（食品科学专业论文）益生菌对微囊藻毒素的清除及其机理初步研究.pdf

，毫，支 4 。二 。立 摘要 题目：益生菌对微囊藻毒素的清除以其机理初步研究 专业：食品科学入学时间：2 0 0 8 0 9 硕士研究生姓名：王松答辩时间：2 0 1 0 1 1 1 6 指导教师：王淼教授授予学位时间： 摘要 针对目前广泛存在的微囊藻毒素( m c s ) 污染问题，本文以益生菌为研究对象，评 价发酵乳杆菌( 三f e r m e n t u mb b e 0 9 2 9 ) 、保加利亚乳杆菌( 三b u l g a r i c u sf b c 0 8 0 3 ) 唾 液乳杆菌( ls a l i v a r i u sb b e 0 9 1 8 ) 、干酪乳杆菌( lc a s e iz h a n g ) 等九株乳杆菌对m c l r 的清除能力，对益生菌清除m c l r 进行可行性分析并从中筛选具有较高毒素清除能力 的益生菌。考察影响益生菌清除m c l r 的关键因素，并对益生菌清除m c l r 的作用 机理做初步探讨。主要研究结果如下： 1 研究选择九株常用的乳酸杆菌作为实验对象，考察益生菌清除m c l r 的可行性。 结果显示，九株实验菌株均具有m c l r 清除能力，但不同菌属间的m c s 清除能力差异 明显，其中三c a s e iz h a n g 、三f e r m e n t u mb b e 0 9 2 9 和l s a l i v a r i u sb b e 0 9 1 8 为九株实 验菌株中m c l r 清除能力最强的三株，而l 。c a s e iz h a n g 的清除能力最强，菌体一毒素 复合体系中初始藻毒素浓度为1 5 0 肛g l 时，3 7 0 c 培养2 4h 后毒素浓度降为8 5 5p l ， 藻毒素清除率可达4 3 。 2 在益生菌清除m c l r 可行性研究的基础上，从九株实验菌株中挑选能力明显的 l c a s e iz h a n g 、l f e r m e n t u mb b e 0 9 2 9 和三s a l i v a r i u sb b e 0 9 1 8 进行m c s 清除的关键 影响因素研究。实验结果表明，菌浓、毒素浓度、温度、菌代谢活性等因素对益生菌的 m c s 清除效率具有重要的影响作用；另外研究也发现益生菌细胞的不同生理状态对m c s 清除具有重要的影响作用，活菌体比死菌体具有更高的m c s 清除能力。 3 进一步研究向菌体毒素复合体系中添加外源碳氮源，考察细胞活性调节后益生 菌对m c l r 的清除能力变化情况，并考察活性调节前后体系中益生菌活细胞变化和胞 内的总蛋白酶活力变化情况。研究结果显示，添加外源碳源可以有效提高益生菌清除 m c l r 的效率，而菌浓以及添加量亦与清除效率成正相关性；另外添d i ：l j l - 源碳源后， 益生菌胞内蛋白酶的酶活力也得以提高。而添d i l j , t - 源氮源，益生菌的藻毒素清除效率未 见改善，菌胞内蛋白酶的酶活力亦未见有改善的趋势。 4 为了探讨益生菌清除m c l r 的途径和机理，研究m c s 清除过程中益生菌胞外 和胞内体系中全细胞蛋白和m c l r 的变化，考察活细胞、死细胞以及无细胞提取液对 m c l r 的作用情况，利用l c m s 分析手段研究菌体毒素复合体系中相关代谢物的变 化。结果表明，益生菌受m c l r 诱导后出现三条中等分子量的蛋白条带，推测其与 m c l r 的降解相关；无细胞提取液对m c l r 具有降解作用，说明了益生菌对m c - l r 的清除与生物降解作用密切相关。 关键词：益生菌，微囊藻毒素( m c s ) ，降解，代谢活性，机理 目录 a b s t r a c t a i m e da tt h e p r o b l e mo fm i c r o c y s t i n c o m t a m i n a t e d i nw a t e ra n df o o de x i s t e d e x t e n s i v e l y , i nt h i sp a p e r , p r o b i o t i c sw e r eu s e da st h er e s e a r c ho b j e c t s n i n es t r a i n s ( s u c ha s 三 s a l i v a r i u sb b e 0 9 - 1 8 ，l d e l b r u e c k i is u b s pf b c 0 7 - 4 7 ，l f e r m e n t u mb b e 0 9 2 9 ，l b u l g a r i c u s f b c 0 8 0 3 。