（食品科学专业论文）丁酸梭菌高产13丙二醇菌株诱变选育及培养基优化研究.pdf

沈阳农业犬学硕士学位论文 摘要 1 ，3 - 丙二醇n ，3 - p d ) 是一个具有多种用途的中间化合物，是生产新型 p t t 纤维的主要单体。为了获得1 ，3 - 丙二醇的高产突变株，以丁酸梭菌为 出发菌株进行诱变处理，并对发酵培养基进行初步优化。 甘油由丁酸梭菌转化生成1 ，3 - 丙二醇的研究是在厌氧条件下进行的， 采用空气置换和降低氧化还原电位相结合的方法制备预还原培养基。取对数 期单细胞菌悬液适量，经过d e s 溶液诱变筛选高产突变株；再在紫外线最 适照射时间和n t g 合适诱变剂量条件下，将经d e s 诱变得到的高产菌株进 行u v + n t g 复合诱变，经初筛和复筛后采用气相色谱法测1 ，3 一丙二酵的产 量以确定高产突变株；分别对温度、p h 等培养条件和碳源、氮源、酵母膏、 金属离子等组分进行单因素实验，确定甘油转化生成1 ，3 一丙二醇的主要影 响因素，然后通过正交实验进行培养基优化。 实验研究结果表明：丁酸梭菌是严格厌氧菌，产孢予；以丁酸梭菌为出 发菌株，经过硫酸二乙酯( d e s ) 诱变及紫外线( u 和亚硝基胍( n t g ) 复 合诱变得到突变株c b u t 3 0 3 7 ，其1 ，3 - 丙二醇产量由出发菌株的2 2 9 l 提高 到1 5 7 9 l ，提高了6 1 3 倍；高浓度甘油对c b u t 3 0 3 7 的生长具有较大的抑制 作用，当甘油浓度为8 时抑制作用十分明显；酵母膏是1 ，3 - 丙二醇发酵所 必需的营养组分，添加适量的酵母膏将有利于1 ，3 - 丙二醇的产生；温度、 p h 和接种量对发酵有着重要的影响，当温度为3 5 、接种量为5 、p h 为 6 0 7 0 时有利于甘油向1 ，3 丙二醇的转化：通过对菌株c b u t 3 0 3 7 培养基 优化，确定最适发酵培养基( l _ 1 ) 是：甘油5 0 9 ，k 2 h p 0 4 3 4 9 ，k h 2 p 0 41 3 9 ， c a c l 21 5 m g ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，n h 4 c 12 o g ，f e s 0 4 7 h 2 01 0 m g ，酵母膏 2 2 ，微量元素液5m l 。在该优化条件下c b u t 3 0 3 7 突变株的1 ，3 - 丙二醇产 量为1 8 7 9 l 。 1 ，3 - 丙二醇极具吸引力的t _ ! l k 应用价值为1 ，3 一丙二醇的大规模生产展 示了美好的前景。目前c b u t 3 0 3 7 发酵能力虽然较出发菌株有了很大提高， 摘要 但还满足不了生产需求，而且高浓度的甘油对产物1 ，3 - 丙二醇的产生具有 强烈的抑制作用。为了进一步提高丁酸梭菌的1 ，3 - 丙二醇产量，除需完善 优异菌株的快速、高效筛选技术路线外，还要进一步进行菌株的甘油抗性筛 选，以获得更高产量的突变株。另外，在条件允许的前提下，可以进行甘油 批式流加发酵的研究，以便减少甘油的抑制作用，提高产物的浓度。 关键词：丁酸梭菌；甘油发酵：1 ，3 - 丙二醇；诱变；选育；培养基优化 i i 沈阳农业大学硕士学位论文 日q盂 玉米全身都是宝，玉米深加工及综合利用不仅是发展食品工业的需要， 也是进一步发展农业的需要。逐年增长的玉米产量要求我们在目前深加工和 综合利用的基础上，利用生物技术手段开拓玉米深加工市场，以提高玉米的 利用率和经济附加值。同时，逐年严峻的环境问题也要求我们从玉米中寻找 新的加工途径，如利用生物技术方法将玉米转化为无污染、生物可降解、可 反复回收利用、经济效益良好的化工、食品添加剂等产品，这样可使玉米的 经济附加值提高几十倍、甚至上百倍。近几年的发展趋势表明利用生物技术 手段将玉米转化为纤维的研究是目前世界玉米深加工研究的热点。 1 ，3 丙二醇是重要的化工和医药中间体原料，是新型聚酯纤维聚对苯二 甲酸丙二酯( p t t ) 合成的单体。与聚对苯二甲酸乙二酯( p e t ) 、聚对苯 二甲酸丁二酯( p b t ) 和尼龙等相比，p t t 具有染色性好、耐磨性强、低吸 水性、低静电等优点，可在地毯、纺织、工程塑料等领域中广泛应用( 黄象 安，2 0 0 0 ；罗抚英等，2 0 0 2 ；张从容，2 0 0 0 ) 。化学法合成1 ，3 - 丙二醇不仅投资 巨大，而且利用的原料是不可再生的石油资源，生产过程中还会产生有毒有 害的中间体。相对于化学合成法，微生物发酵法生产1 ，3 丙二醇技术的产 业化将具有划时代的意义，它将打破过去纤维产品原料全部来源于石油化工 的历史，以玉米为起始原料，首先将淀粉、淀粉水合物、糖蜜等发酵生成甘 油；甘油再在微生物的作用下发酵生成1 ，3 一丙二醇。微生物发酵法生产1 ， 3 丙二醇具有可利用再生资源、对环境污染小、副产物可降解等特点，生产 过程清洁，对环境无污染，符合二十一世纪可持续发展要求，因而它的转化 生产已成为国内外研究的重点( 王剑锋等，2 0 0 1 c ) 。 一、1 ，3 丙二醇生产概况 ( 一) 1 ，3 丙二醇性质及用途 1 ，3 - 丙二醇( 1 ，3 p r o p a n e d i o l ，简写为1 ，3 - p d ) 为无色或灰黄色微有甜味 前言 的粘稠状液体，能与水、醇、醚等互溶，难溶于苯和氯仿，无腐蚀性，是一 种重要的化工原料( 化学试剂目录手册，1 9 9 3 ) 。