（发酵工程专业论文）甘露糖蛋白的提取及在葡萄酒中的应用.pdf

摘要 酵母中含有丰富的甘露糖蛋白。提取的甘露糖蛋白添加到葡萄酒 中可以抑制葡萄酒的酒石结晶，提高蛋白质的稳定性，降低葡萄酒的 涩味，使葡萄酒体更柔和、圆润，同时可以稳定葡萄酒的色素。而且 可以为废酵母的利用提供新的途径，带来经济效益。 本论文对甘露糖蛋白进行了系统的提取、纯化研究，并在葡萄酒 中进行了应用。 ( 1 ) 提取时，先进行了一些单因素试验，然后对酶作用的时间、p h 、 温度三个因素进行了正交实验，得出了酶法提取的最佳工艺条件。酶 i ( r a p i d a s ef i l t r a t i o n ) 的最佳作用条件为温度5 5 ，时间1 2 h ， p h 6 0 ，其中p h 是最大影响因素，在这种条件下多糖得率为7 3 9 。 酶i i ( b 葡聚糖酶) 的最佳作用条件为温度6 5 ，时间1 6 h ，p h 6 0 ，其 中温度是最大影响因素，在这种条件下多糖得率为5 3 7 。另外还确 定了醇沉工艺的优化条件为3 倍体积9 5 乙醇沉淀6 h 。 ( 2 ) 粗甘露糖蛋白在葡萄酒中的最佳用量是2 5 0 m g l ，它能抑制白 葡萄酒的酒石结晶，提高蛋白质的稳定性。使红葡萄酒的多酚更稳定， 减少红葡萄酒在陈酿期间的色度损失，提高红酒的色调。酶法提取的 甘露糖蛋白比热浸提的作用效果好。 ( 3 ) 纯化时，对粗甘露糖蛋白进行了系统的脱蛋白研究。采用了三 氯乙酸法、皂土法、酶法三种方法脱蛋白，并对甘露糖蛋白进行了 s e p h a d e x g - - 7 5 葡聚糖凝胶层析。酶法提取的甘露糖蛋白( m e e ) 有两 部分，分子量分别为8 1 k d a 、3 2k d a 。其中3 2k d a 的部分占8 4 ， 不含葡聚糖。热浸提的甘露糖蛋白( m e c ) 有三部分，分子量分别为 8 1 k d a 、3 2k d a 、1 2 5k d a 。其中3 2k d a 的部分占5 6 ，含葡聚糖 约为1 7 5 。 关键词：酵母甘露糖蛋白葡萄酒 酒石蛋白质色度 a b s t r a c t t h e r ea r ea b u n d a n tm a n n o p r o t e i n si n y e a s t t h em a n n o p r o t e i n s e x t r a c t e df r o mt h ec e l lw a l lo fy e a s th a v ea ni n h i b i t i v ee f f e c to nt h e c r y s t a l l i z a t i o no ft a r t a r i cs a l t s ，i m p r o v ep r o t e i n i cs t a b i l i t y ，a n dh a v et h e a b i l i t yt om a k eaw i n em o r er o u n d ，i n c r e a s ei t sv o l u m ei nt h em o u t ha n d s t a b i l i z ec o l o u r i tp r o v i d e san e ww a yf o ra p p l i c a t i o no fs p e n ty e a s ta n g b r i n g se c o n o m i cp r o f i t s i nt h i st h e s i s ，t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fm a n n o p r o t e i n sf r o m y e a s ta n dt h e i ra p p l i c a t i o ni nt h ew i n ew e r es y s t e m a t i cs t u d i e d 1 s o m em o n o f a c t o r si ne x t r a c t i n gt h em a n o p r o t e i n sw i t he n z y m e w e r es t u d i e d ，b e f o r et h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a so b t a i n e d t h r o u g h o r t h o g o n a l t e s t t h e f i n a l l y r a t i o n a lc o n d i t i o no f r a p i d a s e f i l t r a t i o n ：t e m p e r a t u r ei s5 5 ，t i m ei s1 2 h ，p h i s6 0 p hi st h e m o s ti m p o r t a n tf a c t o r i nt h i sc o n d i t i o n ，t h ey i e l do fp o l y s a c c h a r i d ew a