l h e l v e t i c u sf b c 0 8 15 ，a n d 三c a s e iz h a n ge t c ) ，w e r ee v a l u a t e df o rt h e i r c a p a b i l i t yo fm i c r o c y s t i n - r e m o v a l f e a s i b i l i t ya n a l y s i so fm i c r o c y s t i nr e m o v e db yp r o b i o t i c s w a sc a r r i e do u t ，a n ds c r e e n e dt h es t r a i n sp o s s e s s e dh i g hc a p a b i l i t yo fm i c r o c y s t i n r e m o v a l t h ek e yf a c t o r sr e l a t e dt ot h er e m o v a le 伍c i e n c ya n dt h ep o s s i b l er e m o v a l m e c h a n i s m sw e r e a l s oi n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t so ft h i sd i s s e r t a t i o nw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 n i n ep r o b i o t i cb a c t e r i a sc o m m o n l yu s e di nf o o di n d u s t r yw e r es e l e c t e da sr e s e a r c h s u b j e c t s ，a n dw e r ei n v e s t i g a t e dt h ef e a s i b i l i t yo fm c l rr e m o v e db yp r o b i o t i c s t h er e s u l t s s h o w e dt h a t a l lo ft h en i n et e s t e ds t r a i n sa r ep o s s e s s e dt h ec a p a b i l i t yo fm i c r o c y s t i n r e m o v a l b u tt h ee f f i c i e n c yo fm c - l rr e m o v a lw a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e ng e n e r a a m o n g t h e s et e s t e ds t r a i n s l c a s e iz h a n ge x h i b i t e dt h eh i g h e s tr e m o v a le f j f i c i e n c y a f t e rar e m o v a l t r e a t m e n tw i t h 三e a s e lz h a n gf o r2 4h ( 1 0 c f u h l l ，p h7 0 ，3 7 0 c ) ，t h e m c l r c o n c e n t r a t i o nr e d u c e df r o m15 0p lt o8 5 5p g l ，a n dt h ec l e a r a n c er a t ew a su pt o4 3 2 o nt h eb a s i so ft h ef e a s i b i l i t ys t u d yo fm c - r e m o v a lb yp r o b i o t i c s ，l c a s e iz h a n g ，l f e r m e n t u mb b e 0 9 2 9a n d 三s a l i v a r i u sb b e 0 9 18w e r es e l e c t e df r o mt h et e s t e ds t r a i n a c c o r d i n gt ot h ee l i m i n a t ee 硒c i e n c y a n dw e r eu s e dt or e s e a r c ht h ek e yf a c t o r sr e l a t e dt ot h e r e m o v a le 衔c i e n c y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，v a r i o u sp a r a m e t e r s 。