（食品科学专业论文）降血脂益生菌选育及其特性研究.pdf

降血脂益生菌选育及其特性研究 摘要 本文通过对降血脂益生菌选育及其降解特性的研究，得出主要研究结果如 下： 1 从样品中分离纯化并筛选出可耐受p h1 5 和0 3 胆盐的高效降解胆固醇菌 株s l l 和高效降解甘油三酯菌株b c l ，初步鉴定分别为乳酸杆菌和蜡样芽胞杆 菌。利用微波一硫酸二乙酯和超声波硫酸二乙酯分别诱变s l l 和b c l 菌株，获 得具有耐酸、耐高胆盐能力的突变株s l l 5 和b c l 6 ，接种发酵4 8h 后培养基 中胆固醇和甘油三酯的降解率分别可达8 2 9 和6 4 6 ，分别提高了1 6 1 和 3 6 5 ，传代6 代发酵试验结果表明其具有遗传稳定性。突变株s l l 5 和b c l 6 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。 2 对s l l 5 菌株生长和发酵条件进行优化，确定其适宜生长的培养基为：蛋白 胨1 2 5g ，牛肉膏1 2 5g ，酵母膏6g ，柠檬酸氢二铵2g ，葡萄糖2 5g ，磷酸 氢二钾2g ，无水乙酸钠5g ，七水硫酸镁0 5 8g ，一水硫酸锰o 2 5g ，t w c c l l 8 0 1m l 。适宜生长的p h 值和温度分别为p h5 5 、3 9 。最适发酵培养基为：蛋 白胨1 2 5g ，牛肉膏1 2 5g ，酵母膏6g ，柠檬酸氢二铵3g ，葡萄糖2 0g ，磷 酸氢二钾2g ，无水乙酸钠5g ，七水硫酸镁o 8 6g ，七水硫酸亚铁o 8 3g ，一 水硫酸锰0 2 5g ，胆固醇o 8g ，t w e e n 8 00 5m l 。 3 对b c l 6 菌株生长和发酵条件进行优化，确定其最适生长的培养基为：胰蛋 白胨1 8g 、酵母膏1 0 9 、n a c l5g 、葡萄糖6g 。最适发酵培养基为：胰蛋白胨 1 5g ，酵母膏7 5g ，n a c i5g ，七水硫酸亚铁1 4g ，甘油三酯1 0m l 。最佳发 酵和生长的条件为p h6 5 、3 7 、1 6 0r r a i n 。 4s l l 5 菌株胞外和胞内均存在降解胆固酵的酶，且大多数位于胞外，降解过 程中将胆固醇吸收进入胞内。b c l 6 菌株降解甘油三酯的酶几乎都位于胞外， 胞内极少，降解过程中不将甘油三酯吸收进入胞内。 5 本文筛选的s l l 5 和b c l 6 菌株经小鼠毒性试验证实为安全菌株。小鼠饲喂 高脂饲料1 5d 后成功建立小鼠高脂血症模型。利用s l l 5 和b c l 6 菌悬液饲喂 高脂模型小鼠1 6d ，小鼠血清胆固醇和甘油三酯水平均有所下降，其中s l l 5 和b c l 6 菌株混合饲喂组降血脂效果最好，小鼠血清胆固醇和甘油三酯水平分 别下降了3 5 5 、1 4 2 ，可见该菌株具有良好的降血脂功能。 关键词：益生菌；选育：降解；胆固醇；甘油三酯 s t u d i e so nt h eb r e e d i n go fe f f i c i e n tb l o o df a t t i n e s s - d e g r a d i n gb a c t e r i u ma n dt h e i rc h a r a c t e r s a b s t r a c t t h i sp a p e rr e s e a r c h e do nt h eb r e e d i n go fe f f i c i e n tb l o o df a t t i n e s s d e g r a d i n g b a c t e r i u ma n dc h a r a c t e r so fm u t a n t s t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 w i t ht h eh i g ht o l e r a n c eo fb i l es a l t sa n da c i d e f f i c i e n tc h o l e s t e r 0 1 d e g r a d i n g s t r a i ns l la n de f f i c i e n tt r i g l y c e r i d e d e g r a d i n gs t r a i nb c lw o r es c r e e n e df r o m s a m p l e sa n dw e r ej d e n t i f i e d a sl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sa n db a e i l l u sc e r e u s s e p a r a t e l y s l l 5a n db c l - 6s t r a i n sw i t hs t e a d yt r a n s m i s s i b i l i t yw e r es c r e e n e d f r o