（食品科学专业论文）鸭蛋清中溶菌酶的提取研究.pdf

致谢 本论文是在导师陈有亮副教授的悉心指导下完成的。三年来，导 师严谨的科研作风使我在学习、生活中都获益匪浅，并会一直激励我 在将来的工作中努力奋进。在此论文完成之际，谨向导师致以衷心的 感谢和崇高的敬意! 感谢院系领导和老师在思想、学习和生活上给予我的帮助和指 导! 感谢教育科王昭蒙老师、丁建萍老师曾经给我的帮助! 感谢林嘉老师、陈功老师对我的关心和帮助! 感谢程义平硕士、王树林硕士，黄素芬硕士、张亚军硕士、杨燕 军硕士、方英群硕士及马萍硕士在学习，生活及实验过程中给我的帮 助和支持! 感谢我的父母亲和家人，他们在我成长的道路上付出了巨大的心 血，没有他们的关心、鼓励和支持，我不可能取得现在的成绩最后 感谢我的丈夫郭振飞，没有他的理解、鼓励和支持，我不可能取得现 在的成绩! 最后向参加论文评阅和答辩的全体专家致以最真诚的谢意! 赵晓艳 2 0 05 年5 月 杭州华家池 浙江大学硕士学位论文 摘要 目前溶菌酶的提取研究，以鸡蛋清为主要生产原料，并且鸡蛋清中溶菌 酶被作为溶菌酶的典型代表是目前的重点研究对象。因为溶菌酶的用途广泛， 它既是药品，又是保健品，还是生化药物中理想的工具酶。目前，国外已开 始将溶菌酶作为药物制剂、食品和饮料的添加剂、生化试剂和医学诊断剂等 而研究。因此，对溶菌酶的研究及生产十分必要，特别是对禽蛋产品中溶菌 酶的高效提取技术与产品开发技术研究更为重要。综合分析及归纳起来看， 此领域今后的研究趋势是：采用树脂吸附法提取活力及得率均较高的溶菌酶， 同时需要提取工艺简单、条件温和、投资少，并可进行规模化生产，实现产 、止化。 国内外生产溶菌酶的方法有：离予交换法( t o n e x c h a n g e ) 、超滤法 ( u l t r f i l t r a t i o r t ) 、以亲和力为基础的生物分离技术( a f f i n i t y b a s e db i o s e p e r a t i o n t e c h n i q u e ) 、膜色谱技术( m e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h yt e c h n i q u e ) 、反胶团萃取 ( r e v e r s e dm i c e l l a re x t r a c t i o n ) 技术等。因离子交换法提取工艺资金投入少， 操作简单，可大规模工业化生产，所以一直以来做为溶菌酶提取的首选方法。 目前国内外提取溶菌酶的原料来源主要是鸡蛋，而用新鲜鸭蛋清提取溶 菌酶尚属空白。针对浙江省家禽业主要为鸭类的实际情况，本课题以鸭蛋综 合利用为目的，提取鸭蛋清中微量的溶菌酶，通过研究提高我国禽蛋产品中 高附加值天然产物高效提取技术与产品开发技术水平，提高禽蛋产品的商品 价值，真正使农畜产品加工业成为农畜产业的龙头，牵动浙江省乃致我囡葬 禽业的发震，增强我国禽蛋产品在国际市场的竞争力。符台我国经济发展的 需要。 本试验采用传统的弱酸性阳离子交换树脂吸附法本着对蛋清功能特性 影响小、工艺简单、成本低、酶提取率高以及酶活力也较高的宗旨，实验室 研究鸭蛋清中溶菌酶的提取，以期获得理想的工艺方法。最后确定离子交换 树腊吸附法提取鸭蛋清中溶菌酶的最佳工艺条件为：蛋清树脂比5 ：1 、提取 时间3 5 小时、洗脱液浓度1 m o l l 、洗脱液用量1 5 倍。真空冷冻干燥。最终 所得溶菌酶的得率为9 1 ，2 ，酶活力3 5 2 8 6 5u r a g 。 浙江大学硕士学位论文 关键词鸭蛋清溶菌酶树脂吸附法溶壁微球菌 _ 1 一j 1 日l 螽 改革开放以来，我国养禽业迅速发展，现已成为世界上禽蛋第一生产大 国，从1 9 8 5 年开始，我国禽蛋产量连续1 9 年雄居世界第一位。1 9 8 0 年蛋 类产量最高的国家是美国( 4 1 3 万吨) ，中国的年产量只是美国的6 2 2 3 ，在 世界上所占份额只为9 0 7 ，此后的十几年时间，我国蛋类总产量发展速度为 世界最快，跃超过美国，此期世界蛋类年平均增长速度是2 3 9 ，中国为 l33 2 ，产量为美国的3 _ 8 5 倍，到1 9 9 5 年在世界上所占份额增加到4 2 8 5 ， 十五年间增加了3 3 7 8 个百分点。我国作为全球禽蛋生产和消费大国，接近发 达国家水平，社会商品量约9 6 0 万吨，商品化率提高到4 1 ，20o3 年， 我国禽蛋产量2 5 6 0 7 万吨，比上年增长5 8 5 ，占世界总产量的4 3 ，年入均 占有量达到1 9 3 4 公斤。尽管我国养禽业的发展很快，禽蛋产量不断增加，但 是我国的禽蛋加工业却未跟上禽蛋生产的步伐。2 0 0 3 年我国加工蛋出口累计 2 8 l 亿枚，出口额1 9 9 2 6 万美元。但蛋品深加工比例仅为0 2 6 ，远远低于发 达国家1 5 至4 0 的水平 2 1 目前我国禽蛋还是主要以鲜蛋形式上市，禽蛋加 工率低，加工企业少。此外我国蛋制品加工业起步较晚，禽蛋产品单一，技 术含量低，还未形成规模化生产，远远落后于欧、美等发达国家。由于蛋制 品加工业落后，不能调节鲜蛋生产与加工、消费之间的平衡，加上禽蛋不便 于运输，造成大规模蛋禽饲养地如东北三省等地区的禽蛋供过于求，价格偏 低，特别是华北、东北的蛋鸡生产大省，许多禽蛋生产厂亏损，严重影响了 蛋禽饲养者的积极性，限制了我国养禽业的持续发展。