（食品科学专业论文）中国传统发酵豆制品中毛霉的分离及性质研究.pdf

摘要 摘要 本实验对从自然发酵生产豆制品中分离产蛋白酶菌株，并对其蛋白酶的酶学性质及对豆 腐发酵变化进行了探讨。 研究结果表明：初步筛选得到4 株产蛋白酶的菌株，其中产蛋白酶活力较高的是m 2 菌 株，m 1 菌株的酶活力最低。经菌株稳定性试验表明，m 2 菌株的传代稳定性较好。对m 2 菌 株进行简单的实验室鉴定，根据菌落形态观察，个体形态观察和扫描电镜分析，初步将该菌 株归为真菌门( f u n g i ) 、藻菌纲( p h y c o m y c e t e s ) 、毛霉目( m u c o r a l e s ) 、毛霉科( m u c o r a c e a e ) 、 毛霉属( m u c o rm i c h e l ie xf r i e s ) 。 在温度2 8 、初始p h5 0 、接种量2 、装液量1 0 0m l 和转速1 5 0r m i n 的条件下，有 利于m 2 菌株蛋白酶的生产。m 2 菌株产的蛋白酶可能是含多种蛋白酶的复合酶系，以酸性 蛋白酶为主，最适作用p h 为4 ，最适作用温度为5 5 。在4 、p h 为5 6 时，蛋白酶有着 较好的稳定性。一些常见的金属离子对毛霉蛋白酶活性有一定的影响，在5 0m m o l l 的浓度 下，m n 2 + 、c a “、m 9 2 + 对蛋白酶有较强的活化作用，而z n “、f e “、f e 3 + 对蛋白酶有一定的抑 制作用。低浓度的n a c l 有激活作用但在高浓度下产生抑制作用。该酶的分子量在3 0k d 以 上。 利用质构仪和扫描电子显微镜研究毛霉发酵豆腐的质构和微观结构，通过电泳分析豆腐 的蛋白质水解情况，并与未发酵豆腐经行对比。结果表明，与未发酵豆腐相比，发酵豆腐的 硬度和黏性增大，内聚性和弹性减小。其微观结构较均匀致密。电泳分析和微结构分析均显 示出大分子量的蛋白质在豆腐发酵过程中的降解。 关键词产蛋白酶菌株：蛋白酶；酶学性质；发酵水解 a b s t r a c t s t u d i e so nt h ei s o l a t i o na n ds e l e c t i o no fp r o t e a s e p r o d u c i n gs t r a i n sf r o m t r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o y p r o d u c ta n dt h ep r o p e r t i e so fp r o t e a s e a b s t r a c t a p r o t e a s ep r o d u c t i n gs t r a i nw a si s o l a t e df r o m at r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o yp r o d u c lt h e c h a r a c t e r i s t i co ft h ep r o t e a s ea n dt h ec h a n g eo ff e r m e n t e dt o f ub yt h e s t r a i nw e r es t u d i e di nt h i s r e s e a r c h t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eh i g h e s tp r o t e a s ea c t i v i t yi sm 2s t r a i na n dt h e l o w e s tp r o t e a s ea c t i v i t yi sm 1 m 2s p a i ns h o w e dag o o dh e r e d i t ys t a b i l i t yb ys t a b i l i t ys t u d y m 2 s t r a i ni sb e l o n g e dt of u n g i ，p h y c o m y c e t e s ，m u c o r a l e s ，m u c o r a c e a e ，m u c o rm i c h e l ie xf r i e sb y l a bi d e n t i f ya c c o r d i n gt oc o l o n yf o r m ，m i c r oo b s e r v a t i o na n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm 2s t r a i nc a np r o d u c ep r o t e a s ew e l la t2 8 、i n i t i a lp h5 0 、l i q u i d v o l u m e1 0 0m la n do nar o t a r ys h a k e rw i t has p e e do f1 5 0r r a i n t h ep r o t e a s eo fm 2s t r a i n p r o d u c t e di sm a y b ep r o t e a s ec o m p o