1 ，3 - p d 在高温下与羧酸缩合 成酯；与异腈酸盐及酸性氯化物反应生成聚氨酯：在酸性催化剂条件下与醛 酮反应生成1 ，3 - 丙二醇对苯二酸酯。1 ，3 - p d 的晶相熔点为2 2 8 ，易于生 物降解，对环境无影响。 l ，3 - p d 是一个具有多种用途的中间化合物，它可以参与杂环物合成等多 种化学反应，也可用于缩聚物如聚酯、聚氨酯等合成的单体，是生产p r i t 纤 维的关键原料( 王熙庭等，2 0 0 0 ) 。此外，1 ，3 - p d 还是一种良好的溶剂，可添 加到润滑油中起到防冻、保护作用；也是多种增缩剂、洗涤剂、防腐剂和乳 化剂的合成原料或作为涂料中的反应溶剂( 朱丙田等，2 0 0 0 ) ；1 ，3 p d 还可用 于油墨、印染、药物等；以1 ，3 - p d 代替1 ，4 丁二醇，它的用途还包括热 塑性聚氨酯、工程塑料等。 ( 二) 1 , 3 丙二醇生产状况 9 0 年代初，全世界1 ，3 - p d 的需求量很少，产量很低，1 9 9 1 年的产量 仅为1 0 0 吨。目前，1 ，3 - p d 的生产主要采用传统的石油化工生产工艺，由 于化学合成法选择性差，产率也较其它二醇的生产方法低，导致市场上其销 售价格也比较高，市场占有率远远不及乙二醇、1 ，2 - 丙二醇、1 ，4 - 丁二醇 等其它二醇( 修志龙等，2 0 0 2 ) 。 近些年，随着p t t 纤维优良性质的不断挖掘，1 ，3 - p d 的市场需求量 也发生了明显的变化。1 9 9 5 年，世界上几家著名的大化学工业公司相继投入 1 ，3 - p d 规模化生产并加紧了应用研究和开发。美国s h e l lc h e m i c a l 公司首 先实现了p 1 t 的商品化，并且开发了化学法生产1 ，3 一p d 的新工艺。该公 司于1 9 9 6 年9 月在路易斯安那洲g e i s m a r 工厂建立了生产c o r t e r r a 聚合物的 关键原料1 ，3 - p d 生产装置，年产量4 0 0 0 吨，还于1 9 9 9 年再建了一套年产 7 2 6 万吨1 ，3 一p d 和9 1 万吨c o r t e r r a 聚合物的工厂，并已于1 9 9 9 年底投 入运营。德国d e g u s s a 公司已经在a n t w e r p e n 建成年产2 吨1 ，3 - p d 的中试 基地，年产5 0 吨的大规模工业装置也己投产，并于1 9 9 9 年设计完成了年产 沈阳农业大学硕士学位论文 1 万吨的装置。美国杜邦( d u p o n t ) 公司于1 9 9 8 年从德国d e g u s s a 公司获得 了化学法生产工艺，但是它主要倾向于经济可行的微生物发酵法。d u p o n t 公司与世界上第二大工业酶生产商g e n e n c o r 国际公司共同申请了以可发酵 碳源为底物，用基因工程菌直接生产1 ，3 - p d 的专利并取得了一些进展。该 公司已于2 0 0 4 年5 月末设立合资公司准备上规模化生物法1 ，3 - p d 生产线， 预计在2 0 0 6 年投产。 根据美国一家公司的调查表明，未来全世界仅仅合成p 1 广r 就需要1 ，3 一p d 大约4 0 0 万吨，合计5 0 0 亿元，这还不包含其他领域对1 ，3 - 丙二醇的需求， 这也为1 ，3 - p d 的大规模生产展示了美好的前景( 黄象安，2 0 0 0 ) 。据了解，目 前世界上只有美国壳牌公司和杜邦公司等少数公司采用化学法批量生产1 ， 3 - p d 。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售1 ，3 - p d ，而只向客户销 售p 1 盯切片及其下游产品。 目前，我国的1 ，3 - p d 的产量非常少，仅有少数几家化学试剂厂，如上 海试剂一厂、北京化工厂等用缩水甘油酸乙醇经氢化铝锉还原制得。国内还 没有1 , 3 一丙二醇批量生产的企业。随着p 1 t 纤维等相关产品的高速发展，1 3 一 丙二醇的需求量将很快增长( 赵红英等，2 0 0 2 ；瞿国华，2 0 0 0 ) 。2 0 0 5 年清华大学 国际技术转移中心组织国内外专家，从德国引进了生物发酵法生产1 ，3 - p d 的 小试技术，并将合资致力于1 ，3 - p d 技术的逐级放大，使之成为工业化技术。 ( 三) 1 ，3 丙二醇化学合成法 目前，1 ，3 - p d 的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法( 邵敬伟 等，2 0 0 1 ；瞿国华等，2 0 0 0 ；h a s s i b ame ta l ，2 0 0 1 ) 。在化学合成生产中己具备商 业化的方法有环氧乙烷法和丙烯醛法( 刘银乾等，2 0 0 2 ) 。 1 丙烯醛路线( a c r o l e i n ) 德国d e g u s s a 公司开发出丙烯醛为原料生产1 ，3 - p d 的工业路线，其生 产的主要步骤有以下两步： a 丙烯醛水合得到3 一羟基丙醛( 3 - h p a ) c h 2 = c h c h o + h 2 0 _ h o c h 2 c h ，c h o 前言 b 3 - h p a 催化加氢制得1 ，3 - p d h o c h 2 c h 2 c h o + h 2 h o c h 2 c h 2 c 1 4 2 0 h 丙烯醛水合法反应条件比较温和，水合反应的温度一般控制在5 0 - 7 0 。 