（食品科学专业论文）番茄LeACBF基因的克隆及表达研究.pdf

摘要 苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 是一种诱导酶，许多环境条件以及植物激素对其活性都有不同程度的 影响，它与植物抗逆有着极其密切的关系，对植物的生理意义非常重大。彳巧f 编码了结合在苯丙 氨酸解氨酶启动子a c 富集区上的一个转录因子，a c b f 基因已经在拟南芥、烟草等植物中得到了 克隆。 根据g e n b a n k 中的拟南芥、烟草a c b f 家族成员序列比较的结果，在该基因的保守区设计简 并引物( d e g e n e r a t ep r i m e r ) 以转色期普通番茄果实的r n a 为模板，进行r t - p c r 扩增，获得 2 3 9h p 的扩增片段，以此片段作为探针筛选转色期普通番茄果实c d n a 噬菌体文库，获得了包含 全长编码区的阳性克隆。序列分析表明这个基因属于a c b f 家族，命名为l e a c b f 。l e a c b f 的 c d n a 长1 5 0 3 h p ，编码区含有4 2 8 个氨基酸。l e a c b f 与烟草中的a c b f 基因在d n a 水平上的 序列相似性为8 3 ，在氨基酸水平上的序列相似性为7 9 ，是一个新基因。l e a c b f 的d n a 序 列已在g e n b a n k 登录，登录号为a y 5 0 6 5 4 4 。 n o r t h e r n 杂交的结果分析表明：l e a c b f 基因在转色期番茄的根、茎、叶、果实等组织中均 有表达。并且表达量无明显差异。 用不同的紫外线照射时间处理番茄幼芽，苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 的活性呈先是增加，达到 最大值后再减小的趋势。通过n o r t h e r n 杂交结果的分析，l e a c b f 基因的表达量与苯丙氨酸解氨 酶( p a l ) 的活性变化具有相同的趋势。表明在紫外光照射条件下，l e , 4 c b f 编码的转录因子的变 化趋势与苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 活性的变化趋势有一定的相关性。 关键词：苯丙氨酸解氨酶，番茄，a c b f ，基因克隆，基因表达 a b s t r a c t p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e0 a l ) c a nb ei n d u c e db ym a n yk i n d so ff a c t o r si n c l u d i n g e n v i r o n m e n t ，p l a n th o r m o n ea n ds oo n i th a se f f e c to nt h es e l f - p r o t e c t i o no fp l a n t s s ot h e yh a v ea p r o f o u n dr o l ei np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t a c b fi sat r a n s c r i p t i o nf a c t o rt h a tc o m b i n e dw i t ht h e a c - r i c hr e g i o no ft h ep r o m o t e rr e g i o n i th a sb e e nc l o n e da ta r a b i d o p s i st h a l i a n a ，n i c o t i a n af 6 口c a n ds o o n a p a i ro fd e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e di nt h ec o n s e r v e dd o m a i nw h i c hb a s e do i lt h ea l i g n m e n t o fa c b fg e n ef a m i l yi nt o b a c c oa n da r a b i d o p s i s a2 3 9b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yr t - p c r 但e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ，w h i c hw a su s e da sap r o b ef o rs c r e e n i n gt o m a t o f r u i to i n ks t a g e ) e d n al i b r a r y o n ep o s i t i v ec l o n ec o n t a i n i n ge n t i r ec o d i n gr e g i o nw e r ei s o l a t c d ，w h i c h w a