u n d ， b a s i si sa c i d i cp r o t e a s e ，t h ei d e a lc o n d i t i o n sf o rt h e p r o t e a s ea c t i v i t yw e r ep h4 、5 5 0 a n dh a dg o o ds t a b i l i t yi np h 5 - 6a n d4 c s o m em e t a li o n sh a d i n f l u e n c eo np r o t e a s ea c t i v i t y m n “，c a 2 + a n dm 9 2 + c o u l da c t i v a t ep r o t e a s ea c t i v i t yb u tz n 2 + ， i c e “，a n df e “c o u l di n h i b i tp r o t e a s ea c t i v i t ya tl e v e lo f5 0m m o l l m e a n w h i l en a c ls h o w e da n a c t i v a t i o ne f f e c ta tl o wl e v e lb u ta ni n h i b i t o r ye f f e c ta th i g hl e v e l t h ep r o t e a s em v v sw e r ea b o v e 3 0 k d t h et e x t u r ea n dm i c r o s t r u c t u r eo ff e r m e n t e dt o f ub ym u c o rw e r es t u d i e db yt e x t u r ea n a l y e ra n d s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) p r o t e o l y s i s o ft o f uw a s a n a l y z e db y s d s - p e g a e l e c t r o p h o r e s i sw i t hu n f e r m e n t e dt o f ua sac o n t r 0 1 t h et p ap r o f i l e ss h o w e dt h a th a r d n e s sa n d a d h e s i v e n e s so ff e r m e n t e dt o f uw e r ei n c r e a s e dw h i l et h ec o h e s i v e n e s sa n ds p r i n g i n e s sw e r er e d u c e d t h em i c r o s t r u c t u r eo ff e r m e n t e dt o f uw a sh o m o g e n e o u s r e s u l t sf r o ms d s p e g aa n a l y s i sa n d m i c r o s t r u c t u r ea n a l y s i sa l li n d i c a t e dt h a tp r o t e i n sw e r ed e g r a d e dd u r i n gt o f uf e r m e n t a t i o n k e yw o r d sp r o t e a s e ；p r o d u c t i n gs t r a i n ；p r o t e a s e ；p r o p e r t y ；t e x t u r e ；h y d r o l y z a t i o n i i c a n d i d a t e ： z h e n gx i a o t i n g s p e c i a l i t y ： f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o lz h a ox i n h u a i 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：静 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：本句& 窍 日期：螂吕年月6 日 导师签名：心芗i 乏 前言 1 前言 1 1 豆制品的发酵和常用菌种 豆制品是极具营养的食品。作为高蛋白质作物的豆类，不仅为满足人们对蛋白质的需求 提供了丰富的来源，同时因其不含胆同醇，富含多种对人体有益的生物活性物质而成为当 今食品开发的热点。利用大豆为主要原料力n - r _ 而成的食品已有几千种之多，其中包括通过微 生物发酵制成的各种发酵制品， 如豆豉、腐乳、酱油、酸豆乳和发酵豆乳饮料等。大豆制品 经接种微生物发酵后，使不同物质进行分解，产生了人体所需的多种营养成分，如有机酸 和氨基酸等。发酵大豆制品具有特殊的鲜香味，能刺激食欲， 有助于人体的消化吸收，还 有促进人体造血和营养神经的作用。更重要的是，发酵大豆制品具有许多独特的生理调节功 能。 