s u pt o7 3 9 t h ef i n a l l yr a t i o n a lc o n d i t i o no fb - g l u c a n a s e ：t e m p e r a t u r ei s 6 5 ，t i m ei s1 6 h ，p hi s6 0 t e m p e r a t u r ei st h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r i n t h i sc o n d i t i o n ，t h ey i e l do fp o l y s a c c h a r i d ew a su pt o5 3 7 t h eo p t i m a l c o n d i t i o no fe t h a n o lp r e c i p i t a t i o nw h i c hi s3t i m e sv o l u m eo f9 5 e t h a n o l f o r6 hw a sc o n f i r m e d 2 t h ee f f e c t i v ea m o u n to fm a n n o p r o t e i nu s e di nt h ew i n ei s 2 5 0 m g l i tc a ni n h i b i tt a r t a r i cp r e c i p i t a t i o na n di m p r o v ep r o t e i ns t a b i l i t y i nw h i t ew i n e ，w h i l et h e r ei sn oe f f e c ti nr e dw i n e b u tp o l y p h e n o l ss h o w b e t t e rs t a b i l i t yi nt h ep r o t e c t i o no fm a n n o p r o t e i na n dr e dw i n eh a sl e s s c o l o u rl o s sb e f o r ea n dd u r i n ga g i n g 3 t or e m o v et h ep r o t e i ni nt h ec r u d em a n n o p r o t e i n ，t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( t c a ) s e d i m e n t a t i o n ，b e n t o n i t em e t h o d ，e n z y m ed e c o m p o s i t i o nw e r e s t u d i e d s e p h a d e x g 一7 5g e lc h r o m a t o g r a p h y w a su s e dt o s e p a r a t e m a n n o p r o t e i n m e ec o n t a i n st w of r a c t i o n s ：t h e m o l e c u l a rw e i g h tw a s 8 1 k d a ( 2 6 ) a n d3 2k d a ( 8 4 ) s e p a r a t e l y ，b u td on o tc o n t a i ng l u c a n m e cc o n t a i n st h r e e f r a c t i o n s ：t h em o l e c u l a r w e i g h t w a s8 1 k d a ( 2 6 5 ) ，3 2k d a ( 5 6 ) a n d1 2 5k d a ( 1 7 5 ) s e p a r a t e l y t h ef r a c t i o no f 1 2 5k d ai sg l u c a n k e yw o r d s ：y e a s tm a n n o p r o t e i n w i n et a r t a r i c p r o t e i n c h r o m a t i c i t y 附件三 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用丁- 其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时- 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 强垂蚕 日期： 2 q 篮年上月坠日 日期：2 q 篮 年曼, e l 坠日 山东轻工业学院硕士学位论文 第一章绪论 1 i 甘露糖蛋白( m a n n o p r o t e i n ) 一切糖蛋白的基本组成都可分为糖链和肽链两大部分。只有1 1 种 n 1 单糖可作为糖蛋白糖链的组成成分。绝大多数糖蛋白中的糖与肽链 通过o 一糖苷键或n 一糖苷键连接，0 一糖苷键型和n 一糖苷键型的糖 链具有非常不同的结构特征。