（食品科学专业论文）魔芋多糖的改性及其生物活性研究.pdf

摘要摘要本文以魔芋葡甘露聚糖( k g m ) 为研究对象，以提高生物活性为目标，研究了具有较高分子量的魔芋葡甘露糖醋酸酯( a k g m ) 的制备工艺、超声波降解k g m 和a k g m 的工艺，以及类a c e m a i l i l a l l 物质a k g m 的乙酰化度和分子量与生物活性之间的关系，并筛选得到了具有最佳生物活性的产物。a k g m 的制备工艺研究中，以改进的碱性羟胺比色法测定乙酰基含量，以乙酰化度和代表分子量大小的特性粘度为指标，研究并确定了较优的实验室制备工艺条件为：乙酸酐和魔芋葡甘露聚糖的质量比= 1 5 ，反应温度6 0 8 0 ，反应时间0 5 1 5 h ，催化剂无水乙酸钠用量0 4 0 踺，得到魔芋葡甘聚糖乙酰化度回归方程。此乙酰化方法获得的产物乙酰化度范围在0 3 1 1 之间，具有较高的分子量。超声波降解k g m 工艺的研究表明超声波功率决定产物分子量的降解底限：降解时间决定产物分子量分布分散度；超声波功率和多糖浓度决定降解速度。研究证实了超声波降解k g m 可以产生分子量分布较为均一的产物，且在实验功率( 0 7 6 0 2 2 ，分子量( d a ) 对促增殖作用活性排序为：5 5 ，0 0 0 1 5 0 ，0 0 0 3 0 0 ，0 0 0 ；乙酰化度对免疫活性排序为：o 7 6 o 4 8 o 2 2 ，分子量( d a ) 对免疫活性排序为：3 0 0 ，0 0 0 1 5 0 ，0 0 0 5 5 ，0 0 0 。实验还采用极差分析和两因素分析方法，对比了乙酰化度和分子量对活性增强影响的大小，并对乙酰化度和分子量的交互作用进行了评价。分析结果表明成纤维细胞增殖活性影响因素排序为乙酰化度 分子量，乙酰化度和分子量的交互作用对促增殖活性的影响高度显著( p 乙酰化度，交互作用对吞噬功能影响的显著性一般( p 分子量，交互作用对促进淋巴细胞转化增殖方面的影响高度显著( p o 7 6 o 2 2 ；a c e t y l a t i n gd e 蓼e et oi m m u n o c o m p e t e n c e ：o 7 6 0 4 8 0 2 2 ；m o l e c u l a rw e i g h tt oc e l lp r o l i f e r a t i o na c t i v i t y5 5 ，0 0 0 1 5 0 ，0 0 0 3 0 0 ，0 0 0 ；a n dm 0 1 e c u l a rw e i 曲tt oi m m u n o c o m p e t e n c e3 0 0 ，0 0 0 15 0 ，o o o 5 5 ，0 0 0 0 n h o g o n a l t e s t sa n a l y s i ss h o w e dt h a ta c e t y l a t i n gd e g r e eh a dm o r ei m p o r t a l l tr o l e si nc e l lp r o l i f e r a t i o na c t i v i t ya j l dp r 0 1 i f e r a t i o no fl y m p h o c ”e s ，a n dm 0 1 e c u l a rw e i 曲th a dm o r ei m p o r t a n tr o l e si np h a g o c ”o s i so fp e r i t o n e a lm a c m p h a g e f u r t h e rs t u d yo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm o i e c u l a rw e i g h ta n da c e t y l a t i n gd e 掣e es h o w e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nw a ss i g n i f i c a n ti n c e l lp r 0 1 i f e r a t i o na c t i v i t ya 1 1 dp r o l i f e r a t i o no fl y m p h o c ”e s ，b u tn o ti np h a g o c ”o s i so fp e r i t o n e a im a c r o p h a g e 摘要k e y w o r d s ：k o n j a cg l u c o m a n n a np o l y s a c c h a r i d e ( k g m ) ；m o d i f i c a t i o n ；u i t r a s o n i cd e 擎a d a t i o n ；b i o a c t i v i t y ；m o l e c u l a rw e i g h t 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：! 