mm u t a n t s t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fc h o l e s t e r 0 1a f t e r4 8hi n c u b a t i o nw i t h s l l - 5 s t r a i nw a su pt o 8 2 9 ，i n c r e a s e db y1 6 1 t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f t r i g l y c e r i d ea f t e r4 8hi n c u b a t i o nw i t hb e l 一6s t r a i nw a su pt o6 4 6 ，i n c r e a s e db v 3 6 5 b o t hs l l 5a n db c l - 6s t r a i n sc o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho fe c o l ia n d & a u r e u 2 t h eo p t i m u mg r o w t hm e d i u mo fs l l - 5s t r a i nw e r ep e p t o n e1 2 5g ，b e e fe x t r a c t 1 2 5 g ，y e a s t e x t r a c t6g ，( n h 4 ) 2 h c 6 h 5 0 72g ，g l u c o s e2 5g ，k 2 h p 0 42g ， c h 3 c o o n a5g ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 8g ，m n s 0 4 h 2 00 2 5g ，t w e e n - 8 01m l i t s o p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o n sw e r ep h5 5 3 9 i t so p t i m u mf e r m e n tm e d i u mw e r e p e p t o n e1 2 5g ，b e e fe x t r a c t1 2 5g ，y e a s te x t r a c t6g ，( n h 4 ) 2 h c 6 h s 0 73 9 ，g l u c o s e 2 0g ，k 2 h p 0 42g ，c h 3 c o o n a5g ，m g s 0 4 7 h 2 00 8 6g ，f e s 0 4 7 h 2 00 8 3 g ， m n s 0 4 h 2 00 2 5g ，c h o l e s t e r 0 10 8g ，t w e e n - 8 0o 5m l 3 t h eo p t i m u mg r o w t hm e d i u mo fb e l - 6s t r a i nw e r et r y p t o n e1 8g ，y e a s te x t r a c t 1 0g ，n a c i5g ，g l u c o s e6g t h eo p t i m u mf e r m e n tm e d i u mw e r et r y p t o n e1 5g 。 y e a s te x t r a c t7 5g ，n a c l5g ，f e s 0 4 7 h 2 01 4ga n dt r i g l y c e r i d e1 0m l a n di t s o p t i m u mg r o w t ha n df e r m e n tc o n d i t i o n sw c r cp h6 5 3 7 a n d1 6 0r m i n 4 t h ee n z y m eo fs l l 5s t r a i na n db c l 6s t r a i nw a sm o s t l yd i s t r i b u t e do u t s i d et h e c e i l s d u r i n gt h ed e g r a d i n gp r o c e s s ，c h o l e s t e r o lw a sa b s o r b e db ys l l 5s t r a i n ， w h i c hd i f f e r e df r o mb c l 6s t r a i n 5 s l l - 5s t r a i na n db c l - 6s t r a i nw e r ep r o v e dt ob es a f e t yb yt o x i c i t yt e s t t h et w o s t r a i n sa l lh a de f f e c to nh y p e r l i p e m i am i c em o d e l w h i c hw a si