为解决这些问题，发 挥我国禽蛋优势，开发禽蛋深加工技术，生产溶菌酶、卵磷脂、免疫球蛋白 等科技含量高的功能性产品增加产值利润，对促进我国养禽业的持续发展 和蛋制品加工业豹发展、蛋制品生产的多样化及像健食品的开发具有重要意 义。这样既综合利用了我国禽蛋资源，又创造了更高的经济效益。 我国是养禽大国，禽蛋产量约占世界产蛋总量的4 1 9 ，自。2 - - 十世纪八十 年代中期己连续十九年雄居世界首位；同时我国鲜蛋的人均占有量也名列前 浙江大学硕士学位论文 茅，是世界人均占有量的2 倍，目前，我国年产鲜蛋i o o 万吨以上的省份有7 个。但是，我国禽蛋生产量虽大，加工技术水平却相对较低，尤其是禽蛋产 品中高附加值天然产物高效提取技术与产品开发技术水平很低，致使禽蛋产 品成为低附加值的商品，制约了养禽业的持续发展。 过去十几年中，由于技术落后和国内企业无力承担高昂的成本，再加上 少数发达国家对溶菌酶技术与价格施以垄断，延迟了溶菌酶在国内的开发利 用。8 0 年代中期，我国仅有上海和汉口两个生化制药厂勉强维持溶菌酶口含 片、肠溶片和口腔药膜三个药制口的低档次小规模生产 1 。近十年来，随着 蛋制品工业的飞速发展，溶菌酶的开发亦越来越多，其技术含量相对也有所 提高。 浙江省是我国鸭蛋的主要生产省，长期以来鸭蛋的消费只停留在初加工 层次：如成鸭蛋、皮蛋售初级趣工制品。但是这些产品的消费量是掘当低的， 这在一定程度上制约了鸭蛋产业的进一步发展。如何让鸭蛋精深加工更上一 个层次，本试验通过对鸭蛋清中溶菌酶提取工艺的研究，以期为省内及我国 的禽蛋精深加工提供一些可应用的方案。 1 1 溶菌酶的研究现状 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 又称胞壁质酶或n 一乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存 在于动、植物组织和分泌物中，以鸡蛋清中的最丰富，其含量约占蛋清蛋白 总量的3 4 3 5 ，占蛋清总量的0 ，3 3 04 ，是一种碱性蛋白酶，也是工 业上生产溶菌酶的主要来源。 1 1 1 溶菌酶的分型 溶菌酶可分为三型：c 型( 鸡卵清溶菌酶，c h i c k e ne g g w h i t e l y s o z y m e c l y ) 、g 型( 鹅卵清溶菌酶，g o o s ee g g w h i t el y s o z y m e ，g l y ) 、噬菌体 溶菌酶”1 。大部分溶菌酶都属于c 型，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶 也属1 2 型。e l y 由1 3 0 个氨基酸残基组成，相对分子质量为1 4 7 0 0 d a 1 6 1 o g l y 浙江大学硕士学位论文 最早是由j o l l e s 和c a n f i e l d 发现的，约含有1 8 5 个氮基酸残基，相对分子质 量为2 1 0 0 0 d a 。j o l l e s “1 等报道，c 型与g 型溶菌酶轻度同源。c 型活性中心的 g l u 一3 5 和a s p 5 2 可能和g 型的g l u 一7 3 和a s p 一8 6 同源，此结果已被x 线衍射 所证实19 1 0 噬菌体溶菌酶位于各种噬菌体内，对溶解宿主菌起重要作用。它 含有1 6 4 个氨基酸残基，相对分子质量为1 8 7 0 0d a “们。噬菌体溶菌酶在序列 上与c 型溶菌酶同源性较差，但它们组成的主干、结合底物的定位及催化的特 异性方面有很多相似之处。噬菌体溶菌酶的g l u l l 和a s p 2 0 与c 型溶菌酶活 性中心的g l u 3 5 和a s p 5 2 相对应，都参与组成酶的活性中心1 。在j o l l e s r 的研究中，已证明还有其它不同与c 型和g 型的溶菌酶存在“如。 1 1 2 溶菌酶的基因、结构与功能研究现状 1 1 2 1 溶菌酶的基因与结构 鸡蛋清溶菌酶基因的外显子及其内含子序列已被确定，含有4 个夕卜显子 和3 个内含子。成熟溶菌酶的基因编码1 3 0 个氨基酸残基”，在前体溶菌酶 基因中外显子l 之前还含有一段编码信号肽前导序列。外显子1 编码氨基酸 1 2 8 ；外显子2 编码氨基酸2 9 4 8 2 ；外显子3 编码氨基酸8 3 】0 8 ；外显子 4 编码氨基酸1 0 9 1 3 0 ，相邻的外显子之间共含有三个内含子。三个内含子 分别位于第2 8 位、8 2 位和1 0 8 位氨基酸之间。溶菌酶基因序列长度为相应的 m r n a 序列的7 倍。外显予与结构单位之间存在密切的关系。蛋白化学家将 溶菌酶序列分为四段：a 段1 3 9 ，b 段4 0 4 8 5 ，c 段8 6 1 0 0 ，d 段1 0 1 1 2 9 。 结构上的a 段与外显子1 编码区域不相符。内含子1 的插入点是2 8 位，而不 是4 0 位，它存在于由2 4 3 4 位氨基酸形成的一个c 【螺旋内。除a 段外，其 它外显子产物都构成一个主要结构成分，独自折叠，很少插入其它外显子单 位。c l y 蛋白结构研究表明，一个包含酶活性位点的深裂隙将酶分子分为两半。 裂隙的一半是由段( t 3 - 片层结构) 形成，它含有酶的活性中心。裂隙的另一半 是由礴个链末端的一螺旋( 即a 段和d 段) 组成。最后，由含有毡一螺旋的c 段将两半分子连接起来。