堑垄塾日期：沙辞钼7 日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：逊导师签名：衄日期：坩易年占月、7 日第一章绪论1 1 魔芋葡甘露聚糖与a c e m a 蛐a n1 1 1 魔芋葡甘露聚糖第一章绪论o hg t o hg m图卜1 魔芋葡甘露聚糖的重复结构单元”j魔芋葡甘露聚糖( k o n j a cg l u c o m a n n a l lp o l y s a c c h a r i d s ，简称k g m ) 又称魔芋多糖，是一种以黏液状葡聚糖粒子形式存在于魔芋球茎中的高分子水溶性多糖，含量高达5 5 以上。k g m 的分子量为5 0 0 ，0 0 0 2 ，0 0 0 ，0 0 0 万d a ，随魔芋的品种、加工方法及原料储存时间而变化。k g m 是一类由摩尔比为1 ：1 6 1 7 的葡萄糖和甘露糖组成的天然植物多糖，其主链通过p 1 ，4 糖苷键聚合而成的，它在某些糖残基c 3 位上存在由p l ，3 糖苷键组成的支链，主链上每3 2 个糖残基有3 个支链，每条支链仅有几个糖残基，大约每l9 个糖残基上有一个以酯键结合的乙酰基l 】j 。1 1 2 魔芋葡甘露聚糖的功能性质k g m 具有良好的吸水性、增稠性、成膜性、可塑性、结构性、乳化性、赋形性和保水性等多种功能性质。k g m 具有很强的溶涨能力，吸水量可以达到自身重量的8 0 1 2 0 倍。k g m 是一种非离子型水溶性高分子多糖，含有丰富的羟基，易溶于水，l o l k g m 溶液的粘度可达2 0 0 0 0 m p a s 以上，是一种优良的食品增稠剂。k g m 溶液具有很强的黏结性和凝胶性，溶于冷水可形成粘稠的溶液，经碱处理后可以形成不可逆的凝胶，如魔芋豆腐。k g m 粘着力很强，可用做粘合剂及毛、麻、棉、纱的浆料，代替淀粉作为纺织印染剂。魔芋葡甘露聚糖还可以与一些在溶液中水解成多羟基水合物的盐类形成凝胶 2 。k g m 还具有多种生理活性。k g m 是一种优质的膳食纤维，国内外研究认为，其在很多方面对人体发挥着有益的功用：( 1 ) 提高肌体免疫能力；( 2 ) 螯合胆固醇，降低血脂，预防高血压；( 3 ) 能降低糖尿病人的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯，还可增加高密度脂蛋白，对病人伴有的脂代谢紊乱和习惯性便秘有明显疗效；( 4 ) 吸水通便，改变消化系统中的菌群：此外，还有抗衰老、减肥等多种生理功效】。江南大学硕士学位论文1 1 3 魔芋葡甘露聚糖的改性应用现状根据工业生产的需要，在k g m 的分子链上引入或脱掉一些基团，使k g m 的分子结构发生改变，开发出多种具有特殊加工性能的k g m 的衍生物，即为化学改性。由以上k g m的结构可知，k g m 的分子链中含有乙酰基团和大量的羟基，可方便地对其进行脱乙酰基或酯化、接枝等化学改性处理。1 1 3 1k g m 的去乙酰化改性k g m 在温和的碱性条件下，能脱掉乙酰基团，脱乙酰基后的葡甘露聚糖有利于分子问羟基的氢键相互交联及成膜性能的改变。k g m 经凝胶化处理可制成固定化载体，可作凝胶色谱固定添加剂、柱分离组分等，在医学、食品有广泛的应用前景。1 1 3 2k g m 的交联化学改性k g m 分子中存在多个可反应的羟基，可与多种交联剂发生交联反应。k g m 与具有两个或多个官能团的化学试剂起反应，使k g m 分子羟基问联结在一起，所得的衍生物称为交联k g m 。k g m 交联的形式有酰化交联、酯化交联和醚化交联等。目前在工业上应用于多糖的交联剂不多，主要有三偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三氯氧磷以及双官能团的醛类物质。交联改性方法简便易行，反应快捷，易于控制，产物的成膜性能、抗菌性能、耐水性能、抗剪切性能有显著提高，其原理是经交联的k g m ，加强了分子间的氢键，使k g m 分子更紧密地结合在一起。适度交联的k g m 具有合适的粘度，在食品工业中可用作增稠剂；在医药工业中，可用作外科乳胶用品的润滑剂及赋形剂；在纺织工业中，可用作合成纤维上浆及纺织品碱性印花、染色等，还可用作日化的爽身粉、粘合剂、水果保鲜膜等1 6 j 。1 1 3 3k g m 的酯化改性将k g m 与酸或酸酐等在一定的条件下反应，即可生成相应的酯化产物。有关k g m 的酯化改性研究我国进行的比较早，也比较多，较为成熟的是乙酰化k g m 、马来酸酐酯化k g m 和磷酸酯化k g m 。制取酯化k g m 的反应条件会显著地影响产品的性质，经过酯化的k g m 耐剪切、酸碱的性能显著提高，特别是乙酰化k g m ，其良好的粘度稳定性、高的胶液透明度、很好的粘附纱线特性及高的抗张强度和柔韧性，可广泛应用于食品、造纸、纺织等工业。工业上可根据不同的反应条件制得具有各种特性和用途的系列产品口j 。1 1 3 4k g m 的氧化改性氧化魔芋葡甘聚糖( 0 k g m ) 与k g m 相比，颜色洁白，糊液粘度低且稳定性、透明性和成膜性好，原理为k g m 经氧化作用而引起解聚，结果产生低粘度分散体并引进碳基和羧基，使其糊液粘度稳定性增加，可广泛应用于涂料、印染糊料、造纸工业等。1 1 3 5k g m 的接枝共聚改性k g m 分子链上含有大量的羧基，其伯羧基、仲羧基等处皆可以成为接枝点，可方便地与丙烯膊、丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯等单体进行接枝共聚反应，形成接枝共聚魔芋葡甘聚糖。