n d u c e db yf c e d i n g m i c ew i t hh i g h - f a tf o o df o r1 6d a y s m i c ef e db o t hs l l 5a n db c l 6s t r a i n sh a d 3 5 5 l o w e rs e r u mc h o l e s t e r o la n d1 4 2 l o w e rs e r u mt r i g l y c e r i d e sc o m p a r e dt o t h ec e n t r e lm i c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et w os t r a i n sh a db e t t e rd e g r a d i n g k e y w o r d s ：p r o b i o t i c s ；b r e e d i n g ；d e g r a d i n g ；c h o l e s t e r o l ；t r i g l y c e r i d e 插图清单 图2 1 胆固醇标准曲线1 6 图2 2 菌株细胞形态图片2 0 图3 1 超声波硫酸二乙酯复合诱变致死率2 4 图3 2 超声波- d e s 复合诱变筛选的突交株的降解率2 4 图3 3 微波诱变致死率2 5 图3 4 微波硫酸二乙酯复合诱交所筛选的突变株的降解率2 5 图3 5s l l 和s l l 5 菌株生长曲线2 6 图3 6b c l 和b c l 6 菌株生长曲线2 6 图4 1 胆盐浓度对s l l 5 菌株降解能力的影响3 0 图4 2 初始p h 值对s l l 5 菌株生物量的影响：3 4 图4 3 温度对s l l 5 菌株生物量的影响3 5 图4 4s l l 5 和s l l 菌株对大肠杆菌抑制作用3 6 图4 5s l l 5 和s l l 菌株对金黄色葡萄球菌抑制作用3 6 图5 1 初始p h 值对b c l 6 菌株生物量和降解能力的影响4 0 图5 2 转速对b c l 6 菌株生物量和降解能力影响4 0 图5 3 温度对b c l 6 菌株生物量和降解能力影响4 1 图5 4 不同碳源对b c l 6 菌株生物量和降解能力的影响4 1 图5 5 不同氮源对b c i 6 菌株生物量和降解能力的影响。4 2 图5 6b c l - 6 和b c l 菌株对大肠杆菌抑制作用4 5 图5 7b c l 6 和b c l 菌株对金黄色葡萄球菌抑制作用4 5 表格清单 表1 - 1 人体血脂的正常和偏高标准2 表2 - 1 胆固醇标准曲线的制作方法1 4 表2 - 2 乳杆菌分离株菌落形态及细胞形态观察结果1 7 表2 - 3 菌株耐胆酸盐能力1 8 表2 - 4 菌株的耐酸性1 9 表3 - 1 超声波诱变b c l 菌株方案2 2 表3 2s l l 5 菌株f l 、f 3 和f 6 代降解胆固醇的能力2 7 表3 - 3b c l 6 菌株f l 、f 3 和f 6 代降解甘油三酯的能力2 7 表4 - 1 酵母膏、胆固醇和吐温对s l l 5 菌株降解胆固醇能力的影响3 1 表4 2 表4 1 的方差分析3 2 表4 - 3 发酵培养基成分对s l l 5 菌株生物量和降解能力的影响3 2 表4 4 表4 3 中生物量的方差分析3 3 表5 1 发酵培养基成分对b c l 6 菌株降解能力的影响4 2 表5 - 2 表5 - 1 的方差分析4 2 表5 - 3l b 培养基成分对b c l 6 菌株生长的影响4 3 表5 4 表5 - 3 的方差分析4 3 表5 - 5 不同浓度金属离子s l l 5 菌株降解胆固醇能力的影响4 4 表5 - 6b c l 6 菌株的耐酸性4 4 表5 7b c l 6 菌株耐胆酸盐能力一4 5 表6 - 1 饲喂普通饲料及高脂饲料小鼠血脂的变化4 8 表6 2 菌株对高血脂小鼠血清胆固醇和甘油三酯的影响一4 9 独创性声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 金胆王些太堂 或其他教百机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论_ 作者签字：葫1 签字日期：御，月，乎日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金胆王些太堂 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借 阅。本人授权 金起工些太堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：训守 签字日期：加卯7 年7 2 月g 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师妣吖以 签字日期：易哆年，z 月，矿日 电话： 邮编： 致谢 本论文是在我的导师叶明教授的细心指导下完成的，从论文的选题、试验 方案的确立、实验的实旌过程到论文的修改都凝集着导师大量的心血。