1 1 1 豆制品的分类和利用 大豆加工和开发利用可归纳为二大类：传统豆制品，如豆腐、腐竹、酱油、豆豉、腐 乳，国外有日本的“纳豆”( n a t t o ) 、印尼的“丹贝”( t e m p e r ) ，均为大规模的生产并在健 康保健成分上做了深层的研究( 陈九武，1 9 9 8 ) 。新型豆制品，为营养豆奶、酸豆奶、发 酵豆乳饮料等产品，其中大部分产品均有研究或规模生产，但很多营养指标及理化指标国内 与国外相比较大的差距，如酸豆乳的品质与风味的改良问题，分离蛋白的n s i 值偏低等。 1 1 2 发酵豆制品的营养成分 现代研究表明，发酵大豆制品中有着丰富的生物活性物质，各种生物活性物质各自或 协同作用，构成了大豆发酵食品独特的生理功能，如抗变异原、抗癌、溶解血栓、抗氧化、 降血压和抗菌等。传统发酵大豆食品中的生物活性物质按其来源大致可分为两类：原料中 的生物活性成分不经过微生物及其酶的作用而存在于发酵成品中，称为一次成分；利用微 生物及其酶的综合作用对大豆原料中的大分子有机物分解和重组，同时经过复杂的生化作用 所形成的代谢产物和变异物质，是发酵制品中的二次成分，也是发酵大豆食品比不发酵的大 豆食品生物活性更强的实质所在。 大豆异黄酮是目前大豆及其发酵制品中最引入注目的一种功能性成分。大豆及普通大豆 食品中的异黄酮主要以糖营型形式存在。许多研究表明，游离型大豆异黄酮比糖苷型大豆异 黄酮具有更强的生物活性。游离型大豆异黄酮在抗自由基、抗氧化、抗脂质过氧化、抗溶血、 抗肿瘤和抗菌等生物活性方面均比糖苷型大豆异黄酮高。而通过微生物作用于大豆后因为有 的菌种在发酵过程中会产生一定量的b 葡萄糖苷酶。糖苷型异黄酮是由游离型异黄酮与一分 子的葡萄糖以7 - 位氧苷键结合的产物，1 3 葡萄糖苷酶可作用于糖苷型异黄酮分子中的氧苷 键，使其葡萄糖基团脱掉，供微生物代谢利用，从而使糖苷型大豆异黄酮转化为相应的游 离型大豆异黄酮，即使营转化为苷元的形式，可大大提高异黄酮的生理活性( 宋永生，2 0 0 3 ) 。 大豆中天然存在的低聚糖有棉子糖( r a f f i n o s e ) 、水苏糖( s t a c h y o s e ) 和蔗糖等， 其生理 功能在于其独有的双歧杆菌增殖特性。经微生物发酵后， 低聚糖既有损失也有生成。发酵过 东北农业大学工学硕上学位论文 程中，低聚糖的形成有两大途径：微生物产生的糖苷转移酶通过转糖基作用合成低聚糖； 微生物产生的内切半纤维素酶类，如半乳聚糖酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶及术聚糖酶等 水解半纤维素类多糖产生低聚糖( 唐传核，2 0 0 0 ) 。大豆发酵食品中已发现的低聚糖有低聚 果糖、蔗果三糖( 包括3 种异构体) 、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖，以及低聚木糖等。其中， 低聚果糖是在发酵中产生的，主要由蔗果三糖的3 种异构体在果糖基转移酶的作用下形成 的，而低聚半乳糖是由1 3 一半乳糖苷酶转糖基作用形成的。在自然界，许多微生物如根霉 和毛霉等都会产生半乳糖酶，它是一种内切糖苷酶，可水解半乳聚糖产生低聚半乳糖。低 聚异麦芽糖是支链淀粉的酶解产物，其分子中至少含有1 个a 1 ，6 糖苷键在酱油中存在( 张 海德，张永华，1 9 9 9 ) ，而低聚木糖是由木聚糖受木聚糖酶降解所得的产物。 微生物产生的蛋白酶作用于大豆蛋白后产生的低分子多肽混合物大豆多肽( s o y b e a n o l i g o p e p t i d e ) ，己被逐步证明其在营养学方面优于蛋白质和游离的氨基酸。蛋白质在体内消 化并不完全以氨基酸形式被吸收，而是以寡肽形式被吸收，二肽和三肽的吸收速度比同一 组成的氨基酸快， 多肽在肠道内的吸收率最高。实际上， 人体内大部分蛋白质是以多肽形 式直接吸收的，而小分子大豆肽正好就是一种人体易于消化吸收的肽，大豆多肽比大豆分 离蚩白更容易消化吸收。另外，大豆多肽还具有良好的溶解性、低黏度和抗凝胶形成性：具 有低抗原性，不会产生过敏反应；能增强运动员体能和肌肉，促进肌红细胞复原，帮助消 除疲劳；促进体内的乳酸菌和双歧杆菌的生长； 还具有促进脂肪分解、降低胆固醇含量、 调节胰岛素、降血压及抗氧化性等功能。 发酵大豆食品中的褐色色素类物质主要是类黑精素( m e l a n o i d i n ) ，是美拉德反应的产物。 发酵大豆食品的加工都需要1 - - 6 个月的后熟期，在此期间大豆蛋白质分解的氨基酸和产品中 的各类糖持续发生美拉德反应，经过一系列的化学反应，最终生成棕红色的类黑精素。研 究表明，发酵豆制晶中产生的褐色素( 类黑精素) 具有类似膳食纤维的功能( 增强胃肠的蠕 动) ，可改善耐糖能力( 阻止对糖的消化吸收) ， 预防糖尿病和癌细胞增生( 抑制胰蛋白酶的 异常活性1 ，抑制致癌物质亚硝胺生成，以及抗变易原性和消除活性氧自由基等多种生理活 性( 王明纪春，陈小光，2 0 0 1 ) 。 大豆发酵制品中除以上所述几种生物活性成分外，还有许多生物活性成分。如酱油中发 现的共轭亚油酸，是大豆中的亚油酸经发酵而变异的一种结合型弧油酸，有重要的生理保 健功能，可以抑制癌症和动脉血管硬化，预防糖尿病和减少体内脂肪( p a r kk y 等2 0 0 3 ) ； 腐乳中的红曲也是一种功能性较强的生物活性成分；胆碱是发酵过程中大豆磷脂受微生物分 泌的脂酶降解释放出来的脑营养物质。