s u c ha sb i o m a s s ， t e m p e r a t u r e ，t o x i nc o n c e n t r a t i o na n dc y t o a c t i v e ，w e r ef o u n dt op l a y e di m p o r t a n tr o l e so nt h e m c l rr e m o v e db yp r o b i o t i c s ；i na d d i t i o n ，t h ep h y s i o l o g i c a ls t a t u so fc e l l sh a v ea n i m p o r t a n ti n f l u e n c e o nm i c r o c y s t i n r e m o v a l t h ev i a b l ec e l l sw e r em o r ee f f e c t i v e f o r m c l rr e m o v a lt h a nt h en o n v i a b l eo n e s 3 i n t h e f u r t h e rs t u d y , c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sw e r ea d d e di n t ot h ec o m p o u n d s y s t e mo fs t r a i na n dm i c r o c y s t i n l t h ec h a n g e so fm c l rr e m o v a l v i a b l ec e l l sa n dt o t a l p r o t e a s ea c t i v i t yo fp r o b i o t i c sw e r ei n v e s t i g a t e da f t e rt h ep r o b i o t i cc e l l sa c t i v i t yr e g u l a t i o n t h er e s u l t ss h o w e d t h er e m o v a lp e r f o r m a n c ec a nb ei m p r o v e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h e s u p p l e m e n to fc a r b o ns o u r c e a n dt h ei n t r a c e l l u l a rt o t a lp r o t e a s ea c t i v i t yw a sa l s ob e e n i m p r o v e d b u tt h i sp h e n o m e n o nw a s n th a p p e n e dw h i l et h en i t r o g e ns o u r c e sw e r ea d d e d 4 i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ep a t h w a ya n dm e c h a n i s mo fm c - l rr e m o v e db yp r o b o t i c s ， c h a n g e so ft h ew h o l e e e l lp r o t e i na n dm c l rc o n c e n t r a t i o ni ne x t r a c e l l u l a ra n di n t r a c e l l u l a r s y s t e m sw e r ei n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t i v e n e s so fm i c r o c y s t i n - l rr e m o v a lb yv i a b l ec e l l s n o n v i a b l ec e l l sa n dc e l l f r e ee x t r a c tw e r ec o m p a r e d l c m sw a sb e i n gu s e dt oa n a l y s et h e m e t a b o l i t e sc h a n g ei nc o m p l e xs y s t e