（食品科学专业论文）酶解大豆蛋白抗高血压肽的研究.pdf

摘要 摘要 本论文以大豆分离蛋白为原料，在体外a c e 抑制活性实验的指导下，研究了胃蛋 白酶、胰蛋白酶、碱性内切蛋白酶、n e u t r a s e 蛋白酶、木瓜蛋白酶、a s l 3 9 8 中性蛋向 酶、复合蛋白酶和复合风味蛋白酶等8 种酶对大豆分离蛋白进行水解制备抗高血压肽的 能力。通过水解物体外a c e 抑制活性测定筛选出了3 种水解制取抗高血压肽的蛋白酶， 通过研究确定了水解的最佳条件，并确定了不同水解时间下水解物的a c e 抑制率大小。 通过s h r ( s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ，s h r ) 动物实验，比较了不同蛋白酶水解物 的体内降血压活性大小，并确定了生产抗高血压肽的最佳蛋白酶。研究结果表明： 对筛选出的3 种蛋白酶水解大豆蛋白的条件进行了优化，分别是：木瓜蛋白酶： p h = 7 0 ，温度t = 5 5 ，底物浓度= 1 5 ，【e 】【s = 4 ；复合蛋白酶：p h = 8 0 ，温度t = 4 5 ， 底物浓度= 1 ，5 ， e 】 s 】= 1 2 ：复合风味蛋白酶：p h = 7 0 ，温度t = 5 0 ，底物浓度= 3 ， e s 】= 7 。 木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和复合风味蛋白酶水解大豆蛋白得到的水解物的体外a c e 抑制率较高，分别是7 4 8 、6 3 7 、6 0 1 ，均出现在水解l 小时处。与单酶相比，复 合酶水解大豆蛋白得到的水解物a c e 抑制率反而下降。 s h r 灌胃实验表明：木瓜蛋白酶水解大豆蛋白得到的水解物的抗高血压活性最强。 灌胃后2 小时，s h r 血压下降低了1 8 4 m m h g ，5 小时时血压降低了8 6 m m h g 。其他蛋 白酶( 包括单酶和复合酶) 水解大豆蛋白得到的水解物抗高血压活性较低，给s h r 灌 胃后2 小时，其血压降低值均在8 m m h g 以下。木瓜蛋白酶水解物浓缩后降血压活性基 本不变，但调酸后降血压活性降低很多。该水解物的不同剂量s h r 实验表明：灌胃剂 量为3 m l 只s h r 时，s h r 血压下降最多，继续加大剂量，血压降低值不再增加。 大豆蛋白水解物体外a c e 抑制活性和体内降血压作用之间有一定的对应关系，但 数值上不存在一定的比例关系。 关键词：大豆分离蛋白，蛋白酶，血管紧张素转换酶( a c e ) ，a c e 抑制活性，抗高血 压肽，s h r 目录 a b s t r a c t i nt h i s p a p e re i g h tp r o t e i n a s e s sa b i l i t y t oo b t a i n a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e sb y h y d r o l y z i n gs o y b e a ni s o l a t i o np r o t e i ni s s t u d i e di nt h eg u i d a n c eo fi n h i b i t i o na c t i v i t y e x p e r i m e n tt oa c e ( a n g i o t e n s i o nc o n v e r t i n ge n z y m e ) a n dt h e s ep r o t e i n a s e si sp e p s i n 、 t r y p s i n ，a l c a l a s e ，a s l 3 9 8b a c i l l u ss u b t i l i sp r o t e i n e n z y m e ，n e u t r a s e ，p a p a i n ，p r o t a m e x a n df l a v o u r z y m e t h r e ep r o t e i n a s e si ss e l e c t e dt oo b t a i na n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e st h r o u g h i n h i b i t i o na c t i v i t ye x p e r i m e n tt oa c eo fh y d r o l y s a t ei nv i t r o t h eb e s th y d r o l y s i sc o n d i t i o n a n dh y d r o l y s a t e si n h i b i t i o nr a t et oa c ei nd i f f e r e n th y d r o l y s i st i m ei sc o n f i r m e d t h e a n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t