外显子2 编码t r p 一2 8 到a l a 8 2 ，通过谷氨酸( g l u ) 3 5 和天冬氨酸( a s p ) 5 2 及其周围来自裂隙两侧的重要功能成分将酶的催化活 浙江大学硕士学位论文 性中心合在一起，这部分催化中心含有底物结合位点，可与糖环c 、d 、e 和 f 结合，位于d 环和e 环之间的b l ，4 糖营键是酶的作用位点。外显子3 编 码的片段与外显子2 编码的片段相连，含有a 、b 糖环及部分c 环的结合位 点，使活性中心结构完整。外显子2 产物决定了糖苷酶的活性，外显子3 决 定了酶与特异性底物的结合，外显子2 与3 相连，使酶结合底物的特异性与 催化效率提高。外显子1 和4 编码m r n a 上的翻译信号序列，这种序列位于 前体溶菌酶的信号肽和溶菌酶的n 和c 末端。这两个外显子的编码产物的空 间结构上以二硫键紧密相连，它们不直接参与酶反应，但可以稳定酶活性或 起其它一些未知的生物学作用。 1 1 2 2 溶菌酶活性中心氨基酸残基的研究进展 目前对鸡蛋 清溶菌酶 ( h e w l ) 的酶 学性质、分子结 构、催化机理乃 至酶蛋白的基因 结构己研究清 楚，使其成为研 究蛋白质结构与 功能的一个重要 的模式蛋白。已 知h e w l 是由 1 2 9 个氨基酸残 基组成的一条多肽链，含有4 对二硫键、三维结构为一较紧密的椭球形：谷 氨酸( g l u ) 3 5 、天冬氨酸( a s p ) 5 2 及色氨酸( t r p ) 6 2 残基是酶活性必需 基团，同时a s p l 0 1 、a r 9 1 1 4 、t r p l 0 8 等残基对“底物一酶复合物”的形成也起 着重要作用u 4 。对植物溶菌酶活性中心的研究较少，s m i t h 、h a w a r d 等先后对 木瓜溶菌酶进行了研究。木瓜溶菌酶中t r p 残基不参与底物的结合，活性中心 浙江大学硕士学位论文 除包括一c o o h ( a s p g l u ) 外，还必需一个c y s 。雨且，该酶受组胺抑制，基 本上不受n 乙酰葡糖胺( g i c n a c ) 抑制，这些与h e w l 有所不同1 5 1 。 易继财等采用化学修饰方法，对萝b 溶菌酶活性中心进行了初步研究1 6 1 他 f j 采用脱氨再生凡丁质凝胶亲和层柝从萝b 叶中获得了p a g e 均一的溶菌 酶，并通过微量蒸发扩散法获得其结晶。用p h 动力学研究方法和化学修饰法 对酶活性中心进行了初步研究。实验结果表明：c o o h ( a s p g l u ) 、t r p 及 h i s 残基可能为酶活性所! 必需。对t r y 、c y s 、a r g 、s e f f t h f 残基修饰后，酶活 性基本上不受影响。同时，酶活性受到组胺和g i c n a c 抑制。并且对萝h 溶菌 酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶的活性中心的相互差异进行了讨论。现有情 况表明萝h 溶菌酶活性中心与h e w l 可能不同，h e w l 的活性中心只包括 c o o h ( a s p g l u ) 和t r p 残基；亦与木瓜溶菌酶的不同，其活性中心除含c o o h ( a s p g l u ) 基团外，还含有s h 基团 。用i a a 和d t n b 对萝h 溶菌酶进 行化学修饰，酶活性基本不变，用e i i m a n 试莉法也测不出酶分予含有游离一s h 基团，只测得酶分子中舍有2 ，l l m o l s h 1 0 蛋白质的二硫键存在，所以萝h 溶菌酶活性中心可能不含游离巯基。另个h e w l 受组胺和g i c n a c 显著抑制； 而萝p 溶菌酶也受组胺显著抑制：木瓜溶菌酶不仅受组胺显著抑制，面且受 g l c n a c 抑制也较强。这些差异可能反应了萝卜溶菌酶与鸡蛋溶菌酶和木瓜溶 菌酶在功能上的变化。 l ，2 溶菌酶的抑菌特性 1 2 1 溶菌酶的基本理化性质 早在2 0 世纪2 0 年代，a l e x a n d e rf l e m i n 9 1 6 2 1 ( 1 9 2 2 ) 从人的眼泪和唾液 中发现了溶菌酶并对其性质进行了研究，称之为“一种神奇的杀菌素”。他证 实溶菌酶对g + 菌具有抗菌活性并且广泛存在于绍织和分泌物中，尤其在鸡蛋 清中含量丰富，占蛋清蛋白含量的3 5 左右1 6 3 1 0 卵清溶菌酶是最早被测定其 三维结构的酶，现在对其性质的研究已达到原子水平埔4 16 ”。其多肽链由1 2 9 个氨基酸，共1 9 5 0 个原子组成，分子量约为1 4 ，7 0 0 道尔顿。卵清溶菌酶是 种碱性蛋白质，易溶于水，在普通有机溶剂中不溶，略有甜昧 浙江大学坝上学位论文 ( m a e h a s h i 。1 9 9 8 ) 等电点为1 0 5 儿，o 。在p h 4 5 4 7 范围内，易形成晶体哺”。 酶的结构不很紧密，大多数极性基分布在表面，便于与溶剂结合。酶的整个 分子中有一个狭长的凹陷，最适小分子底物与酶结合时，正好与此长形凹陷 镶嵌，凹陷中的谷氨酸3 5 与天冬氨酸5 2 、色氨酸6 2 是活性中心的氨基酸残 基。通过傅立叶电子密度图谱( f o u r i e rm a po f t h ee l e c t r o nd e n s i t y ) 分析显示 其晶体有一个密度均匀的区带( 多肽) 和四个高密度区( 二硫键) ，外形呈粗 糙的椭圆体，分子上的大部分非极性链指向分子内部 6 4 , 6 7 1 。 