mo fs t r a i na n dm i c r o c y s t i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h r e em i d d l e - m o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i nb a n da p p e a r e di nc e l l sa f t e rp r o b i o t i c si n d u c e db y m c l r a n dm a yb er e l e v a n tw i t ht h ed e g r a d a t i o no fm c - l r ；t h ec f ep o s s e s s e dt h ea b i l i t y o fm c l rd e g r a d a t i o n a n dw h i c hc o n f i r m e dt h ep e r f o r m a n c eo fm i c r o c y s t i nr e m o v e db y p r o b i o t i c sw a sr e l a t e dw i t hb i o d e g r a d a t i o n k e y w o r d s ：p r o b i o t i c s ，m i c r o c y s t i n - l r ，b i o d e g r a d a t i o n ，m e t a b o l i ca c t i v i t y , m e c h a n i s m i i 8 i i iiii ii ii ii ilu1 1 1 l 哪 18 8 9 4 0 4 摘要i a b s t r a c t i i 目录i 第一章绪论1 1 1 概述1 1 1 1 微囊藻毒素1 1 1 2 微囊藻毒素的去除方法2 1 1 3 益生菌与乳酸菌：2 1 2 微囊藻毒素生物降解的研究现状3 1 2 1 国外研究现状4 1 2 2 国内研究现状_ 5 1 3 存在的问题6 1 4 研究内容与立题意义7 1 4 1 研究内容7 1 4 2 立题意义7 第二章材料与方法9 2 1 菌株9 2 2 试剂与仪器：9 2 1 1 试剂_ 9 2 1 2 仪器；9 2 3 培养基与培养条件1 0 2 3 1 培养基。10 2 3 2 培养条件1o 2 4 实验方法l0 2 4 1 生长实验1o 2 4 2 菌体培养与处理1 0 2 4 3 无细胞提取液的制备1 0 2 4 4 毒素浓度对m c l r 清除的影响1 0 2 4 5 菌体浓度对m c l r 清除的影响。1 1 2 4 6 温度对m c l r 清除的影响1 1 2 4 7 菌体活性对m c l r 清除的影响1 1 2 4 8 葡萄糖添加对m c l r 清除的影响1 1 2 4 9 外源氮源添加对m c l r 清除的影响1 1 2 4 1 0m c l r 诱导前后l c a s e iz h a n g 胞内外全细胞蛋白电泳( s d s - p a g e ) 1 1 2 4 1 1m c l r 的降解产物分析12 2 5 分析方法12 2 5 1 菌体密度的测定1 2 2 5 2 蛋白含量的测定1 2 2 5 3 葡萄糖含量的测定12 目录 2 5 4 蛋白酶活力的测定1 2 2 5 5m c - l r 的定量测定12 2 5 6l c m s 分析代谢物1 4 2 6 清除率的计算1 4 2 7 数据处理与统计分析1 4 第三章结果与讨论1 5 3 1 益生菌对m c l r 清除的可行性研究1 5 3 2 益生菌清除m c l r 的影响因素研究1 7 3 2 1 藻毒素浓度对益生菌清除m c l r 的影响1 7 3 2 2 菌体浓度对益生菌清除m c l r 的影响1 8 3 2 3 温度对益生菌清除m c l r 的影响1 9 3 2 4 菌体活性对益生菌清除m c l r 的影响2 0 3 3 益生菌清除m c l r 的活性调节研究2 1 3 3 1 葡萄糖对益生菌清除m c l r 效率的影响2 1 3 3 2 氮源对益生菌清除m c l r 效率的影响j ，2 3 3 3 - 3 外源物质调节菌体清除m c l r 过程前后细胞的总蛋白酶活力变化研究2 4 3 4 益生菌降解m c l r 的途径和机理初步探索2 5 3 4 1m c l r 诱导前后l c a s e iz h a n g 胞内外的活性物质分析2 5 3 4 2 益生菌中m c l r 降解相关的活性物质的定位- 2 6 3 4 3 益生菌降解m c l r 的代谢物分析j 2 8 第四章结论与展望3 3 4 1 结论j 3 3 4 2 展望3 4 致 谢3 5 参考文献3 6 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文4 2 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概述 近年来，随着工农业生产的迅速发展和城市化进程的加快以及人类生活方式的改 善，工农业污水的大量排放使得大量富含氮、磷等营养物进入大江湖泊，导致内陆水体 中的水华事件的发生日益严重。