（食品科学专业论文）非解朊栖热菌HG102耐热β糖苷酶的结构与功能研究.pdf

非解朊栖热菌h g l 0 2 耐热b 糖苷酶的结构与功能研究 摘要 非解朊栖热菌h g l 0 2 耐热b 一糖苷酶t h 西y 为( b a ) 8 桶状结构，具有水解功 能和转糖苷功能的耐热单体酶。该酶可作为一个很好的模型来研究糖苷酶的反应 机制，底物特异性和耐热的分子基础。根据对该酶的晶体结构解析和同家族酶的 结构比较，推测g l u l 6 4 和g l u 3 3 8 分别是质子供体和亲核基团两个活性位点：在 a - 螺旋n 端第一位的脯氨酸和蛋白质外周的精氨酸是耐热机制的关键位点和关 键氨基酸残基。本论文为了鉴定这些氨基酸残基的功能，通过基因定点突变的方 法分别把g l u l 6 4 、g l u 3 3 8 、p r 0 3 1 6 、p r 0 3 5 6 、p r 0 3 4 4 和a r 9 3 2 5 置换成g i n 、 a l a 、g l y 、a l a 、p h e 和k u ，同时还对p r 0 3 1 6 和p r 0 3 5 6 进行了双置换。各个突 变基因均得到表达，突变酶经过纯化得到电泳纯；用c d 光谱进行了野生酶和突 变酶的结构比较。通过突变酶的酶功能和酶学性质分析，结果表明g l u l 6 4 和 g l u 3 3 8 分别b 糖苷酶t n 垂y 水解反应时地质子供体和亲核基团，亲核基团的突 变酶t h d y e 3 3 8 a 可以合成混合型糖苷键寡糖类似物；脯氨酸的刚性结构在a 一 螺旋n 端第一位和精氨酸在蛋白质外周形成离子键是耐热机制的关键位点和关 键氨基酸残基。 另外，通过同家族酶与自然底物、合成底物或抑制剂共结晶的结构分析和同 源性比对，初步推测非解朊栖热菌h g l 0 2 耐热b 一糖苷酶的g l n l 8 和g l u 3 9 2 与酶 既有葡萄糖苷酶活性又有半乳糖苷酶活性有关，a s n 2 8 2 和t y r 2 8 4 与酶的甘露糖 苷活性有关，t r p 3 8 5 的疏水吲哚侧连对底物在酶活性中心的稳定性有关。 关键词：非解朊栖热菌h g l 0 2 ，b - 糖苷酶，转糖苷活性，热稳定性，底物特异性， 定点突变 t h es t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i po ft h e r m o s t a b l e b - g l y c o s i d a s e f r o m t h et h e r m o p h i l i ce u b a c t e r i u mt h e r m u s n o n p r o t e o l y t i c u sh g l 0 2 a b s t r a c t b - g l y c o s i d a s e ( t n g l y ) f r o m t h e t h e r m o p h i l i c e u b a c t e r i u mt h e r m u s n o n p r o t e o l y t i c u sh g l 0 2 w h i c hi sat h e r m o s t a b l em o n o m e r i c p r o t e i na n da d o p t st h e ( 6 a ) s b a r r e lf o l d ，i sa ne x c e l l e n tm o d e ls y s t e mt ob ei n v e s t i g a t e dt h et h e r m o s t a b l e m e c h a n i s m ，a c t i v i t ya n ds u b s t r a t es p e c i f i c i t y h e r e ，b a s e do nt h ea n a l y s i so fs t r u c t u r a l b a s i sf o rt h e r m o s t a b i l i t yo ft n g l y ( w a n g , e ta t , 2 0 0 3 ) a n dc o m p a r i s o no fo t h e r p r o t e i n ss t r u c t u r eo fh o m o f a m i l y , g l u l 6 4a n dg l u 3 3 8m a ya c ta sp r o t o nd o n o ra n d n u c l e o p h i l ei nt h eh y d r o l y s i sr e a c t i o nr e s p e c t i v e l y ；p r o l i n el o c a t e da tn 1o fa h e l i x a n da r g i n i n ew h i c hc a nf o r mi o nl i n km a yc o n t r i b u t et ot h et h e r m o s t a b i l i t y ；g l n l 8 ， h