后者糖链中存在5 糖核心结构，而前者 的糖链中不存在共同的寡糖结构，具有多种类型的o 一糖苷键【2 j 。 由于酵母种类的不同，甘露糖蛋白侧链的数目与长短，和蛋白质 含量均会有些不同，加上提取方法和条件的不同，产品分予量的大小也 因此会有所差异【3 i 。但酵母甘露糖蛋白的基本结构都是糖链中有1 4 个甘露糖寡糖和蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸形成o - - 糖督键，其它都 是含有5 0 或更多个分子的甘露糖的多糖，通过一n 一乙酰酮二糖结 合在蛋白质上的天门冬酰胺处，此长链甘露聚糖是以一( i ，6 ) 甘 露糖苷键为主链。侧链是由i 一4 个甘露糖构成的，它以a 一( 1 ，2 ) 键，a 一( 1 ，3 ) 键连接到上述主链上而构成，侧链长度及结合形式随 菌种不同而不同，有的还含有磷酸酯及n 一乙酰葡糖胺 4 】。甘露糖蛋 白的结构如图1 1 。 ! ：巩i 篮l1 f 2 f 叠 l i i 1 3 m i m l + 】。+ m 1 - l + 瓤1 斗1 一珥 f 2 1 2f a f 2 1 i - pm lm i 麓i m f 2f l m l f f 3 吒l m i f af m lm - - 1 g 3 i z l 舭：_ t c 缸n 图1 1甘露糖蛋白的结构 f i g u r e l 1 t h es t r u c t u r eo fm a n n o p r o t e i n 酵母甘露糖蛋白是三维结构，多糖覆盖于蛋白质的表面，对蛋白 质有部分屏蔽作用，平均每个单糖可以覆盖o 6 n m 的跨度，对防止蛋 白质的水解具有重要意义嘲。 州 lili 丁j i 1 m z 2 嘣hr，疆 。1 i 。叶 ：- _ t 第一章鳍论 1 1 1 甘露糖蛋白的来源 甘露糖蛋白( m a n n o p r o t c i n ) 是广泛存在于自然界的一种多糖，它 不仅存在于酵母中，而且存在于裸子植物的木细胞膜和柿子、海藻、 魔芋等植物体中【6 】。其中魔芋甘露糖蛋白的水解液中存在甘露糖和葡 萄糖，有一部分甘露糖变为乙酸的酯，也就是第6 碳原子的伯醇基的 氢原子被乙醇基所取代。主链是3 8 个甘露糖和葡萄糖以1 4 糖苷键 相连接，支链以1 3 糖苷键相连接。不同来源的甘露糖蛋白的结构虽 有所不同，但它们都有共同的性质。因为它们不易被人体利用，所以 能防止肥胖、便秘、糖尿病及高胆固醇等疾病，不仅是非常理想的低 热、低脂肪的保健品，而且还是既经济又高效的天然食品保鲜剂【”。 酵母是甘露糖蛋白的重要来源。酵母细胞壁厚约2 5 n m ，约占细胞 干重的2 0 一3 0 ，从结构上讲，它类似三明治，外层为甘露糖蛋白 ( m a n n o p r o t e i n ) ( 3 0 ) ，内层为葡聚糖( g l u c a n ) ( 3 0 一4 0 ) ，其间 夹有一层蛋白质分予( 1 0 ) ，层与层之间可以部分镶嵌。葡聚糖是复 杂的分枝状聚合物，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的 形状，主链以b 一1 ，6 糖苷键结合，支链以p 一1 ，3 糖苷键结合。甘 露糖蛋白也是一种分枝状聚合物，主链以d 一1 ，6 糖苷键结合，支链 以一1 ，2 或一1 ，3 糖苷键结合f 8 】。根据资料，酵母甘露糖蛋白可 分成3 类：s d s 可提取的甘露糖蛋白，葡聚糖酶可提取的甘露糖蛋白， 还原剂可提取的甘露糖蛋白。绝大多数葡聚糖酶可提取的甘露糖蛋白 共价结合到细胞壁的b l ，6 葡聚糖上【9 1 。细胞壁结构见图1 2 。 图1 2 酵母细胞壁结构 f i g u r e l 2t h ey e a s te e l lw a l ls t r u c t u r e 2 l 【j 东轻2 e q k 学院硕上学位论文 从酵母细胞壁的结构图中看出，甘露糖蛋白覆盖于细胞表面，已 经确定有两种类型的甘露糖蛋白，一种足具有结构作用的甘露糖蛋白， 它渗入给：弘细胞以韧性的葡聚糖中担负起结构上的功能，含有约9 0 的甘露糖和5 一1 0 的蛋白质。第二种甘露糖蛋白，即甘露聚糖酶， 含有5 0 一7 0 的甘露糖，其余的是蛋白顷。甘露聚糖酶包括转化酶、 糖苛酶、蜜二糖酶、磷酸酶以及蛋白酶1 0 , 1 “。 1 1 2 甘露糖蛋白的功能 ( 1 ) 甘露糖蛋白对葡萄酒的作用 对酒石稳定性的影响 甘露糖蛋白对酒石结晶的抑制作用是在1 9 9 3 年l u b b e r s 首先发现 的，这种抑制作用与为防止蛋白质沉淀而加入的保护性胶体的作用是 相似的。甘露糖蛋白现已在工业上被制备并得到提纯( 1 9 9 7 ) ，它是一 种可溶性强，无气味，无滋味的白色粉末，但在葡萄酒生产中还未得 到应用。甘露糖蛋白能够抑制葡萄酒的酒石结晶，它抑制结晶的剂量 一般为1 5 2 5 9 h l ，如果大剂量的使用将降低其稳定效果，因此，必 须通过作实验来确定酒石稳定所需要的甘露糖蛋白的量，以防止过多 使用这种物质而降低其稳定效果 1 3 j 。 1 9 9 9 年f e u i l l a t 工作组已经证实，在酒泥上陈酿的葡萄酒中富 含甘露糖蛋白，并且研究了甘露糖蛋白对葡萄酒的作用，发现甘露糖 蛋白可以抑制葡萄酒中的酒石结晶，促进苹果酸一乳酸发酵，改善葡 萄酒的感官质量【l4 1 。