温度太低会影响丙烯醇的转化率；温度太高又会影响催化剂的使用寿命，并 且还会加快副反应的发生。水合反应的时间一般在4 h 左右。水合反应后得 到的3 羟基丙醛经浓缩、除去未反应的丙烯醛后催化加氢可制得1 ，3 - p d 。 原料丙烯醛属于易燃易爆物品，难于储存和运输，未反应的丙烯醛可回收利 用，回收率接近7 0 。 2 环氧乙烷法( e t h y l e n e ) 美国s h e l l 公司采用环氧乙烷路线，成功地开发出了经济规模的1 ，3 - p d 生产新工艺，使成本大大降低。其反应步骤如下： a 环氧乙烷在催化剂作用下与c o 和h 2 反应生成3 - h p a c 2 h 4 0 + c o + 2 h 2 _ 3 一h p a b 分离出的3 - h p a 经催化加氢生成1 ，3 - p d h o c h 2 c h 2 c h o + h 2 - - h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 国外共有三家公司研究开发出了环氧乙烷路线生产1 ，3 - p d 的工艺，该 方法的关键还是在于催化剂的制各和选择上，原料比较容易得到，也易于储 存和运输，产品成本价格低，但是设备投资大，技术难度高，尤其是催化剂 的制备和选用上很复杂( e m p t a g e m e ta l ，2 0 0 1 ) 。 除化学合成法外，还有微生物发酵生产1 ，3 p d 的方法，但后者还处于 研究和中试阶段。到目前为止，1 ，3 - p d 都是采用化学法生产的。用化学合 成法进行工业生产，由于其所用的原料是来源于石油，不仅消耗了有限的不 可再生资源，成本高，而且还会造成严重的环境污染。另外，化学法所用的 催化剂复杂，合成工艺需高压，生产工艺条件要求苛刻且不稳定，设备投资 大，对设备要求较高，回收率也不高。在石油日益紧缺的今天，研究以可再 生资源为原料、对环境污染小、产物可降解并且可以反复利用的微生物转化 法生产1 ，3 一p d 具有积极地现实意义( 乇剑锋等，2 0 0 2 ) 。 d 沈阳农业大学硕士学位论文 二、微生物发酵法生产1 ，3 丙二醇研究进展 在1 0 0 多年前，人们就知道】，3 p d 能从甘油中发酵得来。微生物发酵 甘油生产1 ，3 - p d 的研究始于2 0 世纪7 0 年代中期，那时r u c hf e 等( 1 9 7 4 ) 就对甘油在肺炎克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 中的代谢规律进行了研 究，并于1 9 7 5 年报道了在该菌种中存在两条独立的甘油代谢途径。在此后 的大约2 0 年中，人们主要集中在甘油代谢关键酶的研究上，而对甘油厌氧 发酵的研究却仅仅始于2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初期。那时，由于生物油 脂的价格降低，导致人们大量地使用脂肪分解的方法来生产工业上使用的脂 肪酸，从而也导致脂肪分解的副产物一甘油的大量积累过剩，甘油在国际市 场上的价格也随之走低。在这种情况下，欧共体国家为了缓解甘油过剩的压 力，不得不积极地进行甘油转化的研究，当时，甘油转化1 ，3 - p d 的研究被 赋予极大的热情。1 9 8 2 年和1 9 8 7 年f o r a g e 与f o r s b e r g 分别对k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 和c l o s t r i d i aa c e t o b u t y r i c u m 发酵1 ，3 - p d 的厌氧特性和影响因素 进行了研究( d e c k w e rwd ，1 9 9 5 ) 。h e y n d r i c k x ( 1 9 9 1 ) 和d a b r o c k ( 1 9 9 2 ) 等分别 对巴氏梭菌( c l o s t r i d i ap a s t e u i a n u ) 的厌氧发酵进行了报道。b i e b lh ( 1 9 9 1 ) 和 g i i n z e lb ( 1 9 9 1 ) 率先发表了丁酸梭菌( c l o s t r i d i ab u t y r i c u m ) 厌氧发酵甘油 生产1 ，3 p d 的学术论文。迄今为止的十多年里，微生物学专家们主要围绕 着发酵菌种的分离、选育、及发酵条件等方面进行研究，并对1 ，3 - p d 厌氧 发酵的机理、抑制因素、营养需求等多方面进行了报道。 ( 一) 微生物发酵法生产1 ，3 丙二醇菌种 微生物发酵法生产1 ，3 - p d 是由细菌来完成的。现已发现几种能以甘油 为底物发酵生产1 ，3 - p d 的细菌，但还没有发现可以利用其它有机物为底物 生产1 ，3 一p d 的自然菌( d e c k w e rh ，1 9 9 5 ) 。