（食品科学专业论文）黑龙江地区自然发酵黄豆酱中酵母菌的分离鉴定及筛选.pdf

摘要 传统发酵豆制品以其丰富的营养和良好的保健功能越来越受到人们的喜爱。发酵豆酱作 为我国四大传统发酵豆制品之一，一直是人们生活中的佐餐佳品，目前国内豆酱生产大部分 还是采取自然发酵、手工作坊式生产，产品质量不稳定并且可能存在安全隐患。随着生活水 平的提高，人们对传统豆酱的风味、营养和安全性也提出了更高的要求本课题旨在研究传 统豆酱的发酵过程，筛选出适合豆酱工业化生产的菌株，以缩短生产周期、改善生产工艺， 从而获得品质优良的发酵豆酱，来满足人们日益增长的饮食文化的需求。 微生物在豆酱的整个发酵过程中起着重要的作用，其中酵母菌与豆酱的呈味和品质有密 切关系，因此调查清楚豆酱中酵母菌的种类及其对豆酱品质的影响具有重要意义。本课题以 黑龙江地区的豆酱样品为对象进行研究，分离鉴定其中的酵母菌株，然后以总酯和乙醇为筛 选指标，筛选出适合豆酱工业化生产的酵母菌株，并研究其发酵特性，主要内容如下： 1 首次选择黑龙江地区具有代表性的许氏大酱作为研究对象，研究其酱醅和稀态发酵过程 中的各种微生物的分布情况找出发酵黄豆酱生产过程中各种微生物及理化指标的变化 趋势，并确定出最佳采集样品时间为发酵中后期( 2 0 3 0 d ) 。 2 对黑龙江1 2 个地区的2 4 个样品进行研究，分离得到5 8 株酵母菌株，经鉴定为8 个属。 汉逊酵母属1 2 株，其中1 株亚膜汉逊酵母( h m t s e n u l as u b p e l l i c u l o s a ) ，2 株西弗汉逊酵 母( h a n s e n u l ac i f e r r i o ，4 株异常汉逊酵母( h a n s e n u l aa n o m a l a ) 3 株赛道威汉逊酵母 ( h a n s e n u l as y d o w i o r u m ) ：假丝酵母属1 5 株，其中5 株为郎比可假丝酵母( c a n d i d a l a m b i c u s ) , 毕赤氏酵母属8 株，其中3 株为膜醭毕赤氏酵母( p i c h i a m e m b r a n a e f a c i e n s ) ， 5 株为粉状毕赤氏酵母( p i c h i af a r i n o s a ) , 酵母属5 株( s a c c h a r o m y c e s ) t 球拟酵母属 ( t o r u l o p s i s ) 2 株，地霉属( g e o t r i c h u m ) $ 株，德巴利酵母属( d e b a r y o m y c e s ) 4 株，接台酵 母属( z y g o s a c c h a r o m y c e s ) 3 株其中假丝酵母属和汉逊酵母属为优势酵母菌菌群，在各 地区出现的频率高，菌数也最多。 3 酵母菌的呈味作用主要发生在稀态发酵过程中，因此在筛选豆酱中分离的酵母菌作发酵 剂时，测定菌株在高n a c i 培养基中的生长活力的同时，还需考虑到菌株的产酯和产醇 能力。经过对5 8 株酵母菌的筛选，最终得到四株在高盐条件下菌株生长活力旺盛且产 酯产乙醇能力较强的菌株s c l 2 、s c l 3 s c i 和q q 6 。 关键词：豆酱酵母菌分离鉴定 i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n ds e l e c t i o no ft h ey e a s t sf r o m t r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o ns o y b e a np a s t ei nh e i l o n g j i a n g p r o v i n c e a b s t r a c t f e r m e n t a t i o n s o y b e a np a s t ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tt r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o ns o y b e a n p r o d u c t si nc h i n at h a ti sb e i n gp o p u l a t e di n c r e a s i n g l yf o ri t sn u t r i t i o na n dh e a l t hc a r er o l e i ti s w e l c o m e da tm e a l sa l lt h et i m e n o w a d a y sm o s tp r o d u c t sw e r ep r o d u c e db yn a t u r a lf e r m e n t a t i o n , s ot h eq u a l i t yo fs o y b e a np a s t ei si n s t a b a n dn o ts a f ee n o u g h i nt h