蓝藻水华在爆发过程中，蓝藻细胞会释放出内源性蓝藻 毒素，严重危及饮用水源安全、危害了动物和人类的身体健康【l 2 1 。蓝藻毒素种类很多， 主要分为肝毒素、脂多糖毒素和神经毒素三大类型，而肝毒素主要分为微囊藻毒素 ( m i c r o c y s t i n s ) 、柱孢藻毒素( c y l i n d r o s p e r r n o p s i n ) 和节球藻毒素( n o d u l a r i n s ) ，其中微囊 藻毒素的毒性最强、危害最大【3 ，4 1 。一般天然水体中微囊藻毒素的浓度在1 0 g l 以下， 但大面积严重的藻类水华爆发会使水体中的藻毒素浓度达到m e t e 水平p j 。 1 1 1 微囊藻毒素 微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) 是一类由引发水体富营养化的铜绿微囊藻属 - ( m i c r o c y s t i s ) 、水华鱼腥藻( a n a b a e n ) 、念珠藻属( n o s t o c ) 等属中的蓝藻产生的环状 七肽类肝毒素，分子量在1 0 0 0 左右，其基本结构为环d 。丙氨酸l x d - 甲基p - d 一异天 冬氨酸l z a d d a - d 异谷氨酸n 一甲基脱氢丙氨酸( x ，z 为两种可变氨基酸) ( f i g 1 1 ) 。 其中，a d d a 是3 氨基9 甲氧基一2 ，6 ，8 三甲基1o 苯基4 ，6 二烯酸，研列6 j 显示a d d a 是 m c s 的活性基团，去掉a d d a 基团后m c s 的毒性大大降低【7 1 。目前，已知由于x 、z 的 不同而产生的藻毒素异构体有7 0 多种，其中m c l 1 lm c r r 和m c y r 为存在最普遍 且毒性最大的三种类型( l 、r 、y 分别代表l e u 、a r g 和t y r ) ，而m c - l r 的急性毒性 最强、危害也最大、。m c s 以动物肝脏为主要作用靶器官，能够特异性地抑制蛋白磷酸 酶l 和2 a 的活性，激发增强肝脏细胞的原癌基因的转录水平，从而诱发肿瘤和癌症等 一系列生理病变哺j 。 c h ， oc o o h 图1 - 1 微囊藻毒素的一般结构( 图中x ，z 为两种可变氨基酸) f i g 1 1g e n e r a ls t r u c t u r eo f m i c r o c y s t i n s ( x zs t a n df o r t w ok i n d so f a m i n oa c i d ) 虽然早在1 8 7 8 年就有关于蓝藻水华引起家禽家畜中毒死亡的研究9 1 报道，但直到 江南大学硕十学何论文 1 9 9 6 年巴西发生1 0 0 多人因饮用水含藻毒素而发生急性肝功能障碍并有逾5 0 人死亡的 严重藻毒素污染事故【l o 】才真正引起世界各国对藻毒素污染事件的普遍关注。 1 1 2 微囊藻毒素的去除方法 微囊藻毒素由于具有间隔双键和环状结构，化学性质非常稳定，加热、煮沸等一般 处理方法难以将其毒性去除。目前m c s 的去除方法主要有： a ) 物理法：主要通过吸附1 1 1 、过滤和混凝【1 2 】等方法去除水体中的m c s 。但是，常 规的水处理工艺不能有效去除水溶液中的m c s ，混凝沉淀只能通过去除藻类从而去除细 胞内的m c s ，对细胞外的溶解性m c s 无效。n e u m a n n 等【1 3 】研究发现通过纳滤可以去除 水体中9 8 的m c s ，但是这种技术成本高，难以商业推广。 b ) 化学法：主要通过臭氧氧化法【14 1 、光降解1 5 ，16 1 、强氧化剂氧化法【1 7 1 8 1 等方法氧 化破坏a d d a 基团中的共轭双键从而去除水体中的m c s 。然而，化学氧化有时会破坏水 体中的藻类细胞，使藻细胞内的m c s 释放到水体中，增大危害。另外化学氧化试剂的 加入会给水体带来二次污染的潜在问题。 c ) 生物法：生物法主要是微生物降解法【1 9 2 l 】，目前被认为是最为安全有效的去除 水体中m c s 的方法之一。