到目前为止，能够进行转化的细 菌主要有：肠道细菌中的肺炎克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ，简称肺炎 杆菌) ，产气克雷伯氏菌( k l e b s i e i l aa e r o g e n e s ) ，弗氏柠檬菌( a 加6 口c 研 f r e u n d i i ) ，絮凝肠细杆菌( e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ) ；乳杆菌属的短乳杆菌 仁a c f d b a c i l hb r e v i s ) 和布氏乳杆菌伍a c 幻b a c i l l ib u c h n e r i ) ；梭菌属的丁酸梭状 前言 ( - - ) 甘油转化生产1 ，3 p d 代谢途径 甘油j 笔兰塑霎。二羟丙酮 萎i 虱 3 - 羟基丙醛十1 ，3 - 丙二醇 再由二羟丙酮激酶( d h a 目磷酸化生成磷酸二羟丙酮p h a p ) ，从而到达了中心 生素b ，2 为辅酶的甘油脱水酶( d h a b ) 作用下生成3 - 羟基丙醛( 3 一h p a ) ；3 - h p a 6 沈阳农业大学硕士学位论文 在n a d h 参与下被1 ，3 - 丙二醇氧化还原酶还原生成1 ，3 - p d 。该途径为还 原途径，所需的n a d h 由氧化途径提供0 3 i c b lh c ta l ，1 9 9 9 ) 。 磷酸二羟丙酮( d h a p ) a d p 1 甲 a t p a d p n a d + n d h + h + t c a 臼柠檬酸臼磷酸烯醇式丙酮酸 i 声j 。a d p 扩。等a t p 1 w 一。u + u + i 骂 = 弘 i 裂a d h 州+ ， 正丁醇 2 n a d h + h + 2 h a d + a t p 丁酰磷酸 蓐篇 丁酸 乙酸 n a d h + 旷 n a 矿 图1 2 丁酸梭菌厌氧发酵甘油代谢图 f i g u r e1 2 p a t h w a y so fa n a e r o b i cg l y c e r o lm e t a b o l i s mi ncb u t y r l c u m 注： 甘油脱氢酶二羟丙酮激酶甘油脱水酶l ，3 - 丙二醇氧化还原酶 在厌氧条件下，氧化途径中生成丙酮酸的反应在不同的菌种中是一致 的，但是不同的微生物菌种厌氧代谢的副产物是不尽相同的，即丙酮酸有多 7 r 凸呦 舞蜒 粪豫 蒸 盯 m 7 i 呲 ；。汐醛$ 蘩乡婷纂基薅撼趔鬻_ 酸 也 前言 个代谢途径。在肠道细菌中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰辅 酶a 和甲酸，甲酸往往又会分解为二氧化碳和氢气。乙酰辅酶a 在经过乙 酰磷酸化形成乙酸的过程中生成过量的a t p 。在不控制p h 的条件下，丙酮 酸也可能经a 乙酸乳酸产生3 羟基丁醇并最终转化为2 ，3 一丁二醇。此外， 肠道细菌发酵的副产物中还有乳酸和琥珀酸。在巴氏梭菌中丁醇成为氧化途 径的主要产物，同时也有少量的乙醇产生( 修志龙，2 0 0 1 ；m a f i a v l 9 9 2 ；b a r b i r a t o e1 9 9 7 ；b i e b lh ，1 9 9 9 ) 。在丁酸梭菌中，细胞在铁蛋白氧化还原酶的作用下生 成乙酰c o a ，并释放出二氧化碳和氢气，乙酰c o a 进一步代谢最终主要生 成乙酸和丁酸，有时也可以伴随有甲酸和正丁醇的生成。甘油的厌氧发酵代 谢途径如图1 2 所示。 ( 三) l ，3 p d 发酵生产影响因素 1 ，3 - p d 最终浓度的大小主要取决于菌株对底物、主要产物和副产物的 耐受程度，还与酶的代谢活性有关。 1 不同发酵形式对生产能力的影响 1 ，3 - p d 发酵属于液态厌氧发酵。在发酵工艺方面，问歇发酵和连续发 酵研究的相对较多。间歇发酵可以得到较高的产物浓度，但生产强度较低； 连续发酵有利于产率的提高，但产物浓度较低。考虑到l ，3 - p d 自身特有的 性质，及常规分离费用高、高浓度有利于后期提取等特点，选择流加发酵较 为合适，且采用流加发酵可以降低底物抑制作用，提高细胞对甘油的利用。 另外，细胞固定化可以缩短菌体生长时间，提高细胞重复使用率，减少菌体 培养费用，获得较高产率，并有利于发酵过程稳定进行，目前已有人在1 ， 3 - p d 发酵方面研究开发固定化细胞的连续生产反应器。 转化率、生产强度及最终发酵浓度是1 ，3 - p d 生物转化的重要参数。丁 酸梭菌具有很好的甘油耐受力和较高的1 ，3 - p d 转化能力，利用连续发酵和 分批流加发酵，可以使1 ，3 - p d 的转化率达到0 5 5 0 6 5 m o l m o l 甘油，生产 强度为1 - 2 5 9 t h ，1 ，3 - p d 最终浓度达到5 0 6 0 9 l 。p a p a n i k o l a o u 等( 2 0 0 0 ) 新分离的丁酸梭菌生产强度可以达到5 5 9 b h ，有的丁酸梭菌突变株可以使 8 沈阳农业大学硕士学位论文 1 ，3 p d 的最终浓度达到7 0 9 l 。虽然连续发酵可以使生产强度提高到 5 6 9 l - h ，但是发酵液中1 ，3 - p d 的浓度却不及分批流加发酵的一半，对于 同一株菌来说采用连续发酵和批式发酵，选择合适的发酵条件二者转化率可 以相差不大。