导师渊 博的学识、严谨求学的治学态度、兢兢业业的工作精神将使学生受益终身。两 年半的求学生涯无时无刻不见导师的谆谆教诲，感激之情非言语所能表达。在 即将完成学业之际，谨向我尊敬的叶老师致以最衷心的感谢和崇高的敬意! 感谢孙汉巨老师在做动物试验过程中提供了无私的帮助，还要感谢陈辉、 谭炜、钱晓勇、叶崇军、李世艳、朱立、陈九山、沈君子、许庆平、彭伟等同 学在试验和论文修改过程中给予的帮助，感谢他们一直鼓励我、支持我、关心 我，在此向他表示最真挚的谢意j 最后感谢我的家人对我的默默支持! i i i 作者：刘宁 2 0 0 7 年1 1 月2 9 日 第一章前言 1 1 高血脂对人体健康的影响及其调节方法 科技的发展，社会的进步，使人们的生活水平不断提高，人们的膳食营养 也日益增加，但随之而来的负面影响却是高血脂引发的动脉粥样硬化、冠心病、 脑中风等心脑血管疾病，并且发病率呈逐年上升趋势i l j 。 世界卫生组织近期报告：全世界每年有1 5 0 0 万人死于冠心病、高血压、脑 血栓等心脑血管疾病，其中6 5 岁以上的老人占8 0 以上。在我国，心脑血管 疾病、癌症和糖尿病依次是我国死亡率居于第一、二、三位的疾病，因而被称 为严重威胁人们生命与健康的“三大杀手”。心脑血管疾病发病率比解放初期增 加了4 倍，而由高血脂和高血粘度引起的心脑血管疾病更是“三大杀手”之首。 据卫生部统计，目前我国心脑血管病患有1 8 亿人，高血压1 2 亿人，高血腊 人群有近4 亿人。每年全国有3 0 0 万人死于心脑血管疾病，发病人数更以每年 6 0 0 万人的速度新增。最令人担忧的是，近年来在我国年轻人当中高血压、心 肌梗死、脑栓塞和脑溢血的患者越来越多，比3 0 年前增加了1 倍。心脑血管疾 病已不再是老年人的“专利”。世界卫生组织预测，在世界范围内传染性疾病病 死率得到有效控制之后，到2 0 2 0 年心血管疾病将成为全世界第一死因，其中主 要是冠心病和脑卒中导致的提前死亡，而其共同的病理基础都是动脉硬化【”。 动脉粥样硬化由许多因素促成，其中最重要的危险因素是高脂血症即血胆固醇 和血甘油三酯的升高 3 - 5 l 。此外，有研究报道表明原发性高血压患者与血清胆固 醇、甘油三酯均里显著正相关1 6 j ，脑梗死、脑出血中风患者的血浆粘度与血清 甘油三酯、低密度胆固醇呈正相关【7 一i ，可见高血脂己成为危害人类健康的重要 因素之一。 1 1 1 胆固酵与人体健康 胆固醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 是一种具有环戊烷多氢菲的2 7 碳化合物。人体内的胆 固酵有外源性摄入和内源性合成两种来源。正常情况下，机体有约2 3 的胆固 醇是由肝脏、小肠壁等器官自身合成的内源性胆固醇，同位素示踪试验证实人 体内胆固醇的合成速度主要受3 羟基3 甲基戊二酰c o a 还原酶的调节1 8 j ；另外 约1 3 则由膳食中获取，称为外源性胆固醇。膳食中摄入的胆固醇主要来源于 动物性食品，其中以禽蛋蛋黄，动物内脏及海产品中含量最为丰富。胆固醇是 人类生存所必需的营养成分，它既是构成细胞的重要成分，又可在体内转化形 成类固醇激素，并且是合成维生素d 3 的原料及胆汁酸的前体p j 。但是如果体内 胆固醇含量过高也会造成危害。多数动物学实验与流行病学研究显示，人类膳 食中的胆固醇与血液中的胆固醇呈正相关性，即人类膳食中胆固醇含量高，可 增加血浆胆固醇的浓度i “”】。 高血清胆固醇一直被认为是诱发人类心脑血管疾病的重要因素1 1 0 42 1 。自2 0 世纪6 0 年代初开始，这项主要由美国的k e y s 和h c g c s t c d 等人领头的研究，证 实了饱和脂肪会提高血液胆固醇水平，多不饱和脂肪起降低作用，而单不饱和 脂肪不起作用。膳食中的胆固醇也会提高血液胆固醇水平i 1 ”。现在与胆固醇 过量有关的疾病有：动脉粥样硬化、冠心病、脑中风等，已严重威胁着人类健 康f q ”。人类经历多年探索，已充分认识到高脂血症( h y p e r l i p i d e m i a ，h l p ) 与动 脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 的发生发展有非常密切的关系。大量流行病学、 基础和临床研究结果充分表明，血浆总胆固醇( 或l d l c ) 水平升高与人群中冠 心病的发病率和死亡率呈显著的正相关，降低血清胆固醇水平是动脉粥样硬化 防治最有效的措麓之一。美国国家研究会议( 1 9 8 9 ) 和英国政府国家健康报告中 都提到( 1 9 9 2 ) 限$ 1 j 饮食中脂肪和胆固醇摄入量的必要性1 1 钉。美国及我国国内的 营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入标准位不应超过每人每天2 5 0 - - 3 0 0m g ， 高胆固醇患者及老年人，每人胆固醇的摄入量应控制在3 0 0m g 以下i 坩j 。