i s l 2 0 ，g l u 3 9 2 ，a s n 2 8 2 ，t y r 2 8 4a n dt r p 3 8 5a r eh y p o t h e s i z e dt od e t e r m i n es u b s t r a t e s p e c i f i c i t y w ea i m t of u r t h e ri d e n t i f yt h ec r i t i c a ls i t e sa n dt h ea m i n oa c i dr e s i d u e ( s ) r e s p o n s i b l e f o rt h e a c t i v i t y 、t h e t h e r m a l s t a b i l i t y a n dt h es u b s t r a t e s p e c i f i c i t y m u t a t i o n sh a v eb e e nc o n s t r u c t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s t h e ya r eg l u l 6 4 g l n g l u 3 3 8 a l a ，p r 0 3 1 6 g l y ,a r 9 3 2 5 l e u ，p r 0 3 4 4 p h e ，p r 0 3 5 6 a l a a n d p r 0 3 1 6 g l y p r 0 3 5 6 a l a a l l m u t a n t p r o t e i n s w e r e p u r i f i e d c h a n g e s i nt h e c o n f o r m a t i o n sw a se x a m i n e db ym e a n so fc d t h eg l u 3 3 8 a l am u t a n ts h o w e dn o d e t e c t a b l eh y d r o l y s i sa c t i v i t y b u tc a n s y n t h e s i z eo l i g o s a c c h a r i d e s ，a se x p e c t e df o rt h e r e s i d u ea c t i n ga st h en u c l e o p h i l eo ft h er e a c t i o n t h eg l u l 6 4a c t sa st h eg e n e r a l a c i d b a s e c a t a l y s t i nt h e h y d r o l y s i sr e a c t i o n c h a n g e s i ns t a b i l i t i e so fm u t a n t s c o m p a r e dw i t hw i l d t y p ew a sd e t e r m i n e db ym e a n so fh e a ti n a c t i v i t ye x p e r i m e n t t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ea m i n oa c i dr e s i d u eo fp r o l i n ew h i c hi sl o c a t e da tn 1 p o s i t i o n so fa - h e l i x ，a n da l 酪2 5w h i c hf o r ms a l tb r i d g eb e t w e e nah e l i c e s5a n da h e l i c e s6 ，a r et h ec r i t i c a ls i t e st op r o t e i nt h e r m o s t a b i l i z a t i o n k e y w o r d s ：t h e r m u s n o n p r o t e o l y t i c u sh g l 0 2 ，b e t a - g l y c o s i d a s e ，t r a n s g l y c o s y l a t i o n t h e r m o s t a b i l i t y , s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，s u b s t r a t es p e c i f i c i t y 独创性声明 r 6 59 8 0 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 蚕渤喝 时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文 的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位沦文的全部或部分 内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 时间：廖泥形年) 剧占日 时间：矽肇每。