r e i m a n n 等( 1 9 9 8 b ) 用丁梭杆菌采用连续发酵中空纤维膜错流 过滤返回细胞的方法将生产强度提高到2 1 9 l h ，1 ，3 - p d 的含量达到2 6 5 9 l ， 但是它的致命弱点是膜容易阻塞。( g 血e e lb e ta l ，1 9 9 1 ) 。 2 底物和产物的抑制作用及其与代谢的关系 底物和产物对细胞生长的抑制作用是普遍存在的，对于任何甘油发酵生 产1 ，3 - p d 的菌株来说，都会受到底物和产物的抑制作用。 高浓度甘油对发酵1 ，3 - p d 生产具有强烈的抑制作用。赵红英等人( 2 0 0 2 ) 研究了底物甘油浓度对g l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 发酵生产1 ，3 - p d 的影响，针 对底物抑制现象，提出了菌种驯化和流加甘油发酵两种解决途径。在较高甘 油初始浓度( 7 8 9 r e t o o l l ) 的情况下，使用驯化培养获得的耐底物抑制菌株， 采用流加甘油发酵工艺，可使1 ，3 一p d 浓度和转化率分别达到3 9 7 7 m m o l l 和0 6 2 5 m o l m o l 。 在以甘油为唯一碳源并缺少其它外源还原当量的情况下，1 ，3 p d 形成 的生理作用就是把在生物合成和副产物形成过程中释放的还原当量再氧化。 乙酸、乙醇、丁酸等副产物对细胞的生长和生存是必要的。z e n gh ( 1 9 9 4 ) 等认为抑制丁酸梭菌细胞生长的关键浓度为：乙酸( 未游离) o 4 9 l 、丁酸 0 3 9 l 、甘油9 7 9 l 、1 ，3 - p d 6 4 9 l ，并且建立了数学模式来描述几个主要副 产物、产物、和底物对丁酸梭菌的抑制作用。他认为在不添加其它抑制因子 的条件下，连续培养只可以获得很少量的丁酸；代谢产生的丁酸具有比外加 入的丁酸高2 。3 倍的抑制力，丁酸的抑制作用表现为总量。乙酸的作用方式 同丁酸相似，但是乙酸比丁酸的毒性小，乙酸对细胞生长的抑制作用主要来 自于未解离形式的乙酸。乙酸和丁酸只有在培养液中含有较低浓度的1 ，3 - p d 时，对细胞的抑制作用明显；而在含有较高浓度的1 ，3 - p d 时，1 ，3 - p d 的 抑制作用则更为突出。 9 前言 发酵产物的生长抑制可以极大地影响微生物代谢途径，机体内可以通过 n a d h 和h + 之间的相互转换来决定产物的组成。在丁酸梭菌细胞的甘油代 谢中乙酸和丁酸构成了发酵的主要途径。理论上认为，如果只有乙酸一种副 产物，1 ，3 - p d 可以得到最大产量，因此使乙酸路径成为优势路径而生成更 多的乙酸，将会有利于产量的提高。从产物的抑制作用看，在中性条件下丁 酸比乙酸对细胞生长具有更强的抑制作用，而在低p h 条件下，未解离形式 的乙酸增加，乙酸对细胞的生长抑制作用大大增强。实验表明：在丁酸梭菌 的细胞培养中，随着p h 的下降，尤其在酸性时，丁酸乙酸的比率会提高，说 明细胞的生长趋向丁酸途径；在中性条件下的连续培养和分批补料培养中， 随着稀释率增加会产生更多的乙酸和较少的丁酸，说明细胞的生长趋向于乙 酸途径( a b b a d - a n d a l o u s s ise ta l ，1 9 9 8 ) 。 在甘油受控制的连续培养中，丁酸乙酸的比值与1 ，3 - p d 的生长速率 有密切关系。从能量的角度考虑，由于丁酸路径比乙酸路径可以形成更多的 a t p ，丁酸途径比乙酸途径更为有效。在细胞生长慢或能量需求增加时，丁 酸路径占优势，生成较多的丁酸和较少的乙酸：而细胞生长快时，则形成的 乙酸量增多( a b b a d - a n d a l o u s s ise ta l ，1 9 9 5 ) 。 另外，g i i n z e l ( 1 9 9 1 ) 等认为空气流速和搅拌速度对发酵产物的形成无明 显影响。 ( 四) 1 ，3 p d 发酵底物选用 发酵生产1 ，3 - p d 的细菌中，还没有发现能利用除甘油外的其它有机物 为底物生产1 ，3 - p d 的自然菌。在以甘油为唯一底物发酵生产1 ，3 p d 的过 程中，经过微生物代谢后除产生目的产物1 ，3 - p d 以外，还可能产生乙酸、 乙醇、丁酸、2 ，3 丁二醇、乳酸、琥珀酸、丙酸等副产品( h o m a n n t e ta l ，1 9 9 0 ； b o e n i g k re ta l ，1 9 9 3 ；m e n z e l k e ta l ，1 9 9 7 ) ，这样一部分甘油在氧化途径中作为还 原当量个体而被消耗形成了副产物。因为葡萄糖可以部分取代甘油作为还原 当量的供体( 张健，2 0 0 2 ；r o b e r tg e ta l ，1 9 8 2 ) ，通过流加葡萄糖作为甘油发酵 辅助底物，既可提高菌体的浓度，还可以避免葡萄糖对过程的抑制作用，从 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 而显著提高最终发酵液中的1 ，3 - p d 浓度、甘油的转化率以及1 ，3 - p d 的生 产强度。 在实际应用中，虽然甘油的转化率可以得到提高，但是由于同时消耗了 葡萄糖，而且提供相同的还原当量所用葡萄糖的质量是甘油质量的2 倍，因 此，要综合考虑转化率和葡萄糖及甘油的价格，以便决定所采用的工艺路线 ( 修志龙，2 0 0 0 ；r e i m a n n a e ta l ，1 9 9 8 b ；r e i m a n n a e ta l ，1 9 9 6 ) 。 