细胞生长因子微环境与早期胚胎发育.doc

www.CRTER.org王芳，等. 细胞生长因子微环境与早期胚胎发育细胞生长因子微环境与早期胚胎发育王 芳, 陈绍威(泸州医学院附属医院生殖医学技术部，四川省泸州市 646000)引用本文：王芳, 陈绍威. 细胞生长因子微环境与早期胚胎发育J.中国组织工程研究，2016，20(11):1637-1643.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.018 ORCID: 0000-0002-6659-9162(王芳)文章快速阅读：早期胚胎发育的相关细胞因子种类、结构特点和分子调控机制无脊椎动物的胚胎发育与脊椎动物相同处：也是按阶段循序进行生物合成和细胞分化；由组织发生到器官发生，终而在形态建立的基础上出现功能分化这些过程不仅要具体通过细胞间和组织间的相互作用，而且还必须具备一定的环境条件才能实现，如光照、干旱和寒冷对胚胎或幼虫的蜕皮和滞育有直接影响，基质的理化和生物因素可决定水生幼虫的沉落、附着和变态，而营养、盐度、温度、光照、空间和外激素等条件都可影响其性腺的发生和分化 文题释义：胚胎发育：是一个复杂的生理过程，提供某些细胞因子或清除微环境中有害物质等都将有助于胚胎的正常发育。通过胚胎体外培养模拟体内胚胎发育过程，可以了解众多因素对胚胎发育的影响，减少胚胎细胞凋亡。细胞生长因子微环境：创建细胞生长因子微环境有利于胚胎发育，表皮生长因子、胰岛素样生长因子、白血病抑制因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等生长因子在胚胎发育过程中起重要作用。王芳，女，1969年生，重庆市人，汉族，1991年四川省泸州医学院临床医学系毕业，副主任医师，主要从事辅助生殖临床研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)11-01637-07稿件接受：2016-01-24http:/WWW.摘要背景：哺乳动物胚胎早期发育和着床是一个非常复杂的过程，受到多种细胞因子的调节，其中表皮生长因子、转化生长因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子在调控此过程中发挥着重要的作用。目的：介绍影响早期胚胎发育的相关细胞因子种类、结构特点和分子调控机制，同时，对国内外关于表皮生长因子、转化生长因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子在早期胚胎发育中的作用研究进展进行了综述。方法：以检索词 “胚胎发育(embryos development)，表皮生长因子(Epidermal growth factor)，胰岛素样生长因子(1nsulin-like growth factor-II)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)，转化生长因子(Transforming growth factor)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor)” 检索1989至2015年相关文献。归纳总结近几年文献报道综述5种细胞因子表皮生长因子、转化生长因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子对于克服哺乳动物早期胚胎发育阻滞发挥的积极作用。结果与结论：(1)细胞生长因子参与胚胎发育是研究的重点。胰岛素样生长因子能够促进胚胎的生长，表皮生长因子在胚胎发育方面表现出多种形式的功能，白血病抑制因子直接影响卵母细胞发育，孕激素可上调白血病抑制因子表达为胚胎发育提供了良好的细胞因子微环境，血管内皮生长因子促进卵母细胞的体外成熟在胚胎发育的各个阶段都起着非常重要的作用。(2)弄清这些细胞因子的调控模式，不但可以有助于胚胎的体外培养，也有助于减少胚胎凋亡，对促进胚胎发育有十分重大的意义。关键词：组织构建；组织工程；表皮生长因子；白细胞抑制因子；胰岛素样生长因子；胚胎；细胞凋亡主题词：胚胎发育；表皮生长因子；胰岛素样生长因子3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Microenvironment of cell growth factors and early embryonic development Wang Fang, Chen Shao-wei (Department of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China)AbstractBACKGROUND: Early mammalian embryonic development and implantation is a very complex process, which is regulated by a variety of cytokines. Moreover, epidermal growth factor, transforming