em e a nw h i l ep e o p l eh a v ea s t r o n gd e s i r et oi m p r o v et h ef l a v o r , n u t r i t i o na n ds e c u r i t yo f t h ep r o d u c t s i no r d e rt os h o r t e nt h e f e r m e n t a t i o np e r i o d ，i m p r o v et h et e c h n o l o g ya n dg e tb e t l e rp r o d u a , t h i sp r o j e c ts t u d i e dt h ew h o l e f e r m e n t a t i o np r o c e s so ft h et r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o ns o y b e a np a s t e ，a n ds o m eg o o ds t r a i n sw a r e s e l e c t e df o rt h ei n d u s t r y m i c r o o r g a n i s m sp l a yal e a d i n gr o l ei nt h ew h o l ef e r m e n t a t i o np r o g r e s so fs o y b e a np a s t e a si s r e p o r t e dt h ey e a s th a v eh e a v yc o r r e l a t i o n st ot h ef l a v o ra n dt h eq u a l i t yo ft h es o y b e a np a s t e s o i n v e s t i g a t i n gt h es p e c i e so ft h ey e a s t sa n dt h e i rf u n c t i o n sw i l lb ev e r yu s e f u l t oi m p r o v et h e t e c h n o l o g ya n dq u a l i t yo f t h es o y b e a n p a s t e i nt h ep r e s e n tt h e s i s ，t h es a m p l e so f s o y b e a np a s t ei n h e i l o n g j i a n gp r o v i n c e w e r ei n v e s t i g a t e d ，t h e nt h ey e a s t si nt h e p a s t ew e r ei s o l a t e da n d i d e n t i f i c a t e d a tl a s tt h ea l c o h o ia n dw h o l ee s t e rw e r et a k e na st h em a i ni n d i c a t r i x , a n df o u rs t r a i n s o f t h ey e a s t sw e r es c r e e n e df r o mn a t u r ef e r m e n t a t i o ns o y b e a np a s t e t h e i rf e r m e n t a t i o np r o p e r t i e s a n dc o m p o n e n tc h a n g e sd a n gt h ef e r m e n t a t i o np e r i o dw e r es t u d i e d t h em a i nr e s u l t s 姗a s f o l l o w i n g ： 1 t h em i c r o o r g a n i s mo far e p r e s e n t a t i v et r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o ns o y b e a np a s t ew a s a n a l y z e d t h ec h a n g e so fm i c r o o r g a n i s ms y s t e mw e r ea n a l y s e d ，a n da l s ot h ec h a n g e so f p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sw e r es t u d i e d t h eo p t i m u mt i m eo fs a m p l eg a t h e r i n go f t r a d i t i o n a lf e r m a t a t i o ns o y b e a np