不同的接枝单体、接枝率、接枝频率，可以制得各种具有独特性能的产品，可分为吸水性接枝共聚物、热塑性高分子接枝共聚物等。第一章绪论此外，k g m 的化学改性还有按甲基化作用、经烷基化作用、共混化学改性等，这方面的研究较多，改性产品亦皆有广泛应用。1 9 9 8 年卫生部将魔芋列入新资源食品名录，大大促进了魔芋种植业的发展，目前，我国鲜魔芋产量约为4 0 万吨，魔芋精粉和魔芋胶总产量约为2 万吨，绝大部分出口到日本。近年来，随着人们对k g m 的深入研究，也试图通过改性来拓宽k g m 的应用范围，但到目前为止，这些改性仅仅局限于以理化性质为目的，都没有涉及到生物活性层面，远远没有挖掘出k g m 所具有的潜在价值。1 1 4a c e m 柚a 的结构a c e m a n n a l l 是通过多级分离提取工艺获得的一种芦荟多糖组分，是由分子比大于2 ：l的甘露糖和葡萄糖残基通过d 一1 ，4 糖苷键聚合而成的部分o 乙酰化的线性多糖，在某些糖残基c 6 位上存在p l ，6 糖苷键组成的支链，a c e m a n n a i l 乙酰化度较高，分子量5 ，0 0 0 2 0 0 0 0 0 d a 【8 】。2 ，3 1 昏0 a c2 7 墨6 o a c 州1 。6 ) - g a一 肛l ，4 m n 】广【p 1 ，4 g l c 】，一 肛l ，4 m n 广 肛l ，4 m 。 一一 肛l ，4 m i n 】广【p - 1 ，4 g l c 】；一 肛l ，4 m a n 广 肛l ，4 - m a n 一图1 2a m a a 结构示意图【8 】1 1 5a c e m a n 的n 的功能性质及应用a c e m a n n a n 具有多种突出的生物活性。( 1 ) 免疫活性d j e r a b a 等【9 】将剂量为5 0 0 m g k g 的a c e m a l l l l a i l 给2 月龄的鸡肌注后，观察到对鸡体内的巨噬细胞反应有快速而持久的激发作用。给药3 天后，i f n 吖诱导的体外单核细胞n o的产生有极显著的提高，还能明显促进脾细胞自发型和诱生型n 0 的产生，并显著增强植物凝血素p h a 诱导的脾细胞的增殖。k a r a c a 等町也研究了a c e m 锄a 1 1 对正常鸡的脾细胞和h d 细胞株n o 产生的影响，结果提示a c e m a n n a l l 诱导的n o 的合成可能通过调节巨噬细胞甘露糖受体来完成，巨噬细胞的活化与药物的免疫调节作用有一定关系。z h a j l 2 等【l l 】研究发现，a c e m a 衄a n 能够剂量依赖地刺激巨噬细胞株r a w 2 6 4 细胞因子i l 一6 和t n f n的产生、n o 的释放、细胞表面分子的表达以及细胞形态学的改变，进一步证实了a c e m a r u l a n在免疫调节作用中的重要作用。目前此多糖已被美国f d a 获准用于协助治疗艾滋病。( 2 ) 组织修复，促愈合陈晓东等2 的研究结果显示，经芦荟多糖作用后，表皮细胞培养上清液中e g f 和t g f 2 a 水平呈不同程度地升高，其中e g f 水平升高与剂量明显相关，表明芦荟多糖能促进表皮细胞表达e g f 和t g f 2 a ，并以自分泌形式合成和分泌e g f 和t g f 2 a ：e g f 和t g f 2 a 能促进正常细胞分化，刺激表皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞增殖，促进新生血管形成，加速创面的愈合。结果还显示，芦荟粗多糖作用后，表皮细胞合成和分泌t g f 2 8 1江南大学硕士学位论文水平虽与对照组比较无显著差异，但其分泌能力略有增强，t g f 2 8 1 在体内能刺激血管内皮细胞、成纤维细胞的增殖，加速血管化和上皮化，促进胶原合成与成熟。有资料显示，芦荟可通过促进创面组织的胶原更新来影响创面的愈合【l3 1 。i l 2 6 对表皮细胞有活化增殖作用，且能间接诱导表皮细胞的迁移i l ，i l 2 8 能促进表皮细胞生长增殖，并加速新生血管的形成，而t n f 能促进成纤维细胞的成熟，并与i l 2 1 b 及i l 2 6 共同作用下，诱导组织损伤后的修复”“。( 3 ) 抗肿瘤作用a c e m 锄a 1 1 能够激发噬菌细胞单核因子的产生，后者能够支持抗体依赖性细胞毒作用，并刺激胸腺细胞母细胞化。小鼠皮下移植恶性、浸润性肉瘤细胞后，在2 0 4 6 天内全部死亡，而在移植肿瘤细胞的同时腹腔注射a c e m 锄a 1 1 则可使动物存活率达到4 0 。给药小鼠瘤块血管充血、肿胀，多形核白细胞浸润，中心核坏死、出血，表皮纤维化。实验数据显示a c e m a n n a i l 能刺激巨噬细胞产生i l l 、1 n f 等细胞因子，导致肿瘤细胞被免疫细胞浸润进而坏死，即抗肿瘤作用也是通过免疫机制实现的l l “。( 4 ) 抗辐射，促进血细胞生成c a i 矾7 5 0 是一种a c e m a l l n a l l 注射剂，具有多种治疗作用。e g g e r 等1 1 7 ”】研究了c a i 斟7 5 0 的促造血作用，给小鼠皮下注射该药能显著增加脾细胞和外周血细胞数量。