y o fd i f f e r e n t e n z y m a t i ch y d r o l y s a t e i s c o m p a r e dt h r o u g h s h r ( s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ，s h r ) a n i m a le x p e r i m e n ta n dt h eb e s tp r o t e i n a s et o o b t a i na n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e si sc h o o s e d t h er e s u l to fr e s e a r c hi n d i c a t e ： t h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so ft h r e ep r o t e i n a s e ss e l e c t e di s o p t i m i z e d ，t h er e s u l ti sa s f o l l o w s ，p a p a i n - p h = 7 0 ，t = 5 5 c ，【s 】= 1 5 ， e 】 s 】= 4 ；p r o t a m e x ：p h = 8 0 ，t = 4 5 。c ， 【s 】2 1 5 e 】【s - 1 2 ； f l a v o u r z y m e ：p h = 7 0 ，t = 5 0 c ，【s 】= 3 ，【e 】【s = 7 t h ei n h i b i t i o nr a t et oa c ei nv i t r oo f h y d r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db y p a p a i n 、p r o t a m e xa n df l a v o u r z y m ei sh i g h ，t h er e s u l ti s7 4 8 、6 3 7 、6 0 1 s e p a r a t e l ya n d a p p e a r si n 1h o u rf o rh y d r o l y s i s c o m p a r i n gw i t hs i n g l ep r o t e i n a s e ，i ti sl o w e rt h a tt h e i n h i b i t i o nr a t et oa c eo fh y d r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db ym u l t i p l e p t o t e i n a s e s s h re x p e r i m e n ti n d i c a t e ：i ti st h eh i g h e s tt h a tt h e a n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t yo f h y d r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db yp a p a i n b l o o dp r e s s u r eo fs h rd r o pb y 18 4 m m h gi n2h o u r 、衍ms h rg i v e nt h eh y d r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db y p a p a i n ，a n dd r o pb y8 6 m r n h gi n5h o u r i ti sl o wt h a tt h ea n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t yo f h y d r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db yo t h e rp r o t e i n a s e s ，b l o o dp r e s s u r eo fs h r d r o pb e l l o w8 r n m h gi n2h o u rw i t hs h rg i v e nt h eh y d r o l y s a t e t h ea n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t y o fh y d r o l y s a t ef r o ms o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db yp a p a i ni si n v a r i a b l ea f t e rt h eh y d r o l y s a t e b e i n gc o n c