聂f 6 日 a a a m p b p b s a e d t a f p l c g l p t g k d k m 0 d o p n p g p a g e p c r p d b p e g s d s s s c t a e t l c t n - e l y x g a l a m i n oa c i d a m p i c i l l i n b a s ep a i r 缩略词表 b o v i n es e r u ma 1 b u m i n d i s o d i u m e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t a t e f a s tp r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y g r a v i t y i s o p r o p y l b d t h i o g a l a t o p y r a n o s i d e k i l o d a l t o n m i c h a e l i sc o n s t a n t o p t i c a ld e n s i t y o p n i t r o p h e n y l - b d - g l y c o s i d e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r o t e i nd a t ab a n k p o l y e t h y l e n eg l y c o l s o d i u m d e d o c y l s u l f a t e s o d i u mc h l o r i d e s o d i u mc i t r a t eb u f f e r t r i s a c e t a t eb u f f e r t h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y t 3 一g l y c o s i d a s eo f t h e r m u s n o n p r o t e o l y t i c u sh g l 0 2 5 - b r o m o - 4 c h l o r o 3 一i n d o l y l 1 3 d g a l a c t o s e 第部分绪论 1 1 研究的目的和意义 绪论 在自然界中，各种糖类化合物含量丰富，种类繁多。单糖、双糖、寡糖、多糖及糖缀合物 ( 糖蛋白，糖脂) ，并且具有广泛的化学立体异构性，一种还原六糖可以有1 0 ”种构型( l a i n e e t a t , 1 9 9 4 ) 。这些糖类具有重要的作用，不仅是生物体的结构物质、新陈代谢的能源物质，而且是 生物体内重要的信息物质，参与所有细胞的接触过程，细胞表面的寡糖在细胞之间的通讯、识别 和相互作用，胚胎发生、转移，在信号传递、细胞运动与黏附，以及病原与宿主细胞的相互作用 方面起着重要作用( 金，2 0 0 1 ) 。这些功能都与糖类的多样性有关，如糖苷配基的多样性( 芳香 基或烷基) 和糖基的多样性( 葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖和术糖等) 。相应于糖类的多样 性，糖苷酶种类亦繁多，糖苷酶在各个生物当中普遍存在，对糖类发挥以上生理功能起着关键的 作用，这也是近年来糖苷酶成为研究热点的原因。 本论文研究来源于非解朊栖热菌h g l 0 2 ( t h e r m u sn o n p r o t e o l y t i c u sh g l 0 2 ) 耐热b 一糖苷酶 ( b - g l y c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ) 的结构与功能，该酶是外切保留型耐热b 糖苷酶，具有底物r 谱性，可 从双糖的非还原端水解葡萄糖、半乳糖、甘嚣糖和岩藻糖糖基，又有转糖苷功能，水解反应最适 p h 值5 6 ，晟适温度9 0 ( 2 ，9 0 的半寿期为2 8 小时( h ee ta l ，2 0 0 2 ) 。研究有三个目的，一是 探讨酶的催化机制，二是探讨酶的底物特异性，三是探讨耐热酶的耐热机制。 蛋白质的结构特点是其功能的分子基础，进行蛋白质的结构解析和深入探讨关键氨基酸残基 的功能，在理论科学和实际的生物技术应用都有重要的意义。下面分开阐述三个不同研究内容的 目的和意义。 1 1 1 水解功能和转糖苷功能的分子基础研究 b 一糖苷酶可以水解多种b 糖苷键，具有底物广谱性，广泛存在于各类生物中，具有多种生 物功能。水解纤维二糖获得葡萄糖是纤维素降解的限速步骤。保留型b 一糖苷酶还有转糖营活性， 可以合成寡糖及寡糖类似物。许多研究表明，寡糖不仅以它们的缀合物在起作用( 金，2 0 0 1 ) ， 很多寡糖本身就有重要的生理功能，其中非吸收性寡糖是取歧杆菌的增殖因子从而可以改善肠胃 功能、降低口h 和降低腐败产物等( t a n a k ae ta t , 1 9 8 3 ；h i d a k a e t a t , 1 9 8 6 ；m i n a m a e t a l , 1 9 8 3 ) 。 