growth factor, leukemia inhibitory factor, insulin-like growth factor and vascular endothelial growth factor play an important role in this regulation process.OBJECTIVE: To introduce cytokines related to early embryonic development, including types, structural features and molecular mechanisms, and meanwhile to review the effects of epidermal growth factor, transforming growth factor, leukemia inhibitory factor, insulin-like growth factor and vascular endothelial growth factor in the early embryonic development. METHODS: A literature retrieval was performed to search relevant articles published from 1989 to 2015 using the keywords of “embryos development, epidermal growth factor, transforming growth factor, leukemia inhibitory factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor”. Active effects of these five kinds of cytokines in overcoming the mammalian embryonic development block were reviewed and summarized to provide theoretical and experimental basis for further optimization of the embryonic culture system in vitro.RESULTS AND CONCLUSION: Cell growth factors involved in embryonic development is the focus of the study. Insulin-like growth factor is capable of promoting the embryonic growth; epidermal growth factor exhibits multiform functions in the embryonic development; leukemia inhibitory factor directly affects oocyte cell development, and progesterone increases the expression of leukemia inhibitory factor to provide a good cytokine microenvironment for embryonic development; vascular endothelial growth factor promotes in vitro oocyte maturation, and plays a very important role in various stages of embryonic development. To clarify these regulatory patterns of cytokines cannot only contribute to in vitro embryonic culture, but also reduce embryonic apoptosis, which is of great significance for promoting embryonic development.Subject headings: Embryonic Development; Epidermal Growth Factor; Insulin-Like Growth Factor ICite this article: Wang F, Chen SW. Microenvironment of cell growth factors and early embryonic development. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(11):1637-1643.Wang Fang, Associate chief physician, Department of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China1643ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction 人类早期胚胎发育是一个复杂的生理活动，多年来的人胚胎体外培养的研究表明，早期胚胎发育受多种细胞因子的调控1-4，炎性细胞因子会抑制胚胎发育，如肿瘤坏死因子5-7，白细胞介素68，白细胞介素1及其受体等9。而早期胚胎的正常发育必须依赖于源自生殖道上皮细胞的信号，抗凋亡因子和细胞生长因子形成网络发挥生物活性作用，提供某些细胞生长因子或清除微环境中有害物质等都将有助于胚胎的正常发育。因此，细胞生长因子与早期胚胎发育的关系密切，在促进早期胚胎发育、提高胚胎质量等方面具有重要意义。胚胎发育受多种因素的影响，如生长因子，细胞因子，血管活性因子。近年来细胞生长因子参与胚胎发育和着床的功能研究十分热门，对其研究已深入到细胞、分子生物学水平，细胞生长因子发挥改善胚胎发育、启动胚胎着床、调节植入过程等强大作用(图1)。细胞生长因子是由正常细胞分泌的具有刺激细胞生长活性的可溶性蛋白与多肽类物质，既无药物类毒性，也无免疫反应。胚胎发育期间可合成并分泌多种肽类细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞因子、胰岛素样生长因子1等10-13。从目前的哺乳动物以及人类的研究资料表明，哺乳动物早期胚胎可以合成上述多肽类生长因子。这些因子通过胚胎或胚胎周围组织细胞的旁分泌或自分泌途径，促进和影响胚胎发生，同时，它们的受体也在胚胎和母体中表达，影响体外受精胚胎移植的结局。与哺乳动物胚胎发育有关的细胞因子有胰岛素、胰岛素样生长因子家族、表皮生长因子家族、成纤维细胞生长因子家族、血小板衍生生长因子家族、白血病抑制因子、血管内皮生长因子等。胰岛素样生长因子是促合成代谢、促有丝分裂和抗细胞凋亡的因子，能调节脊椎动物细胞的生长、分化和凋亡，胰岛素样生长因子通过内分泌、自分泌或旁分泌机制在早期胚胎发育、胚胎着床中起着重要的调节作用14。此外转化生长因子是一类具有多种生物学作用、多细胞来源的细胞因子，也是表皮生长因子家族的重要成员之一。哺乳动物的胚胎、输卵管和子宫均分泌转化生长第一作者以“胚胎发育，表皮生长因子，胰岛素样生长因子等”检索万方数据库、PubMed数据库1989至2015年相关文献共检索到中英文文献210余篇排除研究目的与本文无关及重复文献通过阅读摘要初步筛选，共选取47篇文献进行综述22篇影响胚胎发育的因素和细胞因子的作用。5篇文献探讨了表皮生长因子的作用5篇文献探讨了胰岛素样生长因子的作用6篇文献探讨了白血病抑制因子的作用9篇文献探讨了其他细胞因子的作用图2 文献检索流程图滋养层外胚层内胚层原肠腔多个细胞8个细胞4个细胞2个细胞受精卵囊胚腔滋养层囊胚透明带内细胞团卵裂图1 哺乳动物受精卵的发育因子，它对胚胎的生长、发育构建有一定影响15。白血病抑制因子(LIF)直接影响卵母细胞发育，经白血病抑制因子的处理过的卵母细胞类皮质颗粒迁移率增加，CD9表达提高，其表达由雌激素调节，对卵母细胞成熟和胚胎着床有重要作用。对胚胎发育有促进作用对胚胎发育有促进作用16-19。血管内皮生长因子促进卵母细胞的体外成熟(IVM)，影响胚胎发育，着床，在胚胎发育的各个阶段都起着非常重要的作用20-22。文章将对这些影响胚胎发育的细胞生长因子进行综述。1 资料和方法 Data and methods1.1 资料来源 检索数据库：万方数据库和PUBMED数据库。检索人相关内容：检索人王芳。检索时间范围：1989至2015年。检索词：胚胎发育embryos development，表皮生长因子Epidermal growth factor，胰岛素样生长因子Insulin-like growth factor-II，白血病抑制因子Leukemia inhibitory factor，转化生长因子Transforming growth factor和血管内皮生长因子Vascular endothelial growth factor。检索文献量：210篇。1.2 检索方法纳入标准：影响胚胎发育的相关生长因子研究。排除标准：重复的，不相关的内容。质量评估：共检索到210篇文章，中文文献90篇，英文120篇。依据纳入排除标准，以47条文献进行分析。文献检索流程图见图2。2 结果 Results 2.1 表皮生长因子 表皮生长因子是最早发现的细胞因子，广泛存在于人体的体液和组织中。表皮生长因子是由53个氨基酸组成的多肽，最初因其能刺激表皮的生长和角化而得名。体内许多细胞包括子宫内膜细胞均可分泌表皮生长因子23-24。表皮生长因子及其受体家族在人和动物各种组织器官生长发育过程中具有明显的促进作用，表皮生长因子参与了胚泡着床和胚胎发育等过程的调节，有研究添加不同浓度表皮生长因子的CZB培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养25，观察囊胚发育率和胚胎细胞数的变化。