溶菌酶的化学性质非常稳定，p h 在1 2 1 1 3 范围内剧烈变化时其结构几 乎不变。对于溶菌酶的活性来说，最理想的条件是p h 6 0 7 ，0 、5 0 。碱和氧 化剂对它起阻遏作用，而食盐则相反能起活化作用。粉状溶菌酶若采用低温 干燥贮存，则几乎可永不变质。即使在p h 值为中性的水溶液中，该酶也可维 持数天而不损失其活性”。1 9 7 2 年，j o l l e s ”和b e r t h o u 注意到，四边形晶 体在温度高于2 5 时，则变得不稳定，特剐是在3 7 4 06 c 时，它们转变成斜 方体状晶体。目前研究的比较清楚，在低温得到的其它形式能够变成稳定的 斜方体形式。无论怎样，它们晶体的最初条件都是一样的，仅仅不同的是过 渡点，因而在高温似乎是稳定的。其实高范围的温度，直到5 5 也能获得。 认为这种可能性是酶经历了构象转换，这种转换能说明有两种晶体形式存在。 溶菌酶的热变性是可逆的，其变性临界点是7 7 。丙酮、乙醚和乙醇可 将水溶液中的溶菌酶沉淀而不破坏其活性，s d s 等表面活性剂及碘等可阻抑其 活性。 1 2 2 溶菌酶的抑菌特性 溶菌酶的典型作用底物是细胞壁粘多糖、甲壳质及糖营。通过通过切断 n 乙酰胞壁酸( n a m ) 和n 一乙酰葡萄糖胺( n a g ) 之间的b 一1 、4 糖苷键来 催化细胞壁的肽聚糖水解，进而溶解细菌的细胞壁。有些革兰氏阴性菌，如 埃希氏大肠杆菌，也会受到溶菌酶的破坏 1 3 jv 溶菌酶对食品中一些嗜中性菌 和嗜热性产芽孢菌有不同程度的抑制。 浙江大学硕士学位论文 1 2 2 1 对嗜中性菌和嗜热性产芽孢菌的抑制 详见表1 1 。 表1 1 蛋清溶菌酶的抗菌活性 t a b l e1 - 1a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fe g gw h i t el y s o z y m e 强烈抑制菌中等程度抑制菡弱抑制菌 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h j l i cb a c i l l u sc e r e u s ( 部分菌株不被c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m 抑制) c l o s t r i d i u mc l o s t r i d i u mp e r f i n g e n s t h e r m s a c c h a r o l y t i c u mc a m p y j o b c t r e rj e j u n i e s c h e r i c h i ac o l i015 7 ：h 7 c i o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u mc l o s t r i d i u mb o t u l i n u m a 、b 、 k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e e 型 s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s s t a p h y i o c o c c u sa u r e u s y e r s i n i ae n t e r o c o i i t j c a v i b r i oc h o l e r a e 1 2 2 2 对酵母菌的抑制 许多酵母拉塔基弧在低p h 条件下生长并产生气味、乙醇和其他食品中不 希望产生的物质从而导致食品的腐败1 6 9 1 0 某些酵母对人类而言是致病性的， 如c a n d i d aa l b i c a n s 。尽管酵母不含溶菌酶的主要底物肽聚糖，但一些酵母的 细胞表面含有溶菌酶可分解的成分几丁质。 j o h n s o n 等1 在溶菌酶对一些酵母，包括s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i i ，c a n d i d ak r u s e i c a n d i d ag l a b r a t a ，c a n d i d aa l b i c a n s 浙江大学硕士学位论文 c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n s 和g e o t r i c h u mc a n d i d u m 的抑制效果试验中发现单独 添加溶菌酶对这些酵母的作用较微弱，但是在同时添加溶血卵磷脂或多聚l 一 赖氨酸时发现他们与溶菌酶有协同杀菌作用。 1 。2 2 3 溶菌酶对一些病原菌的抑制作用 ( 1 ) 对李斯特菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n s ) 的抑制作用7 3 1 李斯特菌是一种重要的食源性病原微生物，其污染容易造成李斯特 杆菌病，它可以在冷藏温度下缓慢生长，因此对其的控制在食品加工中 非常重要。 李斯特菌对溶菌酶的敏感程度与该菌的生理状态以及其所在的介质 或食品成份有关。低温下生长的菌体细胞比常温下生长的菌体细胞对溶 菌酶更敏感。这一点说明溶菌酶在冷藏食品中用于抑制李斯特菌更为有 效。