非吸收性寡糖作为一种重要的功能性食品( f u n c t i o n a lf o o d ) ，已在世界性的保健食品热潮中独树 一帜，被认为是完全符合功能食品属性，且具综合生理功能的代表。虽然近年来有越来越多的动 植物来源的活性寡糖或宙糖化合物被开发为药物或保健品，并不断发现一些寡糖成分的新功能t 但目前对其结构与功能关系及其作用机制仍不清楚。所以寡糖及其糖缀合物的合成就成了研究的 热点。寡糖及其糖缀合物的合成虽然可以并j 化学方法合成，但其过程复杂，成本高，副产物多且 不容易分离：用糖基转移酶来合成，存在的问题是该酶难纯化且不稳定，其反应底物核糖也非常 贵f m o n i c ae t 口f ，1 9 9 9 ；t h e r e s ee tn ，2 0 0 1 ) 。所以用糖昔酶的转糖营法合成或酶法降解等酶工程手 段将是寡糖技术开发热点之一。寡糖生产削酶中，儿丁质酶、海藻多糖酶、唾液酸酶尚无商品， 而极端酶还鲜有信息。因此适合底物特性与工艺要求的极端酶将是我们占领制高点的机会，包括 中因农业大学硕士学位论文绪论 低温) l 5 1 质酶、酸性壳聚糖酶、碱性海藻多糖裂解酶、碱性卡拉胶酶、高温唾液酸酶和高温糖苷 酶等。 这些8 一糖营酶的水解功能和转糖营功能与酶的活性位点氨基酸残基有关，深入研究其功能 可以提高转糖苷活性、筛选酶的抑制剂和开发其他用途打下良好的基础。例如，催化位点的确定 和置换可使糖苷酶有类凝集素的功能。凝集素是自然界广泛存在的一大类非免疫来源的、无酶活 性的、多价的糖类结台蛋白( g o l d s t e i ne ta l ，1 9 8 0 ) 。催化位点的置换使酶失去水解功能，但酶 与底物的结合功能仍然存在，这类似与糖特异性结合的凝集素。它可应用于糖复合物的分离纯化 和糖复合物的检测及鉴定等，是糖苷酶创新性的麻用之一。 1 1 2 底物特异性分子基础研究 底物特异性研究就是确定底物与酶结合位点的氨基酸残基和改变这些氨基酸残基分析酶的 底物特异性变化。 糖复合物功能的多样性与糖类的多样性有关，如糖苷配基的多样性( 芳香基或烷基) 和糖基 的多样性( 葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖和术糖等) 。相对于糖的多样性糖苷酶种类亦繁多， h e n r i s s a t 等人根据其氨基酸序列同渊性和结构的相似性把糖苷酶分成不同的家族( h e n r i s s a te t 口f ，1 9 9 1 ；h e n r i s s a te t a l ，1 9 9 7 ) ，同一家族含有水解不同底物的酶，酶的底物特异性不同，在不同的 生物中起着不同的生理功能。了解酶的底物特异性对探讨酶的生理功能，开发相对于底物结合位 点的抑制剂都有一定的意义：又由于同家族酶的结构相似性，可推测相似结构的同家族酶底物特 异性是由于酶结合底物的结合位点氨基酸残基不同造成的，这为设计作用于特殊底物的工具酶和 通过改变耐热酶的底物特异性扩大耐热酶的应用空间打下良好的基础。 糖苷酶家族1 具有相似的( b a ) 8 桶状结构，它们来自植物、动物、细菌、真菌和古菌等生物， 能够水解广泛的糖苷化合物，在各个生物中有着重要的生物功能。非解朊栖热菌h g l 0 2 ( t h e r m u s h o n p r o t e d f v f f c “sh g l 0 2 ) 耐热b 糖苷酶( b - g l y c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ) 属于糖苷酶家族1 ，这为研究 该家族酶的底物特异性提供了很好的模型。 1 1 3 耐热机制的分子基础研究 现在已知的酶成千上万，但能应用于工业催化的并不多，最主要的限制因素是酶蛋白的熟失 活。了解耐热酶的耐热机制成了当今主要的研究课题之一。如果掌握了蛋白质耐热的分子基础， 可以通过合理的设计来提高酶的热稳定性。 在工业生产当中。耐热酶有许多优点( m o z h a e v e t a l ，1 9 8 8 ) ：1 、提高反应速度，每提高1 0 可加快反应速度2 3 倍。2 、改变反应的平衡，增加产物产最。3 、延长酶的半衰期。4 、可 在极端条件下反应，如极端p h ，或有机溶剂等。5 、增加底物底可溶性，降低溶液的粘度，提高 产物产每，并且用冷却法很容易终止反应。6 、在高温下反应可防止杂菌污染，从而降低损失概 率。所以对耐热b - 糖菅酶的耐热机制的研究有重大的理论意义和现实意义。 总之，研究酶蛋白质的结构与功能能够为酶的应用打下良好的理论基础。 2 1 2 研究进展 糖苷酶是类以内切或外切方式永解各种含糖化台物( 包括简单糖苷、寡糖、多糖、糖蛋 白、糖脂等) 中的糖苷键生成单糖、寡糖或糖复合物的酶。 为了便于研究可以按分类方式给予细分。糖苷酶或确切地称糖苷水解酶按国际系统分类法它 属于六个大类中的第三类：水解酶类。它还有几种分类方法： ( 1 ) 按水解糖苷键的类型来分，有a 或b 一糖营酶。 ( 2 ) 根据生成的糖苷键的构型是否变化，把酶分为反转酶( i n v e r t i n gg l y c o s i d a s e ) 和保留酶 ( r e t a i n i n g g l y c o s l d a s e ) ，这两种酶相同的是在活性位点上都有一对羧酸，不同的是前者活 性位点的距离平均是1 0a ，反庶是一步置换，后者两点的距离是5 5a ，反应是两步置 换( m c c a r t e r e t a l ，1 9 9 4 ；w a n g e t a l ，1 9 9 4 ) 。 ( 3 ) 按水解方式分类，可分为内切和外切型。 ( 4 ) 按氨基酸序列和三维结构的相似性来分类( h e n r i s s a te ta l ，1 9 9 7 ) ，即糖苷酶家族和其折 叠方式来分类。 耱苷酶家族和其折叠方式分类的基本原理是根据酶序列的相似性，可以推导出其结构和作用 机制。h e n r i s s a t b 1 9 9 1 年首次提出糖苷酶按氨基酸序列和结构相似性分类( h e n r i s s a te t a l l 9 9 1 ； h e n r i s s a te ta 1 1 9 9 7 ) ，至今己分成8 2 家族，其家族成员一直在增多，可联网 h t t p ：a f m b c n r s m r s f r “p e d r o c a z y d b h t m l 查询。为了区别常见的超家族( s u p e r f a m i l y ) 特地提出一个高于家族的分类级别，称为“部族”( c l a n ) ，现在已定出5 个部族( c l a n a - e ) 。此 分类方法可以更好地了解糖苷酶氨基酸序列与结构和功能的关系。一个家族中可能有水解多种底 物的酶，如：家族1 、3 、1 6 ：水解同一个底物的酶可能在不同的家族，如：纤维素酶( c e l l u a s e ) 在1 1 个家族中均有( h e n r i s s a t e t a t ，1 9 9 6 ) 。有时蛋白质的三级结构比氨基酸序列更保守，例如家 族1 、2 、5 、1 0 、1 7 、3 0 、3 5 、3 9 和4 2 具有相似的折叠结构，它们被推测从麸同的祖先进化来 的( h e n r i s s a t e t a l 1 9 9 5 ) ，它们有严格保守的催化机制。 许多糖苷酶家族的三维结构被测定发现活性结构域的拓扑学构象只有三种，它们各自有一 样的折叠方式和相同的催化活性氮基酸残基。1 、口袋式( p o c k e to rc r a t e r ) ：识别糖的非还原末 端，典型的外切酶是此构象，口袋的深度和长度决定了底物和酶结合部位的长度。2 、裂隙( c l e f t o f g r o o v e ) ：开放结构，随机结合多聚长连多个糖单位，一般是内切酶，如溶茵酶，淀粉酶等。3 、 隧道( t u n n e l ) ：像纤维二糖酶是对一个长连纤维素分子进行攻击，它们的结合部位处于隧道中 ( d a v i e se ta l ，1 9 9 5 ) 。 糖苷酶家族1 已有4 7 1 个成员，是外切保留型p 糖苷酶，具有i - g l u c o s i d a s e ( e c3 2 ，1 2 1 ) ；p g a l a c t o s i d a s e ( e c3 2 1 2 3 ) ；口m a n n o s i d a s e ( e c3 2 1 2 5 ) ，p - g l u c u r o n i d a s e ( e c 3 2 1 3 1 ) ；p d f u c o s i d a s e ( e c3 2 1 3 8 ) ；p h l o r i z i nh y d r o l a s e ( e c3 2 1 6 2 ) ；6 - p h o s p h o j - g a l a c t o s i d a s e ( e c 3 2 1 8 5 1 ；6 - p h o s p h o - 3 g l u c o s i d a s e ( e c3 2 1 8 6 ) ；s t r i c t o s i d i n ei j - g l u c o s i d a s e ( e c3 2 1 1 0 5 ) ；l a c t a s e 饵c3 2 1 1 0 8 ) ；p r u n a s i np - g l u c o s i d a s e ( e c3 2 1 1 1 8 ) ；o l i g o x y l o g l u c a np - g l y c o s i d a s e ( e c3 2 1 1 2 0 ) ； r a u c a f f r i c i n ep - g l u c o s i d a s e ( e c3 2 1 ，1 2 5 ) ；t h i o g l u c o s i d a s e ( e c3 2 1 1 4 7 ) ；p - p r i m e v e r o s i d a s e ( e c 3 2 1 1 4 9 ) ：h y d r o x y i s o u r a t eh y d r o l a s e ( e c3 - - - ) 等活性，结构奠j ( b a ) 8 桶状结构，活性结构域为口 袋式，如图1 1 ，目前已有p d b i d 的酶5 2 个。 