a s t ew a sa tt h em i d a n a p h a s oo f t h ew h o l ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ( 2 0 - 3 0d a y s ) 2 t w e n t y f o u rs o y b e a np a s t ep r o d u c t sw e r es t u d i e di nh e i l o n g i i a n gp r o v i n c e , f i f t y - e i g h t s t r a i n so f y e a s tw e r ei s o l a t e da n da l lo f t h e mw e r ei d e n t i f i e d t h e yb e l o n gt oe i g h tg e n e r a s t h e r ew e r et w e l v es f f a i n 5o f h a n s e n u l ac o n s i s t e do f o n es t r a i no f h s u b p e l l i c u l o s a , f o u rs t a i n s o f h a n o m a l a , t h r e es t a i n so f h s y d o w i o n u na n dt w os t a i n so f h a n s e n u l ac m i a m o n gt h e f i f t e e ns t r a i n so f c a n d d a , f i v eo f t h e mb e l o n gt oc l a m b i e u s ，a n de i g h to f t h e mb e l o n gt oo t h e r s a n o t h e rt h r e es t a i n so f y e a s tb e l o n gt oz y g o s a c e h a r o m y c e , a l lo f t h e ma 坞z m a j o r s t h e r ea r e f o u rs t a i n so f d e b a r y o m y e e sh a n s e n i ia n de i g h ts t a i n so f g e o t r i e h u r ac a n d i d u t h e r ea r ee i g h t i i s t a i n so f y e a s tb e l o n gt op i c h i a , a n dt h r e eo f t h e m 狮p m e m b r a n a e f a c i e n s f i v eo f t h e m 玳只 f a r i n o s 口a n o t h e rt w os t a i n sw e r ei d e n t i f l c a t e dt ob et o r u l o p s i sv a r i a b i l i sa n dt h ef i v eo f o t h e r s t a i n sb e l o n gt ot o r u l o p s i s 3 s t r a i n so f y e a s tr e s i s t e dt oh 讪s a l tw e r es e l e c t e df o rf u r t h e r 咖d y5 8s t r a i n sw e r o c u l t i v a t e di nl i q u i dm e d i aw i t hh i g hs a l tc o n c e n t r a t i o n , t h e nt h eg r o w t hr a t ea n df l a v o r c h e r a c t e d s t l co f t h ec u l t u r em e d i aw e r eo b s e r v e d f i n a l l yt h es t a i n so f s c , 2 。s c l 3 ，s c ta n dq s h o w e ds t r o n g e rr e s i s t a n c et oh i g hs a l tc i r c u m s t a n c e ，a n da l s ot h e i re s t e r i f i c a t i o ng o tf a s t e rt h a n o t h e rs t r a i n s s os c l 2 ，s c l 3 , s c ia n dq q 6w e r em o r ep o s s i b l et oh ea p p l i e di nt h ei n d u s t r i a l f e r m e n t a t i o no f s o y b e np a s t e k e yw o r d s ：s o y b e a n - p a s t ey e a s ti s o l a t i o ni d e n t i f i c a t i o n i l l c a n d i d a t e ：h u a n g y o n g s p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c ea n dte t h n o l o g y s u p e r v i s o r ：k o n gb a o h u a 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 洼! 