但随 着人民生活水平的提高和膳食结构的调整，胆固醇的摄入量很难加以控制。如 以上海为例，据上海市心血管病研究所在1 9 9 7 1 9 9 9 年间对3 4 6 7 名上海居民 的调查，由于每日的营养摄取量比2 0 世纪7 0 年代有明显增加，脂肪由2 4 1 增至3 1 8 ，胆固醇由2 8 2m g 上升至3 8 8m g ，碳水化合物由6 5 7 降至5 7 3 ， 上海人的血脂明显增高。 自上世纪3 0 年代国外研究者得出“动脉粥样硬化是不正常胆固醇代谢的结 果”这一结论以来，人类经历多年探索己充分认识到高脂血症与动脉粥样硬化 的发生发展有非常密切的关系。北欧辛伐他汀生存研究、胆固醇和再发事件研 究、普伐他汀长期治疗缺血性疾病研究、西苏格兰冠心病预防研究、得克萨斯 空军冠状动脉粥样硬化预防研究等5 项大规模临床试验结果十分明确证实胆固 醇升高特别是l d l - c 升高是冠心病致病性的重要危险因素。一般说来，血胆固 酵浓度每上升1 ，冠心病死亡率则上升2 。因而保持血液中胆固醇浓度在正 常范围内对于预防动脉粥样硬化和心脑血管疾病是至关重要的【2 1 。 对于正常人体，其血脂的正常和偏高标准如表1 - 1 所示。 表1 - 1 人体血脂的正常和偏高标准 t a b l e l - tr e g u l a ra n dh i g h e rl e v e lo fh u m a nl i p i di 丑s e r u m 2 1 1 2 甘油三酯与人体健康 甘油三酯( t r i g l y c e r i d e ，t g ) 是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体 内含量最多的脂类。它是人体必需的营养成分之一，是供应人体热能的主要来 源和构成细胞的基础原料，还参与体内的激素等重要生命物质的合成。大部分 组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进 行甘油三酯的合成。 高血脂及其引发的心血管病病发率逐年升高，如何降血脂成了人们关注的 焦点。降胆固醇是学者们发现较早且研究较多的一个方面，而对甘油三酯的研 究相对较少。t g 与动脉粥样硬化性心血管疾病发生的关系一直有争议，随着 对富含t g 脂蛋白残粒和小而低密度脂蛋白导致动脉粥样硬化作用的临床和基 础研究的深入，人们开始重新认识t g 在心血管病发生与发展中的重要性f 1 9 - 2 3 有关甘油三酯与心血管疾病问题上有较多争议，从二十世纪9 0 年代起，不 少学者提出了高甘油三酯血症与冠心病的发生相关【2 4 2 ”。早期有研究报道，血 甘油三酯升高可使s l d l 浓度升高，其具有较强的致动脉粥样硬化作用i ”j 。极 低密度脂蛋白中大量的胆固醇由胆固醇转运蛋白( 胆固醇t p ) 介导的脂质交换 而来，且甘油三酯水平越高，交换越活跃，极低密度脂蛋白从交换中获得的胆 固醇就越多，致动脉粥样硬化性也就越强。流行病学研究表明高水平t g 使高 密度脂蛋臼浓度下降，高密度脂蛋白浓度受甘油三酯水平的影响，两者呈负相 关【2 9 。们。近来研究表明，血甘油三酯水平异常与体内凝血因子异常密切相关， 血浆甘油三酯水平升高可以导致体内凝血因子水平升高，从而促进凝血，并可 使组织型纤溶酶原激活物抑制剂合成增加，抑制纤维蛋白溶解，形成高凝状态 【3 1 1 ，使冠心病危险性升高。a u s t i n 等学者研究表明：高甘油三酯血症是冠心病、 动脉粥样硬化、心肌梗的独立危险因素f 3 2 。州。流行病学的研究和一些临床试验 结果已证实这一观点。 1 1 3 调节人体血清胆固醇和甘油三酯含量的方法 调节人体血清胆固醇和甘油三酯的含量防止高脂血症的对策大都围绕减少 其摄入量、抑制自身合成及促进转化排泄这三个方面展开，概括起来主要有五 种方法：( 1 ) 通过药物阻断胆固醇和甘油三酯的自体合成。莫那可林、洛伐他 汀、普伐他汀等降胆固醇药物就是通过抑制胆固醇合成途径中的关键酶( 3 羟 基3 甲基戊二酰c o a 还原酶) 的活性减少胆固醇自身合成和诱导肝脏特异性 脂肪酸转运蛋白和乙酰辅酶a 合成酶表达，促进肝脏摄取脂肪酸，抑制肝脏合 成甘油三酯来降低血清胆固醇和甘油三酯含量【3 弘3 8 】；( 2 ) 抑制小肠对胆盐的重 新吸收。胆固醇向胆酸的转化是机体向体外排泄胆固醇的重要途径，也是影响 血脂水平的关键调节点，抑制肠道中胆酸的重新吸收可使肝脏中胆酸的含量下 降，促使更多的胆固醇在肝脏内转化为胆酸，从而降低血清胆固醇的含量。纤 3 维素、药物、某些乳酸菌等均能抑制肠道中胆酸重新吸收，干扰肝肠循环，从 而降低血清胆圃醇浓度：( 3 ) 限制食用胆固醇和甘油三酯含量高的食物，以竞 争性抑制人体对食物胆固醇和甘油三酯的吸收1 3 9 4 叫。( 4 ) 用物理、化学方法去 除食物中的胆固醇和甘油三酯；( 5 ) 生物转化法去除食品中的胆固醇和甘油三 酯，此法在食品中的应用可有两种途径：一种是用微生物直接同化、降解食品 中的胆固醇和甘油三酯，另一种方法是将微生物产生的氧化酶、还原酶等酶应 用于食品【4 1 枷】。 