除了大豆中原有的维生素( 如v e ) 外， 大豆发酵过程 中的一些酶类还会寓集一些维生素类， 如纳豆中的v k 2 ， 印尼天培中的v b l 2 等都是已知的 生理活性物质。 1 1 3 发酵豆制品的作用 发酵豆制品不仅营养丰富，而且由于微生物作用使其消化性大大提高，更重要的是它们 具有许多独特的生理调节机能。早在本草纲目中就有豆豉开胃增食，消食化滞，发汗解 表，除烦平喘，驱风散寒，治水二卜不服，解山岚障气的记载。 1 1 3 1 抗癌作用 2 刖舌 研究发现，大豆中含有抗肿瘤物质大豆异黄酮。原料大豆中，9 9 的异黄酮化合物以糖苷 形式存在。经过微生物作用，这些异黄酮糖苷绝大多数解离为具有更广泛、更强烈生物活性 的苷元，如三羟基异黄酮，它在恶性肿瘤孕育过程中可起到延缓或阻止肿瘤变成 癌症的作用。1 9 8 1 年1 0 月在日本癌学会上，公布了“味噌汁( 酱汤) 摄取频度与胃癌死亡率 关系”的调查报告，证实酱汤摄取频度越高，胃癌死亡率越低。这种倾向按年龄、社会阶层、 地域的差异，分别检查，结果没有变化。酱油的抗癌性也为研究所证实。已经发现酱油中主 要香气成分h e m f 的抗癌作用十分明显，一日摄取4 毫克h e m f ( 每千克体重) ，即可减少鼠 肿瘤发生率7 5 ，而对体重及摄饵量无影响。 1 1 3 2 溶解血栓 血栓病是仅次于癌症的多发病，其主要原因是溶解血纤维的酶血纤维蛋白溶酶低 下。这种溶酶在人体内以其前体血纤维蛋白溶酶原的形式过量存在于血液中，尿激酶、链球 菌激酶是该酶的活化因子。研究发现，纳豆( 日本细菌型豆豉) 中存在一种在原料大豆中没有 的纳豆激酶，它亦可起到使血纤维蛋白溶酶活性化的作用，而且不受抗溶酶剂的抑制。一袋 重约百克的纳豆，即具有相当于临床一次尿激酶剂量的活性，而前者在经济上的优越性显然 是后者所不可比拟的，并且不存在合成药剂的副作用。 1 1 3 3 降血压 在血压调节系统中存在着一个很重要的血管紧张肽酶系，包括血管紧张肽原酶，血管 紧张肽转化酶( a c e ) 。酶的作用是使血管紧张肽原转化为血管紧张肽i i ，后者通过收缩末梢 血管而使血压上升。因此，降低血压的一个途径就是抑制这些酶的活性。将纳豆、脱盐豆酱 投入于饲料中喂养遗传性高血压s h r 鼠，均发现不同程度的血压下降，而添加蒸熟大豆的对 照组却无类似结果，推测可能是这些发酵豆制品中存在着抑制a c e 的物质。 1 1 3 4 抗氧化性 根据最新研究，人体摄取抗氧化物质可以抑制体内脂质的过氧化反应，对抗老化及防止成人 病的发生有重要作用。大豆皂甙可以明显抑制过氧化脂质的上升。三羟基异黄酮的抗氧能力 可与油脂食品所用抗氧化齐u n o g a 及b h a 相匹敌。酱油和酱对亚油酸具有抗氧化作用， 其抗氧化力与成品中含氧量以及糖和氨基酸反应生成的褐色物质有关。 1 1 3 5 抗菌性 丹贝除具有抗氧化性外，还具有很强的抗菌性，因其主要使用具抗菌性能的根霉为发酵 剂，发酵后丹贝中异黄酮对腊样芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠沙寒 沙门氏菌等引起食物中毒和腐败菌有较强的抑制作用。这对人体消化系统的调节有重要意义。 已发现丹贝有整肠作用，确证可以减少食用豆类后肠内气体的发生。另外，丹贝对儿童慢性 下痢营养失调有恢复作用。有关发酵豆制品生理调节机能的报道还有许多，如豆酱就被认为 还具有抑制胆固醇、防止胃溃疡的功效。各种保健作用的发现，促进了发酵豆制品这类传统 食品的发展、研究与开发，也为科研生产工作者提出了更高的要求，即在加工过程中最大限 度地保持生理活性成分的含量，促使向人体有益的方向转化，消除有毒因子的影响，生产出 具备营养机能、感官机能、生理调节机能和安全性的食品( 陈九武，杨军1 9 9 8 ) 。 由于传统大豆制品具有独特的豆腥味，一度不被西方发达国家居民普遍接受，生产和消 费都较少。近年来，随着大豆育种技术和食物生产水平的提高，无豆腥味大豆制品得到普遍 3 东北农业大学t 学硕一f ：学位论文 发展，加上传统大豆制品具有食用方便，含有丰富的蛋白质和钙，并且其中也富含大豆中的 特殊功能保健冈子，因此传统大豆制品如豆腐、腐乳等也受到西方发达国家居民的广泛欢迎， 消费量在逐年升高。 1 1 4 豆制品生产菌种的研究 豆制品生产菌中多种多样，红曲霉、紫红曲霉、米曲霉、溶胶根霉、青霉、交链孢霉 ( a l t e r n a r i a ) 、枝孢霉( c l a d o s p o r i u m ) 、毛霉属( m u c o r ) 、根霉属( r h i z o p u s ) 等以及酵母菌( 如弯 曲乳杆菌和干酪乳杆菌等) 和一些细菌如杆菌、链球菌、小球菌等都可用于豆制品的生产。 传统发酵大豆食品，因其特有的风味而备受青睐。豆酱、酱油、豆豉和腐乳并列为我国 四大传统发酵豆制品，其发酵过程是在开放的环境下进行的，参与发酵的微生物种类繁多， 不同微生物所起的作用各不相同。 目前分离酱醅中的微生物可得到细菌6 个属1 4 个种。