结果显示表皮生长因子注射后138 h，0.1 g/L表皮生长因子添加组扩张囊胚率、孵化囊胚率显著高于其他各组；100.0 g/L表皮生长因子添加组扩张囊胚率和孵化囊胚率显著低于其余各组，且囊胚细胞死亡较多。结果说明通过刺激囊胚期细胞分化而促进胚胎体外发育，但高浓度表皮生长因子抑制胚胎体外发育并使早期胚胎受损。有试验将卵母细胞成熟培养42 h后构建克隆胚，进行电融合激活26，再使用6-DMAP(2 mmol/L)进行化学辅助激活，然后移入NCSU-23培养基培养，激活后第2天添加0，10，20，30 g/L表皮生长因子，7 d后检查囊胚率、囊胚细胞数；激活后第0，2，4，6天添加体积分数10%胎牛血清，7 d后检查囊胚率、囊胚细胞数。结果表明2-4细胞阶段添加表皮生长因子，添加20 g/L表皮生长因子组的囊胚率显著升高；在第4天添加胎牛血清组的囊胚率显著高于对照组。结果说明添加20 g/L的表皮生长因子能促进克隆胚胎的发育率，在第4天添加胎牛血清更有利于胚胎的发育。将表皮生长因子与谷氨酰胺联合添加可以提高细胞发育率和桑囊率，说明表皮生长因子是克服胚胎体外发育过程中发育阻滞现象的有效因子27。人表皮生长因子重组蛋白是在大肠杆菌中重组表达的，是一条单链、非糖基化的多肽链，经过几十年的研究，其结构和功能已被较为全面的了解。表皮生长因子受体与配体结合后可发生同源或异源二聚体化，导致其胞内段受体酪氨酸激酶发生自身磷酸化。表皮生长因子受体是受体酪氨酸激酶家族成员之一，是一相对分子质量为170 000的单跨膜糖蛋白受体，包括胞外配体结合区域、跨膜区域、胞内酪氨酸激酶活性区域和受体C末端结构域，表达于多种正常组织和细胞。该家族属于酪氨酸激酶的跨膜蛋白受体，包括4个成员，由表皮生长因子受体1、表皮生长因子受体2、表皮生长因子受体3和表皮生长因子受体4组成，各成员之间具有高度同源性，均具有酪氨酸激酶活性，能调节细胞生长、分化、迁移及其他细胞反应。如人类表皮生长因子受体2属于一种具有酪氨酸酶活性的跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体家族的第二个成员，参与酪氨酸酶信号转导，促进细胞增生。表皮生长因子与其受体的结合反应可激活一系列的基因，正是这一诱导效应的多样性决定了表皮生长因子生物学活性和生理学功能的多样性。表皮生长因子在改善胚胎发育中起重要作用。2.2 胰岛素样生长因子 胰岛素样生长因子是由70个氨基酸组成的单链碱性蛋白，具有胰岛素样生物活性，参与糖、脂肪、蛋白质的代谢，并可促进细胞增殖分化，抑制细胞凋亡。胰岛素样生长因子对胚胎生长发育有重要作用，通过与胎盘、胎儿各组织器官细胞表面的受体结合调节有丝分裂和其他细胞活动。胰岛素样生长因子在哺乳动物的生长发育过程中通过受体介导对生物体的生长起重要的调节作用。胰岛素样生长因子通过与胰岛素样生长因子结合蛋白的结合调节早期胚胎发育过程中的细胞凋亡。胰岛素样生长因子由具有特定功能的配体2个多肽类生长因子胰岛素样生长因子1、胰岛索样生长因子2两类受体和至少6种结合蛋白构成组成。胰岛素主要调节代谢平衡，而胰岛素样生长因子1和胰岛索样生长因子2的生物学功能通过自分泌和旁分泌对胚胎发育起着十分重要的作用28-29。已知的胰岛素样生长因子1是胰岛素样生长因子家族中的一员，是早期胚胎发育的重要调节因子之一。胰岛素样生长因子1基因核苷酸序列分析揭示它含有 6个外显子，成熟的胰岛素样生长因子1含有B、C、A、D 4个功能区，受营养状态、激素、遗传等多因素的调节，和胰岛素样生长因子1受体相结合可发挥其促细胞增殖等广泛的生物学作用，胰岛素样生长因子1生物学活性受胰岛素样生长因子1受体及胰岛素样生长因子1结合蛋白调节。胰岛素样生长因子1可以增加体外培养的胚胎的囊胚发育率，并与其他基因协同作用调节胚胎细胞的凋亡。钱华等30在促排卵治疗患者血清和卵泡液中血清胰岛素样生长因子1水平/获卵数与卵泡液胰岛素样生长因子1水平呈正相关；M期卵母细胞的卵泡液胰岛素样生长因子1水平高于M期；M期卵母细胞卵丘颗粒细胞胰岛素样生长因子1受体mRNA相对表达量约为M期的3倍，说明卵泡液中胰岛素样生长因子1可促进颗粒细胞胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达，二者可能协同促进卵母细胞成熟，血清胰岛素样生长因子1水平/获卵数可能对卵母细胞成熟有预测作用。胰岛素样生长因子2是迄今所知功能最复杂的细胞因子，它是一种促有丝分裂原，参与生后基因组重建，与X染色体的失活有重要关系。由于它对于胚胎的生长起到重要作用，故又称胚胎样生长因子，所有的这些功能说明胰岛素样生长因子2在机体生长发育过程中的重要性。张媛等31将小鼠胚胎体外培养120 h后，胰岛素样生长因子2添加组囊胚发育率、孵化率明显升高。王丽娟32有研究表明人类未受精的卵母细胞及植入前各阶段胚胎均未检测到胰岛素样生长因子1表达，而所有的卵母细胞及各阶段胚胎均有胰岛素样生长因子2的表达；胰岛素样生长因子2可作为胚胎质量的标记物；胰岛素样生长因子2基因表达量和胚胎的形态学评分呈正相关；年龄较轻和妊娠的患者中其胚胎中胰岛素样生长因子2的基因表达量较高。2.3 白血病抑制因子 白血病抑制因子是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，主要通过与其受体结合发挥作用。