si d e n t i t l e da san e wm e m b e ro fa ff a m i l yb yb l a s ts e r v e r , a n dn a m e da sl e d c b et h e l e a c b fe d n ai s1 5 0 3b pa n dt h ep r e d i c t e dt r a n s l a t i o np r o d u c ti s4 2 8a m i n oa c i d s l e a c b fw a s h o m o l o g o u sw i t ht h a tg a n eo ft o b a c c ow i t h8 3 s i m i l a r i t ya tt h ea i m oa c i dl e v e la n d , w i t h7 9 s i m i l a r i t ya tt h ea m i n oa c i dl e v e l t h ee d n a q u e n c co f l e a c b fw a sd e p o s i t e di ng e n b a n ka n dt h e g 如b a n k a c c e s s i n nn u m b e ri sa y 5 0 6 5 4 4 n o r t h e r nb l o t h y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tl e a c b fh a sw e l l - d i s t r i b u t e de x p r e s s i o ni nd i f f e r e n t t i s s u e so f w i l dt o m a t o ( p i n ks t a g e ) t r e a t m e n tt h es e e d l i n gw i t hu vm a d et h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h ep a l i n c r e a s e dg r a d u a l l ya n dt h e n d e c r e a s e d n o r t h e r nb l o th y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tl e a c b fe x p r e s s i o nh a dt h es a m et e n d e n c yw i t ht h e e n z y m ea c t i v i t y a n di ts h o w e dt h a tt h e 奸a n s c r i p t i o nf a c t o r a c b fm a y b eh a v es o m e r e l a t i o nw i 山t h e e n z y m ea c t i v i t yo f 眦 k e yw o r d s ：p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ( p a l al y c o p e r s i c o n c l o n i n g ，g e n ee x p r e s s i o n l l 独创性声明 y 6 5 9 7 7 5 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：李斥九时问：瑚年年6 月16 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：专札 时间：湘，午年月、日 导师签名：时间：7 脚弘年苦月陀日 a m v a c b f e d n a d e p c e d l a e m s a i p l r g m o p s m r n a p 札 r a c e r ：i 坪c r s d s s s c 1 h s x - g a l 缩略词 a b b r e v i a t i o n a v i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u s a c r i c hb i n d i n gf a c t o r c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y i s o p r o p y l - 1 3 - d - t h i o g a l a c t o s i d e 3 - n - m o r p h o l i n 0 1 - p r o p a n e s u l f a n i ca c i d m e s s e n g e rr n a p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e m p i da m p l i f i c a t i o no f e d n a e n d s r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e