垫遗直基丝霞噩挂剔直盟数：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作暑签名：蒂身乙 日期：w 年6 月扩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：茧身。 日期：7 耐年月曲 导师 签名：孔不7 日期：沙，年s 月娟 1 i 前言 1 1 研究的目的与意义 传统发酵大豆制品营养丰富，口味独特、深受人们喜爱，在我国具有较大的发展空间。 随着人们生活水平的不断提高，特别是随着豆酱保健功能的不断开发。人们对豆酱的品质和 风味也提出了更高要求，需求量正逐渐增大，这使豆酱产品再次焕发出新的活力。 我国传统发酵大豆食品虽然占有得天独厚的市场优势，但随着w t o 的加入，传统特色 食品面临着在安全性、营养性、方便性以及需求多样性和现代国际规模化生产的挑战。面对 着国外食品的大量涌入，以及具有现代消费特点的食品市场的形成，依靠祖传技艺、作坊式 或半机械化生产的传统特色食品将渐渐失去优势，企业生存将面l 悔危机而且目前豆酱企业 的生产方式已经不能满足消费者日益扩大的消费需求这就促使生产企业和科研机构必须进 行技术改造、设备更新，加快整个行业向高科技迈进的步伐。目前国内许多企业也都在开发 发酵豆制品的新品种，但这些产品基本上都是在原有产品基础上进行再加工，没有开发出革 新工艺制造的产品( 周明印，1 9 9 1 ) 因此加大中国传统发酵豆制品的科研力度十分必要。 豆酱在国外已得到深入的研究，且已经规模化，标准化生产，然而我国豆酱尽管生产历 史悠久，但厂家分散，规模较小，生产还处于落后的手工作业阶段，靠经验操作，没有对技 术改造提出更高的要求，对产品的研究没有引起重视，因而对豆酱的研究存在下述问题：对 发酵微生物及其发酵机理、生产工艺和产品的安全性等的研究少；没有筛选出合适的生产菌 株。尤其是对自然发酵过程中乳酸菌和酵母菌的分布和作用始终没有进行专门和系统的研 究，导致工业化生产无法还原豆酱天然风味，难以进行有效的工业化生产；对豆酱发酵过程 中的成分变化，没有进行系统的研究，不了解发酵过程与豆酱营养、风味和功能间的关系； 豆酱生理功能的研究一直被忽视，其机理至今尚不明确。 因此必须加大力度探索豆酱发酵过程中的成分变化，发酵机理，不断深入研究大豆食品 的先进加工技术，将传统工艺与现代食品工程高新技术紧密结合起来，找到适合工业化生产 的工艺，进而使传统豆酱的生产机械化、自动化，规模化 1 2 文献综述 1 2 1 我国传统发酵大豆制品的概况 中国是大豆及大豆制品的发源地，千百年来，中华民族发明了种类繁多的大豆食品，尤 其是中国的传统豆制品，无论从营养上，还是从饮食文化上，都堪称世界食林之精华_ 般 来讲，中国的传统豆制品包括非发酵豆制品和发酵豆制品两大类( 表i - 1 ) 。非发酵豆制品是 大豆经过清洗、浸泡、磨浆，除渣、煮浆、成型等工艺形成的产品，其产品物态属于凝胶状， 东北农业大学t 学硕七学位论文 如豆腐，千张及一些索制品等；而发酵豆制品指以大豆或大豆制品为发酵基质，经一个或几 个特殊微生物发酵过程而形成的产品产品一般都具有特定的形态、风味与营养，如酿造酱 油、豆酱、腐乳和豆豉等。这些大豆发酵食品不仅风味独特，滋味鲜美而且营养丰富、易 于消化，它们在东方饮食中扮演着极为重要的角色，是中华民族繁衍生息的重要物质基础。 它们不但早已流传到东南亚各国，而且日益受到西方发达国家人民的青睐。因此可以说中国 传统发酵大豆食品也是中国人民对世界文明的一大贡献。 表卜i 我国主要传统豆制品品种分类表 t a b i - 1t h e c l a s s i f i c a t i o n o f t r a d i t i o n a ls o y b e a n p r o d u c t s 传统发酵大豆制品的生产虽然已有两千多年历史；但是其加工技术发展比较缓慢，直至 2 0 世纪中叶，传统发酵大豆制品都是以小型的手工作坊式生产的。5 0 年代以后，豆制品的 生产逐步由电力代替人力，机械代替手工，传统发酵豆制品也开始由手工作坊向机械化、工 厂化方向发展( 石彦国，2 0 0 3 ) 。但目前其生产技术仍然比较落后，主要表现在以下几个方面： 手工操作量大，机械化，自动化程度低；质量监控缺乏理论知识，产品质量不稳定；卫生条 件差，包装保鲜技术落后，保质期短；营养与保健功能优势尚未开发，产品品味低( 李里特， 2 0 0 3 ) ，质量与规模都无法满足人们日益增长的饮食生活的需求。 