e n t r a t e da n dd r o pa f t e ri tb e i n ga c i d i c d o s a g ee x p e r i m e n tf o rs h r i n d i c a t e ：b l o o d p r e s s u r eo fs h rd r o pm o s ti nd o s a g e3 m l s h ra n dt h er e s u l td o e sn o tc h a n g ew h e nd o s a g e 目录 i n c r e a s e s t h eh y d r o l y s a t e si n h i b i t i o nr a t et oa c ei nv i t r oi sc o h e r e n tw i t ha n t i h y p e r t e n s i v e a c t i v i t yi nv i v o ，b u tt h e r ei sn o tp r o p o r t i o nr e l a t i o nb e t w e e ni t k e yw o r d s ：s o y b e a n is o i a t i o np r o t e i n ，p r o t e i n a s e ，a n g i o t e n s i o nc o n v e r t i n g e n z y m e ( a c e ) ，a c e i n h i b i t i o n a c t i v i t y ，a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s s h r i l l 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目： 酚锌大豆蛋白抗高血压肽百听完 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密堤) ，保密期至伽y 年f 2 月1 日为止。 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 大豆多肽功能性食品的开发与利用 大豆蛋白质含量高，蛋白质的氨基酸组成合理，决定了大豆是人类摄取蛋白质的重 要来源。大豆蛋白质是植物蛋白质中唯一的能符合f a o w h o 厂u 咐u 1 9 8 5 年制定的标准 中满足2 5 岁儿童必需氨基酸需要的优质蛋白质。大豆蛋白质在食品中应用所体现的机 能特性有乳化性、保水性、粘着性、起泡性、弹性、吸油性。由于大豆蛋白质对人体的 功能优势，现代营养学和现代医学一致认为大豆蛋白质营养好、益智、健脑、润肤、美 容、强体，并对缺铁性贫血、动脉硬化、高血压、肿瘤、冠心病、神经衰弱、糖尿病等 均有较高的约用价值。因此近年来发达国家视大豆蛋白质食品为最优的营养保健食品， 发展中国家视大豆蛋白质食品为实惠的“营养肉食品。1 9 9 8 午5 月美国杜邦公司向美 国f d a ( 食品与药品管理局) 提出了一份大豆蛋白质具有保健作用的申请。1 9 9 9 年 1 0 月2 6 日，美国食品与药品管理局批准了大豆蛋白的健康认证，允许在含有大豆蛋白的 食品上明确标明大豆蛋白具有保健功能，即“每天在低饱和脂肪酸、低胆固醇的食品中 含有2 5 9 蛋白可减少患心脏病的危险”。我国政府从提高全民族健康水平出发，十分重 视大豆产业的发展，从1 9 9 6 年起开始实施“大豆行动计划”，并收到了一定的成效。 然而，由于大豆蛋白质的分子结构非常复杂，使得大豆蛋白质的消化率和生物效价 远不及牛奶、蛋等动物性蛋白质。另外，大豆蛋白质的某些功能特性已不能满足食品加 工的需要，尤其是在低p h 值时溶解性不好，高浓度时粘度大的特点对于某些食品的加 工是不利的。为了进一步提高大豆蛋白质的营养功能和加工特性，人们从2 0 世纪7 0 年 代以来，开始开发了大豆多肽这种功能性食品。大豆功能性食品是以大豆为原料，利用 先进科学技术和借助于先进科学仪器及设备进行提取某些有效成分，作为制作食品的添 加剂。大豆不但可以作为食品也可作为药物。 人们通过研究发现，在组成蛋白质的氨基酸构成的物质中，有一类不同于蛋白质的 中间物质，这种物质具有特殊的功能，人们称之为肽( p e p t i d e ) ，又称多肽，它是由二 个到几百个不同的氨基酸组成的浓缩物。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，多个氦基酸 分子以肽键相连接则称为多肽【z j 。这些多肽多以非活性状念存在于蛋白质长链中，当被 酶解成适当的长度时，它们的活性就会表现出来。近年来，多肽渐渐被人们所认识。随 第一章文献综述 着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，人们发现存在于生物体内的多肽己有数力种， 它们时刻发挥着不同的生理功效。 由于大豆的资源丰富与价格低廉、大豆蛋白质的营养丰富和特殊的生理功能，以及 大豆肽具有的比大豆蛋白质更加丰富的加工特性，现在，大豆肽的生产已经成为大豆及 大豆蛋白质深加工的一个重要方向，同时也为油脂加工厂的副产物一大豆粕的综合利用 提供了一条有效的途径。