h y d m x y - m e t h y l - a n l i n om e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - d a l o r o - 3 - i n d o l y l1 3 - d - g a l a c t o s i d e 鸟类成髓细胞性白血病病毒 a c 富集区结合因子 互补d n a 焦碳酸二乙酯 乙二氨四乙酸 电泳迁移率变动分析 异丙基b - d 硫代半乳糖苷 3 一( n 一吗啉代) 丙磺酸 信使r n a 苯丙氨酸解氨酶 c d n a 末端快速扩增 反转录一聚合酶链反应 十二烷基磺酸钠 标准柠檬酸盐溶液 三羟甲基氨基甲烷 5 溴_ 4 氯3 吲哚一b - d 半乳糖 中国农业人学坝i - 学位渔史 鳓搴0 l 卉 第一章引言 在自然界中，植物生长在开放的系统中，经常受到各种恶劣环境条件的影响，主要有强光、 高温、干旱、水涝和高盐等逆境胁迫，还有由病原菌造成的病害和昆虫等动物取食所造成的机械 伤害( h o n ，1 9 9 5 ) 。多数植物的活动范围有限，不能象动物或者微生物那样可以依靠逃逸来避开恶 劣的环境，因此植物在生长过程中遭遇逆境是不可避免的。但是植物对于逆境也并不是一味地忍 耐，在长期进化的过程中植物形成了一套有效的自身应对胁迫环境的防御措施：从感受环境条件 的变化到调整体内代谢，直至发生具有遗传性的改变，将抗性传递给后代( c u s h m a n ，2 0 0 0 ) 。 人们对逆境给植物造成的影响的认识和研究酋先是从表现其生理指标的一般性描述开始的， 然后是研究在各种逆境条件下植物体产生的生理生化、生态变化和生理调节机制，最后发展到分 子水平，进一步探讨植物对不同逆境的感应、信号转导、基因表达与调控、蛋白质的组装和细胞 膜的功能等等。这些研究为更深入地了解植物对不同逆境做出响应的分子机理和研究人工调控的 生物技术等发面打下了良好的基础。随着基因组学研究的发展，我们获得了大量与抗逆性有关的序 列信息和生物功能信息，从而对植物抗逆的复杂性有了更加全面的理解：植物的抗逆性往往不是由 单个基因决定的而是由一系列相关的、起直接或间接作用的基因形成一个复杂的调控网络在这 个复杂的调控网络中，任何一个环节都有可能是至关重要的( m e l c h e r s ，2 0 0 0 ) 。 1 1 苯丙氨酸解氨酶与植物抗逆 1 1 1 苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 的基本特性 1 9 6 1 年k o u k o l 和c o n n 首次从绿色植物一大麦( h o r d e u mv u l g a t e ) 中发现了苯丙氨酸解 氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a q y a s e ，p a l ) ，并进行了分离纯化( k o u k o l ，1 9 6 1 ) 。此后关于这种酶 的研究迅速展开，随着分离纯化方法的不断完善，已经成功地从拟南芥( 0 蝴，1 9 9 0 ) 、水稻( m h a m ， 1 9 8 9 ) 、小麦、马铃薯、松树( w h e t t e n ，1 9 9 2 ) 、草莓、芥菜、大豆、茶树和扬树( r a j a g o p a l s u b r a m a m i a m ，1 9 9 3 ) 等多种植物中分离纯化得到了苯丙氨酸解氮酶。至今，苯丙氨酸解氨酶已经 在所有的绿色植物中发现在真菌、细菌和藻类中也有发现( m a r s h ，1 9 6 8 ；s i k o r a ，1 9 8 2 ) 。 如图1 1 所描述，苯丙氪酸解氨酶僻札濉化l 苯丙氨酸生成反式内桂酸，是苯丙氨酸代谢途 径的关键酶。莽草酸途径产生的l 苯丙氨酸也是经过苯丙氨酸解氨酶的解氨作用生成反式肉桂酸， 从而进入苯丙烷代谢途径，生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物的，这些酸可以进一步转化为 香豆素、绿原酸，也可以形成乙酰辅酶a 酯，再进步转化为类黄酮、木质素等次生代谢产物( i f - 昌俊，2 0 0 1 ) 。这些次生物质在植物抵抗逆境上有着非常重要的作用。 中旧收、人学扒i 学位论文 弗争0 i 击 两耐艘莽革敬途径 ii j + 0本两氟馥 t 眦一生橱碱 内挂碗z = 螽向鹰合成 蟪醢陂类釉若干虫钫壤苯甲酸蘸糖控其他1 5 碳化台物 图1 - 1 植物体内苯丙烷合成代谢的一般途径 f i g 1 1 t h es y n t h e s i z em e t a b a l i s mp a t h w a yo f p h e n y l p m p a n es k e l e t o ni np l a n t 苯丙氨酸解氨酶是一种诱导酶，许多环境条件以及植物激素对其表达和活性都有不同程度 的影响。红光、白光、蓝光照射后，苯丙氨酸解氮酶活性有不同程度的上升；强效紫外光也能 引起苯丙氨酸解氨酶活性的增加；如果植物遭受到机械损伤，其苯丙氨酸解氨酶活性有明显的增 长过程。生长素g a a ) 、激动素畔) 和乙烯( 乙烯利) 都可诱导植物苯丙氨酸解氨酶基因的表达。 