圈1l 穗冒酮家旗1 ( b a ) 桶状结构 f i g i a ( w a ) s 瑚dn w d e l 1 3 一d 一糖菅酶( e c3 212 1 ) ，可以水解多种b 一构型的0 糖苷键，包括：b 葡萄糖曹，b - 、f 瑰糖苷，b 岩藻糖苷，b 甘露糖苷等( e n z y m ee l a n d b o o ks p r i n g e r v e r l a gb e r ) j nh e i d e b e r g ， 1 9 9 1 ) 。1 9 8 8 年p o s s i 首先将一种底物广谱性的b 一葡萄糖苷酶称为b 一糖苷酶，以后此娄具有底 物广谱性的b 一葡萄糖苷酶多被命名为8 糟营酶( p o s s i 酣n ，1 9 8 8 ) 。f l - 耱营酶的生物来源非常广 泛包括各种生物体( 动物、植物、真菌、占菌和细菌) 。人和哺乳动物有两种b 一葡萄糖苷酶， 一种和细胞膜相连的酸性b 葡萄糖苷酶；另一种是胞质中的b 一葡萄耱茴酶，具有底物厂谱性，并 可阻催化转糖苷反应。由于植物中存在多种0 然底物，所以植物中的凸- 葡萄糖苷酶种类也较多， 有苦杏f i 苷酶( e m u l s i n ) ，b - 葡萄糖硫苷酵( m y r o s i n a s e ) ，产氢氰酸8 葡萄糖昔酶( c y a n o g e n e s i s b - g l u c o s i d a s e ) ，b - 葡萄耱苷酶等。但它们均确相似的结构和苗物广谱性，同属于糖苷酶族i ( c 1 a r k ep fa 上1 9 9 3 ) 。b - 糖苷酶的反应类型：水解o 糖营键，可以从非还原末端水解8 一( 1 - - 4 ) ，e 一( 1 - - 3 ) ，g - ( 1 6 ) 糖营键( n u c c ie t8 j ，1 9 9 3 ) 。水解反应公式：b 4 7 - o l i g o s a c c a r i d e s + 1 t 2 0 = nd - g l y c o s e 。据报道b 一糖苷酶可以水解多种白然和人工合成的底物，酶的最适p h 值 一般为4 8 5 ，最适温度由于来源不同若异很火。从3 5 1 0 5 “c 。 1 ，21b 一糖苷酶反应机制研究进展 糖苷酵的水解和转糖苷作用机制是：在酶的活性音f 位存在两个重要的羧酸郡分，一个质子化， 另一个发生离子化所切耱苷键的氧原子被质子化的羧基攻击，糖苷键断裂，形成的碳正离子- b 离子化的另一个羧基以离子键或共价键的形式形成中间产物，此中间产物不稳定，当亲核试剂进 行亲核攻击时，此中间产物不存在，l 毂而代之的是一个新的糖苷键。当紊核试剂是水对，发生水 解反应当亲核试剂是醇或某个糖的羟基时，则发生转糖苷反应( w a t te ta l ，1 9 9 7 ；c r o u te t 1 9 9 8 ) 。b o n 等人报道来源于枷c 似s r i o s u s 的加葡萄糖昔酶可以在7 5 - - 9 5 。c ，以乳糖为 底物合成三糖和四耱，在7 5 反应效率最高，整个反应速度是常温酶的1 4 倍( b o o ne 1 4 f ，1 9 9 9 ) 。 且然水解反麻时糖苷键的水解有立体选择性，但台成糖苜键时，台成的键型是多样的，可能是b 键或0 键，也可能是1 _ 3 、14 或1 - 6 等( w y m e re t a l ，2 0 0 0 ) t 如图1 2 。 图121 3 一糖苷酶糖基转移反应时的假设模型 f i g1 , 2 a h y p o t h e t i c a l m o d e ld u r i n g t h e g l u c o s y l - t r a n s f e rr e a c t i o no f b g l u c o s i d a s e t h e g i u c o s y l - e n z y m e i n t e r m e d i a t e a c t sa sad o n or w h i l ea na c c e p t o ri st h es e c o n do n p gm o l e c u l e ，g i v i n gr i s ep r e f e n e n t i a l l yt o ( 1 ，3 ) 一b 一，( 1 ，4 ) 一b a n d ( 1 ，6 ) - 1 3 - g l y c o s i d i cl i n k a g e sa si n d i c a t e db yt h ed a s h e da l l o w 团13 糖苷酶g 3 5 8 a 突变之后以氟化糖为底物的转糖苷反应模式围 f i g 1 3c a t a l y t i cm e c h a n i s mo fg l y c o s y n t h a s e , m e c h a n i s mo ff l u o r o s u g a ra d i v a t i o n g e n e r a lb a s e - a s s i s t e dd i s p l a c e m e n t o ff l u o r i d ey i e l d san e wg l y c o s i d i cl i n k a g e 近来有学者利用诱变技术改造糖苷酶来提高它的转糖苷活性的研究报道，m a c k e n z i e 等人把 从a g r o b a c t e r i u ms p 菌中得到的b 一葡萄糖营酶的亲核基团谷氢酸突变成甘氨酸，这个突变的酶只 能合成耱苷键，不再具有水解功能，从而能使寡糖的产率达到9 0 ( m a c k e n z i ee ta l ，1 9 9 8 ) ，如 图1 3 。