实验证明，蛋清溶菌酶在缓冲液中可分解李斯特菌的细胞，而在培 养基中，2 0 2 0 0 m g l 的溶菌酶仅可延迟李斯特菌的生长。但当加入 e d t a 、乳酸、胰蛋白酶、蛋白酶k 、卵类粘蛋白或乳铁蛋白时，溶菌 酶对李斯特菌的抑制作用会增强。另外，培养基中的铁的缺乏也会增强 李斯特菌对溶菌酶的敏感性。e d t a 、卵类粘蛋白或乳铁蛋白均具有结合 铁的能力，铁的缺乏会导致细菌细胞表面结构改变，从而加强了溶菌酶 对细菌的进攻能力。 ( 2 ) 溶菌酶对c l o s t r i d i u mb o f u l i n u m 的抑制作用 o 。4 cb o f u l i n u m 是低酸食品中的主要污染菌，且在气调食品和真空包装 食品中其生长繁殖更为活跃，它可以产生b o f u k i n a lt o x i n 。溶菌酶町有效 地杀死或抑制c b o f u l i n u m 的植物性细胞或阻碍其芽孢的形成。当使用一 些配合剂如：螯合剂( d t p a 、e d t a ) 、胱氨酸、乳酸链球菌素( n i s i n ) 、 聚磷酸盐、对丁基苯、山梨酸钾等，其杀菌效果会进一步增强。 浙江大学硕士学位论文 1 2 3 溶菌酶的抑菌原理 s a l t o na n dp a v i l i k ( t 9 6 0 ) 、v a k i le ta 1 ( 1 9 6 9 ) 、s h a h a n i ( 1 9 7 0 ) 、朱佳珍( 1 9 9 2 ) 、 p e r t e r s o na n dh a r t s e l l ( 1 9 9 5 ) 、刘宗柱( 1 9 9 7 ) 等研究者对溶菌酶的作用机理也 进行了深入研究，弄清了溶菌酶通过切断n 乙酰胞壁酸和n 乙酰葡萄糖胺之 间的b 一1 、4 糖苷键来催化细胞壁的肽聚糖水解，进而溶解细菌的细胞壁。研 究发现溶菌酶对链球菌、微球菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、芽孢八叠球菌、 沙门氏菌属、伤寒杆菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、布氏杆菌属、克雷伯氏杆菌 属、志贺氏杆菌属、奈瑟球菌属、假单孢菌属、巴斯德菌属、欧文氏菌属、 葡萄球菌属和链球菌属细胞壁均有定程度的水解作用。 图t - 2 溶菌酶溶菌溶菌作用示意图 ( 具有8 ，1 4 9 l y c o s i d i c 键之四醣类，被溶菌酶蛋白所水解，箭头所指处 为水解之处) 1 3 溶菌酶的应用 溶菌酶的应用领域主要是食品工业、医药临床和生物工程三大方面 1 3 1 在食品工业上的应用 1 3 1 1 可用做食品防腐剂 用溶菌酶溶液处理新鲜蔬菜、水果、鱼肉等可以防腐，研究表明 浙江大学硕士学位论文 溶菌酶、氯化钠和亚硝酸钠联合应用到肉制品中可以延长肉制品的保 质期，其防腐效果比单独使用溶菌酶或氯化钠或亚硝酸钠的效果更 好；用溶菌酶与食盐水溶液处理蚝、虾及其它海鲜产品，在冷藏条件 下贮藏，可起到保鲜作用；鱼糕、糕点、渣类等也可用溶菌酶来处理， 在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容 易腐败；此外，在干酪生产中添加溶菌酶可替代硝酸盐等抑制丁酸菌 的污染，防止干酪产气，并对干酪的感观质量有明显的改善作用。1 9 9 2 年f a o w t o 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用的安 全性。 1 3 1 2 可用做食品添加剂 溶菌酶是婴儿生长发育必不可少的抗菌蛋白。它既可以杀死肠道 腐败球菌，又能增强y 球蛋白的免疫功能，提高婴儿的抗感染能力， 特别是对早产婴儿有防止体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等 功效，是婴儿功能食品的良好辅料。 溶菌酶作为双歧杆菌的增殖因子直接或间接促进婴儿肠道双歧 乳杆菌的增殖，促进婴儿胃肠道内乳酪蛋白形成微细凝乳，有利于婴 儿消化吸收。 此外，溶菌酶还可用于生产调味品，用含放线菌菌体的溶菌酶处 理酵母液可生产出含鸟苷酸、肌营酸以及其它风味物质。 1 3 2 医药临床上的应用 溶菌酶能参与人体的多糖代谢，加速粘膜组织的修复，并具有消炎、抗感 染、消肿、增强免疫机能等多种药理作用；它能分解粘厚蛋白，降低脓液或 痰液的粘度使之变稀排出；它能与血液中的抗凝血因子结合，具有止血作用， 还能提高抗菌素和其它药物的医疗效果。故而溶菌酶制成消炎药与抗菌素配 合治疗多种粘膜炎症，消除坏死粘膜，促进组织再生，同时起到止血和生血 一 塑垩查兰堡主兰垡笙塞 的作用。 另外虫牙是牙科疾病常见的一种主要原因是因为口腔中存在突变链球 菌，若在牙膏、激口水、口洁剂、口香糖中设法添加一定量的溶菌酶，则可 以杀死这些病菌，达到防止虫牙的目的。 1 3 3 溶菌酶在生物工程上的应用 溶菌酶具有破坏细胞壁结构的作用，用它溶解菌体或细胞壁可获得细胞 内容物，可用于细胞融合或原生质体转化以达到育种或生产蛋白质的目的。 因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作中必不可少的工具酶。 溶菌酶由于具有专性地分解细胞壁的能力，除了在实际生产中的应用 外，溶菌酶更广泛的应用于科学研究中。