主要为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 、泛酸芽孢杆菌( b a c i l l u s p a n t o t h e n t i c u s ) 、坚实芽孢杆菌( b a c i l l u sp a s t e u r i i ) 、 非液化型酱油杆菌( b a c i l l u ss o y an o n l i q u i f a c i e u s ) 、巴氏芽孢杆菌( b a c i l l u s p a s t e u r i i ) 、易变 小球菌( m i c r o c o c c u sv a r i a n s ) 、凝聚小球菌( m i c r o c o c c u sc o n g l o m e r a t u s ) 、溶乳酪小球菌 ( m i c r o c o c c u sc a s e o l y t i c u s ) 、表皮小球菌( m i c r o c o c c u se p i d e r m i d i s ) 、尿素小球菌( m i c r o c o c c u s u r e a e ) 、表皮葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i s ) 、酱油四联球菌( t e t r e c o c c u ss o y a e ) 、 嗜盐足球菌( p e d i o c o c c u sh a l o p h i l u s ) 、粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ) ( 发酵调味品生产技 术，1 9 9 9 ) 。分离得到的酵母菌主要有啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、鲁氏酵母 ( a c c h a r o m y c e sr o u x i i ) 、结实酵母( s a c c h a r o m y c e s # u c t u u m ) 、耐盐德巴利酵母( d e b a r y o m y c e s h a l a t o l e r a u s ) 等。分离得到的霉菌主要为米曲霉( a s p o r y z a c ) 、高大毛霉( m u c o rs p p ) 、黑 曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、酱油曲霉( a s p s o j a c ) 等( 贡汉坤等，2 0 0 3 ) 。 腐乳根据生产类型可分为腌制型、毛霉型、根霉型和细菌型。常用的腐乳生产用微生物 列于表2 ( 赵玉莲，1 9 8 9 ) 。 国内毛霉型豆豉的生产菌种是m r c - 1 毛霉。此菌是1 9 8 2 年李幼筠等人在天然毛霉豆 豉中分离出来的( 陈留记等，1 9 9 8 ) 。根霉型豆豉的代表产品是印尼的天培，其主要发酵微生 物为米根霉( r h i z o p u so r y z e ) 、少孢根霉( r h i z o p u so l i g o s p o r u s ) 和毛霉( m u c o ri n d i c u s ) f f e r a n f r 等，1 9 9 6 ) 。细菌型豆豉的发酵菌种主要有豆豉芽孢杆菌( b a c i l l u sd o u c h i ) 、枯草 芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、乳酸菌( 1 a c t o b a c i l l u s ) 及微球菌( m i c r o c o c c u s ) ( 李祥，1 9 9 9 ) 。 1 2 蛋白酶的酶学性质 生物技术在食品工业中应用的代表就是各种酶制剂的应用。在所有的工业用酶中，蛋白 酶是用量最大，应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的6 0 以上。蛋白酶种类多，来源广， 一般依据其来源将它分为：动物蛋白酶，植物蛋白酶和微生物蛋白酶3 种类型。由于微生物 具有资源广泛，生长繁殖快，培养方法简单，可利用廉价原料通过发酵进行大规模的工业化 生产，并且便于自动化控制等诸多优点，已使得微生物蛋白酶逐渐取代其他来源的蛋白酶， 成为酶制剂工业的支柱产品之一。 4 前言 表1 1 腐乳生产常用菌种 t a b 1 - 1t h em a i ns t r a i n si nt h ep r o c e s so fs u f u 微生物 产地 五通桥毛霉( m u c o r w u t u m g k i a o ) 腐乳毛霉( m s u f u ) 总状毛霉( m r a c e m o s u s ) 雅致放射毛霉( a c t i n m u c o r e l e g a n s ) 根霉( r h i z o p u s ) 紫红曲霉( m o n a s c u s p u r p u r e u s ) 普雷恩毛霉( m u c o r p r a i n i i ) 黄色毛霉( mv u s ) 溶胶根霉( r h i z o p u s l i g u s f a c i e n s ) 米曲霉( a s p o r y z a e ) 青霉( p e n i c i l l i u m s p ) 酵母菌( s a c c h a r o m y c e s ) 芽孢杆菌( b a c i l l u s s p ) 枝孢霉( c l a d