我国的传统发酵豆制品的生产工艺存在着地域的差异，而且产品种类繁多、形态风味各 异，各种发酵豆制品的发展与现状也各不相同。我国四大类传统发酵豆制品为酱油，豆酱， 腐乳和豆豉，它们作为调味佐餐佳品深受广大人民群众的喜爱。且前酱油和腐乳已经逐渐步 入了工业化生产的轨道，但其工业化生产在一定程度上还存在一些不足豆豉与豆酱分别为 我国南北地区的重要调味食品。是人们饮食生活中不可缺少的一部分它们的生产还比较落 后，目前难以形成机械化，工厂化，生产形式大多是作坊式加工点或是半机械化加工工厂。 生产技术仍有待于进一步提高。随着生活水平的提高，人们对酱类制品的质量和感官的要求 也越来越高，酱类制品正逐渐引起人们的重视，因此越来越多的人开始研究、开发、投资传 统酱类制品，这大大促进了酱类加工工艺的改进品种的增加和质量的提高，酱制品企业的 数量也在不断增加。 2 根据国家大豆工程技术中心统计：1 9 9 8 年止，我国传统豆制品加工企业1 6 5 4 家，年加 工大豆4 5 万吨，年产各类豆制品1 1 2 5 万吨( 江连洲，2 0 0 0 ) 到2 0 0 0 年止，传统豆制品加 工企业增加到1 7 7 0 家，年加工大豆1 3 5 万吨，生产各类豆制品1 4 8 0 万吨，销售额达到2 5 0 多亿元，预计到2 0 1 0 年生产传统大豆食品年加工大豆6 0 0 万吨( 曹龙奎2 0 0 4 ) 。我国酱产 量也逐年增加，1 9 9 8 年，我国酱类制品总产量达到了6 0 余万吨，2 0 0 2 年达到了9 0 万吨左 右，2 0 0 3 年酱类产量超过了1 0 0 万吨。但这其中仅有1 0 是工业化生产，9 0 的产品是由 传统的手工作坊，设备简陋的小型企业生产韩国与日本的酱类生产已经实现了自动化、工 业化，而且韩国和日本的发酵大豆酱商业化生产每年都超过1 4 0 万吨( 张炳文等。2 0 0 0 ) 。由 此可见，我国的豆酱生产虽然发展很快，但生产技术还比较落后，还远远落后于日本和韩国。 因此我国豆酱的研究与开发有着广阔的发展空间。 1 2 2 国内外黄豆酱生产与研究的现状 1 2 2 1 我国发酵黄豆酱的生产及发展 ( i ) 我国自然发酵黄豆酱生产方法的发展 酱类制品是我国最古老的传统调味品之一，它的起源可以追溯到商周时代，汉朝时豆酱 的生产己形成一套完整的工艺齐民要术作酱法第七十记载的大豆酱的制作方法可以 说是唐以前大豆酱制作的代表，工艺流程如下： 原料豆一蒸煮一去皮一再蒸一晾凉一和曲一罨黄一酱黄一曝晒一成品 ff 白盐、黄蒸、草苣、麦曲盐卤，黄蒸 由上可见我国古代劳动人民已经懂得利用微生物，通过。制曲”来发酵大豆 随着时代的推移，制酱技术也进一步发展唐朝时期大豆酱的制作工艺的显著变化主 要表现在“制曲”一次完成唐韩鄂四时纂要中有“十日酱法”，其工艺流程如下： 豆黄一蒸烂一拌面一制曲一发酵一成热 这一大豆生产工艺省去诸多繁琐的步骤，只说“豆合面为之”，并且改为一次制曲成功，较 齐民要术中酱料与酱曲分开制作不仅节省了时间和劳动量，同时也保证了质量。因而这 是一个巨大的进步。这样的制酱方法简便，便于家庭制酱，因而逐渐推广流行一直沿用至今 ( 杨坚，2 0 0 0 ) 。 新中国成立之前，酱的制作大部分仍然停留在家庭式的加工，以大豆、面粉等为原料， 利用天然发酵制成酱曲，加入盐水，在室外瓦缸中，日晒夜露，经过发酵制成黄酱，即使工 厂生产也是手工作坊式生产方法。建国以后，由原来利用人工培养制曲，改为“种曲制造方 法”，由自然发酵制酱，改为人工保温发酵制酱，不再受季节变化等影响，开始进行工业化 生产，从根本上改变了几千年来制酱的规模和数量( 于春风，2 0 0 4 ) 。 由于中国不同地区气候与饮食文化的差异。各地区产生具有地方特色的生产工艺和产 品，豆酱的品种也一直不断增加。目前南方地区一般采用熟豆混合面粉后，自然接种制曲。 然后加盐水稀态发酵。我国北方地区大豆生产量大，大豆种植范围广，人们日常又特别喜欢 大豆食品，因此在北方地区豆酱的发展比较快。这其中以东北地区的稀态黄豆酱起源最早， 3 东北农业大学工学硕士学位论文 分布最广t 也日益受到人们的喜爱。其黄豆酱的发酵沿袭了满族八旗酱的制作工艺，原料上 不添加面粉，将蒸熟的大豆经过磨碎，成型，自然接种，再加入盐水自然发酵为成品。 国内对自然发酵黄豆酱生产工艺的研究较少，大部分的生产还处于落后的手工作业阶 段，靠经验操作，酿造时间一般为半年左右目前国内的黄豆酱产品有9 0 以上是通过自 然接种、自然发酵生产，一般采取的生产工艺如下( 方继功，1 9 9 8 ) 。 大豆一清理浸泡蒸煮一冷却一捣碎、成型一自然接种一培养 豆酱酷一水洗分割一混合发酵一打耙一豆酱 t 盐，水 此发酵工艺与民间自然发酵黄豆酱的方法相似，一般在民间自然发酵过程中，没有纯种 制曲的过程，完全采用自然接种微生物进行发酵。大豆经过筛选和清洗后，进行常压蒸煮， 研碎做成酱块。并用报纸等包好，置于室内自然接种，直接利用空气中的各种微生物。酱块 在室温下发酵近半年，酱块成熟后置于室外进行晾晒，清洗掉酱体表面的霉菌菌丝和污物。 