在中国，肽类营养功能食品的开发已列入了食品工业的远景目 标规划，随着人们对食品功能性的越来越强的要求，大豆肽的生产及其应用前景必将非 常广阔，市场潜力巨大。有专家预计，大豆多肽将以其独特的营养功能和生理特性成为 2 1 世纪的健康食品，是极具潜力的一种功能性食品基料。 1 2 大豆多肽的特性 1 2 1 大豆多肽的理化特性 大豆蛋白质经过蛋白酶处理得到多肽后，其溶解性、乳化力、起泡力等功能特性有 所改善，粘度下降p h7 | 。由于大豆多肽分子相对质量小，n s i ( 可溶性氮溶解指数) 超 过9 5 ，水溶性很高，即使在多肽质量分数为5 0 的情况下仍然保持流动性，因此， 它作为食品原料，具有低粘度、速溶和无残渣等特点，大豆多肽加热不凝固，粘度随质 量分数升高变化不大。在p h = 4 5 ( 大豆蛋白等电点) 的情况下不产生沉淀，仍会保持溶 解状刹8 | 。大豆多肽还具有抑制蛋白质形成凝胶、较强的吸湿性和保湿性、调整蛋白质 食品的硬度、改善口感等特性。 1 2 2 大豆多肽的生理功能 1 2 2 1 降低胆固醇的作用 大豆蛋白具有降低血清胆固醇的作用，而大豆多肽不仅具有这样的功能，而且效果 更佳。大豆多肽通过刺激体内甲状腺激素的分泌量增加，促进胆固醇的胆汁酸化，从而 阻碍肠道内胆固醇的再吸收并促使其排出体外。给大鼠分别饲用大豆蛋白和大豆多肽的 实验结果表明p j ，其血清胆固酵浓度( m g d 1 ) 是：大豆蛋白组为3 4 0 土2 0 ，而大豆多肽 组则为9 9 6 土6 6 ；其肝脏胆固醇含量( m g g ) 大豆蛋白组为6 9 5 土2 7 ，而大豆多肽组 则为7 7 0 土0 9 7 ，这表明大豆多肽能显著降低血清和肝脏胆固醇含量。同时测定其粪中 2 第帝义献综述 胆固醇的含量，饲用大豆多肽的老鼠粪便中胆固醇含量明显高于大豆蛋白组，从而可推 论大豆多肽降低胆固醇的作用机理。大豆多肽对于胆固醇值正常的人，没有降低胆固醇 作用。 1 2 2 2 降低血压的作用 人体组织和血浆中广泛存在一种血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n g e n z y m e ，a c e ) 。该酶可通过作用于血管紧张素i ( a n g i o t e n s i ni ) 从其c 末端切除h i s l e u ， 生成有收缩血管活性的血管紧张素i i ( a n g i o t e n s i ni i ) ，同时使舒缓激肽失活，两者共同 作用引起血压升高，a c e 抑制剂可以抑制其活性，从而阻止血压升高。大豆多肽是一种 来源于食品蛋白质的a c e 抑制剂，并且大豆多肽的降压作用平稳，不会出现药物降压 过程中可能出现的大波动，尤其对原发性高血压患者具有显著的疗效l l0 。乃j 。大豆肽对血 压正常的人没有降血压作用，所以对正常人是无害的。 1 2 2 3 低过敏性 蛋白质在体内可能会引起过敏反应，而引起过敏反应的过敏原在通常的消化过程中 是稳定的，通过体外蛋白酶水解可以消除过敏原。通常分子量小于3 0 0 0 的肽可以不具 有过敏性【1 4 】。大豆肽的不溶物质去除后，用酶免疫测定法测得其抗原性比原料大豆蛋白 质降低1 0 旷1 0 ，这有望解决长期困扰人们的食用蛋白质安全问题。 1 2 2 4 易消化吸收性及其营养价值 一百多年前，d o g m a 1 5 】提出了蛋白质必须在肠道内水解为游离氨基酸，才能进入血 液，转运至身体各个部位参与代谢。直到2 0 世纪5 0 年代，n e w a y 和s m i t h l l 6 】f 1 7 1 首先 提出了肽能够被完整吸收的确凿证据，1 9 6 8 年，a d i b i 与m a u e w s 两个课题组研究表明， 2 3 个氨基酸组成的低肽有比游离氨基酸更佳的吸收性能。2 0 世纪8 0 年代以来，由于 直接经验和间接经验的不断积累，肽被完整吸收的观点及其生理作用才被人们重视，其 相关研究也变得空前活跃，并取得了结论性成果。 许多学者在用合成肽做的实验中，发现二肽和三肽的吸收速度，比同一组成的氨基 酸快，为此可得结论；多肽在肠道的吸收率最好，而且人体实际上也是大部分以多肽的 形式直接吸收的。表1 - l 是对白鼠强制喂食蛋白质、氨基酸和大豆肽，1 h 后测定其消化 道内残留量的试验结梨1 8 】。 3 第一章义献综述 表l 。1 对自鼠喂食各种蛋白源1 h 后的吸收率 f i g l 一1t h es o r br a t ea f t e rf e e d i n gp r o t e i nt or a t i n1h o u r 注：无括号项为对投食量的百分比；括号项为对大豆多肽胃肠转移率，或以吸收率为1 0 0 时各 样品的相对值；氨基酸混合物的组成与人豆多肽相同。 从表1 1 可以看出，大豆肽的吸收速度和吸收率与其它蛋白和氨基酸混合物相比都 是最高的，而氨基酸混合物却意外的低。因此大豆多肽可以广泛应用于下列几方面： ( 1 ) 医疗食品 医疗食品【1 9 】即根据已知的已被医学证明的科学原理，旨在对有特殊营养需求的疾病 或状态进行食物控制，并在医生的监督下配制的经过肠消化或摄入的食品。