年来新被发现的一种酶， 它能 将底物麦 芽糖直接转化为 海藻糖. 就目 前的文献报道来看， 海藻糖合酶主要存在于徽生物细 胞内。 根据1 9 9 5 年n i s h i m o t o t等人的 报道p o t ， 他 们在由 土壤中 分离 得到的2 5 0 多个微生物菌株中 发现了多株具有转化麦芽糖生成海藻糖活力的菌株. 主要有脂肪 杆菌r 4 8 , 恶 奥假单 胞 杆菌h 2 6 2 ， 水生 栖热菌a t c c 3 3 9 2 3 , a t c c 2 5 1 0 5 , a t c c 2 7 6 3 4 , 丝状栖热菌a t c c 4 3 2 8 0 等。 其中 前三种菌中的酶活力最高。 同时， 在海藻搪合酶的 研究中， 研究人员也运用了 基因!组技术.1 9 9 6年， 日 本的 t s u s a k i k等人报道， 将海藻糖合酶的 基因导入大肠杆菌后， 得到了高效表 达产物，实 验证明 这种基因重 组酶的性 质稳定甚至好于原供体细胞中的 海 裁锗 酶 1 4 3 , 4 4 1 ( 2 ) 海藻糖合酶的 特性 海藻糖合酶能够特异性的催化麦芽搪转化为海藻糖，该酶是一种分子内 葡搪昔 转移酶，即 将麦芽锗的。 - 1 , 4 糖昔键转化为。 - 1 , 1 糖普键。 在反应过程中， 不濡 要有磷酸盐共存. 海藻搪合酶的底物专一性强，只作用于麦芽锗生成海藻箱及使海 藻糖生成麦芽 箱， 且前者反 应速度明 显大于 后者14 5 ,4 6 1 海藻糖合酶具有徽弱的水解作用， 使海藻箱或麦芽搪生成少t的葡萄糖. 另外， 据k u b o t a m . 等人报道， 来自 水生栖热菌a t c c 3 3 9 2 的海藻糖合醉可以 催化蔗箱生成 t r e h a lu lo s e ， 而且 蔗糖会 完全抑制海藻糖合酶 催化分子内 转葡萄糖昔的 活力， 因 此麦 芽糖， 海藻 精， 蔗 糖可能与海藻 塘合酶分子上同 一个活性区 城相结合 14 7 1 研究发现不同来源的海藻糖合酶在一级结构上有着相似之处。其氮基酸顺序 为: t r p - x i - a r g - x 2 -a l a - x 3 - p h e , ( 其中x l 为p h e 或p r o , x 2 为t h r 或p r o , x 3 为v a l 或a la ) ， 或 是a la -v a l-x 4 - t y r ( x 4 为p h e 或lie). 综合文献报道中对纯化海藻糖合酶的特性研究，列于表1 中。 硕士学位论文透性化细胞海藻糖合酶合成海藻糖的研究东北农业大学 表 i 海藻糖合酶的特性 t a b l e 1 c h a r a c t e r i s t i c o f t r e h a l o s e s y n t h a s e 最 适 温热 稳 定 性 最适 来源度 ( 0 c) ( 0 c p h稳定等电引 用 性分子量点抑制剂激活剂 文献 脂肪杆菌2 0 7 . 5 6 . 0 - 9 . 0 6 2 . 0 0 0 z n z ,t r i s s r z ,d t t 4 .6 c u ,h g z b a ,m n 2 4 5 水生栖热 菌6 5 c . ,h g 6 . 5 5 . 5 - 9 . 5 1 0 5 . 0 0 0 4 . 3 t r i s f e 十4 6 恶臭假单 胞杆菌4 5 6 .0 - 1 0 . 4 0 ,0 0 0 - - z n ,n i 2 4 0 - 5 0 0 5 .0 - 1 1 .0 8 0 , 0 0 0 5 .0 - 6 .0 c . , c a z 4 9 . 5 0 基因重组 酶i 6 5 8 0 6 0 - 6 . 7 5 . 5 - 9 . 5 基因重组5 7 , 0 0 0 - - 酶 1 1 6 7 , 0 0 0 4 . 1 - 5 . 1 4 3 注: 基因 重组酶i :克隆水生栖热菌海藻糖合酶 基因重组酶n :克隆脂肪杆菌海藻糖合酶 ( 3 ) 应 用海藻 糖合酶 生产 海藻 糖 长期以 来， 由于 海藻搪制取上存在的困 难使海藻糖的 价格昂 贵， 限 制了 它的 应 用。 随着应用微生物酶合成海藻搪这一课题的深入研究， 人们陆续发现了 几条适于 工业生产海藻糖的微生物酶途径。 利用海藻糖合酶以 麦芽糖为原料生 产海藻糖就是 一条极有工业化前景的重要途径。 由于麦芽糖可以 通过淀粉水解得到， 因而使原料 成本大为降低。 而且利用麦芽糖转化海藻糖， 仅需一步反应， 工艺简单， 易于调控。 现将海藻糖合酶与麦芽糖磷酸化酶及海藻糖磷酸化酶两条催化麦芽糖生成海藻糖 的过程作对比，如图8 所示。同时研究表明，海藻糖的产率不受底物浓度的影响。 如将这一简单有效的 反应与生化反应器结合，这将适于大量生产海藻糖。 据t s u s a k i k .和k u b o t a m .等人报道14 3 - 4 6 1 ， 将提纯的 基因 重 组酶i i 与5 0 % ( w / w ) 的麦芽糖溶液共同保温，则可以产生5 0 % ( w / w )海藻糖: 将基因重组酶i 与5 0 % ( w / w ) 麦芽糖溶液一同 保温，海藻糖产率可达 8 0 % ( w / w ) ; 使用从脂肪杆菌或水 生栖热菌中 分离纯化的海藻糖合酶， 其产率也都在8 0 % 左右。 总的来说， 水生 栖热 菌的海藻糖合酶的 热稳定性好， 有利于酶的 保存。 而且在较高的温度下反应可防止 杂菌污染，更适合工业生产。 海藻糖合酸途径 麦芽糖磷酸化醉及海 藻糖磷酸化陇途径 安芽铺z r e 化? 47 十硫 醉 盐 左莽修 海藻箱 贾 萄摊磷酿 呀演裕砚 酸 化约 +磷酸盐 海流翎 o 碳原子 0 : 1 位碳原子 口: 叙原子 2磷翻 图8用醉法由 麦芽糖生成海蕊枪的途径 f i g u r e 8 f o r m a t i o n o f t r e h a l o s e fr o m m a l t o s e b y e m z y m e 我国是 淀粉生产大国， 在淀粉工业中有着广阔的 发展前景。 如果能以淀 粉为原 料， 将其水 解成麦芽搪后通过海藻搪合酶转化为海藻糖， 则会为淀粉应用开辟一条 新途径。 本课砚就塞于这一出 发点， 致力于寻找、 开发、 培育优良 的产海藻糖合酶 的菌株， 以 适当的方法获得海藻糖合酶， 研究其特性并优化制取海藻锗的反应工艺。 目 前，还未见国内 有以 海藻糖合酶制取海藻糖的同 类研究