选择其它可发酵物质作为辅助底物的效果不是很理想，如：乙二醇，它 不仅不能提供还原当量，而且还要从甘油的氧化中获取还原当量，最终产生 乙醇，而甘油转化为乙酸，但这种转化只是无用功。只有在经济条件相同的 情况下，甘油的转化率越高，生产工艺的可行性也随之提高( r e i m a n n a e ta l ， 1 9 9 6 ) 。 ( 五) 我国微生物发酵法生产1 ，3 丙二醇研究现状 我国微生物法生产1 ，3 - p d 的研究虽然起步较晚，但已经取得一定的进 展。清华大学、大连理工大学、沈阳农业大学等单位对微生物发酵生产1 ， 3 - p d 进行了研究。清华大学课题组生物发酵法分为两步，首先将葡萄糖或淀 粉、淀粉水合物、糖蜜等发酵生成甘油。甘油在微生物的作用下发酵生成1 ， 3 - p d 。采用的复合菌株是e c o l ，c a c e t o b u t y r i c u m ，i _ c p n e u m o n i a e ，并在 c a c e t o b u t y r i c u m 中排除了导致生成副产品b u t y r a t e 的基因；在工艺上，使用 连续式或间歇式发酵方式f 张健，2 0 0 2 ；赵红英，2 0 0 2 ) ；糖到甘油的转化率为o 4 8 ( m o l m 0 1 ) ，甘油到1 ，3 - p d 的转化率为o 6 4 ( m o l m 0 1 ) ，最终1 ，3 - p d 的 浓度为8 5 9 l 。黑龙江辰能生物工程有限公司在清华大学自主开发的工艺技 术基础上，以玉米淀粉为原料，采用二步耦连发酵技术、连续喷射双法制糖 工艺、糖流加工艺、絮凝和离交工艺以及新型气升式发酵罐，成功实现1 ， 3 - p d 的中试生产，制得的1 ，3 p d 产品纯度达到9 9 9 2 ，超过了国外进口 产品，填补了我国生物法生产i ，3 一p d 的空白。中试产品送交仪征化纤、辽 阳化纤等公司进行聚合生产p 1 r 的试验表明：该产品可以满足聚酯合成及纺 丝等用途的需要，该项目工艺技术达到了国际先进水平。 刚舌 大连理工大学王剑锋、修志龙( 2 0 0 1 b ) 等人对k p n e u m o n i a e 微氧分批 和连续发酵1 ，3 - p d 进行了研究报道，提出了葡萄糖好氧发酵生产甘油与甘 油k p n e u m o n i a e 厌氧发酵生产1 , 3 丙二醇相结合的两步发酵工艺，并提出微 氧发酵的新工艺( 王剑锋等，2 0 0 1 a ) 。 沈阳农业大学食品学院课题组在刘长江教授主持下，重点放在微生物发 酵过程中高产菌株的选育、关键酶基因的重组及基因工程菌的构建方面。 2 0 0 1 年完成玉米两步发酵法生产1 ，3 - p d 的初步研究( 已经申报专利) ，获 得了玉米转化甘油的较高产菌株a 2 0 和甘油转化为1 ，3 - p d 的高产菌株 c p n - 8 6 ：已经对编码c p n 一8 6 菌株1 ，3 - 丙二醇氧化还原酶( d h a t ) 基因及 克雷伯氏杆菌( 瓦p n e u m o n i a e ) 甘油脱水酶基因在大肠杆菌中进行了成功的 克隆、测序、表达；并且进行了重组甘油脱水酶( d h a b ) 基因及其亚基酶活性 鉴定。在将来，在一个强启动子调控下通过d h a t 和d h a b 基因重组就可以实 现玉米糖一步发酵为1 ，3 - p d 的设想。 我国至今尚没有大规模生产1 ，3 一丙二醇的企业。 三、本论文研究内容 由甘油发酵生产1 ，3 - p d 已经有许多菌种，在国内已有肺炎杆菌、巴氏 梭菌的相关报道，虽然肺炎杆菌是1 ，3 - p d 转化的较好菌种，但由于它作为 肠道菌可能的致病性，所以在实际应用上受到一定限制，而有关丁酸梭菌的 相关研究还鲜见报道。本论文主要通过对丁酸梭菌诱变以期提高1 ，3 - p d 的 发酵产量。以丁酸梭菌为出发菌株，着重对微生物转化生产1 ，3 一p d 的菌株 进行物理和化学相结合的诱变处理，并对发酵培养基的成分和培养条件进行 初步了优化。 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章丁酸梭菌高产1 ，3 丙二醇菌株诱变选育 一、材料与方法 ( 一) 实验材料 1 菌种丁酸梭菌( c l o s t r i d i u m6 岫，r 耙删) a s x 2 0 9 购于中国普通微生物菌种 保藏中心。 2 试剂亚硝基胍( n t g ) 购自瑞士f l u k a 公司，上海化学试剂二厂分装； 刃天青( r e s a z u r i n ) 指示剂为进口；其它均为国产生化试剂或分析纯化学试 剂。 