日本学者t a k e n a k a 等【2 2 】筛选得到一株藻毒素降解菌，经测序 鉴定为铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) ，发现其分泌的碱性蛋白酶具有降解 m c l r 能力；2 0 0 8 年s u m i n o 等【2 3 】报道一种利用鞘氨醇单胞菌m d b l 进行水处理的方 法专利，此法具有高效性和安全性等特点；2 0 0 5 年国内有报道了一个利用食酸戴尔福特 菌u s t b 0 2 ( d e l f t i aa c i d o v o r a n s ) 降解藻毒素的专利【2 4 。，可以快速、安全、高效的降解 水体中的m c s 。与物理化学方法相比，微生物法去除m c s 具有成本低廉、安全性高且 有利于水生态修复等优点。因而生物法去除m c s 近年来已成为国内外研究人员关注的 热点。 1 1 3 益生茵与乳酸茵 益生菌( p r o b i o t i c s ) 词来源于希腊文，最早f l t l i l l y 和s t i l l w e l l 于1 9 6 5 年提出。益生 菌的定义随着人们对人体及动物体内正常微生物菌群与健康关系的深入研究而日益完 善，目前关于益生菌最普遍使用的定义是由英国学者f u l l e r 于1 9 8 9 年提出的【2 5 】：益生菌 是一类“适当摄入对宿主有好处的活的微生物”。通俗的说，所谓益生菌就是指能活 着到达小肠，并且抑制有害菌在肠道内的繁殖、促进肠道运动、调节宿主黏膜与系统免 疫功能以及改善肠道营养与微生态平衡，通过定殖作用改变宿主某一部位菌群的组成， 从而产生有利于宿主健康作用的单一或组成明确的混合微生物【2 6 1 。常用的益生菌如乳酸 杆菌和双歧杆菌等，它们是人类肠道内重要的生理菌，对机体有多种其它正常生理菌群 无法比拟的生理作用。益生菌的益生功能包括1 2 5 2 7 j ：整肠作用，调整胃肠道菌群；调 整微生态失调，防治腹泻；缓解乳糖不耐症状，促进机体营养吸收；缓解过敏作 用；降低血清胆固醇；增强宿主免疫能力；预防癌症和抑制肿瘤生长等。 2 0 0 1 年o g a w a 等i 列】研究发现乳酸杆菌c a s e is h i r o t a 和l a c i d o p h i l u sy i t 0 0 7 0 对志 2 第一章绪论 贺毒素产生菌e s c h e r i c h i ac o l i0 1 5 7 ：h 7 具有抑制特性。2 0 0 1 年h a s k a r d 等1 2 叫研究了 l g g ( a t c c5 3 1 0 3 ) 、l r h a m n o s u sl c 7 0 5 ( d s m7 0 6 1 ) 等1 2 株乳酸菌对a f b l 的吸附结合能 力。2 0 0 3 年n y b o m 等【3 0 】研究人员研究考察了l g g 、l r h a m n o s u sl c 一7 0 5 和b b 1 0 n g u m4 6 等l1 株乳酸菌的藻毒素清除能力。2 0 0 7 年h a l t t u n e e 等【3 l j 研究发现b b 1 0 n g u m4 6 、l f e r m e n t u mm e 3 等乳酸菌具有清除镉、铅等重金属离子能力。 益生菌主要是人类和动物肠道内正常生理性菌和非肠道菌，目前常用的益生菌包括 乳杆菌类、双歧杆菌、芽孢杆菌类和链球菌类。目前常用于益生菌产品的菌株列于表1 1 中。 表1 - 1 目前用于益生制品的益生菌菌株 t a b l e1 - 1p r o b i o t i c sa p p l i e di np r o b i o t i cp r o d u c t s 4 l ：l a c t o b a c i l l u s ；b b ：b i f i d o b a c t e r i u m ；b ：b a c i l l u ss ：s t r e p t o c o c c u s , p p e d i o c o c c u s 乳酸菌( 1 a c t i ca c i db a c t e r i a , l a b ) 不是一个分类学上的名称，而是指一类可发酵碳水 化合物并产生大量乳酸、不产孢子、厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称。 乳酸菌在自然界中的种类很多，目前已知的乳酸菌有1 8 个属、2 0 0 多个种，是广泛分布 于自然界中的微生物种群。乳酸菌大体分为两大类：一是植物源性乳酸菌，分布于果蔬、 谷物及植物制品上；二是动物源性乳酸菌，分布于人和动物的内脏( 如胃、肠) 和口腔之 中，以及牛奶、乳制品和肉类制品中。