通过i l 3 反应集落形成单位的培养和高增殖活性集落形成细胞( h p p c f c ) 的分析测定，表明该药对7 j l ( g 辐射造成的骨髓抑制小鼠的脾细胞和骨髓中造血因子的数量均有提高作用，最佳剂量为1 m g 。连续多天给药对骨髓抑制小鼠的作用与最佳剂量的粒细胞集落刺激因子( g c s f ) 相当，甚至更好。随着总细胞数的增加，多形核白细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板等绝对数目均显著增加，揭示对多种细胞有活化作用，而g c s f 则主要活化多形核白细胞。c a r n 7 5 0 对脾细胞群作用的最佳剂量为l m g ，对骨髓的作用则以2 m g 为最好，并且均与注射次数成正比。1 2 多糖分子修饰与构效关系国内外研究进展多糖的活性与其初级结构和高级结构密切相关。由于植物多糖分子量分散以及结构的微观不均一性使多糖的一级结构相当复杂，难以得到完全准确的结构式，因此多糖的高级结构的鉴定难度更大。目前，多糖结构与生物活性关系的研究主要集中在以下几方面：主链的组成、单元间的连接方式、侧链的连接单元、糖单元上不同的取代基团( 取代基的位置及相应的取代度) ，多糖的分子量和多糖的粘度等i l 。主链糖单元的组成决定了多糖的种类，不同种类的多糖，其生物学活性存在较大差异。根据主链糖单元的组成可将多糖分为两类：同多糖和杂多糖。同多糖是指主链由同一单糖连接而成的多糖；杂多糖则是由两种或两种以上的单糖连接而成的多糖。目前己应用于l 临床的抗肿瘤多糖药物，如香菇多糖、裂褶多糖、灰树花多糖等均为具有葡聚糖主链结构的真菌多糖。葡聚糖是自然界许多动植物和微生物多糖的基本结构单元，据推测，它可能是生物产生宿主防御机制的基本诱发基因。除葡聚糖以外，其他同多糖也具有一定的生物学活性，如从酵母细胞壁中得到的甘露多糖能抑制人体细胞突变和抗氧化的活性1 2 。具有生4第一章绪论物学活性的杂多糖也有报道，如以半乳糖葡萄糖为主链的杂多糖t h a n l n o l a l l 具有突出的免疫调节功能和抗肿瘤活性忙“。关于多糖的类型与活性的一般规律还有待进一步深入研究。多糖主链上相邻糖基的连接方式( 即糖苷键的类型) 也是决定多糖活性的重要因素。同是以葡聚糖为主链的多糖，香菇多糖具有较强的抗肿瘤活性，而淀粉则无任何生物学活性，这在定程度上源于两者主链糖苷键的类型不同，前者为( 1 ，3 ) 键型，后者为( 1 ，4 ) 键型。研究表明，多数具有突出生物学活性的葡聚多糖都以( 1 ，3 ) 糖苷键连接：凝结多糖是一种( 1 ，3 ) 葡聚糖，地衣多糖是由3 3 的( 1 ，3 ) 一葡聚糖和6 6 的( 1 ，4 ) 葡聚糖组成的杂多糖，d e m l e i t n e等【2 2 】比较了两者衍生物的抗肿瘤活性，在相同取代条件下，凝结多糖衍生物的抑瘤率远大于地衣多糖衍生物，说明( 1 ，3 ) 键型比( 1 ，4 ) 键型在葡聚多糖及其衍生物的抗肿瘤活性中作用更大【2 ”。除了葡聚糖外，其他多糖的活性也受到糖苷键类型的影响，如具有抗肿瘤活性的甘露多糖为( 1 ，6 ) 键型，活性半乳多糖则以( 1 ，3 ) 键型连接。多糖主链的构型有a 一构型和p 一构型，两种构型也在多糖活性中起重要作用。香菇多糖与淀粉的主链构型不同，前者为p 一构型而后者为构型，这也是导致两者活性上差异的重要原因。对于葡聚多糖而言，n 一葡聚糖一般没有活性，主要是因为人体内存在n 葡萄糖苷酶，能使旺一糖苷键发生水解。尽管也有a 葡聚糖增强人体免疫能力和产生抗肿瘤活性的报道，但这些研究还停留在实验阶段，未进入临床实验，只有那些在人体内不被葡萄糖苷酶降解的p 葡聚多糖才有可能成为多糖药物。对于其他类型的多糖具有生物学活性者也多是p 构型，p 构型与多糖生物学活性的具体作用机制目前还不清楚。支链的类型对分支多糖的活性有一定的影响，可以作为多糖支链的基团包括某些阴离子基团、各种糖基和一些烷基等。多糖及其衍生物中取代基的种类、数目和位置对其活性具有显著的影响。运用分子修饰的方法，通过改变多糖取代基的种类、数目和位置来改变多糖的结构，可有目的地得到高活性的多糖片段或寡糖。例如，硫酸化多糖具有抗病毒、抗肿瘤和抗凝血等活性。多糖中硫酸根的取代位置和数目对其生物活性有着重要的作用。硫酸多糖能有效抑制h 的感染和复制，对其他具囊膜病毒也有明显的抑制作用【2 3 j 。在对硫酸葡聚糖的研究中发现，聚合链长度不变，硫酸根含量为1 8 1 时的抗h i v - 1 活性最高，在多糖浓度1 0 m g i 。时可完全起到保护作用，而不含硫酸根或硫酸根含量低( 4 8 ) 的葡聚糖无明显作用。香菇多糖在浓度达5 0 0 m l 时，对h i v 也无抑制作用，但硫酸醋化香菇多糖在1 0 m g l 时就能强烈抑制h i v 抗原的合成。硫酸裸藻淀粉能抑制h i v 1 和h i u 2 感染m t - 4 细胞和p b m c ，但脱去硫酸根后的裸藻淀粉无此活性；卡拉胶对h i v 等病毒有显著的抑制作用，脱去硫酸根后活性也消失“。在对硫酸化甲壳素和硫酸化羧甲基甲壳素研究中发现，o 一硫酸化壳聚糖具有2 5 的肝素活力；n 一硫酸化壳聚糖无活力；c 6 硫酸化一n 一羧甲基化壳聚糖具4 5 的肝索活力，可见，c 6 位上的一c h 2 0 s 0 3 h 基团可显著提高其活性【2 5 。