m a y e r 等人2 0 0 0 年在糖苷酶的活性位点亲核位置上置换上丝氨酸，使糖苷酶的合成速度 提高2 4 倍并且也提高了产品的产量减少了反应时间( m a y e re a l ，2 0 0 0 ) 。也有把内切糖苷酶突变 成糖苷合成酶，该酶是用氟化的寡糖作为供体来完成合成反应的( m a l e te la l ，1 9 9 8 ；f o r te ta l ， 2 馍) 0 ) 。 1 2 2b 一糖苷酶底物特异性研究进展 由于缺乏有效的手段了解蛋白质的结构以及与底物的相互作用，尽管有许多糖苷酶的结构和 反应机制方面的数据，但国内外研究糖苷酶底物特异性分子基础的文章并不多。 外切保留型b 一糖苷水解酶家族1 水解底物类型是g o s - x , g 代表糖残基，如，葡萄糖、半 乳糖、甘露糖、岩藻糖和木糖以及修饰过的磷酸化糖基。o 代表o - 连接的糖苷键，s 代表s - 连接 的糖萤键，x 代表其他糖残基或非糖化合物，如芳香基、烷基、巯基等糖苷配基( v e r d o u c qe t a t , 2 0 0 3 ) 。酶结合非还原端糖残基的亚位点称为1 ，结合糖苷配基的区域称为+ l ，糖苷配基如果是 糖链，那么糖链上的其他糖残基在酶的结合区域以此类推称+ 2 、+ 3 亚位点f r h o m ae ta l ，1 9 7 0 ) ， 如图1 4 。研究酶的底物特异性就是研究酶识别糖残基或糖苷配基特异性的分子基础。这些底物 特异性与酶结合底物的区域结构和结台位点上的氨基酸残基有关，如果改变这些氨基酸残基，那 么底物特异性可能会发生变化。 5 中国农业大学硕士学位论文 绪论 底物非还原端糖残基立体构型不同主要表现在2 、4 、6 位上的羟基构型不同，葡萄糖2 、4 位上的羟基是平铺型，半乳糖的4 位上的羟基是垂直型，甘露糖的2 位羟基是垂直型，岩藻糖的 6 位没有羟基2 位羟基垂直。另外糖残基的修饰，如磷酸化，也会使非还原端糖残基的构型不同。 糖苷配基的构型也是多种多样，如单糖、糖链、芳香基、烷基、氰基、巯基和其他基团等。由于 底物结构的特异性以及酶结合底物空间结构的不同，使酶与底物之间形成不同的非共价键，这些 非共价键的强弱决定了酶的底物特异性。 研究酶的底物特异性分子基础的方法有序列比对、3 d 结构分析、同源建模和定点突变。 酶与天然底物、合成底物或抑制剂共结晶结构是分析酶结合底物分子基础的主要手段。糖苷 酶家族i 中已有1 2 个酶有晶体结构，分别来自植物的3 个，古菌的有2 个，嗜热细菌4 个和中 温菌3 个。有的酶有不同结晶形式，如今已有5 2 个p d bi d ( w w w r c s b o r g p d b ) ，其中只有4 种 酶与它们的天然底物、合成底物或抑制荆有共结晶结构，并用这些晶体结构阐述了酶与底物结合 的分子基础。 6 - p h o s p h o 1 3 - g a l a c t o s i d a s e ( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 晶体结构有四种，分别是1 p b g ( w i e s m a n n ， 1 9 9 5 ) 、2 p b g 、3 p b g 和4 p b g ( w i e s m a n ne t a 41 9 9 7 ) 。通过6 - - p h o s p h o b - g a l a c t o s i d a s e 晶体结 构分析，酶的活性中心在酶分子的中部，和活性中心相连的“隧道”有一个大口和一个小口，小 e l 的大小不足于底物进入但可以使水解单糖释放( w i e s m a n ne t a l , 1 9 9 7 ) 。a g u i l a r 等人模拟b - 1 ，4 连接的寡葡萄糖链与古菌s u l f o i o b u ss o w t a r i c u s 的b - g l y c o s i d a s e 酶晶体结构( 1 g o w ) 结合后发 现非还原端在“小口“的位置上( a g u i l a re ta l ，1 9 9 7 ) 。从6 p h o s p h o b - g a l a c t o s i d a s e 酶与g a l - 6 p 共结晶的结构分析g l u l 6 0 和半乳糖上的糖苷氧形成氢键，a s n l 5 9 和半乳糖的第二个羟基形成氢 键，h i s l l 6 、g l n l 9 和t r p 4 2 9 与半乳糖的第三位羟基形成氢键，s e r 4 2 8 、l y s 4 3 5 和t y r 4 3 7 与半 乳糖上的磷酸基团形成氢键。