除少数外，如肺炎链球菌( p n e u m o n i a e ) 和化脓 性链球菌( sp y o g e n e s ) 【3 2 】，绝大部分乳酸菌是人和动物体内必不可少的具有重要生理功 能的菌群。除片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 夕b ，以上各属乳酸菌均广泛应用于轻工、食品、医 药以及饲料工业等许多行业中，如干酪乳杆菌( 三c a s e i ) 和嗜热链球菌( st h e r m o p h i l u s ) 。 1 2 微囊藻毒素生物降解的研究现状 目前国内外有关m c s 的生物降解研究主要为微生物降解，侧重于以下几个研究方 面：微囊藻毒素微生物降解的可行性以及降解菌的筛选、影响藻毒素微生物降解的因素 和藻毒素的微生物降解途径。 3 江南人学硕士弓乏位论文 1 2 1 国外研究现状 在m c s 纯降解菌株研究方面，1 9 9 4 年j o n e s 等【3 3 1 首次从澳大利亚的水体中分离获 得藻毒素降解菌m j p v ，经1 6 s r r n a 测定为鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s ) 。1 9 9 6 年 c o u s i n s 研究利用自然混合菌群降解m c l r ，发现水库水体中的微生物在约一周的时间 里可降解完1 0p l 的m c l r 【3 4 】。i s h i i 等【3 5 】研究人员从日本的s u w a 湖的表面水样中分 离获得可降解藻毒素的细菌7 c y ，鉴定发现其属于鞘氨醇单胞菌属，研究表明该菌能在 4d 时间内完全降解初始浓度为6m g l 的m c l r 、m c l y 、m c l w 和m c l f 。k i y o m i 掣3 6 】从日本t s u k u i 与s a g a m i 湖中分离出一株藻毒素降解菌纯菌株b 9 ，其ld 内可将 一定浓度的m c s 全部降解，经1 6 s r d n a 测序发现其与鞘氨醇单胞菌y 2 的同源性达 9 9 。t a k e n a k a 等人从日本湖泊中分离出一株铜绿假单胞菌属藻毒素降解菌，其经2 0d 对初始浓度5 0m g l 的藻毒素溶液的清除率可达9 0 以上，研究认为其中的碱性磷酸酶 对藻毒素的降解起到重要作用【2 2 1 。2 0 0 5 年，德国学者a h e 分离出一株微生物纯菌种 c b a 4 ，经1 6 s r d n a 测序确定为鞘氨醇单胞菌，其在3 6h 内可将初始浓度为2 0 0n g l 的m c r r 完全降解【3 7 】。p a r k 等【38 1 科研人员从富营养化得水体中筛得十株微生物，实验 发现其中一株革兰氏阴性厌氧菌对m c l r 和m c r r 具有清除效果。l a t h i 研究了从湖 水和沉淀物中分离的大量细菌菌株的藻毒素清除情况，发现其中1 7 的菌株具有藻毒素 降解能力【3 9 1 。 目前已研究报道的藻毒素降解菌多为变形杆菌类( p r o t e o b a c t e r i a ) 微生物，诸如 s p h i n g o m o n a s ( 鞘氨醇单胞菌属) 、p a u c i b a c t e r 、b u r k h o l d e r i a ( 伯霍尔德杆菌属) 、 s p h i n g o p y x i s 、m e t h y l o b a c i l l u s ( 甲基菌属) 等【4 0 4 3 1 。2 0 0 9 年m a n a g e 等1 4 4 从水体和湖底沉 积物中发现三株不属于变形杆菌的藻毒素降解菌，经1 6 s r r n a 测序确定分别为节杆菌 属( a r t h r o b a c t e rs p p ) 、甾短杆菌( b r e v i b a c t e r i u ms p ) 、红球菌属( r h o d o c o c c u ss p ) 。 在m c s 的生物降解途径和机理研究方面，一般认为此类环肽结构化合物生物降解 途径按照环肽一线性多肽一多肽一氨基酸一氨的规律变化，其中开环是此类化合物其生 物降解过程中至关重要的关键步骤【4 2 4 5 1 。c o u s i n s 等【3 4 1 研究发现，m c l r 生物降解后其 a d d a 侧链的共轭双键遭到破坏，从而证明了a d d a 侧链是m c l r 生物降解的攻击靶位， 由于其结构的变化导致m c l r 毒性降低或丧失。 澳大利亚的研究人员b o u n r e 等 4 2 1 研究鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s ) 降解m c l r 的途径( f i g 1 2 ) ，认为鞘氨醇单胞菌对m c l r 的降解至少是由胞内三种降解酶促成， 研究发现了毒素降解过程中的两种中间代谢产物。