深入研究表明：这些有关抗逆的因子对苯丙氨酸解氨酶活性的影响是发生在转录水平上的 ( e n g e t s m a ，1 9 7 4 ；l e y v a ，1 9 9 5 ) 现在已经证明苯丙氨酸解氨酶可以受到多种因素的调控，各种类型的低温、机械伤、光照、 病原菌感染、毒素处理和昆虫取食都可以诱导苯丙氨酸解氨酶基因表达的变化，而且这种诱导 是发生在转录水平上的( 曾永三，1 9 9 9 ) 。苯丙氨酸解氨酶的酶蛋白是含有4 个相同亚单位的 寡聚体( m a r s h ，1 9 6 8 ) ，相对分子质量一般在2 2 0 ，0 ( 1 0 3 3 0 ，0 0 0 ，不同来源的酶蛋白略有差异 ( c a m m ，1 9 7 3 ) 。研究表明，苯丙氨酸解氮酶的活性随植物种类的不同而不同，并且具有组织、 器官的特异性，就同一类植物而言，苯丙氨酸解氨酶的活性具有时空特异性( s u b r a m a n i a m ， 1 9 9 3 ) 。 苯丙烷类代谢是植物次级代谢途径中很重要的一条代谢途径，对植物具有非常重要的生理 意义，一切含苯丙烷骨架的物质都是通过这一条途径直接或者间接生成的。苯丙氨酸解氨酶是 连接初级代谢和苯丙烷类代谢即催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶 和限速酶。人们发现随着苯丙氨酸解氨酶活性的升高，伴随有木质素的积累、酚类物质以及植 保素的合成，因此认为苯丙氨酸解氩酶与植物抵抗逆境有着极其密切的关系。 2 剐|， f |垦泔，附。， 中国农业人学坝l 学位论文 笫章1 j i 。 1 1 2 苯丙氨酸解氨酶对植物生理代谢的意义 苯丙烷类代谢途径可以生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些中间产 物可以进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成反式香豆酰辅酶a 酯，再通过多条途径进一步转 化为木质素、黄酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等次生代谢产物。这些产物在植物的生长发 育过程中都起着非常重要的作用，而这些物质的含量总是与苯丙氨酸解氨酶的活性密切相关，所 以苯丙氨酸解氨酶对植物的生理意义非常重大。 i 、在植物细胞分化和木质化中的作用 2 0 世纪7 0 年代以来苯丙氨酸解氨酶与细胞分化的关系已经有过不少的报道，人们发现在愈 伤组织分化的过程中，苯丙氨酸解氮酶的活性有所增高，其结果主要是造成了术质素在细胞壁中 的沉积。j i n n a k a s h i m a 等用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质素、管状分子 形成和细胞分化之间的关系，发现在百日草的细胞分化过程中，木质素的合成以及管状分子的形 成与苯丙氨酸解氨酶活性的增加成正相关( f u c u d a ，1 9 8 0 ) 。其中细胞溶质中的苯丙氨酸解氨酶 活性是在细胞木质化之前迅速上升，而微粒体和细胞壁中的苯丙氨酸解氨酶活性则是在木质化期 间快速增加的( j i mn a k a s h i m a ，1 9 9 7 ) 。 - 2 、在植物色素形成过程中的作用 早在1 9 6 0 年，n e i s h 就证实了苯丙氨酸解氨酶能催化花青素的合成( n e i s h 。1 9 6 0 ) 。苯丙烷 类代谢产物反香豆酰辅酶a 经过类黄酮途径可以生成花色素、花色素苷等，这些都是植物的花朵、 果实和叶片颜色的重要组成部分，而且这些物质的合成都与苯丙氨酸解氨酶的活性密切相关 ( r i t e n o u r ，1 9 9 6 ) 。 3 、在植物根瘤形成过程中的作用 苯丙烷类代谢产物经过类黄酮途径可以产生黄酮类化合物，有些黄酮类化合物可以作为根瘤 菌结瘤基因的诱导物质。这些黄酮类物质的含量与苯丙氨酸解氨酶的活性存在着密切的关系，在 根瘤菌形成的过程中常常伴随着苯丙氨酸解氨酶活性的逐渐增加( h a r t w i n g ，1 9 9 1 ) 。 1 1 3 苯丙氨酸解氨酶在植物抗逆境中的作用 植物对病原菌的侵染具有多方面的抵抗能力。例如，生长的形态结构对病原菌不适合，生理 代谢对病原菌的限制以及抗病物质的产生等等。植物还有类似于动物的免疫反应。如果先用无致 病力的菌株或死的病原菌接种到植物体内，植物就会产生对病原菌有毒杀作用的物质。这类物质 的产生，可认为是植物的一种免疫反应。 在研究中发现。许多植物在遭受低温、机械伤害、病害、紫外光线辐射的时候，植物自身的 防卫系统特别是苯丙烷类代谢被激活，苯丙氨酸解氨酶的活性迅速上升。苯丙氨酸代谢途径的产 物如木质素、香豆素、类黄酮等具有抑制病原菌的作用，因此该代谢的第一个关键酶一苯丙氨 酸解氨酶活性的强弱可以作为植物抗逆境能力的一个生理指标。 3 中国农业人学坝一j 学位论义 筘一章0 l 言 幽1 2 展示了在病原菌侵染等伤害条件一b - ，植物可以调动其自身复杂的防卫体系对胁迫做出 反应，其中苯丙氨酸解氨酶等与逆境有关的酶类被激活。 