在法国勃艮第地区，绝大多数干白葡萄酒都在酒 泥中陈酿数月，并在陈酿过程中每周搅拌1 2 次。统计表明，如果在 第二年3 月份就将酒与酒泥分离，则大部分酒的酒石不稳定。但如果 到第二年的7 月份再将酒与酒泥分离，则酒的酒石稳定性非常好【l5 1 。 波尔多的干白葡萄酒也存在这种现象。与此相反，相同的酒如果不与 酒泥一起贮存，则必须经冷稳处理才能达到酒石稳定。法国第戎大学 葡萄与葡萄酒学院的葡萄酒酿造实验室和波尔多葡萄酒工艺学院的研 究小组通过多年的实际观察发现，摁白葡萄酒与酵母泥一起在酒桶中 贮存数月，通常可获得酒石稳定性，省去了冷处理过程 1 3 1 。甘露糖蛋 白保护葡萄酒的方法非常明了，这一方法将朝着能最大限度完善葡萄 酒质量，同时限定操作规程的葡萄酒酿造设想发展。李小全设想本世 纪酿制瓶装葡萄酒的方法：轻微的粘合过滤：澄清；甘露糖蛋白处理； 错流过滤；无菌罐贮存：装瓶( 遴常在换桶前进行薄膜过滤) 1 8 1 。 对蛋白质稳定性的影响 研究表明，在白葡萄酒和桃红葡萄酒中，甘露糖蛋白可极大地提 第一章绪论 高蛋白质的稳定性，从而减少皂土的使用量，避免香气成分的损失。 这种甘露糖蛋白与从酵母中提取的一种转化酶( i n v e r t a s e ) 具有1 0 0 的同源性，它们的基本氨基酸序列都是：l y s i n e v a l i n e p h e n y l a l a n i n e t r y p t o p h a n e t y r o s i n e g l u t a m i n e p r o l i n e s e r i n e - g l u t a g i n e l y s i n e 1 2 1 。 甘露糖蛋白与酚类化合物 葡萄酒的外观是评价葡萄酒质量好坏的重要依据之一，而外观则主 要是看葡萄酒的颜色和澄清度。葡萄酒的颜色与葡萄酒的结构、丰满 度以及尾味和余味有着密切的关系，颜色可以帮助我们判断葡萄酒的 醇厚度、年龄和成熟度等【l9 1 。在红葡萄酒中，颜色的深浅与单宁的含 量往往成正相关，如果红葡萄洒的颜色深而浓，几乎处于半透明状态， 多数情况下，它必然醇厚、丰满、单宁感强；相反，色浅的葡萄酒， 则味淡、昧短，但它如果较柔和，具醇香，仍不失为好酒。葡萄酒的 色调可表现出其成熟程度，与酒龄的关系特别大。新鲜葡萄酒的呈色 物质主要是由于游离的花色素苷而引起，而陈酿过程的呈色作用较为 复杂，但主要是由于花色素苷聚合作用所引起 2 0 , 2 1 1 。在葡萄酒成熟过 程中，由于游离花色素苷逐渐与其它物质结合而消失，使陈年葡萄酒 的色调在聚合单宁的作用下逐渐交为紫红或宝石红色。 葡萄酒中的酚类化合物主要包括单宁和色素物质，研究表明酵母 甘露糖蛋白会缚获涩味单宁并与之结合从而降低葡萄酒中的涩味。目 前，我们的专家已经完成了酵母多糖与涩味单宁相互结合反应的图谱 模型【2 2 】，如图1 3 。 图l 3 甘露糖蛋白与单宁结合反应模型 f i g u r e l 3 o u t l i n eo ft h ea c t i o no fm a n n o p r o t e i no nt a n n i np a r t i c l e s 4 山东轻工业学院硕士学位论文 该模型充分表明了某些酵母菌种( 如l a l v i nd 2 5 4 或b m 4 5 ) 其产 生丰富的甘露糖蛋白能够与单宁结合，形成稳定的单宁复合物，使得 葡萄酒口感更圆润、更饱满、更醇厚绵长并且色度稳定。 f e u i l l a t 研究小组2 0 0 1 年研究结果表明，与白葡萄酒一样，当 红葡萄酒在酒泥上陈酿并带搅拌时，葡萄酒中的含氮物质和不溶于酒 精的中性多糖的含量增加【l ”，也就是说当葡萄酒在酒泥上陈酿时，酵 母菌自溶，细胞壁中的甘露糖蛋白大量进入葡萄酒。陈酿过程中如果 加以搅拌，葡萄酒酵母体的含量会进一步提高。这些物质具有与多酚 物质结合的能力。因此，在酒泥上陈酿的葡萄酒风味更为柔和、圆润、 肥硕，骨架和结构更完善，色素稳定性更好。对多酚物质的变化而言， 在酒泥上陈酿并不会提高总花色素苷的含量，但在酒泥上陈酿，可使 红葡萄酒中结合态花色素苷的含量提高2 0 左右( 用p v p p 系数和离 子化系数表示) ，而正是结合态的花色素苷才能保证红葡萄酒的颜色在 时间上的稳定性【2 3 1 。此外，在酒泥上陈酿，可使红葡萄酒中的胶体单 宁的含量提高( 明胶系数降低，酒糟系数提高) 。这一变化表明，单宁 对蛋白质的活性降低，而与多糖的结合提高，从而使葡萄酒的涩味降 低【l6 1 。在发酵初期添加酵母细胞壁于红葡萄汁中，可使色泽深度增加， 并得到组成更加理想的红葡萄酒，因为来自酵母细胞壁中的甘露糖蛋 白与单宁结合，使葡萄酒的收敛性降低，酒体更加醇厚。同样，甘露 糖蛋白也有利于白葡萄酒获得良好的组成 2 4 1 。 据李华在橡术桶与葡萄酒一文中介绍：由细胞壁( 特别是微 生物细胞壁) 释放的一些多聚体，可以软化葡萄酒中的单宁。对于涩 味重的红葡萄酒，加入l g l 橡木锯末，贮存3 个月的软化效果，相当 于加入2 0 0 m g l 酵母甘露糖蛋白的效果【1 7 】。 ( 2 ) 乳化剂功能 甘露糖蛋白是由甘露糖聚合物共价连接在蛋白骨架上构成的，具 有即亲水又亲油的双亲性质，这种结构是表面活性剂和许多高效乳化 剂所共有的。对甘露糖蛋白进行了一系列小型乳化试验，其乳化稳定 性较好，能乳化所有的油类、烃类以及所试验的有机溶剂【1 1 】。很多从 植物、果实中提取的油性香料，其香味纯正、浓郁、口感适宜，具有 原产品特有风格，但这些香料不溶于水质，在饮料及奶制品中难以使 用。即使使用后，经过一段时间产品贮存，使饮料表面出现油状分层， 影响产品质量。张国春研究发现酵母甘露糖蛋白能很好的解决这个问 蹶n 2 1 。 5 第一章绪论 ( 3 ) 防腐剂功能 化学合成防腐剂均有一定的毒性，这是困扰人们的重大问题。随 着社会、经济的发展，人们对食品的要求越来越高，为满足对食品在 品种、品质和数量上更高的要求，除加速开发安全、高效、经济的新 型化学合成食品防腐剂外，更应充分利用天然食品防腐剂。天然食品 防腐剂一方面在安全卫生性上比较有保证，另一方面还能更好地接近、 符合消费者的需要。甘露糖蛋白无色、无毒、无臭，广泛地存在于自 然界中，是既经济又高效的天然食品防腐剂。 以0 0 5 一0 1 的甘露糖蛋白水溶液喷雾、浸渍或涂布在生鲜食 品表面或掺入某些加工食品中，能显著地延长食品保存期。可用于水 果、蔬菜、豆制品、蛋类和豆类等多种食品的贮存保鲜。如，未经处 理的新鲜草莓，存放2 日后表面失去光泽，3 日开始发霉，而用0 0 5 的甘露糖蛋白水溶液浸渍新鲜草莓1 0 秒钟，取出经风干，贮存i 周仅 表面稍失光泽，3 周也未见长霉。又如鸡蛋的保存，将新鲜鸡蛋洗净 后擦干，浸渍于o 3 的甘露糖蛋白水溶液中，待鸡蛋表面全部沾湿后 取出，使鸡蛋表面自然风干，然后置于7 和相对湿度为7 0 的环境 中，存放2 1 日鲜度不变，3 0 日以上仍能食用，而未经处理的鸡蛋， 在相同条件下存放1 2 日，即己变质发臭【6 】。 ( 4 ) 免疫学功能 甘露糖蛋白主要通过激发免疫功能，维持微生态平衡来增强动物 免疫力，改善动物健康状况，增加动物对外界不良刺激的适应性，从 而提高生产性能，增加经济效益。在美国、巴西和我国台湾己普遍使 用酵母甘露糖蛋白，在畜禽和趣类养殖中发挥了良好的防病、治病和 保健作用。它是一种很有发展前景的，具有抗生素和益生素双重作用 的饲料添加剂和免疫促进剂，越来越受到学术界和养殖业的重视阻5 1 。 在肉鸡和火鸡的日粮中添加酵母甘露糖蛋白，显著降低了肠道内沙门 氏菌和大肠杆菌的数量 2 “。 1 1 3 甘露糖蛋白的提取方法 酵母甘露糖蛋白位于细胞壁的最外层，提取方法主要有三种： ( 1 ) 热浸提法 王骊在甘露糖蛋白是一种有效的生物乳化剂一文中提到在中 性柠檬酸盐缓冲液中高压浸提出甘露糖蛋白。王义华也用类似方法进 行提取，具体方法：啤酒酵母细胞用灭菌的0 9 n a c i 溶液收集以后， 3 0 0 0 r m i n 离心2 0 r a i n ，沉淀用p h 7 2 的0 0 2 m o l l 柠檬酸缓冲液洗涤 6 第一章绪论 ( 3 ) 防腐荆功能 化学合成防腐剂均有一定的毒性，这是困扰人们的重大问题，随 着社会、经济的发展，人们对食品的要求越来越高，为满足对食品在 品种、品质和数量上更高的要求，除加速开发安全、高效、经济的新 型化学合成食品防腐剂外，更应充分利用天然食品防腐剂。天然食品 防腐剂一方面在安全卫生性上比较有保证，另一方面还能更好地接近、 符合消费者的需要。甘露糖蛋白无色、无毒、无臭，广泛地存在于自 然界中，是既经济又高效的天然食品防腐剂。 以00 5 一0 1 的甘露糖蛋白水溶液喷雾、浸渍或涂布在生鲜食 品表面或掺入某些加工食品中，能显著地延长食品保存期。可用于水 果、蔬菜、豆制品、蛋类和豆类等多种食品的贮存保鲜。如，未经处 理的新鲜草莓，存放2 日后表面失去光泽，3 日开始发霉，而用0 0 5 的甘露糖蛋白水溶液浸渍新鲜草莓l o 秒钟，取出经风干，贮存1 周仅 表面稍失光泽，3 周也未见长霉。又如鸡蛋的保存，将新鲜鸡蛋洗净 后擦于，浸渍于0 - 3 的甘露糖蛋白水溶液中，待鸡蛋表面全部沾湿后 取出，使鸡蛋表面自然风干，然后置于7 和相对湿度为7 0 的环境 中，存放2 1 日鲜度不变，3 0 日以上仍能食用，而未经处理的鸡蛋， 在相同条件下存放1 2 日，即已变质发臭j 。 ( 4 ) 免疫学功能 甘露糖蛋白主要通过激发免疫功能，维持微生态平衡来增强动物 免疫力，改善动物健康状况，增加动物对外界不良刺激的适应性，从 而提高生产性能，增加经济效益。在美国、巴西和我国台湾已普遍使 用酵母甘露糖蛋白，在畜禽和鱼类养殖中发挥了良好的防病、治病和 保健作用。它是一种很有发展前景的，具有抗生素和益生素双重作用 的饲料添加剂和免疫促进剂，越来越受到学术界和养殖业的重视1 2 5 。 在肉鸡和火鸡的日粮中添加酵母甘露糖蛋白，显著降低了肠道内沙门 氏菌和大肠杆菌的数量【z 。 1 1 3 甘露糖蛋白的提取方法 酵母甘露糖蛋白位于细胞壁的最外层，提取方法主要有三种： ( 1 ) 热浸提法 王骊在甘露糖蛋白是一种有效的生物乳化剂一文中提到在中 性柠檬酸盐缓冲液中高压浸提出甘露糖蛋白。