三种降解酶中，金属蛋白酶m i r a 是 m c l r 降解中的最重要的酶，是由3 3 6 个残基组成的肽链内切酶，其能促使稳定的 m c l r 开环【4 引。h a r a d a 在利用鞘氨醇单胞菌菌株b 9 对m c l r 进行生物降解过程中， 分离出了完整的a d d a 基团，这一结果为b o u r n e 提出的降解途径提供了重要证据1 4 6 1 。此 后b o u r n e 等通过无性繁殖和基因文库筛选等技术手段发现了m c s 降解基因组m i r a 、 m i r b 、m i r c 和m i r d ，发现m i r a 基因编码的酶具有打开m c l r 环状结构的功能。在 m i r a 编码的降解酶的催化作用下，m c l r 的a d d a a r g ( 精氨酸) 肽键被打断生成线性 的m c l r ，随后线性m c l r 被第二种降解酶( m l r b 编码) 进一步分解成四肽化合物， 4 第一章绪论 最后在m i r c 编码的水解酶的作用下四肽降解生成更小的肽和氨基酸。位于m i r a 下游 且具有相同翻译方向的是m i r d ，其编码的是一个寡肽转运子1 4 引。 s a i t o 在鞘氨醇单胞菌m j p v 中也检测到了藻毒素降解基因m i r a ，并在藻毒素降解 菌m d 1 和y 2 中发现了与m i r a 相似的基因。通过p c r 和p f i m e r s e tm f m r 等手段确 认m i r a 基因存在于能够降解藻毒素的菌体中【4 7 1 。然后2 0 0 9 年m a n a g e 等【删从水体和沉 积物中发现三株藻毒素降解菌，通过全基因组比对，这三株降解菌中并没有发现已报道 的鞘氨醇单胞菌藻毒素降解基因组m i r a 、m i r b 、m i r c 和m i r d 。 h y e n s t r a n d 等【4 8 】采用放射性同位素1 4 c 示踪法研究水体中m c s 的生物降解，发现 m c s 的最终降解产物c 0 2 。 m e r i l u o t o 等1 4 9 】研究发现益生菌l r h a m n o s u sg g 和双歧杆菌b b l 2 具有藻毒素清除 能力，l g g 经7 h 对0 5p g m l 的m c l r 的清除率可达4 6 。 m i c r o c y t i n l rm w “) 9 4 一c ，l 、鲥呶 喻醐r k 斗一t 铡 lc i m i t i d e d 融：a d d a - i s o g l u - m d h 矗- a l a - o h e n z , y 雠，l a m i n oa c i d sa n d u n d u e c t e ds m a l l e rp e p t i d e s 图l - 2 鞘氨醇单胞茵的m c l r 降解途径 f i g 1 - 2t h ed e g r a d a t i v ep a t ho fm c l rb ys p h i n g o m o n a s 1 2 2 国内研究现状 2 0 0 2 年闰海等从滇池底泥中分离获得株m c s 高效降解菌， 1 6 s r d n a 澳j j 序为青 枯茵( r 口l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) ，其同均降解m c l r 速率达9 4g g m l 。2 0 0 6 年周洁等【5 l 】 5 丁i 江南大学硕十学何论文 从滇池底泥中分离获得一株高效降解m c s 菌株，经1 6 s r d n a 测序为食酸戴尔福特菌 ( d e l f i i aa c i d o v o r a n s ) ，其m c l r 和m c r r 同均降解速率分别达到1 9 8p g m l 和4 5 1 l a g m l ，为国内外迄今报道降解m c s 速率最高的纯菌种。2 0 0 9 年严少华等( 5 2 】研究人员从 太湖水体中筛选到m c s 高效降解菌群j s m 0 0 4 ，2 4h 内可以完全降解起始毒素浓度为3 6 4 和2 6 2l a g m l 的m c r r 和m c l r 。2 0 0 9 年杨静东等【5 3 】从太湖水体中筛到一株高效藻毒素 降解菌e s m ，1 8h 可完全降解1 7i t g m l 的m c l r ，经1 6 s r i 酬a 测序发现降解菌e s m 与嗜 麦芽寡养单胞菌( s t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i a ) 同源性达9 4 。胡梁斌等1