图i - 2 信号传导途径和调整植物防卫反应的示意图 f i g 卜2s i g n a lt r a n s d u c t i a np a t h w a ya n d t h ed e f e n c er e a c t i o no fs t r e s si np l a n t 1 1 3 i 苯丙氨酸解氨酶在抗病中的作用 经研究发现苯丙氨酸解氨酶与植物抗病性有以下几个基本特点： 1 植物感病后苯丙氨酸解氨酶的活性发生有规律的变化。感染最初几个小时酶的活性上升比 较缓慢，随后急剧上升达到顶峰，接着酶活性又急剧下降。感病后的苯丙氨酸解氨酶酶活性的变化 与植物的防御反应正好相吻合，因此苯丙氨酸解氨酶被认为是植保工程的关键酶( 曾永三，1 9 9 9 ) 。 2 致病菌对苯丙氨酸解氨酶活性的影响远远大于非致病菌。同时接种感染病原菡后，抗性强 弱不同的寄主其苯丙氨酸解氨酶的活性具有不同的表现。用病原菌接种后，抗病品系和感病品系 的苯丙氨酸解氨酶活性均有所增加，但是病原菌作用于抗病品系植物诱导所产生的苯丙氨酸解氨 酶的酶活性远比感病品系高( l o s c h k e ，1 9 8 1 ) 。 3 用毒素处理同病原菌接种感染一样能刺激苯丙氨酸解氨酶活性的升高，而且毒素的作用显 得更加强烈，反应出现得更早。从真菌培养液和菌丝细胞壁制备的激发因子也能诱导苯丙氨酸解 氨酶活性的增加。( l o s c h k e ，1 9 8 1 ) 4 用寡聚半乳糖醛酸酶( p g ) 处理杨树幼芽后也可以引起苯丙氢酸解氨酶快速而短暂的上升， 4 中国农业人：学坝i 。学位论文第一章ii ； 这是因为寡聚半乳糖醛酸酶可以释放细胞壁中的果胶部分，这些物质也可以起到内源激发因子的 作用，激发植物的防卫反应( m a r i o ，1 9 9 2 ) 。 5 病原菌的侵染、毒素或真菌培养液的诱导所引起的苯丙氨酸解氨酶活性增加的辐度与这些 激发因子的浓度有关，或者说与植物的受害程度有关。并且在侵染点的周围病原菌对酶活性的刺 激作用要高于距离侵染点较远的部分，在最边缘部位的酶活性与未感染部位的酶活性基本相同 ( r a j a g o p a ls u b r a m a m i a m ，1 9 9 3 ) 。 6 在经过诱导因子的诱导后，随着苯丙氨酸解氨酶活性的升高，苯丙烷类代谢途径及其下游 途径中的某些酶类的活性也升高，如在寡聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的诱导下，苯丙氨酸解氨酶、4 一香豆 酸一辅酶a 联结酶“吨l ) 、b 一葡萄糖苷酶均剧烈上升，而且变化规律非常相似，基本上是同步的 ( m a r i o ，1 9 9 2 ) 。 苯丙氨酸解氨酶参与植物抗病的机制： 1 、苯丙氨酸解氨酶参与木质素的合成 苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类代谢途径的关键酶，也是合成木质素的关键酶。木质素的形成 可以增加细胞壁的厚度，增加组织木质化的程度，形成病原菌入侵的机械屏障( 商旭辉，1 9 9 8 ) 。 木质素的含量增加一方面可以提高细胞壁抗真菌穿透、抗酶溶解的能力，另一方面还可以限制真 菌的酶和毒索从真菌向寄主扩散，同时限制了水和营养物质从寄主向真菌扩散，使病原菌得不到 足够的营养，从而起到抑制病原菌生长及增殖的作用( 陈慧勤，2 0 0 3 ) 。 2 、苯丙氨酸解氨酶参与植保素的合成 植保素是植物受到病原菌侵染后产生的一类低分子量的抗病化合物，是参与植物防御反应的 重要生理活性物质之一，其产生的速度和积累的量直接反映了植物抗病性的强弱。植保素与植物 局部抗性密切相关，它只局限在植株受侵染的细胞周围积累，并不被运输到植株的其它部位。抗 病与感病的植株被病原菌侵染后均可产生并积累植保素，但是在抗性植株中积累得快，可以迅速 达到高峰。主要有酚类植保素( 绿原酸、香豆素和儿茶酚等) 、异黄酮类植保索( 豌豆素、菜豆 素、大豆素、苜蓿黄素等) 和萜烯类植保素。其中，前两类都是苯丙烷类代谢的直接或间接产物， 其生成量与苯丙氨酸解氨酶的活性成正相关关系( 陈慧勤, 2 0 0 3 ) 。 3 、 苯丙氨酸解氨酶参与其它酚类物质的合成 酚类化合物也是苯丙烷代谢的产物，苯丙氨酸解氨酶活性的增高与酚类物质的合成具有一致 性。在研究植物抗性的大小与原来组织中酚类物质的含量以及染病后其含量的增加之间的关系中 发现：酚类物质含量高的幼果比成熟的果实具有更高的抵抗力( n d u b i z u ，1 9 7 6 ) 。抗性大的品种， 在受侵染后其酚类物质合成的能力迅速增加，以抵抗病原菌的侵入，而感病品种虽然在病害发展后 期酚类物质也有较多积累，但这时为时已晚，病害已经开始蔓延，这在许多植物中都得到了证实( 周 洁，1 9 9 7 ) 。有研究表明：酚类物质的氧化产物其杀菌能力大大超过原来的酚类物质。例如，有人 指出，绿原酸酶促氧化产物的杀菌力比其自身提高约3 0 ，而且在经过氧化后本来不具有抗病原 菌作用的酚类物质也可以转化成为杀菌的物质( 陈伟，1 9 9 7 ) 。 总之，苯丙氨酸解氨酶参与了植物次生抗病物质( 植保素、木质素和酚类物质) 的合成和积 累，因此认为它是一种植物防御酶。 5 中罔农业人学倾 ：学位论立第章j i 吉 1 1 3 2 苯丙氨酸解氨酶在抗虫中的作用 苯丙氨酸解氨酶参与植物抗虫的报道主要集中在这一代谢途径的产物( 木质素、植保素) 与 植物抗虫性的关系方面。