与糖苷酶家族1 其他的糖苷酶相比，在对应的磷酸基团结合l o o p 区上s e r 4 2 8 、l y s 4 3 5 和t y r 4 3 7 氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。在6 - p h o s p h o b - g a l a c t o s i d a s e 上t r p 4 2 1 残基的吲哚环对底物g a l 6 p 形成一个平台，吲哚环的稳定性对底物与活性中心氨基酸 残基的相互作用可能有很重要的意义，这种结构在家族1 中很保守( w i e s m a n ne t a l , 1 9 9 7 ) 。 来自植物s i n a p i sa l b a 的m y r o s i n a s e s 是已知唯一的s - g l y c o s i d a s e ，其氦基酸序列和结构都和 糖苷酶家族1o - g l y e o s i d a s e 相似。1 9 9 7 年b u r m e i s t e r 等人通过m y r o s i n a s e 晶体结构及其和底物的 共结晶结构深入分析了该酶的催化机制和底物识别机制。催化机制方面，除了质子供体g l u 被取 代为g i n 之外，其他与糖苷酶家族1o - g l y c o s i a s e 相同。酶与底物中葡萄糖残基结合相关的氨基酸 残基是g 】n 3 9 、h i s l 4 1 、a s n l 8 6 、t y r 3 3 0 和g l u 4 6 4 等，如图1 5 。与糖苷配基结合的相关氪基 酸残基是p h e 3 3 1 、p h e 3 7 1 、p h e 4 7 3 、n e 2 5 7 和t y r 3 3 0 ，它们在m y r o s i n a s e s 很保守，在亚位点形 成一个口袋，可能与糖苷配基的疏水部分( 如，a l l y l ，b e n z y l ，o ri n d o lg r o u p s ) 结合。与硫酸根基 团相互作用的是a r 9 1 9 4 和a r 9 2 5 9 。这两个残基亦很保守，但在b - g l u c o s i d a s e 被相应的氨基酸残 基取代( b u r m e r s t e re ta t , 1 9 9 7 ) 。 固1 4 底物和酶结台的亚位点分布固 f i g 1 , 4t h ea p p r o x i m a t ep o s i t i o no ft h eg l u c o s y l - b i n d i n gs u b s i t e s 图1 ，5b a c i i l u sp o y m y x af l - g iu c o s i d a s e 与抑制剂d - g i u c o n o - 1 ，5 - ia c t o n e 相互作用的氨基酸残基拓扑图 f i g 1 5b g l a g l u c o n a t ei n t e r a c t i o n s s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ep o s s i b l ee n z y m e l i g a n dh y d r o g e nb o n dn e t w o r k i n v o l v e di nt h er e c o g n i t i o no f t h es u b s t r a t e b g 渔来自b a c i l l u sp o l y m y x ab - g | u c o s i d a s e 与抑制剂d - g l u c o n o 1 ，5 一t a c t o n e 的共结晶结构表 明，g i n 2 0 、h i s l 2 1 、t y r 2 9 6 、g l u 4 0 5 和t r p 4 0 6 是识别底物的关键氮基酸残基( s a n z - a f ，a r i c i oe ta l ， 1 9 9 7 ) ，如图1 6 。g l n 2 0 和g l u 4 0 5 对底物形成双叉氢键可能是家族1 大部分糖营酶具有葡萄糖苷 酶活性和j | 乳糖苷酶活性的分子基础。h i s l 2 1 在家族1 中很保守该残基和二位上的羟基形成 氢键有两个功能，一是酶反应过渡态的稳定性，另一个是识别底物。t y , f 2 9 6 和第五位上的氧原子 形成氢键，可能对氧和碳正离子的稳定有一定的贡献。t r p 4 0 6 吲哚环上的氮原子和第三位上的羟 基形成氢键，该残基在家族t 亦保守，但在磷酸葡萄糖苷酶中被s e r 或c y s 置换，特别在m y r o s i n a s e s 中被p h e 置换。 除了对非还原端单糖残基的特异性研究之外还有人探讨过对糖苷配基的特异性。c z j z e k 等 人通过 玉 米 1 3 - g l u c o s i d a s e 与自然底物d i m b o a g i c