如用溶菌酶专一性地水解细胞壁的 特点，了解微生物细胞壁的构造；分解细胞壁后制备原生质体用于微生物 育种以及微生物分类等学术研究和专用试剂学。 制备细胞浸泡提取酵母膏药发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它 的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌 酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的得率，还可以大大缩短酵母膏的制 备时间。也可以用溶菌酶从酵母细胞中制备风味物质，如有些溶菌酶中除了 含有溶菌酶活性外，还含有能分解酵母细胞中的核酸为肌苷酸和鸟暂酸的单 核酸类的风味物质。 1 4 溶菌酶提取工艺的研究进展 溶菌酶在医药上用于杀菌、消炎，在食品工业上用于抗菌防腐。近年对 蛋清中有效活性物质研究重点大多围绕在溶菌酶提取技术方面。 1 9 0 7 年，尼科尔在枯草秆菌( b s u b t i l i s ) 溶解因子研究报告中开始提到 溶菌酶。1 9 2 2 年，a l e x a n d e rf l e m m i n g 从人的眼泪和唾液中发现了溶菌酶。 浙江大学硕士学位论文 随着溶菌的发展，科学工作者对其进行了大量研究。1 9 3 6 年，m e y e r 等人验 证了溶菌酶的溶菌现象；1 9 5 1 年证明溶菌酶是细菌细胞壁溶解酶：1 9 5 9 年 1 9 6 3 年s a t t o n 等人又通过实验证明溶菌酶是一种能切断n 一乙酰胞壁酸和n 一 乙酰葡萄糖胺间b 一1 、4 糖苷键的酶。2 0 世纪5 0 年代后，随着实验工具和实 验方法的发展，研究者对鸡蛋清溶菌酶和许多动物溶菌酶的研究也更加确切， 对溶菌酶的结构、氨基酸序列等有了更多的了解：对溶菌酶的提取方法研究 也不断深入，研究出溶菌酶提取的直接结晶法、超滤法、离子交换树脂吸附 法、亲和层析法、反胶束萃取法、薄层层析法、沉淀法等。研究结果表明： 直接结晶法是一种传统方法，缺点是蛋清中含盐量高，蛋清的功能特性爱到 破坏，不能再利用，造成浪费：树脂吸附法因其吸附性好、产品中不含盐， 对蛋清的破坏小而受到关注，研究也较多；其它方法因成本较高而只是试验 研究，没有得到应用。 此外，还有一些学者对溶菌酶的提取技术进行了更为深入的研究。其中 主要有： a l d e r t o n 和c a r d o n ( 1 9 4 5 ) 采用彭润土吸附溶菌酶，再用5 p l l 啶溶 出得到溶菌酶。l i c h a n ( 1 9 8 6 ) 用d u o l i t e c 4 6 4 阳离子交换柱色谱分离蛋清中 溶菌酶，再用一定浓度和p h 值的氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液将溶菌酶洗脱下 来，得到活力较高的溶菌酶，得率高达9 5 左右。d u r a n c e n 9 8 8 ) 利用两步法 即离子交换等电点沉淀同步分离蛋清中溶菌酶和抗生物素蛋白，得到高 纯度、高活力的溶菌酶和抗生物素蛋白。c h i a n g ( 1 9 9 3 ) 结合超滤和亲和色谱分 离纯化蛋清溶菌酶，二次超滤浓缩后再用几丁质纯化，得到高活力溶菌酶， 酶得率高达8 0 ，但是成本较高。赵哲勋( 1 9 9 3 ) 利用d 2 0 1 大孔离子交换树 脂从鸡蛋壳膜中提取溶菌酶，主要采用静态吸附，再经洗脱、盐析、透析纯 化而得到了活力较高的成品，活力 1 3 0 0 0 。施德恒( 1 9 9 2 ) 则采用阳离子交 换树脂c m s e p h a d e x 抽取鸡蛋壳膜中溶菌酶。蒋治息( 1 9 9 7 ) 利用超滤技术 制备溶菌酶，冷冻干燥得到的溶菌酶质量达到药用标准( 活力 4 0 0 0 u m g ) 。 而c h i n g c h u ny a n g ( 1 9 9 8 ) 利用阴离子多糖分离溶菌酶。s h u r i n gt h o u ( 1 9 9 8 ) 利用反胶束萃取鸡蛋清溶菌酶，得率9 0 ，比活高达? 3 0 0 0 u m g ，是目前有报 道的资料中溶菌酶活力最高的一种方法，但此种方法是否能达到所报道的酶 活力，尚待测定。在以上这些方法中树脂吸附法相对成本较低，但是这些方 浙江大学硕士学位论文 法都缺乏对其进行工业化的深入研究。 1 4 1 离子交换法( i o n e x c h a n g e ) 离子交换法是得用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异 进行物质分离的操作技术。在蛋清中，其它蛋白质带负电荷，而溶菌酶带正 电荷，是一种碱性蛋白质，所以可以采用弱酸性阳离子交换树脂能选择性的 提取溶菌酶。最初，这种方法应用于粗酶液中精制溶菌酶，使其纯度满足注 射级药品的要求7 钉。随即将其应用于从蛋清中提取溶菌酶，由于具有简便、 高效、成本低，且可自动化连续操作的优点，因此一直以来都是溶菌酶生产 所常用的方法。 常用的离子交换剂有d u o l i t e 4 6 4 、羧酸纤维素( p c ) 、羧甲基纤维素( c m c ) 和羧甲基琼脂糖等。l ic h a n g 等”“用d u o l i t e 4 6 4 从性质均一的蛋清溶液中 分离溶菌酶，建立的一种简便而有效的工艺过程，可使溶菌酶的回收率高达 9 0 - - 9 5 。