o s p o t i u m s p ) 链球菌( m i c r o c o c c u s s p ) 棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m s p ) 藤黄小球菌( m i c r o c o c c u s l u t e u s ) 芽枝霉( c l a d o s p o r i u m s p ) 粘质沙雷氏菌( s e r r a nk m a r c e s c e n s ) 裂殖酵母菌( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s s p ) 华根霉( r h i z o p u s c h i n e n s i s ) 四川、五通桥 浙江、绍兴、江苏、苏州 台南 北京 南京 红豆腐乳生产厂家 台湾 四j f l 江苏 江苏、四川 江苏 江苏 四川、黑龙江 江苏 江苏 江苏 黑龙江 湖北 浙江 湖北 台湾 1 2 1 蛋白酶的生产现状 蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽肽键水解。它广泛存在于动物 内脏、植物茎叶、果实和微生物中。各种生物体都能合成它，但唯有微生物蛋白酶具有生产 价值，蛋白酶也是研究的比较深入的一种酶，已做成结晶或得到高度纯化物的蛋白酶达1 0 0 多 种，其中不少酶的一级结构以及立体结构也已阐明。 蛋白酶的商品生产始于2 0 世纪初，3 0 年代微生物蛋白酶开始用在食品和制革工业。近2 0 年来，微生物蛋白酶的研究蓬勃开展。2 0 世纪5 0 年代初，日本学者首先发现霉菌中存在几种 类型的蛋白酶，特别是酸性蛋白酶，2 0 世纪6 0 年代初，荷兰开始生产添加碱性蛋白酶的洗涤 剂。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶8 0 - 1 0 0 ；胂以上。 1 2 2 蛋白酶的分类 5 东北农业火学工学硕十学位论文 按蛋白酶水解蛋白质的方式可分为以下几种。( 1 ) 切开蛋白质分子内部肽键，生成相对 分子质量较小的多肽类，这类酶一般叫内肽酶；( 2 ) 切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端 的肽键，而游离出氨基酸，这类酶叫外肽酶。作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末 端的称为羧肽酶；( 3 ) 水解蛋白质或多肽的脂键；( 4 ) 水解蛋白质或多肽的酰氨键。 按酶的来源可以分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶。 微生物蛋白酶又可分为细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶。按蛋白 酶作用的最适p h 可以分为p h 2 5 5 0 的酸性蛋白酶、p h 9 5 1 0 5 的碱性蛋白酶、p h 7 8 的 中性蛋白酶。为了方便起见，微生物蛋白酶常用这种分类方法；根据蛋白酶的活性中心和最 适反应p h 可以分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和活性中心有两个羧基的酸性 蛋白酶。 1 2 3 蛋白酶的基本性质 蛋白酶种类繁多，形制上差别较大，但同类的蛋白酶之间，亦有其共同之处。蛋白的 基本性质如下： ( 1 ) 从蛋白酶活性中心的基团来看，丝氨酸蛋白酶的活性中心均含有丝氨酸；巯基蛋白酶活 性中心含有半胱氨酸；羧基蛋白酶活性中心含有酸性氨基酸，即谷氨酸或天冬氨酸；金属蛋 白酶的活性中心则含有二价金属离子，如锌离子、锰离子、钴离子、铁离子、铜离子等。 ( 2 ) 许多霉菌蛋白酶和动物胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等是酸性蛋白酶，其作用最适p n 值为 2 0 - - - - 4 5 ，等电点为p h 3 5 ，在p h 2 5 的范围内较稳定，最适作用温度3 7 6 0 ，相对质 量一般为3 0 0 0 0 3 5 0 0 0 。 ( 3 ) 许多芽胞杆菌蛋白酶和植物蛋白酶是中性蛋白酶，其最适p l q 值为6 0 - 8 0 ，等电点8 9 ，在p h 6 - - - 7 稳定，相对分子质量3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 ，反应时间在1 0 一- - 3 0 m i n ，最适温度4 0 - - 5 0 ，对热稳定性差。大多说中性蛋白酶属于金属蛋白酶。 ( 4 ) 碱性蛋白酶几乎都有微生物产生，其最适p h 为9 0 - 1 0 5 ，等电点p h8 9 ，相对分子 质量较小，为2 0 0 0 0 - - , 3 5 0 0 0 ，对热稳定性较差。 1 2 4 蛋白酶的活力测定 蛋白酶的种类繁多，不同的蛋白酶的性质和催化反应条件各不相同，无法规定一个统一 的测定方法，目前使用最多的有福林酚法、紫外分光光度法、甲醛滴定法、d h t - 酪蛋白法。 1 3 蛋白酶的用途 1 3 1 用于食品发酵工业 酱油的酿造就是利用米曲霉分泌的蛋白酶分解原料中的蛋白质，使其降解为胨、多肽、 氨基酸，生成色、香、味于一体的产品。