木质素的积累可以使植物细胞壁加厚，成为食草类动物取食的机械障碍， 而植保素对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用( h a n l e y ，1 9 8 9 ) 。所以苯丙氨酸解氨酶活性的高 低与植物的抗虫性有很大的关系。 1 1 4 关于苯丙氨酸解氨酶基因的调控 1 苯丙氨酸解氨酶具有组织特异性 苯丙氨酸解氨酶是一个多基因的家族，不同的组织具有多种苯丙氨酸解氨酶的同工酶 ( c r a m e r ，1 9 8 9 ) 。在这个多基因家族中，不同成员的表达特异性不同( l i a n g ，1 9 8 9 ) 。不同的同工酶 定位于不同的组织细胞中，控制不同的代谢途径( l o i s ，1 9 8 9 ；p e u e g r i n i ，1 9 9 4 ) 。苯丙氨酸解氨酶 家族成员在表达上的差异，是由于它们的启动子包含不同的顺式作用元件( c i s a c t i n g d e m e n t s ) 所引起的。正是由于这些顺式作用元件和相应的转录因子的共同作用，使得苯丙氮酸解氨酶基因 的表达具有时空特异性。 2 乙烯诱导植物苯丙氨酸解氨酶基因的表达 植物在生长发育过程中和受到病原物及诱导物、伤害等刺激时，苯丙氨酸解氨酶常常伴随植 物体内乙烯生成的增加而积累。因此认为乙烯可能是植物苯丙氨酸解氨酶诱导表达的内源信号分 子( 程水源，2 0 0 3 ) 。 3 植物病原物的调控 植物苯丙氨酸解氨酶基因的表达受到植物病原物的诱导调控。植物病原物对苯丙氨酸解氨酶 基因的诱导与品种的抗性相关。抗病品种的苯丙氨酸解氨酶的m r n a 水平要远远高于感病品种。 通过n o r t h e r n 杂交分析证明，植物病原物对苯丙氨酸解氮酶基因的诱导调控是在转录水平上进行 的( s u s r r n er e i n o l d ，1 9 9 6 ) 。 4 植物苯丙氨酸解氨酶启动子在转基因植物中的表达调控 利用苯丙氨酸解氨酶的启动子和报告基因g u s 的融合物转烟草，能够迅速地诱导g u s 基因 的大量表达，而且表达不但受到环境因子的诱导调控，受到病原菌的调控，也受到转基因植物发 育阶段的调控，从而表现出来不同时空的表达模式( s h u f f l e b o t t o m 。1 9 9 3 ) 。 5 逆境条件下苯丙氨酸解氨酶活性的变化 一般来说在逆境条件下，苯丙氨酸解氨酶的活性开始的时候快速增加，随后急剧下降，最后缓 慢下降。原因可能是：植物在遭受逆境时，其防御系统特别是苯丙烷类代谢开始被激活，促使苯丙 氨酸解氨酶的活性上升以产生更多的植保素、木质素等来减少植物所受到的伤害。当合成较多的 次生代谢产物后，它们也会反馈抑制苯丙氨酸解氨酶的活性，以免过多地消耗养分，并防止次生物质 过度积累而对其自身产生毒害( 高旭辉，1 9 9 8 ) 。 总之，苯丙氨酸解氨酶是植物次生代谢中一种非常重要的酶类，在植物的生长发育过程中起 着非常重要的作用。国内外对这种酶的研究比较多，也比较深入，主要集中在它的提取纯化、抗 6 中幽农业人学倾1 学位论正 第0 。| - 一 逆境、生理作刚、基因克隆等方面，但是关f 它的基闪表达和调控方瓶的研究还不多，需要进 步展开更深入、更广泛的研究，以便为将米的基因工程、抗病虫育种l 州。提供理论依据( i 吕俊， 2 0 0 1 ) 。 1 2d n a 结合蛋白与基因调控 1 2 1d n a 结合蛋白 生物体中所有的细胞中都携带着完全相同的基因，为什么这些基冈在某些细胞( 时期) 中起 作用、得到表达，而在另外一些细胞( 时期) 中则不起作用、不能表达呢? 即：基因的表达是如 何开关的呢? 对于不同的d n a ，其功能主要是通过能够识别一定的d n a 序列并通过固定在某个作用位点 上的d n a 结合蛋白来调控的，这种蛋白质称为序列特异性d n a 结合蛋白。d n a 结合蛋白在d n a 的复制、重组、链裂解、转录等过程中起着关键的作用，与细胞周期中染色体的一系列变化有关。 因而长期以来，人们就致力于研究蛋白质与d n a 之间特异性识别的分子机制，希望能够揭示出 蛋白质对d n a 的调控作用( 张若蘅，1 9 9 4 ) 。 d n a 结合蛋白与d n a 的相互作用是通过以下几种作用力来实现的： 1 d n a 结合蛋白上带正电的氨基酸残基与d n a 上带负电的磷酸根之间形成的盐桥： 2 氨基酸与碱基之间形成的氢键： 3 芳香族氨基酸与碱基之间的芳环堆积作用； 4 非极性氨基酸与碱基之间的疏水作用； 5 范德华力。 d n a 的遗传信息贮存在碱基序列中，而在磷酸糖骨架上没有信息存在，所以非特异性的结 合主要发生在磷酸骨架上，而特异性的识别则必须通过d n a 结合蛋白和碱基的作用来实现。真 核生物的转录因子可以与d n a 的大沟相互作用，它们具有共同的特点即都是由两部分组成，一 部分富岔a r g l y s ，负责与d n a 主链上磷酸基进行非特异性相互作用，另一部分则负责识别、结 合d n a 的碱基( 杨岐生，1 9 9 6 ) 。 d n a 结合蛋白调控d n a 的转录、复制及翻译，而其结构域几乎具有全部的生物活性，因此 研究结构域具有非常重要的理论和实际意义： 1 为蛋白质的全新设计打下基础。 