同时采用d u o l i t e 4 6 4 分离纯化溶菌酶适合于连续自动化操作。 d u r a n c e 等他”也采用d u o l i t e 4 6 4 从未被稀释的蛋清溶液中同时分离溶菌酶和 抗生素蛋白。林亲录等f 2 2 】采用7 3 2 型树脂纯化溶菌酶，但其得率与酶活都不 太理想。同时也有很多科研者使用7 2 4 型树脂对溶菌酶进行分离纯化。 一般的离子交换剂都具有刚性小、收缩性大、再生手续麻烦，且易被柱 堵塞的弊端，而李蓉比3 1 等采用硅胶基质弱阳离子交换剂x i d a c e w c x 作为 填料制作的色谱分离纯化蛋清中的溶菌酶克服了上述的弊端，获得了良好的 分离效果，活性回收率为1 0 7 ，蛋白的比活为15 4 6 7 u m g ，纯化倍数提高了 5 6 倍。这种方法比传统的软基质离子交换色谱分离法速度快，纯化效率高。 g h o s hr 陀4 采用p o l y v i n y l i d i n ef l u o r i d e ( p v d f ) 膜从蛋清中纯化溶菌酶，此膜 通过离子交换机制选择性地结合溶菌酶，它对大量各种各样的有机溶剂、酸 等有抑制作用，能通过加热复性而不改变膜的孔度，与其他合成膜比不易阻 塞、更耐用。 1 4 2 超滤法( u l t r f ii t r a t i o n ) 浙江大学硕士学位论文 超滤技术与传统的生化分离技术相比主要的优点是产品的高产出量，然 而尽管超滤技术在反渗析及浓缩等过程中得到广泛的应用，但是它作为在生 物工业领域中潜能很大的一种蛋白质分离技术仍然未被得到充分利用。运用 超滤技术可以很好地通过调节而获得高产量的高纯度的产品，如果在无菌条 件下操作，可以直接生产无菌的溶菌酶溶液，直接用于i 临床治疗。g h o s hr 2 5 1 等1 9 9 9 年报道使用经肌血球素预处理的5 0 k d a m w c o 聚砜膜的超滤系统分离 溶菌酶。利用这种经预先处理过的膜可使溶菌酶的通过量比未经处理的膜提 高大约2 6 ，而其他的蛋清蛋白质的通过量依赖于透膜压( t r a n s m e m b r a n e p r e s s u r e ，t m p ) 。随着透膜压的升高，通过量下降，因此通过表面预处理和透 膜压调节两种方法综合使用，可使溶菌酶全部通过而其他蛋清蛋白质几乎全 部截留。在透膜压为2 0 k p a 时，溶菌酶的纯度为1 8 ，而在1 2 0 k p a 时，纯度 超过9 6 。 同样是g h o s hr 等他6 1 于2 0 0 0 年报道采用小型的中空纤维超滤系统 ( 3 0 k d a m w c o ，聚砜膜) 从蛋清干粉中分离溶菌酶。溶菌酶选择透过膜，而 其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留，改进系统的液体动力学可增加溶菌酶 透过量，从而获得较高的得率。用这种超滤方法只能得到中等纯度的溶菌酶， 可用于食品行业，如果要在医药行业上使用，则需要经过进一步的精制。 c h i a n g 啪等于1 9 9 3 年报道过使用超滤与亲和色谱相结合的二步分离纯 化方法。经过第一步超滤与反渗析过程可回收9 6 的溶菌酶活力，第二步可 得到7 0 4 0 0 u m g 蛋白，总的溶菌酶回得率可达7 9 。 1 4 3 以亲和力为基础的生物分离技术( a f f i n i t y b a s e d b i o s e p e r a t i o nt e c h n i q u e ) 1 4 3 1 固定金属亲和层析( i m m o b i l i z e dm e t a la f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y 。i 【a c ) 固定金属亲和层析是指蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应并与之 浙江大学硕士学位论文 结合，可用于吸附纯化蛋白质。用螯合剂将金属离子固定在固体表面会减少 蛋白质金属相互反应的自由度，蛋白质因此也不容易失活，在后继的分离纯 化过程中仍然保持较高活性。它的优点是可用不同的金属离子固定到螯合载 体上，因此可用一种更强的螯合剂将所用的螫合剂洗脱下来从而实现再生1 2 8 1 i v a n o va e 等i 【2 9 1 报道在蛋白质的固定金属亲和层析中，v c l v i 合成共聚物 被研究作为热敏，可重复使用的置换剂，这种共聚物的平均分子量为 1 1 7 0 0 9 t o o l ，是以单体摩尔比9 ：l 通过自由基聚合反应而形成的。它可以被 i m a c 和热沉淀过程分为几个组分，当某一组分平均含有v 1 8 ，5 时，在 c u ”一i d a s e p h a r o s e 上用i m a c 分离溶菌酶和其他蛋白质时可做为一种非常 有效的、可重复使用的置换剂。在置换层析过程中蛋清蛋白质的回收率大于 9 5 。置换剂能在4 8 。c 通过热沉淀定量地从蛋白质组分中除去。 1 4 3 2 亲和沉淀( a f f i n i t yp r e c i p i t i o n ) 亲和沉淀法采用在物理场( p h 、离子强度和温度等) 改变时发生可逆性 沉淀性聚合物为亲和配基的载体，从而利用目标分子与其亲和配基的特异性 结合作用及沉淀分离的原理进行目标大分子的分离纯化，是蛋白质等生物大 分子的新型亲和技术之一。