利用物理、化学方法处理食品，降低其胆固醇和甘油三酯的含量已有一些 报道1 4 3 4 5 1 。如b 环状糊精吸附包埋、食用油和溶剂提取、分子蒸馏、真空蒸馏、 电渗析、c 0 2 超临界萃取等等。但这些方法都存在一定的缺点，例如，环糊精 在许多国家不是合法的食品添加剂，必须要用酶分解残余的环糊精，成本较高； 有机溶剂法所用溶剂会残留在油中；蒸汽法对设备的要求太高：c 0 2 超临界萃 取法的投资太大；分子蒸馏很难实现工业化等等。并且这些方法在转移胆固醇 的同时也影响食品风味或营养成分。所以利用可降解胆固醇和甘油三酯的微生 物转化和其氧化酶来处理食品，近年来受到广泛的重视【4 “4 引。 1 2 降血脂益生菌研究现状 1 2 1 降血脂益生菌研究及其机理 益生菌( p r o b i o t i c s ) 是指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物 活体。1 9 7 4 年，m a n n 和s p o c r r y l 4 9 j 发现，非洲m a s a i 人大量饮用由乳杆菌发酵 的乳制品，其体内胆固醇含量普遍较低。1 9 7 7 年，他们调查发现经常饮用酸奶 和相关发酵乳制品的美国入，其体内血清胆固醇含量也较低。其他学者也先后 通过对新生儿的研究以及直接对酸乳的研究【5 ”，发现乳酸菌具有降低人体血 清胆固醇的作用。迄今为止又有大量试验也证明了这一结论，并发现嗜酸乳杆 菌表现出最强的降胆固醇能力，且具有更多的供选择菌株类型。1 9 8 8 年日本 a i h a r a l 5 2 5 3 】就把从黄油中分离的r h o d o c o c c u se q u in o 2 3 菌株接种在鸡蛋黄中 做降解胆固醇试验效果显著，并证明没有积累酶解中间产物。澳大利亚 c h r i s t o d o u l o u 等f 5 4 】用诺卡氏菌、链霉菌、短杆菌和假单胞杆菌提取的胆固醇氧 化酶降解鸡蛋黄中胆固醇，其降解的效果是假单胞杆菌 诺卡氏菌 链霉菌。 a k a l i n 等m 】应用小鼠作为模型，分别给小鼠饲喂含有嗜酸乳杆菌的酸奶和鲜 奶，研究了乳酸菌对小鼠血清中总胆固醇含量，三酰基甘油和低密度脂蛋白浓 度的影响。他们的结论是：嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌可以显著降低小鼠血清总 胆圃醇和低密度脂蛋白含量。另外，f u k u s h i m a l 56 】和m o h a n p ”分别在小鼠和雏 鸡的研究中也获得了同样的结论。 贾士芳等f 58 l 报道了双歧杆菌除了具有一般微生物产生的一般酶类外，可能 还有一些特殊的酶系，如产生合成有机酸、多糖、维生素的酶系，分解脂肪、 4 乳糖、酪蛋白、胆酸的酶系，控制内毒素的酶系，降低胆固醇的酶系等1 9 9 8 年，张佳程等【4 0 l 利用食品基质，从1 4 个乳酸菌株中筛选出胆固醇同化率为4 0 以上的菌株9 个，其中胆固醇同化率为4 5 以上的3 个，实验还表明乳酸菌降 低胆固醇作用主要是它的胆固醇同化作用，而与胆固醇的共沉淀作用不明显。 香卫钦等( 4 7 】利用选择性培养基从成年人的粪便中分离出一株能降解胆固醇的 乳酸菌，初步鉴定为双歧杆菌，该菌能以胆固醇作为生长的唯一能源，在液体 发酵中胆固醇的降解率为3 4 6 。王成涛等 5 9 1 成功将芽胞杆菌与嗜热乳杆菌及 嗜酸乳杆菌进行原生质体融合，获得两株高效降胆固醇的乳酸菌融合子，且具 有乳酸菌发酵食品的风味特征。俞筱琦等 6 0 l 以含双歧杆菌和乳酸杆菌的微生态 制剂作动物试验，结果表明，服用微生态制剂后能够抑制肥胖型大鼠血清胆固 醇、甘油三酯升高，使高密度脂蛋白升高，并有润肠通便作用。肖琳琳1 6 1 l 从西 藏传统发酵乳中分离筛选得到一株在液体培养基中降胆固醇达到5 1 8 的于酪 乳杆菌亿a c t o b a c i l l u sc a s e i ) ，用由这株干酪乳杆菌制备的菌悬液灌胃高脂模型 小鼠1 4d 后，发现实验组小鼠血清中胆固醇和甘油三酯浓度较对照组显著降低 佃 0 0 1 ) ，同时h d l 胆固醇浓度有所增加，动脉硬化指数低于对照组的水平。 与国外相比，国内对于微生物降低血脂的研究起步较晚，且大多研究以降 解胆固醇为主。随着心脑血管疾病发病率的增加以及医学研究报告证实甘油三 酯与胆固醇一样是引发心脑血管疾病的重要因素之一，甘油三酯引起了人们的 关注，目前生物降解甘油三酯主要是以红曲、鬼伞菌、灵芝等大型药用真菌为 主【4 8 ，6 2 西3 1 ，利用益生菌降解甘油三酯的研究仍未见报道。 1 2 2 降血脂菌株的研究现状 据报道，某些微生物能在以胆固醇为唯一碳源的培养基上生长，通过降解 胆固醇来获得碳源和能量，并且有些微生物可以将胆固醇吸附在自身的细胞膜 上，进而同化胆固酵为细胞膜的组成成分。 