由于严重病 人的生理条件与健康人完全不同，具有高代谢性和对蛋白和能量的需求增加，且由于其 肠膜细胞受损，一些关键性加工器官，如肝、胰、肾不起作用，因此肽的易吸收性和高 能性成为替代传统含氮制品，如完整蛋白和游离氨基酸的主要原因之一。 ( 2 ) 老年人食品 由于老年人单位体重对n 和氨基酸的需求并未随着年龄的增加而降低，同时，由于 老年人因各种原因如隔离、孤独、压抑、体育活动减少导致体质下降，食欲下降，加上 消化吸收功能的衰退造成了老年人营养的严重不足，而由于肽不经过消化就可以迅速有 效地被吸收，因而成为老年人食品中理想的氮源强化剂。大豆多肽还能够阻碍肠道内胆 固醇的再吸收，促使其排出体内，这一点对老年人来说也尤为重要。 ( 3 ) 运动员食品 蛋白质对运动员的重要性一直有争论，直到2 0 世纪8 0 年代以来，蛋白质对补充运 动员体能的重要作用才得到证实1 2 0 1 。运动员的体能和肌肉量是呈正相关的，因此要增加 体能，必须增加肌肉量，肌肉量的增加一方面需要运动的刺激，另方面需要蛋白质的 补充。同时，体育运动中消耗热量的4 1 0 是由蛋白质来提供的，由于体内不能贮存 蛋白质和不能合成必须氨基酸，所以必须及时从外部补充氨基酸，一面造成肌肉蛋白质 的负平衡而使肌肉疲劳。小分子的肽类由于具有比蛋白质和氨基酸更容易吸收性，因此 4 第章文献综述 可以在运动时迅速的为肌肉提供充足的蛋白质，使体力得到及时地恢复和增强。 1 2 2 5 促进微生物发酵特性 大豆多肽有促进微生物生长发育和活跃代谢作用1 2 。大豆多肽能增强双歧杆菌的发 酵作用，并能促进乳酸菌、霉菌、酵母增殖，增强酵母的产气作用1 2 2 】。赵毅等【2 3 】通过研 究添加大豆蛋白水解物对保加利亚乳杆菌培养过程中体系的酸度、粘度、细菌生长量的 影响，验证了大豆蛋白水解产物对保加利亚乳杆菌增殖的促进作用。 1 2 2 6 促进钙磷及微量元素的吸收 人体吸收钙磷等金属离子时必须在小肠粘膜上处于溶解状态才能有效地被人体吸 收。人体内存在p h 梯度，特别是处于吸收段的小肠环境p h 为碱性，使得钙易与磷酸 形成不溶性盐，从而大大降低了钙的吸收，在这种状态下通常人体只能吸收3 0 5 0 ， 从而导致d , j t , 、老年、孕妇等敏感人群普遍缺钙，目前由此引发的少年缺钙、老年骨质 疏松已成为社会关注的焦点问题【2 引。大豆多肽可以与金属离子形成螯合物，保证其可溶 状态，有效地防止了不溶性磷酸钙形成，大大促迸了人体对钙磷物质及微量元素的吸收。 1 2 2 7 抗氧化作用 有学者用微生物蛋白酶水解大豆球蛋白，得到分子量在7 0 0 1 4 0 0 的肽，试验证明 具有抑制亚油酸自动氧化的作用，体外模型实验证明这些肽具有清除自由基的作用，可 用于食品抗氧化剂和抗衰老食品【2 5 】【2 6 】。 1 3 抗高血压肽的开发与研究 1 3 1 高血压的分类及标准 1 3 1 f 国际上高血压的分类标准 高血压是一种常见的心血管疾病，它发病率高，常伴随有高血脂、冠心病、糖尿病、 动脉粥样硬化等疾病和心脏、血管、脑以及。肾脏等器官功能性或器质性改变，对人民的 身体健康造成很大的威胁，是全球性的重大的公共卫生问题。 有关高血压的定义和标准，不同的国家有不同的规定。国际上普遍认可的是1 9 9 9 年世界卫生组织( w h o ) 与国际高血压联盟( i s h ) 联合发表的( ( 1 9 9 9 年高血压治疗指 5 第一章义献综述 南( 9 9 w h o i s h ) 对高血压的定义和分类。该指南规定高血压的最低限为：未服降压 药的情况下，收缩压1 4 0 m m h g 或者舒张， 9 0 m m h g 。w h o i s h 对血压水平的定义 和分类情况具体见表卜2 【2 7 】。 表1 - 2 血压水平的定义和分类( w h o i s h ) t a b l e1 - 2d e f i n i t i o na n dg r a d eo rb l o o dp r e s s u r el e v e l 1 3 1 2 我国的高血压分类 在我国，于1 9 9 9 年发表了中国高血压防治指南，该指南参考了1 9 9 9 年高血压 治疗指南( 9 9 w h o i s h ) 的标准，使我国的高血压防治既根据自己的条件和经验又与 国际接轨。根据中国高血压防治指南，高血压分类情况如下： 1 3 1 2 1 按照舒张压水平分类 自1 9 7 4 年开始，我国规定，按照舒张压水平将高血压分为三度： 轻度：舒张压水平为9 5 1 0 4 ( 单位：m m h g ，下同) ： 中度：舒张压水平为1 0 5 1 1 4 ： 重度：舒张压水平 1 1 5 。 1 3 1 2 2 按病因分类 按病因分类，高血压可分为原发性高血压( e s s e n t i a lh y p e r t e n s i o n ) 和继发性高血压 6 第一章文献综述 ( s e c o n d a r yh y p e r t e n s i o n ) 两大类。所谓原发性高血压，是一类病因尚不完全清楚的、 以体循环动脉血压升高为主要临床表现的一种独立性疾病，这种高血压占总高血压患者 的者的9 5 以上，是危害人体健康的主要的疾病。 