由于生物亲和相互作用的选择性高，离心分离法 操作简便，易于放大，因此亲和沉淀法不仅具有接近于亲和层析法的纯化效 率，而且可弥补亲和层析法放大困难的缺点。此外亲和沉淀操作中目标分子 与配基的亲和作用在水溶状态下，传质阻力小、吸附速率快、可处理高粘度 甚至含微粒的粗原料1 v a i d y aa a 等 1 ，3 2 1 n 一异聚丙烯酰胺与酸单体的共聚 物扶蛋清中热沉淀溶菌酶，得到9 0 的得率。他们认为使用此共聚物从蛋清 中热沉淀溶菌酶比使用p h 敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较 低的得率。 此外，s t e r b e r gm 和h e r s h b e r g e rd 等口3 】用聚丙烯酸形成p a a 溶菌酶聚 电解质复合物；c h e nc s 等 4 1 使用p h 敏感的亚微粒烯酸胶浆以及e u d r a g i t l 1 0 0 作为溶菌酶的沉淀剂对蛋清进行纯化溶菌酶。 浙江大学硕士学位论文 1 4 3 3 亲和过滤法( a f f i n i t yf i l t r a t i o n ) h el z 等口5 i 报道采用一个多步亲和过滤工艺过程纯化溶菌酶。它是将辛 巴蓝3 g a 固载在t s kg e lh w - 6 5 f 上，可制得一种亲和吸附剂。经吸附平衡 实验表明这种b l u et s kg e l 对溶茵酶具有很强的亲和力，而对b s a 则很弱。 利用一个三步亲和过滤系统分别从人工混合物及天然原料中纯化溶菌酶，其 结果与一步法相比溶菌酶的产率可从6 1 提高到9 6 。 1 4 4 膜色谱技术( m e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h yt e c h n i q u e ) 膜色谱技术是液相色谱与膜分离结合起来的种新技术，具有快速、高 效、高选择性、易于放大的特点，能满足生物大分子高效分离与纯化的要求， 它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视，广泛地应用于大分 子物质的纯化。 t 4 4 1 亲和膜色谱( a f f i n i t ym e m b r a n ec h r o a t o g r a p h y ) 2 0 世纪8 0 年代末出现了亲和膜色谱技术，兼具膜分离与亲和分离的特点， 与传统的膜分离、亲和色谱相比，不仅具有纯化倍数高，压降小，分离时间 短，生物大分子在分离过程中变性几率小，允许较快的加料速度等特点，而 且比柱亲和色谱更易实现规模化生产1 3 6 1 。 人们将固定离子亲和色谱与膜分离结合制各具有分离性能的固定金属亲 和膜用于分离纯化蛋白质，s e r a t i c a 用改性的玻璃中空纤维膜固定金属离子， 从q 胰凝乳蛋白酶原a 中分离溶菌酶1 3 7 1 郑宇3 肋、李静1 3 9 1 柴红0 1 等用 自制的金属螯合亲和膜亚氨二乙( i d a ) 一c u ”亲和膜分离纯化混合酶和蛋清 ( 壳) 中的溶菌酶，在适当的操作条件下，提取的溶菌酶纯度大于1 7 5 0 0 u m g ， 如果能进一步提高溶菌酶的得率，则该亲和膜纯化新工艺有可能取代传统的 工业生产工艺。b a y r a m o g l ug 等“”采用一种新型亲和染料配基复合膜对溶 菌酶的吸附及动力学特征进行研究，结果表明这种染料配基复合膜与普通膜 浙江大学硕士学位论文 对溶菌酶的吸附能力分别是1 2 1 5 m g m l 和8 3 m g m l ，提高了1 3 6 倍。 1 4 4 2 离子交换膜色谱( i o n e x c h a n g em e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y ) 离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的基团与目标蛋白质之间进行离 子交换作用进行分离的，其操作条件比较温和，可以有效地保持蛋白质的活 性，并可延长膜的使用寿命，缺点是选择性较差。s a s a g a w a 等h 2 1j 先在中空 纤维膜上接入环氧基团，然后通过亚硫酸钠接入s 0 3 h 基团，再与镁离子交联， 制成阳离子交换膜，用于从蛋清中分离溶菌酶。以n a h c 0 3 n a o h 缓冲液为 洗脱液，在p h 为9 0 时洗脱率达到1 0 0 。 1 4 5 反胶团萃取( r e v e r s e dm i c e l l a re x t r a c t i o n ) 反胶团是表面活性剂在非极性的有机溶剂中形成的纳米级聚集体。表面 活性剂是由亲水的极性头和疏水的非极性尾两部分组成的。当表面活性剂在 溶剂中的浓度超过临界胶束浓度( c m c 值) 时，表面活性剂就聚集，形成胶 团。在水溶液中形成的是正常的胶团，在有机溶剂中形成极性头向内，非极 性尾朝外的含有水分子内核的聚集体，即反胶团。反胶团的极性核具有包含 水和大分子( 如蛋白质) 的能力。极性核包入水后形成“水池”，当反胶团相 与含有蛋白质的水相混和时，蛋白质能溶于反胶团的“水池”中，由于水和 表面活性剂在蛋自质分予表面形成一层“水壳”，使蛋白质不与有机相接触而 得到保护。从而可利用反胶团将蛋白质从