能够降解胆固醇的微生物种类很多，目前报道 5 3 - 5 5 , 6 4 - 6 6 】的主要有：诺卡氏 菌属( n o c a r d i ae y t h r o p o l i s ；mr h o d o c h r o u s ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s ； s h y g r o s c o p i c u s ) 、红球菌属( g h o d o c o c c u se q u i ；r e r y t h r o p o l i s ) 、短杆菌属 ( b r e v i b a c t e r i u m ) 、棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u ms l o p ) 、节杆菌属臼r t h r o b a c t e r s i m p l e x ) 、假单胞菌属佛e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ) 等。这些菌株都可产生较高活 性的胆固醇氧化酶或胆盐水解酶。有的可产生较高活性的胞内酶，如诺卡氏菌 属( n o c a r d i ae y t h r o p o l i s ；n r h o d o c h r o u s ) ：还有的可产生较高活性的胞外酶，如 链霉菌属 l i v i d a n s ) 和短杆菌属阻s t e r o l i c u m ) 等。 为了寻求具有降解血脂能力较强的菌株，国内外学者进行了大量的实验研 究：如s o m k u t i 6 4 j 将链霉菌( ，叩f d 厅c e ss 职) 的胆固醇氧化酶( c h o a ) 基因克隆 到嗜链球菌和干酪乳杆菌上，意大利b r i g i d i 也将c h o a 基因克隆到芽胞杆菌 ( b a c i l l u s 艘) 、乳杆菌a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ) 和大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 中， 5 而且转化子c h o a 基因能够稳定保持。l u i 将两株节杆菌翻s i m p l e x ) 进行原生 质体融合，融合了的胆固酵氧化酶活性提高了2 0 6 0 。我国学者王成涛等1 5 9 】 则进行了有关应用原生质体融合技术构建高效降解胆固醇的乳酸菌的研究。他 们采用筛选出的具有高效降解胆固醇的芽胞杆菌t 1 2 1 ，应用原生质体融合技术 与亲本菌株嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s 简称s t ) 和嗜酸乳杆菌 ( 工a c t o b a c i l l u sa c i d l o p h i l u s 简称c 3 ) 进行融合，通过抗性标记的筛选、碳源标记 的筛选，得到的菌株接种到食品基质中，发酵后测定基质中胆固醇含量。通过 一系列的实验，获得了胆固醇转化能力高的、食品发酵性状良好的融合乳酸菌 菌株，胆固醇降解率达7 8 ，可降低食品基质中的胆固醇约3 9 4 5 ，且两株 融合子s t 1 3 3 7 、c t 2 4 8 发酵出的食品风味与亲本s t 和c 3 相似而亲本t 1 2 1 虽能大大降低食品中的胆固醇含量，但发酵出的食品风味欠佳，其直接应用于 食品发酵还有一定的问题。 1 2 3 益生菌降血脂的机制 乳酸菌等益生菌在体外和体内都有降血脂作用，这与益生菌的生长代谢有 关。其中益生菌降解胆固醇的作用得到体内和体外实验的支持，但其作用机理 至今尚无定论，主要有3 种观点。 1 2 3 1 吸收理论 体外研究表明，在厌氧条件下，乳酸菌在含有胆盐的高胆固醇培养基中生 长时，菌体细胞可以吸收介质中的胆固醇，降低介质中的胆固醇的含量。 g i l l i l a n d ”j 等对从猪肠道中分离到的嗜酸乳杆菌a c i d o p h i l u sp 4 7 ) 进行了降低 胆固醇的体内和体外研究，并以类胸膜炎体代替胆固醇加入到含有不同胆盐的 培养基中，接种后厌氧培养，发现培养液中胆固醇含量明显降低。破碎菌体细 胞后，发现细胞内胆固醇含量显著增加。他们同时指出，菌体细胞对胆固醇的 吸收因胆盐浓度，胆盐种类和菌株的不同而表现出明显的差异。g r i l l 等1 6 8 j 对 l a m y l o v o r o u s 和b b r e v e 降胆固醇的效果作了研究，发现在含有牛胆盐的高胆 固醇培养基中，厌氧条件下，a m y l o v o r o u s 细胞可以吸收介质中约5 0 的胆 固醇，b b r e v e 细胞却无胆固醇吸收现象。而在含有相同浓度的牛磺胆酸的高胆 固醇培养基中，二者均表现出较强的胆固醇吸收能力。由于菌体细胞吸收胆固 醇的机制仅仅是在纯培养条件下得到了证实，尚未经过动物及人体实验研究， 所以人们推测，由于细菌细胞吸收了肠道中的胆固醇，可能会减少机体对胆固 醇的吸收，从而导致体内血清中胆固醇的含量降低。此外，对于胆盐与乳酸菌 降胆固醇之间的关系，众多研究者均认为，适当增加胆盐浓度可以提高菌体细 胞壁的通透性，使固醇类物质渗入细胞内部，引起环境中胆固醇浓度下降【6 7 j ， 而胆盐浓度过高，则抑制细菌的生长，不利于菌体细胞对胆固醇的吸收。 