碎成小块，加入盐水，开始进入稀态发酵过程盐水添加量凭借经验和口味的需求，一般采 用“十分水三分盐”的理念( 陈苍林，2 0 0 1 ) 发酵酱缸一般放置在太阳直接照射的地方，自 然晒酱发酵过程中每日打耙2 3 次，以混匀物料，随着发酵时间的延长可以适当减少每 天打耙的次数，每次打耙后除去上面漂浮的泡沫等杂质。一般经过一个月左右，酱品即成熟。 可以食用。 ( 2 ) 我国黄豆酱工业的生产方法 近年来对豆酱生产的研究主要集中于发酵菌种的选择和制作工艺上。目前我国制酱行业 普遍使用的固态低盐发酵，曲法制酱。其生产包括原料处理、制曲和后发酵三大过程。流程 如下： 面粉种曲( 或曲精) li 大豆一洗净一浸泡一蒸熟冷却一混合一接种一厚层通风培养一大豆曲呻 入发酵容器一自然升温一加第1 次盐水一酱酷保温发酵一加第2 次盐水一翻褚一成品 原料的前期处理，包括清洗、浸泡和蒸煮。浸泡过程中要注意浸泡的水温和浸泡时间。 一般采用自然水温。浸泡的时间在4 2 4 h 不等，目的都是通过大豆的吸水膨胀，以便在蒸 料的时候蛋白质迅速达到适度的变性，同时可以供给曲霉生长繁殖所必须的水分一般吸水 量在8 0 左右蒸煮的过程中需要控制温度、压力和时间不同的工艺过程，对应的参数 也不同常用条件如0 0 7 m p a ，1 1 5 ，2 0 r a i n ( 赵丰丽，卫红春，2 0 0 2 ) ；0 1 im p a ，3 0 m i n f 高 玉荣，2 0 0 4 ) ：0 1 3 加1 4 m p a ，1 5 2 0 m i n ( 吴晓琴。卢绪华，2 0 0 1 ) 等。日本人发明了一种高 温短时蒸煮法，这种方法无需添加水分，在蒸煮之前，用过热蒸汽在4 0 0 8 0 0 k p a 的压力下， 或温度2 0 0 2 8 9 下蒸煮大豆1 5 s ，即能得到相同的蛋白消化率( 徐岩，b r i a n ，2 0 0 1 ) 。虽然 蒸料条件不同，但需要达到的目的是相同的，一是达到原料的灭菌，一是使大豆蛋白质适度 变性，淀粉质全部糊化，为微生物提供有利的生长环境。最终成熟的大豆色泽均匀，有豆香 4 前言 气，无硬心，不沾手。 对于豆酱的生产，最重要的就是制曲工序，即以大豆作为培养基质的微生物发酵过程 目前国内大多数酱类制品生产厂家均采用沪酿3 0 4 2 制曲。此菌株适宜固态制曲，蛋白酶活 力高，还具有生长快、易管理、较粗放、原料全氮利用率稳定等特点。各种工艺的不同就在 于制曲菌株的接种量，接种温度和制曲温度的不同。但单一菌种制曲发酵酶系不全，生产周 期长，风味差。为了克服这些缺陷，一些工厂在发酵后期加入乳酸菌与酵母菌发酵液，以增 加其风味物质的形成。与传统工艺相比，不但缩短了加工周期，而且豆酱中氨基酸态氮含量、 还原糖含量均比传统发酵产品高，与现行速酿工艺相比弥补了其风味不足的缺陷( 赵丰丽等， 2 0 0 2 ) 。 目前国内豆酱生产的研究趋势是利用多菌种制曲生产黄豆酱，使传统生产工艺的周期减 短，不受季节限制，原料利用率高，成品品质好，加速实现酱品行业机械化、现代化。江浩 ( 2 0 0 2 ) 等人曾利用膨化原料，以菌种米曲霉a s 3 9 5 1 ，黑曲霉a s 3 3 5 0 分开制曲，混合发酵 生产黄稀酱。在稀醪发酵后期添加鲁氏酵母a s 2 3 7 1 增香，与传统工艺相比，明显缩短生产 周期，提高了原料及设备利用率，并且产品质量稳定。风味好贡汉坤( 2 0 0 4 ) 等研究在黄豆 酱生产中，采用米曲霉1 0 1 ，酱油曲霉3 0 2 双菌种制曲，添加植物乳杆菌7 1 0 和具有增香作 用的鲁氏酵母6 3 8 进行人工接种发酵，可使豆酱生产周期从1 8 0 d 缩短为6 0 d ，产品品质符 合国家有关酱的标准 盐水发酵是形成豆酱特有风味的重要阶段。豆酱发酵方法有天然晒酱法、保温速酿发酵 法、固态无盐发酵法及固态低盐发酵法。由于盐分高时会抑制发酵微生物产酶，延长发酵时 间，所以目前广泛使用的是固态低盐发酵法。发酵过程中主要控制的工艺参数有温度，p h 值，湿度， 时间和通风量等。佟德永( 1 9 9 6 ) 在成曲中加入4 5 的热盐水后，加盖密封。在 3 0 4 0 c 的环境中发酵，经过4 5 d 后开盖正常打耙发酵至成熟，产品质量很好。周明坤 ( 1 9 9 8 ) 采用两段式发酵方法，前期高温短时发酵后期补加盐水低温发酵的方式，制得的豆 酱色泽红褐色，酱香浓郁无异味 ( 3 ) 我国豆酱生产的研究现状 我国酱类制品的研究主要经历3 个发展时期。第一时期是自然酿造时期，从豆酱生产到 2 0 世纪5 0 年代中期被称为自然酿造技术时期。这个时期所制作的酱或酱油都是利用大自然 的野生霉菌和酵母制曲。再加入高质量分数的盐水，日晒夜露，使其发酵成熟。由于该工艺 可以使原料充分水解，乳酸及酒精发酵和酯化等化学变化依次和交叉进行，所以产品的酱香 和酯香浓厚，风味好。但是发酵周期很长( 6 个f 1 ) 后来天然发酵工艺逐步改为保温发酵， 提高了发酵温度，缩短了发酵周期。产品酱香和酯香较差，但依然保持了一定的固有风味 第二时期是传统生物技术时期。从2 0 世纪5 0 年代中期起直至现在是传统生物技术时期，可 能还要延续一段时间这段时期的特征是：定向选育菌株，微生物细胞和酶的培养、提取， 应用技术在逐步深化，掌握了发酵条件，正在逐步转向机械化生产。