2 揭示蛋白质一级结构与高级结构的关系。 3 研究蛋白质与d n a 相互作用的机制，了解基因表达调控的分子机理，揭示生命的本质， 对于理论研究和实际应用都具有非常重要的意义( 王锐，1 9 9 5 ) 。 在目前发现的许多d n a 结合蛋白中，人们发现其中某些片段( 通常在i 0 0 个氨基酸残基以 下) 单独存在时，具有相当强的结合d n a 的能力，这些片段称为d n a 结合区( d n a - b i n d i n g d o m a i n ) ，它们是识别d n a 顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸，序列相对比较保守。结构域 比整个d n a 结合蛋白要小很多，因此研究结构域可以使问题得以简单化。 7 中i i 农业人学蝴i - 学位论义 第一辑j i 苦 如幽1 - 3 所示，翻前己知的d n a 结合蛋白常见的结构域主要有三种结构形式：h o m e o 结构 域、亮氨酸拉链和锌指结构。 s p l 髓 c i q g o g k v y g k t s l 镰 m 噱w m t g e 髓f 咐w s y e g k 黼溅髓啪盯g e k m o c t 2k 毋 0 4 0 m i n r r e k k u si 盯 n v r f a l e k s f l a 阳* p 1 馥ei l ll 蹰l i l m 疆e 1 f i r v 艰n r 购k e k r i n j 锄淋a 站台籽亮氨唆拉稹：囊休结挎墙 s q 随i l 【 环k r h r n r i a a s k c r k r k 0 隙i l l l e 眈v i 1 1 k q n 轭l a s t a n h l l i 鞠y a q l k q 图1 - 3 转录因子的3 种与特异d 结合的结构域 f i g 1 2 3 t h ck i n d so f d n a b i n d i n gd o m a i no f t r a n s o r i p t i o nf a c t o r s 锌指结构：锌指的部分螺旋片段是镶嵌在d n a 双螺旋的大沟中的，并且能够特异地识别其 中的碱基顺序。目前已经发现大量的具有锌指结构的d n a 结合蛋白，锌指结构是这类蛋白质与 d n a 结合的关键，结构域范围内单个核苷酸的缺失和突变都可能导致蛋白质与d n a 结合功能的 丧失( r a k a t s , , j i ，1 9 9 8 ) 。 h o m e o 结构域( h d ) ：此结构域跨越约6 0 个氨基酸，不同蛋白的h i ) 区域中最保守的位置 是由碱性氨基酸及疏水氨基酸残基所占据的( k l i n g e ，1 9 9 6 ) 。 亮氨酸拉链二聚体( 1 e u c i n ez i p p e rd i m c r i z a t i o nd o m a i n ) ：一组3 5 个氨基酸中含有4 - 5 个亮氨 酸残基，每两个亮氨酸之间有6 7 个氨基酸相间隔。3 5 个氨基酸形成一个a - 螺旋，亮氨酸相对交 错，导致两个具有a 螺旋的亚基形成二聚体，构成一个拉链的形状。 1 2 2 转录园子与基因调控 植物的发育是一个非常复杂的过程，在这个过程中d n a 与蛋白质起着主要的作用，通过它 们之间的相互作用，实现了对基因表达的调控。由于生物体的多样性是由蛋白质来实现的，因此 在发育调控过程中的复杂性也必定是与蛋白质结构和功能的多样性密切相关的。现在已经知道， 基因表达的调控主要发生在转录水平上，而在转录水平上与d n a 发生相互作用的蛋白质分子中， 最具多样性的便是转录因子( 刘强，2 0 0 0 ) 。 转录因子( 也叫反式作用因子) ，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相 互作用的d n a 结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用来激活或抑制转录。 8 中剐农业人学坝i 学位论义 第, 7 - j i i i 真核生物基闪在表达的过程中受到许多蛋白闪于的调节，转录因子只是这些调节闪f 中的一类。 真核生物的转录启始是由顺式作州元件( c i s a c t i n ge l e m e n t s ) 和反式作川蛋白冈子 ( t i t a n s a c t i n g p r o t e i nf a c t o r s ) 之间的复杂作用所调控的。顺式作元件是指具有调控作用的d n a 区域( m o t i f ) 。在顺式调控区域中，启动子靠近转录起始位点，并且常常由邻近的元竹( t a t a b o x ) 和较远的元件( c c a a t b o x ) 所构成。启动子和增强子常由几个分离的元件组成，每个元件都可 以由一个或多个反式作用因子特异地识别出来。 基因表达的程序、时问和位置是受不同层次的调控元件控制的，这种控制不仅决定了基因表 达的数量。而且决定了基因表达的时间和空问的秩序性。生物的正常生长、发育与分化都是由于 基因受到调控元件的控制而有序表达的结果。因此我们认为定时和定位，即时间和空间是转录过 程中至关重要的因素。