1 2 3 2 沉淀理论 体外研究发现，乳酸菌产生的胆盐水解酶均可以结合胆酸分解为游离胆酸， 6 游离胆酸与胆固醇结合形成复合物共同沉淀下来，从而导致环境中胆固醇含量 的降低( 6 9 1 0 1 。k l a v e r 等【7 1 l 利用多株乳杆菌和双歧杆菌进行的降胆固醇研究证实 了这一观点。同时，t a r a n t o 和g r i l l “4 9 】对此也有相关研究，均认为胆盐水解 酶活性是胆固醇降低的关键因素。应用动物实验也证实了乳酸菌促进胆固醇沉 淀和排出的观点。m o l t 等1 7 0 j 对仔猪进行研究发现，饲喂嗜酸乳杆菌的仔猪与正 常仔猪相比，前者血清胆固醇含量较低，且粪便中类固醇排泄量较高。因此推 测，人体内也存在脱结合胆酸与胆固醇共沉淀现象，这一作用将阻止胆固醇进 入血液循环，避免了血清高胆固醇的出现。 这种降胆固醇的效果或许来源于两个方面：( 1 ) 因胆固醇的溶解度取决于 胆盐的溶解度，胆盐经水解后溶解度下降，从而致使胆固醇也一同沉淀下来1 7 2 】。 所以，胆盐水解酶催化产生的脱结合胆酸是沉淀胆固醇，降低降低血清胆固醇 含量的直接因素；( 2 ) 在体内，胆盐水解酶作用后产生的脱结合胆酸在大肠内 不被重复吸收而由粪便排出，胆酸的排出导致其在肠肝系统循环次数减少，从 而增加了胆酸的生物合成。由于胆固醇是形成胆酸的前体物，部分胆固醇需要 转化为胆酸以弥补被分解后排出体外的部分，这样就加速了胆固醇的分解代谢， 从而导致胆固醇浓度的降低f 6 9 】。因此，一些研究人员认为，口服高胆盐水解酶 活力菌株可以减少肠道胆汁酸的重复吸收，加速胆汁酸的排泄，从而起刭降低 血清胆固醇浓度的作用。 然而，纯培养条件下的研究也表明，在含有胆盐的高胆固醇培养基中，乳 酸菌沉淀胆固醇的能力受多种因素的影响，如胆盐浓度、胆盐种类、活细菌数 量和菌种以及培养液的p h 值等。适宜的胆盐浓度，较高的活菌数和较低的p h 值有利于胆固醇的沉淀。鉴于体内与体外实验结果存在的差异性，因此，仅仅 用体外实验数据和部分动物模型的的实验结果来阐述乳酸菌在人体内的胆固醇 降低机制，显然是不够充分的，尚需要更多的研究，特别是加强开展乳酸菌降 低人体血清胆固醇的研究。 1 2 3 3 其他理论 鉴于乳酸菌降低胆固醇作用受多种因素的影响，其作用方式随所采用的菌 种( 株) 和测试对象有很大差别，对于嗜酸乳秆菌和其他乳酸菌降低胆固醇的 作用，部分研究人员倾向于菌体吸收和共沉淀联合作用的观点，而且在不同条 件下乳酸菌会表现出以某一种作用方式( 吸收或沉淀) 为主的能力。此外，对 双歧杆菌的研究还发现，双歧杆菌通过抑制人体内活化的t 细胞，可以控制新 形成的低密度脂蛋白接受器，有助于降低血清胆固醇含量。利用小鼠作为模型 的实验结果表明，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌可以影响胆固醇合成途径中的3 羟基 甲基戊二酸单酞辅酶a 还原酶的活性，羟甲基戊二酞辅酶a 还原酶是胆固醇 合成过程中的限速酶，对胆固醇的合成速度起着重要的调控作用。该还原酶的 活力增加，胆固醇合成速度快，反之就慢，乳酸菌能抑制该还原酶，使酶反应 7 速度降低，从而抑制胆固醇的合成，因而具有降低血清胆固醇含量的功效。 另外，乳酸菌制剂中的一些有机酸盐类如醋酸盐，丙酸盐和乳酸盐可能对 脂肪的代谢调节，对降低血浆t c 和l d l ，升高h d l 起着一定的作用【7 引。在 乳酸菌产生的特殊酶系中，有降低胆固醇的酶系，它们在体内可以抑制胆固醇 的合成。乳酸菌及其制剂使h d l 浓度升高从而影响血液中胆固醇含量的机制目 前还不清楚，有人认为可以从一下几个方面进行探讨：( 1 ) 细胞或其它脂蛋白 来源的脂质供给增加，当富含甘油三酯蛋白颗粒增加时，转移到h d l 上的胆固 醇，磷脂和载脂蛋白量增加，因而可使h d l 浓度升高；( 2 ) 胆固醇酯转运蛋白 ( c e t p ) 活性降低。c e t p 的功能是促进胆固醇酯从h d l 转移到其它脂蛋白上。 如果c e t p 活性降低，可阻止h d l 中胆固醇酯的转移，由此可引起血浆h d l 水平提高；( 3 ) h d l 颗粒分解代谢减慢。h d l 颗粒的分解代谢减慢会使血浆h d l 浓度升高【7 4 l 。上述研究结果充分说明乳酸菌降低血清胆固醇含量的机制是复杂 的，或许还存在其他的作用机理。 1 2 4 益生菌降血脂的临床试验 采用人工配方食品喂养的婴儿到出生第5d 时，其血清中总的胆固醇浓度 为1 4 7m g 1 0 0 m l ，其粪便中e c o l i 的数量要高于乳杆菌。在这些婴儿的饮食中 添加碳酸盐或者乳酸菌可以使这两种细菌的比例逆转，与此相连的是在随后的 三天内，血清胆固醇降低，平均值为1 1 9n l g 1 0 0 m l 。当血清胆固醇水平较低时， 粪便中乳酸菌占优势地位，他们可能在胆固醇代谢中扮演着重要角色。 h a r r i s o n 对一种含有l b a c i d o p h i l u