继发性高血压又可称为症状性高血压( s y m p t o m a t i ch y p e r t e n s i o n ) ，这种高血压发 病的病因比较明确，是由一些己知的原因引起的。这种高血压在临床上比较少见，约占 总高血压患者的1 5 左右，如能及时的治疗，部分患者可以得到根治。这类高血压根 据其继发的原因，又可分为肾性高血压、内分泌性高血压、神经源性高血压、机械性血 流障碍、妊娠性高血压和外源性疾病引起的高血压等。 1 3 1 2 3 其它类型高血压 除以上几种高血压外，还有单纯收缩性高血压( 收缩压1 4 0 m m h g ，舒张压 f o 川( 1 ，7 ) - - 1 2 2 5 ，说明回归方程在a = o 0 1 水平上是显著的， 且相关系数r 2 = 0 9 9 8 5 ，更证明了光密度与酪氨酸浓度之间具有线形相关性。因此在以 后的实验中，可以根据此曲线由吸光度值来推断出样品中含有的酪氨酸浓度，并可以得 酪氨酸的含量。 3 3 牛血清蛋白标准曲线 蛋白质水解程度般用其生成的t c a 可溶性氮的多少来表示。由于在碱性溶液中蛋 白质与铜离子形成复合物，且这个复合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原f o l i n 一酚试剂 产生深蓝色。为此首先用福林一酚法来制作标准可溶氮曲线，再通过标准曲线回归方程 测定蛋白质水解液中的t c a 可溶氮。这里选用小牛血清蛋白标准溶液，实验测得标准 可溶氮吸光度值见表3 - 6 ，数据处理见表3 7 、3 8 和3 - 9 。 l 9 8 7 6 5 4 3 2 1 o o 0 0 0 0 o o 0 0 第二三章实验结果。j 讨论 表3 - 6 小牛血清蛋白标准曲线实验数据表 t a b l e3 - 6d a t ao fp a p s i np r o t e i n ss t a n d a r dc u r v e 表3 - 7 小牛血清蛋白浓度与吸光度值的标准曲线实验数据分析表 t a b l e3 7d a t aa n a l y s i so fp a p s i np r o t e i n ss t a n d a r dc u r v e x ky k x k 2y k z x k y k o 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 1 8 0 0 0 0 0 5 8 o 。1 3 0 o 1 8 4 0 2 4 3 0 3 0 1 0 3 5 2 0 4 0 2 0 4 5 2 2 1 2 2 2 5 0 2 5 0 0 1 0 0 0 0 2 2 5 0 0 4 0 0 0 0 6 2 5 0 0 9 0 0 0 0 1 2 2 5 0 0 1 6 0 0 0 0 5 1 0 0 0 0 0 0 0 3 3 6 4 o 0 1 6 9 0 0 3 3 8 5 6 0 0 5 9 0 4 9 0 0 9 0 6 01 o 1 2 3 9 0 4 o 1 6 1 6 0 4 0 2 0 4 3 0 4 0 6 9 3 5 8 2 0 2 9 】3 2 7 6 4 8 6 7 5 2 5 1 0 5 6 1 4 0 8 1 8 0 7 5 9 4 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 第三章实验结果j 讨论 表3 8 小牛血清蛋白标准曲线实验数据分析表 t a b l e 3 3 8d a t aa n a l y s i so fp a p s i np r o t e i n ss t a n d a r dc u r v e x k = 1 8 0 0y k = 2 1 2 2 n = 9 x = 2 0 0y = 0 2 3 7 y k 2 = 0 6 9 3 5 8 2 x k 2 = 5 1 0 0 0 0e x k y k = 5 9 4 4 51 n ( y k ) 2 = o 5 0 0 3 2 1 n ( x k ) 2 = 3 6 0 0 0 01 n ( x k ) ( y k ) = 4 2 4 4 l y y = 0 1 9 3 2 6 2 l x x = 15 0 0 0 0l x y = 17 0 0 5 a = l x y l x x = 0 0 01 lb = y - a x = 0 0 0 9 同归方程：y = 0 0 0 1l x + 0 0 0 9 x ：小牛血清蛋白浓度( u g m 1 ) y ：5 3 0 n m 的o d 值 趔 毯 果 签 01 0 02 0 03 0 04 0 05 0 0 牛血清蛋白浓度( u g m 1 ) 图3 2 牛血清蛋白标准曲线 f i g 3 2p a p s i np r o t e i n ss t a n d a r dc h i v e 表3 - 9小牛血清蛋白标准曲线线性方著分析表 t a b l e 3 9r e s u l ta n a l y s i so fp a p s i np r o t e i n ss t a n d a r dc u r v e 方差来源d f s sm sf f o 0 1 ( 1 ，7 ) 同归 离同归 1 7 0 1 9 2 3 0 0 0 0 0 6 0 1 9 2 32 1 6 1 2 2 5 0 0 0 0 0 3 总变异8 o 1 9 3 3 5 5 4 5 3 5 2 5 1 5 o n吼c；之m o m 0 o o o o 第三章实验结果，i t 论 经回归分析，f = 2 1 6 f 0 0 1 ( 1 ，7 ) = 1 2 2 5 ，说明回归方程在a = o 0 1 水平上是显著 的，且相关系数r 2 = 0 9 9 7 5 ，证明了吸光度值与小牛血清蛋白浓度之间具有线性相关性。 