产品向调味、营养、保 健方面全面发展，开始注入高新技术。第三时期是现代生物工程时期。在这一时期，酶的培 养、提取，应用技术，液体培养工艺和发酵技术等一系列生物工程高新技术开始向酱类工业 领域渗透，但由于目前我国对豆酱的发酵机理的研究很少，还限于菌种选择和制曲工艺等方 东北农业大学工学硕士学位论文 面。因此要达到这种技术性质，还有很多工作待做，还要相当一段时间( 栾金水，2 0 0 2 ) 随着对豆酱研究的进展，豆酱生产原料和酿造方法上都已有所改进，使用的发酵微生物 也由过去的单一菌种向多菌种方向发展生产工艺也出现多样化的趋势。目前人们已逐渐摸 索出微火稀发酵、温酿稀发酵，温酿固稀发酵，温酿固体发酵等速酿大豆酱的方法。 近年来豆酱最新的研究方向为酶法制酱。出发点为向原料中添加适合的发酵酶制剂。更 快速地发酵大豆原料，但这种工艺的缺点是风味较差，成本太高。朱史齐( z 9 9 4 ) 很早就提出 了酱油等酱用酶制剂制造的新工艺设想。其设想的出发点是采用液体曲浓缩液添加固体粗 酶，制成酱油、酱类用“复合粗酶制剂”的新工艺，可以降低酶制剂的生产成本，提高酱品 质量，便于推动酿造行业发展商品酶。胡杨( 1 9 9 7 ) 利用现代生物工程技术生产的廉价复合微 生物酶制剂，结合传统制酱工艺，在5 4 5 5 0 发酵，发酵周期为4 d 酶法甜面酱新工艺由 于采用复合酶制剂保温速酿，生产周期短。出率高，卫生条件好。但是这种工艺条件的要求 比较高，产品质量达不到传统发酵工艺的水平，还需要进一步的研究。 1 2 2 2 国外黄豆酱的生产与研究现状 唐朝时我国大豆发酵技术传入朝鲜半岛、日本以及东南亚国家和地区，这使我国的豆制 品文化远播海外。并根植于当地，形成了具有地方特色的大豆发酵食品文化印尼的天培， 韩国的大酱汤，日本的豆酱、味噌和纳豆等实际上都是我国传统发酵豆制品的衍生品种。我 国的自然发酵黄豆酱传入韩国和日本后，为适应当地气候和文化都进行了相应的改造，也得 到了快速发展，目前日本与韩国都已基本实现了黄豆酱的工业化、自动化生产，各方面的技 术已领先于我国。 ( 1 ) 韩国黄豆酱的生产与研究动态 大豆的种植技术早在公元二世纪就已经传入朝鲜半岛，公元6 8 3 年豆酱传入高丽，改名 为“d o e n j a n g ”，其独特的风味深受当地人们喜爱经过漫长时期的发展，那里已经形成了 具有其地区特点的酱制品和生产工艺9 0 年代韩国酱类产业发展迅猛，到2 0 0 2 年年产量超 过了1 4 0 万吨，其中工业化生产的豆酱占7 0 。韩国豆酱主要分为：韩式大酱，大酱，辣 椒酱、春酱，青曲酱和混合酱不同种类的韩国豆酱的主要区别是原料配比( 大豆，小麦， 大米) 和使用的菌种不同，其生产工艺基本相同。 韩国自然发酵黄豆酱的生产工艺与我国自然发酵黄豆酱的生产工艺相似( 如图1 - 1 ) 。原 料大豆经过筛选、清洗和浸泡后在o ix1 0 6 p a 下蒸煮2 h 。将蒸煮好的大豆压碎，成形( 砖块 形) ，在空气中千燥2 d ，然后用草绳绑好悬挂3 0 6 0 d ，在自然环境下接种得到的酱块叫做 酱醅( m e j u ) ，它是豆酱和酿造酱油制作的基础。酱醅加入盐水发酵成熟需要6 0 9 0 d ，酱醅 和盐水充分发酵后分成液态和固态部分液态部分经过滤，煮沸制成酱油，固态部分放入陶 器中进一步发酵成熟6 0 d 以上( 6 0 1 8 0 d ) 制成豆酱。 6 前言 分类、清洗 冷却、粉碎干燥两天 ll 大豆l o o 蒸煮2 h 成型( 砖形8 x 1 2 2 0 e r a s ) 自然发酵成熟酱块 加入盐水混合在陶瓷罐种发酵( 2 3 m o n t h s ) l 一分离 厂 固体液体 粉碎，混匀一ll 一过滤，煮沸 放入陶瓷罐种l酱油 发酵( 2m o n t h s ) l 豆酱 图卜1 韩国自然发酵黄豆酱的生产工艺 f i g 1 - lm a n u f a c t u r i n gp r o c e s so ft r a d i t i o n a ld o e n j a n g 目前韩国豆酱的生产工艺已经比较完善，近几年主要是针对黄豆酱成品的安全性及功 能性进行研究。k u n ( 2 0 0 3 ) 对韩国传统自然发酵酱工艺研究表明韩国传统发酵豆酱有较强的 抗诱变作用。由于微生物来源于自然环境中，部分曲霉菌会产生黄曲霉毒素，但黄曲霉毒素 在发酵过程中被降解而消失。发酵过程中产生的n h 3 、微生物之间的竞争、蛋白黑素和木炭 的加入能够降解黄曲霉毒素。而同时，豆酱发酵过程中会产生高抗氧化作用的物质。 b y u n ( 2 0 0 2 ) 研究了辐射对豆酱生理功能及微生物的影响。韩国发酵豆酱工业化生产使用的微 生物主要是杆菌、产酸细菌、酵母菌，这些菌在辐射量1 7 8 k g y 和2 0 k g y 时能够被杀死， 在l o k o y 时一定数量的杆菌能够存活，但由于细胞严重损害在储藏6 个星期后大量死亡 结果表明l o k g y 以下的辐射不会影响豆酱的生理功能，有效的保证了韩国发酵大酱食品的 微生物安全性 ( 2 ) 日本黄豆酱的生产与研究现状 大豆是由朝鲜半岛传入东瀛日本的。素食者将豆腐带到日本后，大豆及其制品在东瀛盛 行起来。