也有直接用蛋白酶制剂酿造酱油，但风味欠佳。啤 酒酿造中，当麦芽糖用量减少辅料增加时，常需要补充蛋白酶，使蛋白质充分降解，霉菌和 细菌蛋白酶适合这一用途。微生物酸性蛋白酶还是有效的啤酒澄清剂。鱼露是鲜鱼加 2 5 3 0 食盐自然发酵6 。1 2 个月而成，若添加少许霉菌蛋白酶可缩短发酵时间，提高风味。 6 前言 1 3 2 用于制革生产 制革的原料皮中纤维蛋白是皮革的有用成分，此外还有不少非纤维状的蛋白存在于纤维 间隙和表皮中，这些蛋白含量虽少，若不去除，成品皮革僵硬而脆。蛋白酶不能分解天然胶 原，而只能分解间质蛋白，因而可用于制革工艺，国内生产的中性和碱性蛋白酶制剂均可用 于酶法脱毛。 1 3 3 制造明胶和可溶性胶原纤维 工业上用石灰水浸去皮、骨等原料中的油脂与杂蛋白等，此工艺耗时长达数月，劳动强 度大，出胶率低而且能耗大，用蛋白酶净化胶原，明胶纯度高，质量好，相对分子质量均匀， 分子排列整齐，生产周期短，明胶收率高，几乎达1 0 0 。 1 3 4 预处理羊毛低温染色 羊毛用高温染色，会使毛的强度受到损害，且易造成纤维毡化收缩和毛体竖起，用蛋白 酶处理后的羊毛，在沸点下染色，2 r a i n 的上色率可达1 0 0 ，成品色泽鲜艳，手感丰满，废 水中燃料含量大大降低。 1 3 5 丝绸脱胶 生丝织物必须脱胶，丝胶是一种蛋白质，我国历来用碱皂法高温炼丝进行脱胶，缺点很 多，碱质侵袭丝素，易引起发毛影响光泽，用蛋白酶脱胶后，成品手感润滑柔软，光泽鲜艳， 而且脱胶时间短，操作温度低，劳动生产率提高。 1 4 研究的目的与意义 本研究试图从徽州自然发酵豆制品中分离筛选出特有的优势菌株，此菌株可能产蛋白酶， 或也可能未被研究过的菌株。而且，对它生长条件及它产生的蛋白酶的酶学性质等因素的研 究可作为日后的实际生产应用的指导和参考。 1 5 研究内容 本研究课题的主要研究内容如下： ( 1 )从自然发酵产品中分离出产蛋白酶活力较高的菌株。 ( 2 )对产蛋白酶的菌株的液体培养条件进行初步优化。 ( 3 ) 对产蛋白酶的菌株的基本酶学性质进行研究。 ( 4 )对菌株的豆腐制品应用与品质变化进行研究。 7 东北农业大学下学硕i j 学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 原料与试剂 自然发酵豆制品 豆腐 干酪素 酵母膏 蛋白胨 牛肉膏 麦芽糖 果糖 可溶性淀粉 大豆蛋白 硝酸钠 硫酸铵 乙醇 乳酸 蔗糖 冰乙酸 葡萄糖 琼脂粉 磷酸氢二钾 甘油 甲醇 乳糖 硫酸铁 氯化镁 浓盐酸 钨酸钠 氯化锌 l 酪氨酸 氯化钠 氯化钙 硫酸铁 溴酚蓝 购于市场 北京奥博星生物技术有限责任公司( 生化试剂) 天津市东丽区天大化学试剂厂( 生化试剂) 北京奥博星生物技术有限责任公司( 生化试剂) 天津市东丽区天大化学试剂厂( 生化试剂) 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津市东丽区天大化学试剂厂 哈尔滨高科大豆食品有限公司 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津凯通化学试剂有限公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 北京益利精细化学晶有限公司 北京双环化学试剂厂 天津市耀华化工厂 上海山浦化工有限公司 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市光复精细化工研究所 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天火化学试剂厂 北京益利精细化学品有限公司 天津市博迪化工有限公司 8 材料与方泫 柠檬酸 钼酸钠 硫酸锂 浓硫酸 氯化钾 碳酸钠 硫酸锰 硫酸锌 三氯乙酸 二水磷酸二氢钠 甘氨酸 a 巯基乙醇 n ，n 甲叉双丙烯酰胺 三羟甲基氨基甲烷( 瓢s ) 十二烷基磺酸钠( s d s ) 三羟甲基氨基甘氨酸( t r i s c i n e ) 考马斯亮蓝r - 2 5 0 低分子量标准蛋白质 扫描电镜药品 所有药品除特殊说明外均为分析纯 2 1 2 仪器与设备 电子分析天平 h z q f 1 6 0 型全温振荡培养箱 d h p 9 2 7 2 型电热恒温培养箱 p h s 3 c 型精密p h 计 手提式压力蒸汽灭菌器 摄影生物显微镜 x s p 1 6 a 光学显微镜 电热恒温水浴锅 7 2 2 e 型可见分光光度计 凝胶成像分析系统 t a x tp l u s 物性测定仪 s 3 4 0 0 n 扫描电镜 y q 3 型电动均质机 d h g 9 2 4 0 a 型电热鼓风干燥箱 h 1 微型漩涡混合器 天津市东丽区天大化学试剂厂 上海山浦化工有限公司 上海山浦化工有限公司 天津市耀华化工厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 北京双环化学试剂厂 北京双环化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂厂 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市博迪化工有限公司 s o l a r b i