3 4 水解度的计算 3 4 1 大豆分离蛋白溶液总氮含量 表3 10 大豆分离蛋白溶液总氮含量 t a b l e 3 1or e s u l t so fs o y b e a np r o t e i no fi s o l a t i o n st o t a l ne l e m e n t 3 4 2 水解反应前1o t c a 中可溶性氮含量 表3 11 水解反应前lo t c a 中可溶性氮含量 ta b l e 3 1 1s o l u b l enc o n t e n ti n10 t c ab e f o r eh y d r o l y z i n g 3 5 蛋白酶酶活力的测定 表3 - 1 2 胃蛋白酶酶活力测定结果 t a b l e 3 1 2m e a s u r er e s u l to f p e p s i n se n z y m ev i t a l i t y 胃蛋白酶的活力测定： 【稀释2 5 0 0 倍p h = 1 8t = 4 0 c 表3 一1 3 胰蛋白酶酶活力测定结果 t a b l e 3 一i3m e a s u r er e s u l to f t r y p s i n se n z y m ev i t a l i t y 0 d0 4 7 80 4 7 1 0 。4 4 60 4 5 7 o d 平均值( e ) 0 4 6 3 酶活( 万u g )4 1 5 2 2 胰蛋白酶的活力测定： 【稀释2 5 0 0 倍p h = 8 0t = 4 0 * c 2 7 第三章实验结果j 讨论 表3 1 4n e u t r a s e 蛋白酶酶活力测定纬果 t a b e3 - 14m e a s u r er e s u l to fn e u t r a s e se n z y m e v i t a l i t y n e u t r a s e 中性蛋白酶的活力测定： 【稀释8 0 0 倍p h = 6 5t = 4 0 。c 表3 1 5 木瓜蛋向酶酶活力测定结果 t a b l e 3 15m e a s u r er e s u l to fp a p a i n se n z y m ev i t a l i t y 木瓜蛋白酶的活力测定： n n4 0 0 0 倍p h = 6 5t = 4 0 。c 】 由表3 1 2 、3 一1 3 、3 1 4 和表3 1 5 可以看出，胃蛋白酶、胰蛋白酶、n e u t r a s e 蛋白 酶和木瓜蛋白酶的酶活力大小分别是3 2 2 、4 1 5 、2 3 4 、2 3 5 万u g 。 3 6 蛋白酶水解大豆蛋白单因素最适条件的测定 3 6 1 最适温度的确定 图3 - 3胃蛋白酶最适水解温度 f i g 3 3o p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e p s i n 2 8 1 1 趔 1 o o 0 9 0 8 0 7 o 6 图3 - 4 胰蛋白酶最适水解温度 f i g 3 4o p t i m u mt e m p e r a t u r eo f t r y p s i n 第三章实验结果j 讨论 图3 - 5n e r u t r a s e 中性蛋白酶最适水解温度 f i g 3 5o p t i m u mt e m p e r a t u r eo f n e r u t r a s e j 型 8 图3 - 6 木瓜蛋白酶最适水解温度 f i g 3 - 6o p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp a p a i n 由上述最适温度曲线可知，胃蛋白酶、胰蛋白酶、n e r u t r a s e 中性蛋白酶、木瓜蛋白 酶的单因素最适水解温度分别为5 5 、5 0 、4 5 、6 0 。当温度较低时，酶活力较低， 酶催化反应速度较慢；随着温度的升高，酶催化反应速度加快，当温度过高时，酶活力 下降，生成的产物量迅速减少。 温度对酶促反应的影响有两方面：一方面是当温度升高时，反应速度也加快；另一 方面，随着温度的升高而使酶逐步变性，反应速度下降。酶反应的最适温度就是这两种 过程平衡的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，则后一种 效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。