王义华也用类似方法进 行提取，具体方法：啤酒酵母细胞用灭菌的0 9 n a c l 溶液收集以后， 3 0 0 0 r m i n 离心2 0 r r d a ，沉淀用p h 7 2 的o 0 2 m o l l 柠檬酸缓冲液洗涤 3 0 0 0 r m i n 离心2 0 r r d a ，沉淀用p h 7 2 的0 0 2 m o l l 柠檬酸缓冲液洗涤 6 山东轻工业学院硕上学位论文 形成悬浮液，放入高压锅内高压抽提9 0 m i n 。取出冷却后，以3 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n 。上清液冷却至4 ，加入三倍体积的冷甲醇，出现乳白色 沉淀，4 放置过夜后，离心得到白色沉淀，放入干燥器中干燥隅”。 ( 2 ) 稀碱法 周义发用稀碱法从啤酒酵母中提取甘露糖蛋白，并用斐林试剂络 合沉淀。具体方法：取废酵母按其干重配成5 的稀碱悬浮液，室温搅 拌提取l h ，6 m o i l h c l 调至中性，迅速升温到9 0 。c ，搅拌1 0 r a i n ，再迅 速降温到1 0 。o 以下，静止过夜。离心，用6 m o l l h c i 将上清液调至 p h 2 5 ，低温静止过夜，4 0 0 0 r r a i n 离心除去核酸。上清液被调至中性， 乙醇醇析得粗多糖。s e p h a r o s e c l4 b 柱层析表明此多糖是均一的，气 相色谱法检查是甘露糖蛋白 2 8 1 。 ( 3 ) 酶法 主要是用b 一葡聚糖酶将细胞壁中的葡聚糖降解成小分子，用乙 醇沉淀得到粗的甘露糖蛋白。美国专利6 2 3 8 8 8 0 中用b 一葡聚糖酶在 4 0 水浴中从酵母细胞壁中提取甘露糖蛋白，其中葡聚糖酶包括外切 p 一1 ，3 葡聚糖酶，内切p 一1 ，3 葡聚糖酶，外切p l ，6 葡聚糖酶【2 9 1 。 专利6 1 3 9 8 9 1 中用外源蛋白酶和b 一葡聚糖酶直接从酵母中提取甘露 糖蛋白，结果发现蛋白质残留太多，效果不理想【3 0 1 。 1 1 4 甘露糖蛋白分析方法 粗甘露糖蛋白常含有游离蛋白质，需要去除，常用的去蛋白的方 法有s e v a g 法3 1 1 、b e c m 法3 2 1 、三氯乙酸法3 扪、鞣酸法、酶法结合 s e v a g 法等。糖蛋白是由分支的糖链与多朕链相连而构成的生物大分 子，是一种十分重要的复合糖。完整的分析一种糖蛋白包括对蛋白部 分，糖链部分以及这两部分的连接情况的分析。在分析之前，通常先 将蛋白与糖链分开。对蛋白部分的分析相对简单，而对糖的分析则其 有相当的挑战性。过去，测定一个糖蛋白中糖链的完整结构几乎是不 可能的，2 0 世纪8 0 年代以来，随着碳水化合物化学在方法学上的改 进和新技术的发展，使人们可以通过采用多种分析技术相结合的方法 正确阐明一个糖链的结构特征。综合近2 0 年来糖蛋白提纯及糖链结构 分析的方法，可将其概括为物理方法和化学方法。 ( 1 ) 物理方法 离子交换色谱( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，i e c ) 离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具 有相同电荷的溶剂离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换 7 第一章绪论 剂具有不同的亲和力而将它们分离【3 4 i 。该法适合于离子和在溶剂中可 发生电离的物质的分离。大多数生物大分子都是极性的，都可使其电 离，所以离子交换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋 白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占主 导地位吲。 1 9 9 5 年e l i z a b e t hj w a t e r s 用以p h 5 5 的哌嗪一盐酸缓冲液平衡过 的m o n o q ( h r 5 5 ) 阴离子交换柱纯化甘露糖蛋白。1 9 9 8 年w i l l i a m w o l l a c e 用以p h 3 0 的柠檬酸钠缓冲液平衡过的m o n o s ( h r 5 1 5 ) 阳离 子交换柱纯化甘露糖蛋白 3 6 10 亲和色谱( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a h y ，a f c ) 7 0 年代以来，人们利用凝集素可专一、可逆地与游离糖及复合糖 类中的单糖或寡糖结合这一特性，将亲和色谱用于糖蛋白的分离纯化 和序列测定。学者们利用固定化凝集技术将c o n a 固定于琼脂糖凝胶 和硅胶柱上，用于亲和色谱和h p l c 分析。c o n a 即伴刀豆球蛋白a ( c o n e a n a v a 1 i na ) 是一种外源凝集素，具有类似抗体的活性，并能 与一些糖的残基或链段有高度亲和力，广泛用于糖蛋白、糖多肽、糖 脂等多糖化合物的检测、分析和纯化口4 1 。m o n s i g n y 用c o n a s e p h a r o s e 4 b 亲和层析纯化甘露糖蛋白，以p h 5 6 的醋酸钠一盐酸缓 冲液平衡i 拍】。 