公元8 世纪中叶，唐朝高僧鉴真东渡日本，带去了大量的中国食品及其制作技术， 其中就有豆酱，日本当时称之为“唐酱”黄豆酱传到日本后改名m i s o ，形容黄豆酱的风味 为i ts m o m s t a s t e ，可见日本人对黄豆酱的青睐。日本各地家庭制作豆酱十分常见，不同 地区形成了不同的风味 日本黄豆酱的自然发酵生产工艺与我国黄豆酱的自然发酵生产工艺大体相同。不同之处 是酱醅的成型不同，日本黄豆酱酱醅成半卵圆形。成型后的酱醅在空气中风干l d 。然后用 草绳悬挂进行自然接种。其他制作过程与中国自然发酵黄豆酱的制作过程相同( n q g u c h j ， 2 0 0 0 ) 日本豆酱工业化生产工艺的不同之处是米曲的制备精米经清洗、浸泡2 4 h 、常压 蒸3 0 m i n ，冷却，接种米曲霉或酱油曲霉培养种曲。制酱醅时米曲的用量通常为制酱原料大 豆的5 0 2 5 0 其中甜口豆酱米曲用量较多，辣口豆酱米曲用量较少( 叶树山，2 0 0 1 ) 。 7 乳酸菌、酵母菌培养液、食盐 i 大豆清洗_ 浸泡! 生蒸煮旦堕丝翌坠竺竺苎一冷却- 接种一混合= 垒竺竺竺生哼发 酵 t 米曲 日本对豆酱生产工艺的研究较早，二次世界大战前，大豆在日本是豆酱生产的主要原科。 而现在被广泛使用的原料是豆饼。因为在制曲方面，大豆比豆饼的粒度大，比较容易散热， 因而，由于品温高而引起的细菌感染很少。所以比较容易制曲。近期日本对豆酱的研究主要 是针对其功能性、成品品质和工艺的完善。c h i o u ( 1 9 9 9 ) 研究了日本低盐发酵豆酱中添加乙 醇对豆酱发酵过程中微生物、酶和成品品质的影响。结果表明添加5 的n a c l 和7 5 的乙 醇不但可以增加蛋白酶和淀粉酶的稳定性，抑制致病菌生长，且可以促进酵母生长得到较好 的风味。l m a m u r a ( 1 9 9 6 ) 研究利用多波段味觉传感器监控豆酱的发酵过程。传感器的味觉传 感物质是脂质膜。研究发现随着豆酱发酵过程中二辛基磷酸盐和油胺含量的增加，传感器膜 电压直线上升。当豆酱成熟后二辛基磷酸盐和油胺含量平稳增加，传感器膜电压也随之平稳 上升。发酵过程中氨基酸浓度和总酸度升高，传感器输出的信号与这些指标数量的变化密切 相关因此，豆酱发酵过程可以很容易的利用传感器进行监控。 1 2 3 黄豆酱中的微生物 1 2 3 1 发酵酱类制品中的微生物种类及作用 酱类制品具有独特的风味，其风味是由生产过程中微生物发酵基质所形成的小分子物质 产生的。酱油酿造中，与原料发酵成熟时间、成品颜色以及味道有直接关系的微生物是米曲 霉和酱油曲霉与酱品风味有直接关系的微生物是酵母菌和乳酸菌。其他细菌( 如芽孢杆菌 等) 在酱类制品整个发酵过程中也会起到不可忽视的作用。 ( 1 ) 霉菌 酱类制品发酵过程中对基质发酵起主要作用的微生物为霉菌。其代表菌为曲霉，它的作 用是分泌各种酶类( 包括蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶系、植物组织分解酶等) ，这些 酶将原料中的蛋白质分解成多肽及多种氨基酸，把淀粉转化成葡萄糖、双糖、三糖及糊精等 这些氨基酸和糖类不仅是豆酱中的风味来源，而且为后阶段其它微生物的生长创造条件。目 前在酱类制品中分离出来的有益霉菌主要有米曲霉、酱油曲霉、高大毛霉、黑曲霉等( 贡汉 坤。2 0 0 3 ) 。同时也存在一些对豆酱有不良影响的杂菌和有害菌，如毛霉，根霉和青霉。它 们产生霉臭味影响酱的风味。青霉对曲霉的生长有抑制作用。霉菌中的黄曲霉、烟色曲霉、 土曲霉、烟曲霉以及交链孢霉，孺孢霉、芽枝霉，头孢霉等危害污染菌株会对人体产生相当 大的损害，它们产生的毒素甚至会危及生命( e s a k i ， 9 9 7 ) 。 ( 2 ) 酵母菌与乳酸菌 乳酸菌与酵母菌的作用主要是发酵糖类产生小分子醛、酸、酯等风味物质，这是酱类制 8 品呈味的主要途径。一般情况下，乳酸菌分解糖类产生乳酸，形成的弱酸性条件抑制自身生 长的同时却诱发酵母菌的生长，酵母菌在有氧环境下发酵糖类产生各种有机酸，厌氧发酵产 物中乙醇含量较高。而各种有机酸与乙醇反应生成的酯类，是特殊酱香风味的来源。由此可 见乳酸菌与酵母菌对酱类制品的呈味具有重要的影响。与酱油及豆酱关系密切的乳酸菌主要 有嗜盐四联球菌、酱油片球菌、植物乳杆菌，戊糖片球菌和乳酸片球菌等。 酵母菌在酱类制品中的主要作用是发酵糖类产酸产醇。酱醅发酵初期霉菌分解蛋白与淀 粉，此时酱醅中分解出的糖类含量相对较低，致使提供酵母菌生长的碳源不足，影响酵母菌 的生长；同时此阶段微生物数量级较大，也抑制了酵母菌的生长在稀态发酵阶段，较高的 盐度抑制了大部分微生物的生长，而一些耐盐性的酵母菌会继续生长，发酵糖类，产生乙醇、 有机酸等小分子物质及酱类风味成份之一的糠醇，并能由乙醇与有机酸生成各种酯、琥珀酸 等，增加酱类的风味。 酱类制品发酵中与酱类制品关系密切的酵母菌包括毕赤氏酵母属( p i c h i a ) 、红酵母属 ( r h o d o t o r u l a ) ，酵母菌属( s a c c h a r o m y c e s ) 、假丝酵母属( c a n a z a a ) 、汉逊氏酵母属( h a n