最适温度不是酶的特征物理常数， 而是上述影响综合作用的结果，它不是一个固定值，而与酶水解作用时间的长短有关， 当酶反应时间已经规定了的情况下才有最适温度。 3 6 2 最适p h 的确定 o 8 巅 0 5 0 4 0 3 0 2 o 1 0 图3 7 胃蛋白酶最适水解p h f i g 3 - 7o p t i m u mp ho fp e p s i n 2 9 趔 o o 图3 - 8 胰蛋白酶最适水解p h f i g 3 - 8o p t i m u mp ho ft r y p s i n 1 9 8 7 6 5 4 3 2 0 0 o o o o o o 第三章实验结果j 讨论 56789 1 0 图3 - 9n e r u t r a s e 中性蛋白酶最适水解p h f i g 3 9o p t i m u mp ho fn e r u t r a s e 图3 一l o 木瓜蛋白酶最适水解p h f i g 3 10o p t i m u mp ho fp a p a i n 由上述蛋白酶的最适p h 曲线图可以看出，胃蛋白酶、胰蛋白酶、n e r u t r a s e 中性蛋 白酶、木瓜蛋白酶的单因素最适水解p h 分别为1 8 、8 5 、7 5 、6 5 。在蛋白质酶解过程 中，酶的活性受环境p h 的影响。在一定的p h 条件下酶反应速度最大，当p h 值高于及 低于此p h 时，酶活都较低，水解速度也就较慢，生成的产物量较少。 p h 对酶促反应的影响是复杂的，其原因可能在于以下几个方面：( 1 ) 过酸、过碱 会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活：( 2 ) p h 会影响底物分子解离状态，也会 影响酶分子的解离状态。最适p h 与酶活力中心结合底物的基团及参加催化的基团的p k 值有关，往往只有一种解离状态最有利于与底物结合，此p h 下酶的活力最高。p h 也可 能影响到中间络合物的解离状态；( 3 ) p h 影响分子中另一些基团的解离，这些基团的 离子化状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。 3 6 3 最适 e s 曲线 1 0 9 型 80 8 o 7 0 6 0 5 o 4 23456789 1 0 ( z s ( ) 图3 11 胃蛋白酶最适【e 】【s 】曲线 f i g 3 11o p t i m u m e i s 】o fp e p s i n 3 0 趔 1 。2 q o l 0 8 0 6 23456789l o e l s 值( ) 图3 1 2 胰蛋白酶最适【e 】 s 】曲线 f i g 3 12o p t i m u m 【e s o ft r y p s i n 3 1 9 7 5 1 1 o o o 覃1 8 h p 8 7 6 5 4 3 2 1 o o o磐o。o o o o 第三章实验结果1 i 讨论 o 7 智0 6 o o 5 0 4 o 3 12 3 4567 e l s 3 ( ) 图3 1 3n e u t r a s e 蛋白酶最适 e s 曲线 f i g 3 13o p t i m u m e l i s o f n e u t r a s e 1 。1 趔 81 0 9 o 8 0 8l1 21 41 61 8 e s ( ) 图3 1 4 术瓜蛋白酶最适 e i s 曲线 f i g 3 14o p t i m u m e s o fp a p a i n 由上述最适【e s 】可以看出，胃蛋白酶、胰蛋白酶、n e r u t r a s e 中性蛋白酶、木瓜蛋 白酶的单因素最适 e 】 s 值分别为8 、8 、5 、1 6 。随着加酶量的增加，与酶的 活性中心结合的底物蛋白质数量增加，因此反应速度加快，当酶量增加到一定量时，生 成产物的量不再增加甚至有所减少，其原因可能是产物积累对反应有抑制作用。 3 6 4 蛋白酶水解大豆蛋白的单因素最适条件 由上述最适温度、最适p h 、最适 e 】【s 实验的结果可以得到，胃蛋白酶、胰蛋白 酶、n e r u t r a s e 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的单因素最适条件分别是( 1 ) 胃 蛋白酶：t = 5 5 。c ，p h = 1 8 ，【e 【s 卜8 ；( 2 ) 胰蛋白酶：t = 5 0 c ，p h = 8 5 ，【e s 】= 8 ； ( 3 ) n e r u t r a s e 中性蛋白酶：t = 4 5 。c ，p h = 7 5 ，【e 】 s 】- 5 ；( 4 ) 木瓜蛋白酶：t = 6 0 。c ， p h = 6 5 ，【e 】 s = 1 6 。 3 7 蛋白酶水解物抑制率的测定 3 7 1 单酶水解大豆分离蛋白水解物a c e 抑制率测定结果 实验选用8 种蛋白酶：胃蛋白酶、胰蛋白酶、n e r u t r a s e 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、