最近，n i s h i m u r a 等定位合成了o 2 和0 3 位硫酸酯化的新型硫酸甲壳素，进行结构及活性研究后发现，这两种硫酸多糖比0 6 位硫酸酯化的多糖具有更强的抗h i v 活性，而其抗凝血活性显著减小。表明其抗病毒活性不仅依赖于糖链上的负电荷，特定的结构也影响其作用效果。硫酸基对多糖抗病毒活性具有极其重要的作用，因此多糖硫酸化修饰在近年江南大学硕士学位论文引起高度重视。分子量大小对多糖活性有显著影响。鉴于此，运用分子修饰手段将多糖降解到适宜的分子量，得到高活性低分子量的多糖片段或寡糖，或通过络合等方法得到具有活性的高分子量的多糖复合物。多糖分子量和分子体积越大，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。肝素经过降解后的低分子量组分能克服肝素原有的出血和诱导血小板减少等不足，还具有抗血栓活性强、生物利用率高、体内半衰期长和口服易吸收等优点；裂褶多糖起初由于分子量太大，影响临床应用效果，经过超声波降解后，分子量降低，临床应用效果大为改善【2 7 j 。但也并不是多糖分子量越低越好，因为分子量过低，无法形成产生活性的聚合结构。a l b a l l 等人研究了分子量与硫酸化凝结多糖抗凝血活性的关系，认为抗凝血活性与相对分子量呈哑铃型曲线关系。g a o l 2 埘等人报道，硫酸化凝结多糖在相对分子量为( 7 1 1 ) x 1 0 3 内，随着相对分子量升高，其抗凝血活性有增强的趋势，这说明存在满足多糖活性的最佳相对分子质量范围，从细菌中分离的某种果聚多糖l e v a l l s ，相对分子量达到2 1x 1 0 5 时抑制肿瘤生长的活性最强。相对分子量为9 0 0 0 左右的右旋糖苷具有一定的活性，其活性随着大于或小于此相对分子量值而迅速降低【2 9 j 。由此可见，不同的多糖产生生物学活性的最佳相对分子量的范围不同。多糖的粘度与活性也具有定的相关性。多糖的粘度主要是由于多糖分子间的氢键相互作用产生，还受多糖分子量大小的影响，它不仅在一定程度上与其溶解度呈正相关，还是临床上药效发挥的关键控制因素之一，如果粘度过高，则不利于多糖药物的扩散与吸收。通过引入支链破坏氢键和对主链进行降解的方法可降低多糖粘度，提高其生物利用率。如向纤维素引入羧甲基后，分子间的氢键发生断裂，产物粘度从0 1 5 p a s 降至o 0 5 p a s 。裂褶多糖起初由于粘度大而无法在临床上使用，后来在不破坏其结构的前提下使其发生降解，从而降低其粘度，而抗肿瘤活性保持不变，生物利用率大大提高【3 们。分子修饰是通过化学、物理及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得众多结构类型衍生物的方法。选择合适的方法对多糖进行分子修饰可改变其结构、理化性质和生物活性，不仅可以更好地研究多糖的结构与功能关系，而且也为药物筛选提供了各种结构类型的候选化合物。因此，目前对多糖进行分子修饰已成为多糖结构与功能关系研究的重要手段，更为拓宽多糖应用范围奠定了基础。虽然近年来多糖构效理论研究得到了较快的发展，但构效理论仍不够完善。由于多糖构效理论来自于对天然多糖结构与功能活性对应关系的总结，又反过来指导多糖分子修饰研究，因此受天然多糖所表现出的功能活性的左右，p 一构型以( 1 ，3 ) 和( 1 ，6 ) 连接的多糖、硫酸酯化多糖一直是科学家研究的重点，而其他类型多糖的研究相对薄弱。此外，目前的研究通常只针对单因素对多糖活性的影响而没有考察多个因素存在情况下的交互作用，以及影响因素的主次顺序。1 3 立题意义魔芋主要产于中国和日本，虽然其多糖结构与a c e m a 皿a j l 相似，但物理、生物学性质上的差异限制了其在食品、医药、化工等领域的广泛应用。芦荟中a c e m a r u l a n 虽然具有很6第一章绪论强的生物活性，但是叶片中芦荟多糖的总含量不足2 ，a c e m 锄a n 含量更低，通过多级分离提取工艺获取a c e m a n n a n 又造成较大的损失，因此价格昂贵，从而限制了它的应用。k g m 和a c e m a n n a i l 具有比例相近的单糖组成，相同的主链连接方式，取代基团都是乙酰基，而存在的差异是芦荟多糖乙酰化度高于k g m ，分子量远远低于k g m ，以及侧链的连接方式不同。根据多糖分子修饰的研究进展以及结构决定功能性质这一理论，可以推断这两种植物多糖的活性之所以存在如此大的差别与其结构上的差异( 乙酰基含量、乙酰基取代位点、分子量大小、侧链的组成和连接方式不同) 密切相关。k g m 结构较为均，是一种理想的改性修饰材料，加之现代分子修饰水平的不断完善，由k g m 制备类a c e m 黜a i l多糖具有很大的潜力和可能性。通过分子修饰的手段来研究乙酰基含量、乙酰基取代位点、分子量大小和侧链结构对k g m 生物活性的影响，从新的角度研究植物多糖的构效关系，有助于开发具有高附加值的类a c e m a n n a l l 功能产品。在多糖构效研究方面，口构型以( 1 ，3 ) 和( 1 ，6 ) 糖苷键连接的多糖、硫酸酯化多糖一直是科学家研究的重点，而其它类型多糖的研究则相对薄弱。通过分子修饰k g m 制各类a c e m a i l i l a i l 物质研究可以补充完善( 1 ，4 ) 糖苷键连接的多糖以及乙酰酯化多糖构效关系的理论研究。