气相色谱( g c ) 气相色谱法从6 0 年代起开始用于糖蛋白寡糖链的结构分析，该方 法主要通过化学修饰( 如甲基化、乙酰化、硅烷化等) 将寡糖链的单 糖组分转化为易挥发的衍生物进行测定，其准确性的提高关键在于改 进化学修饰及柱后检测法，以提高糖肽定量裂解的转化率和检测灵敏 度【3 们。1 9 9 8 年，m o n s i g n ye t a l 先将甘露糖蛋白用2 m o l l 的三氟醋酸 降解后，用丙硅烷硅烷基化，用气相色谱分析【3 “。 毛细管电泳技术( c e ) 毛细管电泳技术( c e ) 用于糖蛋白结构测定是近年来蓬勃发展起 来的分析技术，它克服了液相色谱中水解氨基酸和肽链对分析有干扰 这一缺点，以快速、高效、高灵敏度和所需样品少等特点正在逐渐成 为一种标准的分析手段。1 9 9 8 年w i l l i a m 运用毛细管电泳技术和液相 色谱相结合，对甘露糖蛋白进行了详细的分析 3 5 o 2 ) 化学方法 经典而有效的分析糖链结构的化学方法主要有：甲基化分析、高 山东轻工q k 学院硕士学位论文 碘酸氧化和s m i t h 降解、部分酸水解等。 甲基化分析 甲基化分析是多糖也是寡糖结构分析的最有力的手段之一。它包 括糖的所有自由羟基全部生成甲醚，接着通过水解释放出甲基化单糖， 再经n a b h 。还原成糖醇，进而乙酰化水解生成的羟基，得到各种部分 甲基化的糖醇乙酰衍生物，生成的产物用气相色谱进行定性和定量分 析，可确定组分多糖的各单糖种类和比例，进而用气相色谱一质谱， 结合标准谱图的分析，可得到各种部分甲基化单糖衍生物的归属，从 而确定各单糖的连接位置，即糖苷键的位置。但甲基化分析还无法知 道异头碳糖苷键构型及多糖中单糖残基的顺序信息，所要注意的是对 含有糖醛酸或氨基己糖残基的多糖比较难甲基化，而且有可能会产生 二级产物，如糖醛酸残基能产生缩酮衍生物，n 一乙酰基氨基己糖残 基可产生n 一甲基一n 一乙酰氨基己糖，对这些衍生物需要特殊分析技 术才能鉴定瞄”。 过碘酸氧化及s m i t h 降解 多糖的过碘酸氧化反应通常在p h 3 5 的水溶液中进行，用过碘酸 盐为氧化剂，因双醛型的氧化产物在水中不稳定，因此需要在酸水解 前用n a b h 。将它们还原成醇，最后，通过水解产物的分析结果可获得 多糖中单糖连接的类型是l 一4 ，l 一6 ，1 2 ，还是各种连接兼而有之。 s m i t h 降解实际上是一种改良的过碘酸氧化。它是将多糖过碘酸盐氧 化，n a b h 。还原后用弱酸部分水解( 通常在室温下用稀无机酸水解还 原产物) ，生成具有特征性的糖连接的重复单元，进而获得更多的结构 信息 3 8 , 3 9 1 。 部分酸水解 部分酸水解是多糖结构分析中一个很有用的技术，一是通过部分 水解可以获得结构较为容易测定的短链片段，从雨集零为整推断出多 糖的结构。二是可以在特殊糖苷键处断裂，帮助整个结构分析。如呋 喃环结构的单糖对酸不稳定，用弱酸水解就可以得到这些残基，再通 过残基片段的分析可得到有用的结构数据。一个成功的例子是枸杞子 糖蛋白中一条由阿拉伯糖和半乳糖组成的o - - 连接多糖【4 0 1 ，并从甲基 化分析结构得知，该多糖的非还原末端均为呋喃环阿拉伯糖，通过部 分酸水解并用纸层析跟踪检测，首先释放出a r a ，到刚有g a l 释放时 终止水解，通过水解前后两种多糖的甲基化分析结果比较，再结合其 它方法测定的结果可推断出整个多糖的可能结构。 9 第一章绪论 1 2 葡萄酒现状 葡萄酒是成分非常复杂的有机液体。其澄清度是消费者所要求的 第一质量指标。如果出现浑浊沉淀，则不论产品的味感，香气怎样， ，均不能被消费者接受。此外大多数浑浊沉淀都是葡萄酒变质的象征， 影响其感官质量，即使某些沉淀( 酒石) 不影响其色、香、味，但从 经营角度考虑，也应将之除去 4 1 i 。因此进入流通领域的葡萄酒必须在 一定的时间内保持良好的澄清度和持久的稳定性。所以研究葡萄酒的 稳定性，鉴别各种浑浊沉淀并探索合理有效的防止措施。对生产、经 营、消费等方面，都具有重要的意义。葡萄酒的稳定性主要包括以下 几个方面： 1 2 1 葡萄酒中酒石酸盐的稳定性 在葡萄酒中能引起结晶沉淀的一般只有两种物质，即酒石酸氢钾 和酒石酸钙。其中洒石酸氢钾较容易通过冷处理达到稳定，而酒石酸 钙是一种很不稳定的盐，易在装瓶后产生沉淀，影响酒的感官质量。 因此，研究葡萄酒中酒石产生的原因及防治方法对于指导葡萄酒的生 产，提高葡萄酒的质量具有重要意义1 15 1 。目前酒石酸盐沉淀的预防措 旋有： ( 1 ) 冷冻法 酒石析出和酒精含量、温度、贮存时间有关。酒石的溶解度随酒 精含量的升高而降低，随温度降低而降低。当酒温在0 以上时，酒 石析出过程缓慢，酒温在0 * c 以下时，酒石析出加快。冷冻应在短时 间内( 5 6 h 内) 达到所要求的温度，这样结晶时间短，形成的晶体 大，沉淀效果好。并在葡萄酒温度降至要求温度时，加入磨得很细、 纯度很高的酒石酸氢钾和中性酒石酸钙作为晶核，然后搅拌阻促进结 晶沉淀的生成，从而可使葡萄酒的酒石稳定【4 ”。