o 公司 s i g m a 公司 s o l a r b i o 公司 s i g m a 公司 s o l a r b i o 公司 s i g m a 公司 中科院上海生化研究所( 电泳级) 东北农业大学电镜中心提供 梅特勒托利多仪器上海有限公司 哈尔滨东联电子技术开发有限公 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 上海雷磁仪器厂 镇海金鑫医疗器械有限公司 德国 上海光学仪器厂 天津市泰斯特仪器有限公司 上海光谱仪器有限公司 美国 美国 日本h i t a c h i 江苏江阴科研器械厂 上海恒科技术有限公司 上海精科实业有限公司 9 东北农业大学t 学硕_ f 学位论文 w d 9 4 5 0 b 型水平摇床 f w l 0 0 型高速万能粉碎机 d y y - 6 c 型电泳仪 d y c z 2 8 a 型电泳槽 s h z d ( i i i ) 循环式真空泵 f l c 3 型超净台 j y 9 2 i i 型超声波细胞破碎机 f o s s 2 4 0 0 全自动凯式定氮仪 2 2 试验方法 北京市六一仪器厂 天津市泰斯特仪器有限公司 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 巩义市予华仪器有限公司 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 上海新芝生物技术研究所 瑞典 2 2 1 产蛋白酶菌株的初筛 2 2 1 1 初筛培养基 斜面培养基( g l - 1 ) ： 硝酸钠0 3 、磷酸氢二钾o 1 、七水氯化镁0 0 5 、氯化钾 0 0 5 、硫酸亚铁0 0 0 1 、蔗糖3 、琼脂2 ；自然p h 值；1 1 5 c 灭菌2 0 m i n 。 平板培养基( g l - 1 ) ：蛋白胨1 、葡萄糖4 、琼脂2 ；自然p h 值；1 1 5 灭菌2 0 m i n 。 酪素平板分离培养基( g l - 1 ) ： 磷酸二氢钾0 0 3 6 、十二水磷酸氢二钠0 1 0 7 、七 水氯化镁0 0 5 、氯化锌0 0 1 4 、氯化钠0 0 1 6 、氯化钙0 0 0 2 、硫酸铁0 0 0 0 2 、酪 素0 4 、水1 0 0m l ；p h6 5 7 0 ；1 2 1 灭菌2 0m i n 。 2 2 1 2 初筛过程 1 样品来源从自然发酵豆制品毛豆腐中取样。 2 样品处理称取发酵豆制品5g ，在灭菌均质器中以8 0 0 0r m i n 处理1m i n 后，放入装有 2 4 5m l 无菌水的三角瓶中，振荡2 0m i n 后静置5m i n ，然后，将其以1 0 倍梯度分别稀释到质 量浓度为1 0 - 2 9 l 1 0 一g l 。 3 初筛将处理好的样品稀释液，分别在各浓度下取1m l 滁布于平板培养基，将培养皿 放入2 8 培养箱中培养4 8h 。取出培养好的平皿，选择生长良好、形态明显的单菌落，接种到 酪素平板分离培养基上，于2 8 培养箱中恒温培养，2 4h 后每隔1 2h 观察平皿，挑选出能在酪 素分离培养基上产生透明圈的单菌落，接种到斜面培养基上于2 8 。c 培养，待菌长好后放入4 。c 冰箱冷藏。 2 2 2 产蛋白酶菌株的复筛与初步鉴定 2 2 2 1 复筛培养基 脱脂乳平板培养基( g l 1 ) ：脱脂乳1 5 、琼脂2 ；自然p h 值：1 0 0 灭菌2 0m i n 。 脱脂乳试管培养基( g l 1 ) ；脱脂乳1 5 ；自然p h 值t1 0 0 灭菌2 0m i n 。 液休初始培养基( g l 1 ) ： 蛋白胨2 、葡萄糖1 、氯化镁0 2 、磷酸二氢钾0 2 ； 自然p h 值；1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 1 0 材料与方法 2 2 2 2 复筛过程 1 将初筛得到的菌株，分别接种到脱脂乳培养基和上，2 8 培养3 6h 后测量水解圈直径与 菌落直径，选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株。 2 将初筛得到的菌株，分别接种到脱脂牛乳试管里，2 8 培养2 4h 、4 8h 、7 2h 、9 6h ，测 量澄清层长度，选取长度最大的菌种。 3 将初筛得到的菌株制成菌悬液，分别等量接种到液体初始培养基中，2 8 摇振培养3 6h 后，用6 0 目筛网过滤，滤去菌体，滤液在3 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，弃沉淀，收集上清液， 即得粗酶液，测定粗酶液中蛋白酶的活力，选取酶活力最大的菌种( 3 次平行试验) 。 2 2 2 3 出发菌株的稳定性试验 对复筛后选出的菌株经行传代，每次传待发酵培养后测定其蛋白酶活力，连续六次传代 后，其菌株的酶活力依然比较稳定的菌株可作为出发菌株。 2 2 2 4 产蛋白酶菌株的初步鉴定 通过对菌落形态、个体形态的观察，对筛选的菌株进行实验室初步鉴定。 1 菌落形态的观察 在2 8 恒温培养2 4h 、4 8h 、7 2h 后，观察菌落形态，包括菌落大小，颜色，组织状态 等。 2 个体形态的观察 ( 1 ) 将滤纸两张、“u ”形玻璃棒、载玻片及盖玻片按图所示放入平皿内，盖上平皿盖，