此外，目前多糖构效关系研究通常只针对某一影响因素对多糖活性的影响而没有考察多个影响因素并存情况下功能性的变化，以及影响因素的主次顺序。展开对构效关系各影响因素间交互作用的研究，可以更好的阐述各因素如何发挥效应，更好地指导分子修饰研究的方向。1 4 研究内容：本研究主要从乙酰基取代度和分子量大小两方面来考察其对k g m 生物活性的影响，从而为总的研究思路作探索性尝试，进而展开其他方面的研究。1 4 1k g m 的分子修饰高取代度高分子量水溶性k g m 醋酸酯的研制目前，多糖醋酸酯产品还不能够兼具高取代度和高分子量这两方面的指标，因此，还需对多糖乙酰化工艺进行研究。k g m 可控降解方法的研究利用超声波一步制取特定分子量范围k g m 多糖的可控降解方法，确定影响因素和最佳工艺参数。1 4 2 分子修饰产物的鉴定分光光度法测定多糖乙酰化度；利用红外等手段进行k g m 修饰产物的特征鉴定；借助高效凝胶过滤色谱( h p g f c ) 确定k g m 分子修饰产物的分子量分布。1 4 3k g m 分子修饰产物构效关系研究对k g m 分子修饰产物进行体外、半体外免疫学功能测定以及体外细胞培养促增殖活性7江南大学硕士学位论文的研究，考察乙酰化度、分子链长、作用剂量对促进正常细胞增殖活性和免疫活性的影响以及各因素间可能存在的交互作用：提出产物结构与促增殖活性、免疫活性的关系。1 5 研究目标制各具有不同取代度、不同取代位点的水溶性k g m 醋酸酯为了研究不同乙酰化度对多糖活性的影响，需要掌握制备乙酰化取代度在0 1 o 9 之间的k g m 醋酸酯的工艺，并且要求在此制备过程中k g m 本身不会发生显著降解。一步制取特定分子量范围的分子修饰产物为了研究不同分子链段对多糖活性的影响，需要掌握可控降解的工艺，要求此降解工艺不会造成多糖上取代基团数量的减少，不会造成侧链的降解，还要求产物有较为均一的分子量分布，并且掌握工艺参数与分子量分布之间的关系。目前，国内外多糖降解的研究多集中在获取低聚产物的工艺条件上，而在获取特定分子链段的多糖产物的研究上较为薄弱，最终往往借助超滤、分子筛等方法来完成，既没有一步制取的简便性，也限制了目的产物的得率，因此我们希望这一工艺对工业化生产具有实际应用价值或指导意义。通过对k g m 分子修饰产物进行体外、半体外免疫学功能测定，得到乙酰化度、分子量、剂量对多糖活性的影响，找出影响多糖活性的主要因素，以及因素问可能存在的协同效应，总结分子修饰产物结构与活性之间的关系，得到能够与a c e m a n n a l l 在生物活性方面相媲美的k g m 。1 6 拟解决的关键问题乙酰化产物既具有较高的取代度又具有较大的分子量；k g m 的可控降解工艺。第二章分光光度法测定多糖乙酰化度第二章分光光度法测定多糖乙酰化度2 0 引言测定乙酰基的常用方法是酸碱滴定法。其原理是醋酸酯在碱性条件下( p h 8 5 以上)易水解，故用过量的碱将乙酸酯水解，然后用标准酸来滴定剩余的碱即可测定出乙酰基的含量。此方法费时、费力，重复性差。羟胺比色法，也是定量测量乙酰酯的方法【3 ”，最初用于医学检验上血液中乙酰胆碱等的测定【3 2 j 3 1 。其利用乙酰基与羟胺能起反应生成乙酰肟羟酸，再与f e 3 + 生成可溶性红色络合物羟肟酸铁，然后利用分光光度计在特定波长测定吸光度，在一定的浓度范围内吸光度与乙酰基的含量关系符合朗伯一比尔定律。但是过量的羟胺可将高铁离子( f e 3 + ) 还原成亚铁离子( f e 2 + ) ，从而降低异羟肟酸铁的生成量，影响结果的准确性和精密度p 4 ，3 5 】。因此有人对试验方法进行改进，以高氯酸铁为显色剂，并加入强氧化剂高氯酸来防止高铁离子被还原成亚铁离子，但是这两种试剂较为危险，高氯酸铁作为一种制爆试剂不易得到。本章主要研究k g m 乙酰化度的测定方法，具体内容包括两部分：( 1 ) 用改进的苯酚硫酸法测定多糖；( 2 ) 用改良的羟胺比色法测定乙酰基，用较为安全、易得的盐酸、三氯化铁替代危险的高氯酸、高氯酸铁的可行性，通过调整试剂配比重点考察络合物显色稳定性。2 1 材料与设备磁力搅拌器电子分析天平w f j 2 0 0 0 型可见分光光度仪数显恒温干燥箱电动搅拌器氢氧化钠溶液( 分析纯)盐酸( 分析纯)三氯化铁( 分析纯)五乙酰基葡萄糖标准品葡萄糖( 分析纯)甘露糖( 分析纯)浓硫酸( 分析纯)苯酚( 分析纯)2 2 实验方法2 1 2 1 魔芋葡甘露聚糖含量的测定方法2 2 1 1 原料预处理本实验采用醇沉法获得k g m 。1江苏泰县姜埝无线电厂上海精密科学仪器有限公司尤尼柯上海有限公司上海医疗仪器厂广州i k a 制造有限公司国药集团化学试剂有限公司中国上海化学试剂有限公司中国上海化学试剂有限公司购自s i g m a 公司中国上海化学试剂有限公司中国上海化学试剂有限公司中国上海化学试剂有限公司中国上海化学试剂有限公司克魔芋胶溶于1 5 0 m l 7 0 的去离子水中，搅拌溶涨9江南大学硕士学位论文3 0 分钟，用3 一g 玻璃砂芯漏斗抽滤，除去不溶杂质，s e v a g e 法除蛋白，滤液以1 5 体积9 5 的乙醇为沉淀剂，边倒边搅拌，收集白色絮状沉淀物，无水乙醇脱水洗涤3 次，用去离子水在室温下溶解多糖沉淀，最终得到k g m 多糖的水溶液。2 2 1 2 多糖标准曲线的绘制称取7 6 9 2 m g 葡萄糖( 干燥) 和1 2 3 0 8 m g 甘露糖( 干燥) ，定容至5 0 m l 容量瓶中，即4 0 0 u g ，m l 【3 7 】。