人和哺乳动物胚胎植入前的所有阶段均有白血病抑制因子和受体的表达。白血病抑制因子和受体在人胚胎4细胞期前和停止发育48 h后的胚胎中均下降，在植入前表达呈现峰值。所有这些表明白血病抑制因子以自分泌或旁分泌的方式调节植入前胚胎以及胚胎的植入。在体外胚胎培养液中加入白血病抑制因子促进了囊胚的孵化，减少了胚胎的退化，提高了体外培养胚胎的植入率33-35。白血病抑制因子对体外胚胎具有营养作用，在诱导子宫内膜容受、调节胚胎发育、控制滋养细胞入侵和调节母胎免疫等方面具有重要作用，为胚泡着床所必需。白血病抑制因子对胚胎着床的过程有着较大的影响力，对白血病抑制因子通过降调节的方法可使胚胎的着床率随之降低，着床率又是通过STAT3磷酸化来取得效果的36。有研究取35例行体外授精-胚胎移植或单精子卵细胞浆内注射的不孕患者受精后第3天的胚胎培养液37，分为优质胚胎组和劣质胚胎组，采用酶联免疫吸附法测定其中白血病抑制因子的含量。结果显示白血病抑制因子在人胚胎培养液中有表达，优质胚胎培养液中白血病抑制因子的含量较劣质胚胎培养液中高，但无统计学意义；优质胚胎培养液中的白血病抑制因子含量与妊娠结局关系明显，白血病抑制因子含量 700 ng/L时妊娠结局较好。说明白血病抑制因子在胚胎发育过程中可能起重要作用，测定胚胎培养液中的白血病抑制因子含量可以作为预测妊娠结局的一项指标。也有研究应用免疫组织化学方法检测白血病抑制因子及其受体在30例宫外孕、30例人工流产以及30例足月妊娠胎盘组织中的表达38。用卡方检验检测白血病抑制因子、受体在宫外孕、人工流产及足月妊娠胎盘组织中的表达是否有差异。结果白血病抑制因子、受体在宫外孕胎盘组织中阳性率分别为93%和90%，在人工流产胎盘组织中阳性率分别为93%和90%，在足月妊娠胎盘组织中无阳性表达。结果说明白血病抑制因子及其受体在早期妊娠中，对维持胎盘的功能和胚胎的生长发育具有重要意义，对晚期妊娠的临床意义还有待进一步研究。2.4 转化生长因子和血管内皮生长因子 胚胎着床前胚泡的内细胞团和滋养外胚层细胞均表达转化生长因子及其受体，转化生长因子尤其是其膜结合型的前体在子宫植入窗期的特异性表达提示其在胚胎植入过程中具有调控作用。转化生长因子能够促进胚胎的发育39-40。转化生长因子超家族成员，在胚胎植入部位大量表达，通过卵巢旁分泌和/或自分泌起到调控卵泡发育和卵成熟的作用，能明显抑制体外滋养细胞的增殖，干扰其分化，调控其对子宫内膜及血管壁的侵蚀作用。转化生长因子1和转化生长因子3的表达开始于胚胎发育第 9天，直到第 10-11天，各部才出现较强的转化生长因子2染色，第12 天达高峰，第 13天后，表达下降41。卵泡液中转化生长因子能够协调卵泡液局部雌二醇/孕酮比值，从而获得高质量卵子，改善体外受精-胚胎移植结局42。血管内皮生长因子是一种能促进血管增殖，特异作用于血管内皮细胞，增加血管通透性的糖蛋白， 也是与血管生成密切相关的生长因子。目前已知血管内皮生长因子参与胚胎植入及胚胎的血管发生43-44。血管内皮生长因子是内皮细胞的特异性致裂原，在血管发生和血管生成过程中占有重要地位。近年来发现，血管内皮生长因子对胚胎植入也具有一定作用。在DMEM+BSA培养中加入血管内皮生长因子2在8细胞期胚胎表达最高45，添加血管内皮生长因子后卵裂率，第8细胞期发育率增加46。同样有研究显示在培养液中加入血管内皮生长因子卵母细胞的体外成熟率和卵裂率分别为86.09%和75.18%，较未添加时显著升高(80.68%，69.38%)，桑葚胚率和囊胚率也较未添加时提高。而添加剂量在5 g/L较1 g/L更能有效促进卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎早期发育47。3 小结 Conclusion 随着细胞凋亡研究的深入，对细胞因子对早期胚胎发育的功能调控已取得一些进展，胚胎着床前相关因子的调控关系到胚胎发育的结局，同时也影响其的生理功能。胰岛素样生长因子能够促进胚胎的生长，表皮生长因子在着床与胚胎发育方面表现出多种形式的功能。孕激素可以上调白细胞介素4介导的白血病抑制因子的表达，为胚胎发育提供了良好的细胞因子微环境，提高胚泡形成，刺激小鼠胚胎发育。血管内皮生长因子可以促进卵母细胞的体外成熟(IVM)，对胚胎发育产生积极的影响，在胚胎发育的各个阶段都起着非常重要的作用。综上所述细胞生长因子在早期的胚胎发育过程中，对胚胎的生长发育十分重要，在启动胚胎着床、调节植入等过程起着举足轻重的作用，细胞因子协同作用、体外培养环境等已引起研究者的重视，进一步弄清这些细胞因子的调控模式，不但可以有助于胚胎的体外培养，也有助于减少胚胎凋亡，为进一步优化胚胎体外培养体系提供理论和实验依据。 作者贡献：综述设计陈绍威、资料收集王芳、文章撰写王芳、审校陈绍威。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References 1 Wilton LJ, Trounson AO. 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