外消旋酒石酸钙也可 以作为晶种，如果加入o 4 9 l 这种晶种，在1 时大约需8 小时可沉 淀，然而沉淀后的酒经过滤仍有大量酒石酸钙存在，在后来过程中仍 有沉淀的可能，而且商业用酒石酸钙很难达到很高的纯度( 9 9 以上) ， 其中杂质会引起酒的p h 值发生较大变化，所以它的使用受到一定的限 制。 ( 2 ) 离子交换法 离子交换树脂法稳定葡萄酒中的酒石一般可用弱碱性阴离子交换 树脂和强酸性阳离子交换树脂。强酸性阳离予交换树脂中的阳离子一 般为n a + 型，用于与葡萄酒中的k + 交换。如果完全以n a + 进行交换， 山东轻_ t l k 学院硕士学位论文 则葡萄酒中的酸度会略有下降。为了防止葡萄酒的酸度下降，可采用 n a + 和h + 的混合型。如果酸度太低可用h + 型。当酸度太高时可用阴 离子交换树脂，用氢氧根离子与酒中部分酒石酸根离子交换”。 弱碱性阴离子和强酸性阳离子交换树脂并用，可基本除去形成酒 石的成分一酒石酸和k + 、c a “，对酒的总酸度无影响。交换后色度、 c a 2 + 浓度显著降低，电导率略有降低。经过6 个月的贮存，葡萄酒没 有出现沉淀，品尝结果表明，苦味比对照明显减弱，口味也比较柔和 且平衡感强。r a n k i n e 的研究结果表明：离子交换树脂对葡萄酒的香味 有影响，使用之前虚在葡萄酒中浸渍几天，如果处理不当，会影响葡 萄酒的香气。一般说来，过多地使用离子交换工艺，将影响葡萄酒的 质量，对于红葡萄酒来说，还将引起大量色素的丧失阻“。 ( 3 ) 加入偏酒石酸法 在葡萄酒中加入一定量的偏酒石酸，当葡萄酒中刚刚有微小晶体 生成时，由于吸附作用，这些微小晶体表面吸满了偏酒石酸而使其无 法再进一步结晶，从而可以避免那些微小酒石酸盐相互结合而变成更 大的晶体沉淀 4 4 1 这是一种被广泛使用的方法。 偏酒石酸是通过酒石酸分子间的酯化作用而形成的一种聚酯。在 葡萄酒中，它易缓慢水解，重新形成酒石酸，从而逐渐失去其保护作 用，这一变化速度与温度有关。在0 9 c 时，葡萄酒中加入0 1 3 9 l 偏滔 石酸后，可在几年内有效，而在2 0 时，只能保持3 个月。因此，偏 酒石酸只宜使用于冬季供应市场的葡萄酒。 1 2 2 葡萄酒中蛋白质的稳定性 蛋白质破败是千白葡萄酒中常出现的物理和化学性浑浊或沉淀， 葡萄酒中并不是所有的蛋白质都不稳定，它分为稳定蛋白质和不稳定 蛋白质，只有不稳定的蛋白质才产生沉淀。引起蛋白质破败的原因有 很多，如葡萄品种、发酵方式、澄清剂的种类及用量、储藏环境等都能 引起葡萄酒的浑浊和沉淀。因此，在装瓶前必须保证葡萄酒能在瓶内长 期保持其稳定性，这就需要在装瓶前对葡萄酒中的蛋白质进行分析和 稳定性试验，以诊断出葡萄酒是否在装瓶后。有发生蛋白质破败的危险 4 5 1 。蛋白质不稳定的原因主要有以下几点： 蛋白质易变性，故在剧冷或剧热的条件下蛋白质可能变性而产 生沉淀。同时，蛋白质的溶解度也受有机溶剂的影响。葡萄酒中的酒精 含量较高，而酒精属于有机溶剂，也能使蛋白质缓慢变性。从而使其溶 解度下降，这样蛋白质便沉淀出来。 第一章绪论 由于葡萄酒中含有少量的单宁，此外，橡木塞中也含有少量的单 宁，当葡萄酒中的蛋白质与单宁接触时，蛋白质就会与单宁发生化学反 应，形成难溶物质而沉淀出来。 葡萄酒中还有许多带负电荷的胶体物质，如f e p 0 4 或c u s 0 4 ，而 蛋白质胶体带正电荷，故前者能破坏蛋白质的水化层，而使蛋白质不稳 定，二者相互结合而沉淀出来。 现在葡萄酒厂防治蛋白质破败病的方法主要是加皂土，在葡萄酒 中，较大的蛋白质分子量位于4 0 k d a - - 2 0 0 k d a 之间，其等电点在4 8 5 7 之间。研究证明，这些组分是引起葡萄酒蛋白不稳定的主要因素 4 6 1 。 皂土可大大除去原汁酒中的蛋白质。皂土具有阳离子交换能力， 不能除去葡萄酒中带负电荷的蛋白质和中性蛋白质组分，对酚类组分 基本是惰性的，而对花色苷类阳离子除外。使用皂土除掉蛋白质，能 使葡萄酒中的蛋白质稳定，但酒的质量有所降低，同时酒中一些有营 养价值的蛋白质也被除去了。而且皂土容易残留细微的尘粒，尤其用 粉状皂土，沉降时凝聚不良和在葡萄酒澄清后的硅藻土过滤过程中更 容易遗留这种缺陷。 因为蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的一种多肽分子，因此 可以找到一种或几种非专一酶切位点的酶对葡萄酒中的蛋白质进行酶 解，将酒中的蛋白质切成小的肽段或是氨基酸，这样既可以防治酒中 蛋白质的不稳定性，同时又可以增加酒中多肽或氨基酸的含量，提高 酒的营养价值h ”。 国外正在试用酶解法来分解酒中的蛋白质，目前最常用的蛋白酶 主要有：胰蛋白酶( t r y p s i n ) 、糜蛋白酶( c h y m o t r y p s i n ) 、胃蛋白酶 ( p e p s i n ) 、嗜热菌蛋白酶( t h e r m d y s i n ) 等。根据e l i z a b e t h 等人研究 报道，葡萄酒中的热不稳定蛋白质对蛋白酶有抵抗作用。因为它们是 球状蛋白质，蛋白酶切点比较少，故不易被降解。应当采用适当的方 法使蛋白质变性，暴露出更多的酶切位点【4 。 这方面国内外的研究报道都较少，使用蛋白酶稳定酒中的蛋白质 存在很大困难，而且蛋白酶的价格昂贵，会提高葡萄酒的成本。 山东轻工业学院硕士学位论文 1 3 开展课题的目的、意