吸取标准液1 o o m l ，2 0 0 m l ，3 0 0 m l ，4 o o m l ，5 0 0 m l ，6 o o m l ，7 0 0 m l ，8 o o m l 分别置于5 0 m l 容量瓶中，加水定容至5 0 m l 。吸取上述溶液各1 0 0 m l ，再加苯酚溶液1 0 0 m l 及去离子水1 0 0 m l ，边摇匀( 用微型振荡器) 边迅速滴加浓硫酸5 0 0 m l ，摇匀后放置1 5 分钟，迅速冷却至室温，于4 9 0 n m 处测吸光度，以o d 值为横座标，以糖浓度为纵座标，绘制标准曲线。2 2 1 3 样品中多糖含量的测定吸取处理完毕的待测样品液1 o o m l ，置于1 0 0 m l 容量瓶中，定容。吸取上述溶液1 0 0 m l ，再加苯酚溶液1 0 0 m l 及去离子水1 0 0 m l ，摇匀后迅速滴加浓硫酸5 o o m l ，用微型振荡器振荡均匀匀后置沸水浴加热1 5 m i n ，然后用冰水迅速冷却至室温，于4 9 0 m 处测吸光度，另以去离子水2 0 0 m l 同上操作做空白。2 2 2 魔芋葡甘露聚糖乙酰基含量测定方法2 2 2 1 碱性羟胺比色法原理羟胺比色法，利用多糖上乙酰基与羟胺能起反应生成乙酰肟羟酸，再与f e ”生成可溶性红色络合物羟肟酸铁，然后利用分光光度计在特定波长测定吸光度，在一定的浓度范围内吸光度与乙酰基的含量关系符合朗伯一比尔定律【3 ”。o c o c h 3 + n h p h 啼鼠o h + c h 一c 0 一n h o h3 c h 3 一c o n h o h ，+ f e ”j 蛉h 3 一c o n h c q ，f e + 3 h 2 2 2 2 试剂配置( 】) 1 5 m o l 几氢氧化钠溶液：溶解3 0 9 n a o h 于蒸馏水中，定容至5 0 0 m l 。( 2 ) 0 1 m o l ，l 盐酸羟胺溶液：溶解6 9 6 9 盐酸羟胺在水中，定容至1 0 0 0 m l 。( 3 ) 2 m o l l 盐酸溶液：准确移取8 4 m l 浓盐酸，稀释定容至5 0 0 m l 。( 4 ) 0 1 m o l l 盐酸溶液：准确移取4 2 m l 浓盐酸，稀释定容至5 0 0 m l 。( 5 ) o 3 7 m o l l 三氯化铁溶液：称取5 0 o g f e c l 3 6 h 2 0 以o 1 m o l l 盐酸溶液溶解并定容至5 0 0 m l 。( 6 ) 5 乙酰葡萄糖标准溶液：缓慢地在5 m l 乙醇中加热溶解纯度为8 5 1 的b d 5 乙酰葡萄糖2 0 3 5 m g ，并用蒸馏水定容至1 0 0 m l ，分别取1 、2 、3 、4 、5 m l 于5 个5 0 m l 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，每5 m l 乙酰基含量分别为1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，4 0 0 和5 0 0 u g 。第二章分光光度法测定多糖乙酰化度2 2 2 3 样品测定步骤样品先经过多糖测定后，精确移取l m g 左右的多糖于5 0 m l 容量瓶中，用移液管加入5 m l 羟胺溶液，然后移取并缓慢加入5 m l n a 0 h 溶液，振荡均匀，静置反应2 0 m i n 后加入5 m l 盐酸溶液，中和过量得碱，混匀后再静置2 0 m i n ，然后滴加一定量的三氯化铁溶液，充分混合，振摇至颜色稳定后用去离子水定容，一定时间内测定吸光度。2 2 2 4 最大吸收波长测定以三氯化铁为显色剂，以水做空白对照，用紫外吸收分光光度计对生成的棕色络合物进行全波长扫描。2 2 1 2 5 显色剂三氯化铁用量对吸光值稳定性的影响取同一样液5 份，分别向其最终反应体系加入不同体积的三氯化铁，充分混和，在最大吸收波长处，每间隔一定时间测定一次吸光值，观察吸光值变化，选择合适的三氯化铁用量。2 2 2 6 标准曲线的制备将n a o h 溶液和盐酸羟胺溶液按1 ：l 混合后，立即用移液管吸取6 份1 0 m l 此溶液，分别至5 0 m l 容量瓶中，再各吸取5 m l 含1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，4 0 0 ，5 0 0 肛g 乙酰基的五一乙酰葡萄糖标准溶液，加到上述5 个5 0 m l 容量瓶中，空白用水，边加边摇。2 0 m i n 后各加入5 m l 2 m o l lh c l 溶液，混匀后再静置2 0 m i n ，然后滴加1 0 m l 三氯化铁溶液并用去离子水以定容，每滴加一次都需充分混合，显色l o m i n 后在5 0 0 r 1 1 1 1 处测定吸光度。2 2 2 7 多糖乙酰化度计算m ：丝1 0 0 m 4 + ”傩：! ! 