3 实验仪器 y q x i i 厌氧培养箱上海跃进医疗器械厂 8 5 2 恒温磁力搅拌器常州国华电器有限公司 h h 6 型数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司 f a 2 0 0 4 型电子天平上海天平仪器厂 p h s 2 5 型数字式精密p h 计上海理达仪器厂 d h g 一9 2 0 3 a 型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 z d x - 3 5 b i 自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安理疗器械厂 d w 4 0 0 5 0 l 型立式电热蒸汽两用杀菌锅上海光华机械厂 s w - c j 1 f 超净工作台苏州安泰空气技术有限公司 b c d 2 1 5 k h c 容声电冰箱 u v - 1 1 0 0 紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司 h z q f 1 6 0 全温震荡培养箱哈尔滨市东连电子技术开发有限公司 h z s h 水浴震荡器哈尔滨市东连电子技术开发有限公司 岛津g c 一9 a 气相色谱仪日本 h i t a c h ih i m a cc r 2 1 g 高速冷冻离心机日本 第一章丁酸梭菌高产1 ，3 - 丙一醇菌株筛选 其它器皿：高纯氮气瓶干燥器微生物厌氧培养瓶( 厌氧培养管)圆 底烧瓶三角瓶培养皿移液管温度计玻璃棒酒精 灯试管涂布棒接种针 分析天平( 精度度0 o o m g ) 一 次性注射器电炉 4 培养基t g l ) ( 1 ) 活化培养基：玉米粉培养基 玉米粉5 0 ，蛋白胨0 1 ，葡萄糖1 0 ，琼脂2 0 0 ，l - 半胱氨酸少量，厌 氧指示剂刃天青( o 1 ) 0 4 m l ，p h 6 8 0 0 。 ( 2 ) 斜面培养基：r c m 培养基 胰蛋白胨1 0 ，牛肉膏1 0 ，酵母膏3 0 ，葡萄糖5 o ，可溶性淀粉1 0 ，半 胱氨酸0 5 ，琼脂2 0 ，氯化钠5 o ，乙酸钠3 0 ，p h 6 8 7 0 。 ( 3 ) 种子培养基 甘油2 0 ，酵母膏2 0 ，k 2 h p 0 4 3 4 ，k h a p 0 4 1 3 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 2 0 ，c a c 0 3 2 0 ， m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 ，c a c l 2 0 0 1 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 1 ，半胱氨酸0 5 ，微量元素2 0 m l ， 铁液1 0 m l ，o 1 刃天青指示剂1 0 m l ，p h 7 0 左右。 ( 4 ) 发酵培养基：甘油5 0 ，酵母膏1 0 ，半胱氨酸盐酸盐0 5 ，其它同种子 培养基。 ( 5 ) 鉴别培养基：k 2 h p 0 41 0 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，酵母膏1 0 ，溴百里酚兰( o 2 ) 2 0 m l ，不加c a c 0 3 ，其它同种予培养基： ( 6 ) 增菌培养基：胰蛋白胨1 0 ，牛肉膏1 0 ，酵母膏3 0 ，葡萄糖5 o ，可溶 性淀粉1 0 ，半胱氨酸o 5 ，刃天青( 0 1 ) o 4 m l ，p h 6 8 7 0 。 ( 7 ) 分离培养基：不加溴百里酚兰，其它同鉴别培养基。 ( - - ) 实验方法 1 原始菌株的活化 将装有原始菌株的安瓿管用7 5 的酒精消毒开封后立即通入纯氮气，以 防止氧气进入。用无菌注射器吸取已经灭菌的液体活化培养基o 3 m l 0 5 m l ， 注入安瓿管内，轻轻振荡使其呈悬浊状后，吸取全部菌液分别移植到玉米粉 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 培养基或r c m 增菌培养基上，于3 5 。c 条件下培养4 8 h 。继续传代培养2 次， 取生长良好的菌株保藏，并进行革兰氏染色观察菌株形态。 2 预还原培养基制备 将称量好的培养基各组分溶解后装入细口圆底烧瓶内，煮沸一段时间 ( 5 1 0 m i n ) 初步驱除氧气，再通入高纯度氮气继续驱氧。与此同时在培养 基内加入o 1 刃天青溶液指示剂。当指示剂由蓝色变为浅红色时，加入少量 半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐，同时用l m o l l 的k o h 将p h 值调至所要求的 范围。当培养基变成无色时，用注射器分装到事先已置换高纯氮气的厌氧培 养瓶或管中，于1 2 1 c 灭菌1 5 m i n ，备用。 刃天青( r e s a z u f i n ) 的氧化还原指示电位为4 2 m v ，它在氧化态时呈绎 紫色，还原时无色。刃天青反应时，首先不可逆地还原为桃红色的r e s o r u f i n ， 然后在可逆地还原为无色的二氢r e s o r u f i n 。如果培养基呈现桃红色时说明培 养基已经被氧化。 3 培养方法 取新鲜斜面r c m 培养基上的菌株一环，接种于装有预还原种子培养基 的厌氧管中，于3 5 。c 条件下培养1 6 h 。 发酵培养时按一定比例( 除了特殊说明外，一般为5 v v ) 转接于厌氧 瓶的液体发酵培养基中，在3 59 c 培养4 8 h ，其中用l m o l l k o h 调节酸碱度， 使其p h 控制在6 0 - 7 o 范围之间。 