基因表达的这种时空特异性主要是由于转录因子与其识别的d n a 顺式作 用元件之间的相互作用以及与r n a 聚合酶之间的相互作用，从而对内、外环境的影响做出反应 的结果( 吴乃虎，1 9 9 8 ) 。 i 鲤洋 “碱麟黼黼 l f ，磊璺翌生 ：焉嚣葫笈挥z 糖 图卜4 环境胁迫诱导基因的转景表达示意圈 f i g 1 - 4p a t h w a y o f t h ee n v i r o n m e n ts t r e s si n d u c i n gt h eg e n te x p r e s s i o n 图1 4 描述的就是植物在感受外界干旱、高盐、激素、病害以及体内的细胞发育等信号后 通过一系列的信号传递激发了转录因子即反式作用因子。反式作用因子和顺式作用元件相结合以 后，激活了r n a 聚合酶i i 转录复合物，启动了基因的转录表达。犀终通过基因产物的作用对体 内、外界信号在植物体本身的生理生化等方面作出适合的调节反应。因此，转录因子在基因的表 达调控中起着关键的作用( 刘强，2 0 0 0 ) 。 9 中崮农业人学砸l j 学位论丘 鼐章j i 击 典型的植物转录冈子具有d n a 结合域、转录调控域( t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o nd o m a i n 卜激活域 ( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ) 或抑制域t r a n s c r i p t i o nr e p r e s s i o nd o m a i n ) 、寡聚化1 ：| ) = 点和核定位 信号区4 个功能区域。转录因子通过这些功能区域在特定的时间进入细胞核内与特定基因启动 子区域中的顺式作用元件相互作用来调控基因的表达。 同类型转录因子的主要区别就在于它们的转录调控域各不相同，不同的转录调控域决定着转 录因子功能上的差异。 激活功能域的结构：与特异d n a 序列结合的转录因子通常具有一个或多个激活功能域，而 且一些相关的结构域也参与了它们的功能。不同类型的激活功能域与不同类型的结合域相互组合 形成各种类型的转录因子。如图1 - 5 所示，目前真核生物转录因子的转录激活功能域大致可以分 为三类： 第一类激活功能域是由一段短的氨基酸组成，明显特征是带有大量负电荷的酸性区，而且能 形成两性a 螺旋结构。 第二类激活功能域富含谷氨酰胺残基。 第三类是富含脯氨酸的活性结构域。这个区域如果与各种d n a 结合结构域相连就可以激活 转录过程( 黄泽军，2 0 0 2 ) 。 国耥 韶r g a ! 敬性! 袁悔城 d s a a a h h d n s t i p l d r m p r d a i h g f d w s e e i ) d m s r ) 6 i ，p f o k 兀) p n n n g f s p l奢谷氯或膝螽他结拘域 q g q t i 椎r v s g l q g s d a l n _ 拍n q t $ c ；g s lq a i 撇k e g 芷q n q ：q - f 日旧| q q l l 1q t 嘞t l v o z , g o a l q a l q a a p l s o ( 1 t 玎”r q ls q e t l q n l q l q a v p n s g piti r t f i w g p n g q v s w o t l q l q n l q v q n p q a q t i t l ap m q g v s t 正q c t f富讨氯酸结构域 p p h l n p q q p l k d l v 甜 c d p a s q q p g r l n g s g q l k m p s h c l s q m l a p p p p g l 隙l l p p t k f a r 鹅e 瓣a t s p s y s 卵仃r s p 图 1 - 5 转录因子的三种激活结构域 f i g 1 - 5 t h r e ek i n d so f t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n 转录抑制功能域的研究现在正在进行中，对它的结构和作用机理目前还了解不多抑制域的 作用方式可能有： 1 与启动子的相关位点结合之后能够阻止其他转录因子与该启动子结合。 2 通过对其他转录因子的抑制作用而阻止了转录的进行。 3 通过某种方式改变了d n a 的高级结构( h i g h - o r d e rs t r u c t u r e ) ，使得转录不能正常进行。 核定位信号区( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l , n l s ) 是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核 定位区域，转录因子在进入细胞核的过程中受到这段区域的控制( b o u l i k a s ，1 9 9 5 ) 。 寡聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 可以使不同的转录因子通过这个功能域发