型4 3 0 0 一4 2 朋m a c _ 一从标准曲线上查得的乙酰基量( 扯g )m 多糖含量( p g )m 多糖中乙酰基百分含量d s 多糖乙酰基取代度2 3 结果与讨论2 3 1 多糖测定标准曲线江南大学硕士学位论文1 0 08 06 04 02 0000 102030 4050 6o d 值图2 一l 多糖标准曲线得到其直线回归方程为y = 1 4 4 5 6 x + 0 4 6 2 6 ，相关系数r 2 = o 9 9 9 32 3 2 最大吸收波长测定以三氯化铁为显色剂，以水做空白对照时，用紫外吸收分光光度计对生成的棕色络合物进行全波长扫描，获得最大吸收波长为5 0 0 n m ，不同于以高氯酸铁为显色剂时，在5 1 0 姗处产生最大吸收波长。一、7图2 - 2 异羟肟酸铁最大吸收波长扫描图2 3 3 显色剂三氯化铁用量对吸光值稳定性的影响03 7o3 603 503 4o d 值0 3 303 203 10 3o2 9o2 851 01 52 02 53 0时间( i n )图2 - 3 三氯化铁用量对吸光值稳定性的影响一1高n)唰如辟特第二章分光光度法测定多糖乙酰化度由图2 3 可见，络合物的生成量与三氯化铁用量有很大的相关性，随着用量的增加，初始o d 值呈上升趋势，但在加入量7 m l 与1 0 m l 时已无明显差异；同时随着三氯化铁用量的增加，吸光值稳定性也有较明显提高。r 一文删s 一一r j 引+ r 一文n h o h + f e 3 。一i r 文 jl + 矿4 f e3 + + 2 h z n o h 卜4 f e2 。+ n 2 1 。+4h+h p图2 _ 4f “在反应中的两个过程由图2 4 可以看到，反应体系中存在的过量的羟胺可以还原高铁离子成亚铁离子，从而降低异羟肟酸铁的生成量，影响结果的准确性和精密度。通过实验数据分析可以得到异羟肟酸铁的稳定性主要决定于【f e ”】 n h 2 0 h 】比值，至少应为5 。如其比值略小于5 ，尚可得到较好的结果；如果其比值小于1 ，则得不到稳定结果。2 3 4 乙酰基标准曲线6 0 0巨5 0 0；如0回| j3 0 0寺雨2 0 0矗甚1 0 0门000 0 50 101 50 20 2 5o 3o d 值图2 - 3 乙酰基d d 值标准曲线得到其直线回归方程为y = 2 叭5 4 x + 5 7 4 5 6 ，相关系数r 2 = o 9 9 9 72 3 5 羟胺比色法精密度实验表2 - 3 同条件下测得的平行o d 值本方法测定乙酰化度的标准偏差为o 0 1 2 ，具有很好的重现性。2 3 6 魔芋葡甘露聚糖和芦荟多糖平均乙酰化度的测定江南大学硕士学位论文表2 _ 4 魔芋葡甘露聚糖和芦荟多糖乙酰化度的测定2 4 本章小结本章采用改良的苯酚硫酸法测定杂多糖含量，以盐酸、三氯化铁替代危险的高氯酸、高氯酸铁进行显色，建立了新的多糖乙酰化度测定分光光度法。本方法提高了操作安全性；通过调整三氯化铁和盐酸羟胺的用量比例，使得碱性羟胺比色法测定乙酰基具有很好的精密度、稳定性和安全性。第三章k g m 乙酰化改性研究第三章k g m 乙酰化改性研究3 0 引言乙酰基是天然存在于k g m 中的唯一取代基团，k g m 的乙酰化改性是加强多糖功能性质、拓宽其应用范围的基础。同样多糖分子量也是非常重要的一个因素，因为它影响着多糖的粘度、溶解性乃至应用范围例等，因此乙酰化改性和功能性对比应兼顾取代度和分子量。前人所作的乙酰化改性研究中，碱性条件下的乙酰化虽然使得产物具有较大的分子量，但副反应多、乙酰化度太低【3 9 j o 】；光善仪等人【4 1 】克服了碱性条件下副反应多的问题，采取酸性条件下的乙酰化工艺，制得了乙酰化度o 7 以下的a k g m 并进行了物理性质的比较，但此工艺使多糖分子量降解严重。此外，在我们的探索性试验当中，分析得到影响乙酰化度和分子量的最主要因素是p h 值，碱性条件下无法得到较高乙酰化度多糖，酸性条件下则导致多糖的酸降解，而且乙酸酐具有遇水分解生成乙酸的性质，在以乙酸酐为酰化剂时，水的存在无疑会导致酸降解。本章在分析和总结前人方法的基础上，采用乙酰化度和代表分子量的特性粘度作为k g m 乙酰化工艺研究的指标，在接近中性无水的条件下探索建立既对分子量无显著降解作用又可制得较宽乙酰化度范围a k g m 的制备工艺。3 1 材料与设备魔芋胶2 8 ( 经去淀粉、去蛋白工艺处理) 武汉强森魔芋有限公司乙酸酐( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司无水乙酸钠( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司9 5 乙醇( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司超级恒温水浴玻缸江苏金坛市荣华仪器制造有限公司乌氏黏度计( o 6 o 7 mm )上海亚太技术玻璃公司w f j 2 0 0 0 型可见分光光度仪尤尼柯上海有限公司透析袋( 截留分子量3 5 0 0 d a )上海绿鸟科技发展有限公司f t - i r 富立叶红外光谱仪美国t h e n n on i c o l e t秒表上海手表五厂3 2 实验方法3 2 1 分子量测定3 2 1 1 特性粘度法待测多糖透析2 4 h 后，以去离子水为溶剂，配成1 9 l 多糖液，采用乌氏粘度计( 直径o 6 - o 7 m m ) 在2 5 土o 1 条件下以外推法测定特性粘度m ，【喇爿( m 。“。并测得改性前k g m 喇2 7 5 5 m l g 。ls江南大学硕士学位论文3 2 2 乙酰化度测定3 2 2 1 多糖测定：( 见2 2 1 3 )3 2 2 2 乙