双水相萃取实验课件.ppt

1,生化物质分离纯化基础实验,两水相萃取蛋白质的相图及分配系数,2,PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图,生化物质分离纯化基础实验,一.实验原理高聚物与无机盐成相的原因：用相图表示两水相形成的条件和定量关系，它是一根双节线（binodal）。,无机盐盐析作用。,P,Q,互溶区,两相区,3,二.相图的制作方法,(一)溶液配制配制43.00%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：,称硫酸胺215.0g,少量水溶解,稀释至500ml,密度计测密度,生化物质分离纯化基础实验,4,PEG400%(NH4)2SO4%,按表格重复操作,PEG4000.700g,H2O0.5ml,(NH4)2SO4,混和,H2O0.3ml,浑浊,记录(NH4)2SO4ml数,混均,（二）相图的制作,澄清,生化物质分离纯化基础实验,5,表1.相图制作表,(NH4)2SO4溶液浓度43.00%(g/ml)密度1.20g溶液/ml溶液PEG400=_g温度=_,生化物质分离纯化基础实验,6,两水相系统中蛋白质分配系数的测定,实验原理1.糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分配，分配系数K=C上/C下。相比R=V上/V下2.考马斯亮兰（CoomassieBrilliantBlueG-250）比色法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰G250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大吸收值。低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。,生化物质分离纯化基础实验,2019/12/14,7,可编辑,8,操作方法（一）蛋白质在两相中的分配：,10ml刻度离心试管,加(NH4)2SO4固体1.30克,加PEG4002.00克,加入糖化酶2.00ml,加水,总重8.00g,离心3000转/分5min,振摇混和(固体溶解),求相比R=V上/V下,求蛋白质分配系数K=C上/C下,生化物质分离纯化基础实验,9,生化物质分离纯化基础实验,试剂配制1.考马斯亮兰G-250溶液配制：精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml95%乙醇中，并加入50ml85%浓磷酸，然后，用H2O稀释定容至500ml。2.牛血清蛋白溶液配制：精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成120g/ml的牛血清蛋白原液。,（二）比色测定上、下相蛋白质浓度：,10,生化物质分离纯化基础实验,标准曲线制作方法：见下表上相液：吸取0.5ml蒸馏水定容至50ml按下表操作。下相液：直接按下表操作。空白液：吸取1.0ml蒸馏水5ml考马斯亮兰液。,表1.标准曲线和样品的测定牛血清蛋白浓度120g/ml,11,标准曲线图：,OD,g,OD=Kgb求斜率K和截距b,生化物质分离纯化基础实验,12,生化物质分离纯化基础实验,思考和讨论:,二.选择正确的离心操作顺序:1.将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放在离心机中。2.将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡对称放在离心机中。,加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解，原因是什么？,选择正确的吸出上、下相操作方法：1.吸管小心插入下相，吸出下相换吸管，吸出上相。2.吸管小心吸出上相插入下相，吸出下相。3.吸管小心吸出上相将多余上相和少量下相弃去换吸管，吸出下相。,13,生化物质分离纯化基础实验,四.可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）：1.要吸取0.4ml液体，可用10005000l规格的枪。2.向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值增大。3.下列操作哪