4 生长曲线测定 生长曲线的测定采用活菌计数法，具体步骤如下： ( 1 ) 在装有少量玻璃珠的5 0 0 m l 带塞玻璃容器中首先通入高纯氮气，来 置换其中的氧气； 一 ( 2 ) 加入3 0 0 m l 经过预还原的发酵培养基，在1 2 14 c 条件下高压灭菌 1 5 m i n ： ( 3 ) 取培养1 8 h 的种子培养基1 5 m l ( 按照5 比例) 接种于发酵培养基 中，在3 5 。c 条件下进行静置培养，其中用l m o l l k o h 调节酸碱度，使其p h 第一章丁酸棱菌高产1 ，3 - 丙二醇菌株筛选 控制在范围6 o o 0 之间。 ( 4 ) 分别在不同时间里取培养液l m l ，使用已灭菌的预还原生理盐水逐级 稀释至1 0 3 1 0 7 ，取适当稀释度的菌液0 1 m l 涂平板，每个稀释度做3 个重复。 ( 5 ) 3 5 1 2 条件下培养4 8 h ，计算各个平板的菌落数。以培养时间为横坐标、 菌落的对数值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。 5 诱变方法 微生物诱变一般按照图2 1 所示程序进行。 原始苗株( 出发困株) 活化 士 细胞悬浮液制备 上活细胞计数 诱变预备实验诱变剂处理 上活细胞计数 中间培养 士 突变株分离 初筛复筛 图2 1 丁酸梭菌诱变一般程序 f i g u r e2 1 t h e g e n e r a lp r o c e d u r eo f m u t a t i o no ncb u t y r i c u m ( 1 ) 硫酸二乙酯( d e s ) 诱变 1 ) 单细胞悬液制备从新鲜r c m 斜面培养基中取菌种一环，接种于 2 0 m l 种子培养基中，于3 5 预培养1 6 h 1 8 h 。再在其中取5 m l 转到无菌厌氧 管中，在4 。c 条件下3 0 0 0 r p m m i n 离心1 5 r a i n ，弃上清液，沉淀用p h 7 0 磷酸缓 冲液洗涤，经玻璃珠打碎，用血球计数器计数制成1 0 7 1 0 8 个佃l 菌悬液。 敬 体 分 菌 荡集涤震收洗珠 心心璃滤离离玻过 广_il 沈阳农业大学硕士学位论文 2 ) 最佳诱变时间确定取菌悬液5 m l ，加入5 m l 2 d e s 溶液( 剂量 1 v ，混合，样品分别置于3 0 。c 恒温水浴中，1 2 2 r p m m i n 振荡处理2 0 9 0 m i n 后，用2 5 硫代硫酸钠l m l 终止诱变。取处理后的菌液0 1 m l ，逐级稀释到 1 0 5 ，分别取稀释度为1 0 、1 0 。4 、1 0 _ 5 的菌悬液各0 1 m l 在分离培养基上涂 平板；同时取未经诱变处理的菌悬液0 1 m l ，逐级稀释到1 0 1 ，分别取稀释 度为1 0 4 、1 酽、1 0 一的菌悬液各0 1 m l 在分离培养基上涂平板，作空白实 验；3 5 c 培养7 2 h ，计算致死率。每个平行作三个重复。 3 ) 初筛将诱变后的菌液稀释涂布于鉴别平板培养基上，将接种后的平 皿置于干燥器中，用凡士林密封，干燥器抽真空充氮气，进行三次空气置换 后，加入焦性没食子酸和n a o h 溶液，轻轻振荡。在3 5 。c 培养箱中倒置培养 4 8 h ，挑取菌落周围显色圈较大的菌落继续培养，进行复筛。 4 ) 复筛将初筛得到的菌株接种到种子培养基中，3 5 培养1 6 h 左右， 再按一定比例接到发酵培养基中，3 5 。c 静置培养4 8 h 。发酵液在室温下1 0 0 0 0 r p m m i n 离心1 5 m i n ，测1 ，3 - p d 的产量。 ( 2 ) 紫外线诱变 方法参照文献( 张贵友，2 0 0 3 ) ，略有改动。诱变时间为3 0 s 、4 5 s 、6 0 s 、 9 0 s 、1 2 0 s ，绘制致死曲线，确定紫外线最适照射时间。 1 ) 细菌培养接种丁酸梭菌c b u t 2 0 3 1 和c b u t 2 0 4 6 到加有少量玻璃珠的 液体种子培养基中( 1 0 0 m l 厌氧瓶装3 0 m l 培养基) ，3 5 * ( 2 静置培养1 6 h 1 8 h ， 调整厌氧瓶中的菌液浓度为1 0 7 1 0 8 个m l 。 2 ) 收集菌体将菌液在室温下4 0 0 0 r p m m i n 离心1 5 m i n ，弃上清液后，加 入3 0 m l 无菌已预还原的p h 6 0 磷酸缓冲液将细菌沉淀打匀，备用。 3 ) 细菌计数取厌氧瓶中的菌液l m l ，采用1 0 倍稀释法稀释到l f f 7 ，分 别取1 0 - 5 、1 0 一、1 0 7 三个稀释度的菌液各0 1 m l 加入到固体分离培养基上， 用无菌涂棒将菌体涂匀( 每个稀释度三个平行) 。将平皿置于培养箱中3 5 。c 培养4 8 h 后，进行平皿计数，计算出原菌液的菌浓度。 4 ) 诱变处理分别吸取厌氧瓶中的菌液9 m l 于4 个9 c m 的无菌培养皿 1 7 第一章丁酸梭菌高产1 ，3 - 丙二醇菌株筛选 中，将平皿放在磁力搅拌器上，在1 5 w 的紫外灯( 紫外灯须预先打开稳定 1 5 m i n ，使其输出功率稳定) 下，距离保持在3 0 c m 左右，分别照射3 0 s 、4 5 s 、 6 0 s 、1 2 0 s ；再将平皿放于白光中暴露3 0 m i n 后作菌液稀释，取1 0 。、1 0 4 、 1 矿三个稀释度的菌液各0 1 m l 涂布平板( 具体方法参照上一步骤) ，将平皿 用报纸包好培养计数。